Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

Síndrome nefrótica é definida pela presença simultânea de edema sistêmico, hipoalbuminemia e proteinúria intensa. Vários componentes da composição corporal, principalmente relacionados à água corporal, sofrem rápidas e frequentes alterações nessa síndrome. A espectroscopia por bioimpedância (BIS) é um método de fácil execução, baixo custo, que pode ser repetido e praticamente isento de riscos que permite avaliar água corporal, massa magra e gordura corporal e tem sido pouco utilizado na síndrome nefrótica. Objetivo. Avaliar as alterações da água e de outros componentes da composição corporal através da BIS em pacientes com síndrome nefrótica. Métodos. Pacientes foram avaliados na ocasião da biópsia renal e no desfecho com ou sem remissão do edema. Foram medidos o peso corporal, albumina sérica e proteinúria de 24 h e, pela BIS, variáveis relacionadas à água corporal e a outros parâmetros de composição corporal. Resultados. Foram estudados 17 pacientes (idade: 51,1 + 17,4 anos) com síndrome nefrótica. Dez pacientes obtiveram remissão do edema (grupo R), sendo que em nove ocorreu também remissão da síndrome nefrótica. Em sete pacientes o edema permaneceu presente, sem remissão (grupo SR). A variação entre a primeira e a segunda medida para a sobrecarga hídrica foi de -5,4 L (-8,5 L; -1,8 L) no grupo R e de 0,0 L (-1,1 L; 1,2 L) no grupo SR (p < 0,05). A água corporal total variou de -4,75 L (- 10,20 L; -2,50 L) e de 4,80 L (-1,30 L; 6,10 L) nos grupos R e SR, respectivamente (p < 0,05), e a água extracelular variou de -5,90 L (-10,10 L; -0,42 L) e de 1,20 L (-0,80 L; 2,70 L) nos mesmos grupos (p < 0,05). Não houve diferença estatisticamente significante na variação entre as duas avaliações nos grupos R e SR para a água intracelular, massa de tecido magro, massa de tecido adiposo, massa gorda total e massa celular corporal. A variação do ângulo de fase entre as avaliações foi de 1,55° (0,41°; 2,24°) no grupo R e 0,10° (-0,28°; 0,46°) no grupo SR (p < 0,05). Houve correlação estatisticamente significante entre cada variável definidora da síndrome nefrótica (peso corporal, proteinúria e albumina sérica) versus sobrecarga hídrica, água corporal total, água extracelular e ângulo de fase, mas não versus as demais medidas de composição corporal obtidas pela BIS. Conclusão. A espectroscopia por bioimpedância mostrou-se eficiente em detectar mudanças da água corporal e do ângulo de fase em pacientes com síndrome nefrótica, mas não para identificar variações relacionadas à massa de tecido magro, massa de tecido adiposo, massa gorda total e massa celular corporal. . / Nephrotic syndrome is established by the simultaneous presence of systemic edema, hypoalbuminemia, and severe proteinuria. Several components of the body composition, mainly related to the body fluid, undergo to rapid and frequent changes in this syndrome. Spectroscopy by bioimpedance (BIS) is a reliable, cost-effective and easy-to-perform method to evaluate body water, adipose tissue mass, and body cell mass. Despite these advantages, BIS has barely been used to evaluate patients with nephrotic syndrome. Aims. To evaluate body fluid variable changes and other components of the body composition in patients with nephrotic syndrome by bioimpedance spectroscopy. Methods. Patients were studied in two moments: at the occasion of the renal biopsy (1st evaluation), and at the end-point (2nd evaluation). Patients were grouped according to they reached remission (Group R) or remained without remission (Group WR) of the edema at the 2nd evaluation. Body weight, serum albumin and 24 hours proteinuria were measured at the two time-points, as well as other variables associated with body fluid and other components of the body composition obtained by the BIS. Results. Seventeen patients (age: 51,1 + 17,4 years-old) with nephrotic syndrome were studied. Ten patients reached remission of the edema while nine of them were also in remission of the nephrotic syndrome. Seven patients remained with edema at the end-point. The variation between the 1st and the 2nd measurement for the overhydration was of -5,4 L (-8,5L; -1,8L) at the group R and of 0,0 (-1,1 L; 1,2 L) at the group NR (p < 0,05). Total body water changes were of -4,75 L (-10,20 L; -2,50 L) and of 4,80 L (-1,30 L; 6,10 L) at the groups R and WR, respectively (p < 0,05), and the extracellular water changed of the -5,90 L (-10,10 L; -0,42 L) and of 1,20 L (-0,80 L; 2,70 L) at the same groups, respectively (p < 0,05). There was no statistically significant difference in the variation between the two evaluations for the groups R and NR for intracellular water, lean tissue mass, fat mass, adipose tissue mass, and body cell mass. The variation of the phase angle between the two evaluations was of the 1,55° (0,41°; 2,24°) at the group R and 0,10° (-0,28°; 0,46°) at the group WR (p < 0,05). There was a statistically significant correlation between each related nephrotic syndrome variable compared with overhydration, total body water, extracellular water, and phase angle, but no difference when compared with the other variables related to the body composition measured by the BIS. Conclusion. The spectroscopy by bioimpedance was efficient to measure body water changes and the phase angle in patients with nephrotic syndrome. However, the BIS could not detect changes related to the intracellular water, lean tissue mass, fat mass, adipose tissue mass, and body cell mass.

Síndrome nefrótica é definida pela presença simultânea de edema sistêmico, hipoalbuminemia e proteinúria intensa. Vários componentes da composição corporal, principalmente relacionados à água corporal, sofrem rápidas e frequentes alterações nessa síndrome. A espectroscopia por bioimpedância (BIS) é um método de fácil execução, baixo custo, que pode ser repetido e praticamente isento de riscos que permite avaliar água corporal, massa magra e gordura corporal e tem sido pouco utilizado na síndrome nefrótica. Objetivo. Avaliar as alterações da água e de outros componentes da composição corporal através da BIS em pacientes com síndrome nefrótica. Métodos. Pacientes foram avaliados na ocasião da biópsia renal e no desfecho com ou sem remissão do edema. Foram medidos o peso corporal, albumina sérica e proteinúria de 24 h e, pela BIS, variáveis relacionadas à água corporal e a outros parâmetros de composição corporal. Resultados. Foram estudados 17 pacientes (idade: 51,1 + 17,4 anos) com síndrome nefrótica. Dez pacientes obtiveram remissão do edema (grupo R), sendo que em nove ocorreu também remissão da síndrome nefrótica. Em sete pacientes o edema permaneceu presente, sem remissão (grupo SR). A variação entre a primeira e a segunda medida para a sobrecarga hídrica foi de -5,4 L (-8,5 L; -1,8 L) no grupo R e de 0,0 L (-1,1 L; 1,2 L) no grupo SR (p < 0,05). A água corporal total variou de -4,75 L (- 10,20 L; -2,50 L) e de 4,80 L (-1,30 L; 6,10 L) nos grupos R e SR, respectivamente (p < 0,05), e a água extracelular variou de -5,90 L (-10,10 L; -0,42 L) e de 1,20 L (-0,80 L; 2,70 L) nos mesmos grupos (p < 0,05). Não houve diferença estatisticamente significante na variação entre as duas avaliações nos grupos R e SR para a água intracelular, massa de tecido magro, massa de tecido adiposo, massa gorda total e massa celular corporal. A variação do ângulo de fase entre as avaliações foi de 1,55° (0,41°; 2,24°) no grupo R e 0,10° (-0,28°; 0,46°) no grupo SR (p < 0,05). Houve correlação estatisticamente significante entre cada variável definidora da síndrome nefrótica (peso corporal, proteinúria e albumina sérica) versus sobrecarga hídrica, água corporal total, água extracelular e ângulo de fase, mas não versus as demais medidas de composição corporal obtidas pela BIS. Conclusão. A espectroscopia por bioimpedância mostrou-se eficiente em detectar mudanças da água corporal e do ângulo de fase em pacientes com síndrome nefrótica, mas não para identificar variações relacionadas à massa de tecido magro, massa de tecido adiposo, massa gorda total e massa celular corporal. . / Nephrotic syndrome is established by the simultaneous presence of systemic edema, hypoalbuminemia, and severe proteinuria. Several components of the body composition, mainly related to the body fluid, undergo to rapid and frequent changes in this syndrome. Spectroscopy by bioimpedance (BIS) is a reliable, cost-effective and easy-to-perform method to evaluate body water, adipose tissue mass, and body cell mass. Despite these advantages, BIS has barely been used to evaluate patients with nephrotic syndrome. Aims. To evaluate body fluid variable changes and other components of the body composition in patients with nephrotic syndrome by bioimpedance spectroscopy. Methods. Patients were studied in two moments: at the occasion of the renal biopsy (1st evaluation), and at the end-point (2nd evaluation). Patients were grouped according to they reached remission (Group R) or remained without remission (Group WR) of the edema at the 2nd evaluation. Body weight, serum albumin and 24 hours proteinuria were measured at the two time-points, as well as other variables associated with body fluid and other components of the body composition obtained by the BIS. Results. Seventeen patients (age: 51,1 + 17,4 years-old) with nephrotic syndrome were studied. Ten patients reached remission of the edema while nine of them were also in remission of the nephrotic syndrome. Seven patients remained with edema at the end-point. The variation between the 1st and the 2nd measurement for the overhydration was of -5,4 L (-8,5L; -1,8L) at the group R and of 0,0 (-1,1 L; 1,2 L) at the group NR (p < 0,05). Total body water changes were of -4,75 L (-10,20 L; -2,50 L) and of 4,80 L (-1,30 L; 6,10 L) at the groups R and WR, respectively (p < 0,05), and the extracellular water changed of the -5,90 L (-10,10 L; -0,42 L) and of 1,20 L (-0,80 L; 2,70 L) at the same groups, respectively (p < 0,05). There was no statistically significant difference in the variation between the two evaluations for the groups R and NR for intracellular water, lean tissue mass, fat mass, adipose tissue mass, and body cell mass. The variation of the phase angle between the two evaluations was of the 1,55° (0,41°; 2,24°) at the group R and 0,10° (-0,28°; 0,46°) at the group WR (p < 0,05). There was a statistically significant correlation between each related nephrotic syndrome variable compared with overhydration, total body water, extracellular water, and phase angle, but no difference when compared with the other variables related to the body composition measured by the BIS. Conclusion. The spectroscopy by bioimpedance was efficient to measure body water changes and the phase angle in patients with nephrotic syndrome. However, the BIS could not detect changes related to the intracellular water, lean tissue mass, fat mass, adipose tissue mass, and body cell mass.

Metalofármacos baseados em rutênio têm se mostrado promissores com relação à atividade anticancerígena frente a diversos tipos de tumores. Nosso grupo de pesquisa dedica-se ao estudo de compostos contendo o centro dimetálico de valência mista Ru2(II,III) coordenado a ligantes derivados de Faines (Fármacos anti-inflamatórios não esteroides), tendo demostrando o potencial desses complexos frente a glioma. O entendimento do modo de ação destes complexos requer o estudo de suas interações com biomoléculas presentes no meio biológico. Neste cenário, o presente trabalho teve por objetivo investigar a interação de três complexos de dirutênio-Faines, ou RuFaines, [Ru2(ibp)4Cl], [Ru2(ceto)4Cl] e [Ru2(npx)4(H2O)2]PF6 (ibp = ibuprofenato, ceto = cetoprofenato e npx = naproxenato), e também do precursor [Ru2(O2CCH3)4Cl], RuAc, com as principais proteínas presentes no soro humano, transferrina e albumina. Os complexos foram sintetizados e caracterizados conforme metodologias desenvolvidas no grupo. A interação destes complexos com a transferrina, em suas formas apo e holo, e com a albumina foi avaliada por técnicas como espectroscopia eletrônica, dicroísmo circular, fluorescência, e realizaram-se estudos de ultrafiltração com análise do aduto formado por ICP-OES e espectrometria de massas. Além disso, fez-se um estudo de captação celular dos complexos RuFaines por células de glioma humano da linhagem U-87. Os resultados demonstraram que os complexos de dirutênio-Faines interagem com ambas as proteínas séricas (transferrina (apo e holo) e albumina), de modo semelhante, mas que é distinto daquele observado para o complexo RuAc. A presença de íons Fe(III) nos sítios específicos da transferrina não afetou a interação dos complexos RuFaines, enquanto que um comportamento diferente foi observado para o RuAc. Verificou-se que todas as proteínas avaliadas (albumina, apo-transferrina e holo-transferrina) apresentam capacidades similares de retenção dos complexos (~ 70% da quantidade de Ru adicionada inicialmente), independentemente da natureza do ligante carboxilato coordenado. Estudos de captação celular mostraram que a interação dos complexos RuFaines com a transferrina não contribuiu para modificar a capacidade de entrada desses complexos na célula, em comparação com os metalofármacos livres. Em alguns casos, inclusive, a formação de aduto com a apo-transferrina teve um efeito contrário, diminuindo a captação de rutênio. Dessa forma, concluiu-se que o ciclo da transferrina provavelmente não é a principal rota de entrada nas células para os complexos estudados. / Ruthenium metallodrugs have shown promising antitumor activity against to several tumor types. Our research group is dedicated to study compounds containing the mixed-valence Ru2(II,III) dimetallic center coordinated to NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatory drugs) derived ligands, and have demonstrated the potential of these complexes against glioma. The understanding of the mode of action of these complexes requires the study of their interactions with biomolecules present in biological environment. In this scenario, the present work aimed to investigate the interaction of three complexes of diruthenium-NSAIDs, or RuNSAIDs, [Ru2(ibp)4Cl], [Ru2(ceto)4Cl] and [Ru2(npx)4(H2O)2]PF6 (ibp = ibuprofenate, ceto = ketoprofenate, npx = naproxenate), and also of the precursor [Ru2(O2CCH3)4Cl], RuAc, with the major proteins present in the human serum, transferrin and albumin. The complexes were synthesized and characterized according to methods developed in our group. The interaction of these complexes with transferrin, in the two forms apo and holo, and with albumin was evaluated by techniques as electronic spectroscopy, circular dichroism, fluorescence, and ultrafiltration studies accompanied by analysis of adducts by ICP-OES and mass spectrometry. Moreover, cellular uptake studies of the RuNSAIDs complexes by U-87 human glioma cells line were performed. The results demonstrated that the diruthenium-NSAIDs complexes interact with both proteins (transferrin (apo and holo) and albumin), in a similar way, but that is distinct of that observed for the RuAc complex. The presence of Fe(III) ions in transferrin specific binding sites did not affect the interaction of the RuNSAID complexes with the protein, while a different behavior was shown by RuAc. All the proteins studied here (albumin, apo-transferrin and holo-transferrin) showed similar capabilities for retention of the complexes (~ 70 % of the initial amount of Ru added), independently of the nature of the coordinated carboxylate ligand. Cellular uptake studies showed that the interaction of the RuNSAIDs complexes with transferrin did not contribute to modify the internalization capacity of these complexes, in comparison with the free metallodrugs. In some cases, the adduct formation with apo-transferrin showed an opposite effect, leading to the decrease of ruthenium uptake. The findings led to the conclusion that transferrin cycle probably is not the main entry way to the cells for the studied complexes.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 418046.pdf: 4060677 bytes, checksum: 5a23c04f46b75d342b7b1205a3877568 (MD5) Previous issue date: 2009-10-27 / Introdu??o: s?ndrome metab?lica (SM) ? definida como um conjunto de anormalidades aterotromb?ticas e inflamat?rias. Seus portadores apresentam predisposi??o aumentada a morbi-mortalidade por doen?as cardiovasculares (DCV) e diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Diversos biomarcadores inflamat?rios, do metabolismo lip?dico, oxidativo e isqu?mico, ligados a fisiopatologia da SM t?m sido investigados. Recentes estudos sugerem que a albumina modificada pela isquemia (IMA) ? um biomarcador de isqu?mia e que seus n?veis elevados representam uma poss?vel indica??o de disfun??o microvascular em pacientes com SM. Objetivo: investigar a associa??o de marcadores lipidicos, oxidativos e inflamat?rios potencialmente associados a processos isqu?micos em pacientes com s?ndrome metab?lica. Material e m?todos: estudo prospectivo, do tipo caso-controle, onde foram inclu?dos 32 (30,2%) indiv?duos saud?veis (grupo controle C) e 74 (69,8%) indiv?duos com SM (grupo caso SM). Os indiv?duos com SM foram recrutados no ambulat?rio de risco cardiometab?lico do Servi?o de Cardiologia do Hospital S?o Lucas da Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul e os saud?veis foram recrutados na Universidade Federal de Santa Maria (UFSM - alunos, funcion?rios e professores). O crit?rio diagn?stico de SM utilizado foi o NCEP-ATPIII. Glicose, colesterol total (CT), HDL e triglicer?deos (TG) foram determinados por m?todo enzim?tico colorim?trico (Ortho-clinical Diagnostics); LDL foi determinada pela equa??o de Friedwald; Prote?na C ultra Sens?vel (PCR-us) foi determinada por nefelometria, autoanticorpo anti-LDL-oxidada (anti-OxLDL) e LDL oxidada (OxLDL) foram determinadas por ensaio imunoenzimatico (ELISA); IMA foi mensurada por ensaio colorim?trico com cobalto. Resultados: a amostra incluiu 34 homens e 72 mulheres. A m?dia de idade do grupo C foi 55,2?8,8 anos e do grupo SM 57,6?8,3 anos (p=0,142). O grupo SM apresentou maior IMC (32,6?6,1 kg/m2, p=0,0001), press?o arterial sist?lica (147?26,8 mmHg, p=0,001), press?o arterial diast?lica (85,9?15,9 mmHg, p=0,01), glicose (133,7?68,7 mg/dL, p=0,001), CT (204?58,1 mg/dL, p=0,001), LDL (114,4?49,5 mg/dL, p=0,001), TG (214,9?/34,8 mg/dL, p=0,001) em compara??o com o grupo C. N?veis de IMA, PCR-us, IL-6, OxLDL e anti-OxLDL foram significativamente mais elevados (0,618?0,1355, p=0,0001; 1,72?0,964, p=0,0001; 53,20?14,52, p=0,0001; 0,662?0,461, p=0,001; 27,822?17,010, p=0,001) respectivamente no grupo SM, em rela??o ao grupo C. A an?lise multivariada mostrou associa??o entre n?veis elevados de IMA e SM e esta foi independente de sexo, idade DM2 e hipercolesterolemia (p=0,0405). Conclus?o: no presente estudo, observou-se associa??o entre IMA, biomarcadores inflamat?rios, do metabolismo lip?dico e oxidativo com SM, indicando que esses indiv?duos portadores de SM est?o mais propensos a desencadearem processos aterotromb?ticos. Estudos adicionais envolvendo intera??es gen?ticas e ambientais em pacientes com SM podem contribuir para elucidarmos o potencial papel cl?nico da IMA, para que se torne um preditor de eventos aterotromb?ticos, com vistas ? diminui??o da morbi-mortalidade cardiovascular.

Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM

INTRODUÇÃO: a albumina sérica reduzida em pacientes em diálise peritoneal (DP) é associada à aterosclerose, causa de morte mais comum entre esses pacientes. Semelhantemente à síndrome nefrótica, supõe-se que a perda de proteínas conjuntamente a de fatores de regulação da hemostasia leva ao estímulo da síntese hepática de fatores pró-coagulantes, como o fibrinogênio, deslocando o equilíbrio hemostático em direção ao estado pró-trombótico. Pacientes em DP apresentam valores séricos elevados de marcadores da ativação endotelial e fatores pró-coagulantes, quando comparados a pacientes em hemodiálise (HD). A tromboelastografia (TEG) é um método que avalia propriedades do sangue global e dinâmica da coagulação, fornecendo, por meio de um traçado, valores absolutos do tempo de formação de fibrina (K), a agregação plaquetária (amplitude máxima - AM), a firmeza do coágulo (G), entre outros dados. Por final, classifica a coagulação em normal, hipocoagulante ou hipercoagulante segundo o índice de coagulação (IC) apresentado, sendo assim útil no diagnóstico precoce de coagulopatias. Por ser pouco utilizado em pacientes com DRC, utilizou-se o TEG na avaliação da hemostasia dos pacientes em diálise peritoneal automatizada (DPA) e investigou-se a relação com a perda de proteínas, bem como outras condições clínicas inerentes ao tratamento dialítico. MÉTODOS: este estudo foi do tipo transversal que incluiu pacientes estáveis em DPA. Foram obtidos dados demográficos, clínicos e bioquímicos de rotina do prontuário médico eletrônico. Adicionalmente, foram avaliados a coagulometria, a hemostasia primária [antitrombina (AT), proteína S, fator VIII (FVIII), fator IX (FIX), fator V (FV), fibrinogênio e dímero-D] e o TEG. Os pacientes foram submetidos ao teste de equilíbrio peritoneal (PET), a avaliação da perda de proteínas para a solução de diálise (PSD) e a absorção de glicose. O estado nutricional dos pacientes foi avaliado por meio de métodos objetivos e subjetivos. RESULTADOS: vinte pacientes (38±16 anos de idade, 55% mulheres, 22,4±14,8 meses em DPA, 40% de glomerulopatia, 70% transportadores médio lento/lento e em bom estado nutricional) foram incluídos no estudo. O FVIII e FIX elevados em 85% e 50% da amostra, respectivamente. O fibrinogênio (553,8±100,5 mg/dL) e o dímero-D (720 (520-1940) ug/L) foram elevados em mais da metade dos pacientes. O TEG revelou 55% dos pacientes hipercoagulantes, 45%, normais, e nenhum era hipocoagulante. Os pacientes hipercoagulantes foram caracterizados por um tempo K menor (1,3±0,4 vs. 1,8±0,3 minutos, p=0,007); AM (72,1±2,4 vs. 64,7±3,6 mm, p=0,000) e G (13,1±1,6 vs. 9,3±1,5 K, p= p=0,000) elevados, também alterados em 78% e 33%, respectivamente, nos pacientes com coagulação normal. Pacientes hipercoagulantes também apresentaram maiores valores de plaquetas (251±28 vs. 214±51 mil/mm³, p=0,038), que se correlacionou positivamente com AM/G (r=0,594, p=0,006), enquanto a proteína C foi menor (108±12 vs. 117±20 %, p=0,034) e a AT se correlacionou positivamente com o tempo K (r=0,635, p=0,011). Não houve diferença de albumina sérica, PSD, cinética de creatinina e estado nutricional entre os grupos normal e hipercoagulante. Os pacientes hipercoagulantes, entretanto, apresentaram menores valores de hemoglobina (10,3±1,4 g/dL vs. 12,0±1,1 g/dL; p=0,007), que se correlacionou negativamente com AM/G (r=-0,673, p=0,001), bem como o hematócrito (31±4 % vs. 36±3 %; p=0,010), que também se correlacionou negativamente com AM/G (r=-0,640; p=0,002). CONCLUSÃO: demonstramos que pacientes em DPA estáveis apresentaram uma tendência pró-trombótica caracterizada pela hiperfunção plaquetária e maior força de coágulo. Mesmo não havendo linearidade na relação com a hemostasia a perda de proteínas pode ter contribuído para a hipercoagulabilidade nesses pacientes. Entretanto, os eritrócitos reduzidos representaram um fator de confusão para o resultado do / INTRODUCTION: reduced serum albumin in patients on peritoneal dialysis (PD) is associated to atherosclerosis that is the leading cause of death. Similarly to nephrotic syndrome they lose protein; it is assumed that together with regulating factors of haemostasis this loss leads to liver synthesizes of procoagulants factors, such as fibrinogen, shifting the hemostatic equilibrium to a prothrombotic state. Patients on PD present elevated serum markers of endothelial activation and coagulant factors when compared with hemodialysis (HD) patients. Thromboelastography (TEG) is a method that evaluate blood properties through coagulation\'s global and dynamic perspectives, providing through a trace absolute values of fibrin\'s time formation (K), platelet aggregation (maximum amplitude - MA), clot strength (G), among other data. Finally it classifies the coagulation in normal, hypocoagulant or hypercoagulant according to the coagulation index (CI), so that it is useful in the early diagnosis of coagulopathies. TEG is not often used in patients with CKD, because of this we chose to use TEG for hemostatic evaluation in patients on APD and investigated its relation with protein loss as well as other clinical conditions intrinsic to the dialytic therapy. METHODS: this was a cross-sectional study that included stable patients on automated peritoneal dialysis (APD). Demographic, clinical and routine biochemical data were obtained from electronic medical chart. Additionally the coagulometry, primary hemostasis [antithrombin (AT), protein S, factor VIII (FVIII), factor IX (FIX), factor V (FV), fibrinogen and D-dimer] and TEG were evaluated. Patients were submitted to peritoneal equilibrium test (PET), protein loss to dialysis solution (PDS) and glucose absorption evaluations. Patients nutritional status was evaluated by objective and subjective methods. RESULTS: twenty patients (38±16 years old, 55% women, 22.4±14.8 months on APD, 40% of glomerulopathy, 70% slow average/slow transporters and well nourished) were included in this study. FVIII and FIX were elevated in 85% and 50% of the sample, respectively. Fibrinogen (553.8±100.5 mg/dL) and D-dimer (720 (520-1940) ug/L) were elevated in over half of the patients. TEG showed 55% of the patients hypercoagulant, 45% were normal and nobody was hypocoagulant. Hypercoagulant patients were characterized by a lower K-time (1.3±0.4 vs. 1.8±0.3 minutes; p=0.007); elevated MA (72.1±2.4 vs. 64.7±3.6 mm; p=0.000) and G (13.1±1.6 vs. 9.3±1.5 K; p= p=0.000); altered too in 78% and 33%, respectively, in normal coagulation patients. Hypercoagulant patients presented too higher values of platelet count (251±28 vs. 214±51 mil/mm³, p=0,038), but within the normal range, that correlated positively with MA/G (r=0.594; p=0.006) while protein C was lower (108±12 vs. 117±20 %; p=0,034) and AT correlated positively with K-time (r=0.635; p=0.011). There was no difference to serum albumin, PDS, creatinin kinetic and nutritional status between hypercoagulant and normal groups. However hypercoagulant patients presented lower values of hemoglobin (10.3±1.4 g/dL vs. 12.0±1.1 g/dL; p=0.007); that correlated negatively with MA/G (r=-0.673; p=0.001), as well as hematocrit (31±4 % vs. 36±3 %; p=0,010), which also correlated negatively with MA/G (r=-0.640; p=0.002). CONCLUSION: we demonstrated that stable patients on APD presented a prothrombotic tendency characterized by platelet hyperfuntion and clot strength. Even though there was no linearity in relation to hemostasis; protein loss may have contributed to the hypercoagulability in these patients. However reduced erythrocytes were a confounding factor in the TEG analysis

Bovine serum albumin (BSA) is the most abundant protein in plasma and it is responsible for the transport of most of the exogenous and endogenous compounds present in blood. Roxarsone (RX) and its metabolite acetarsone (AC) are organic compounds of arsenic(V) used in poultry as a food additive. In this sense, the interaction process of RX and AC compounds with BSA was evaluated under physiological conditions using spectroscopic techniques. It was possible to determine the formation of a supramolecular complex between RX and AC ligands using molecular fluorescence. The interaction degree was moderate, with a binding constant (Kb) of 4.27x105 L mol-1 and 0,27x105 L mol-1 for RX and AC, respectively. The quenching mechanism involved in the interaction process for both ligands was static and, preferably, by electrostatic interactions to the BSA-RX complex and hydrogen bonds and Van der Waals forces to BSA-AC. Both the formation of the complex and the quenching mechanism were confirmed by UV-vis spectroscopy. The 3D fluorescence analysis evidenced structural changes in the BSA polypeptide chain, being more pronounced in the presence of the RX ligand in comparison to AC. In addition, the BSA-RX interaction process modified the BSA surface, leading to reduction of hydrophobic regions more effectively compared to BSA-AC. About the binding site, both ligands are preferably in the site II of BSA. From the results obtained by 1H NMR, greater chemical shift was observed in the presence of the AC ligand, being the region close to amide group interacting with BSA, while the RX ligand possibly interacts more superficially in the protein. Thus, the RX and AC ligands do not favor the kinetics of protein fibrillation, giving indications that the possible deleterious effects in the evaluated in vitro system are not related to this process. Alkaline phosphatase inhibition kinetics demonstrated inhibition of enzymatic activity from 5 min and signal stabilization in 55 min of analysis for both RX and arsenate (positive control). Finally, the evaluation of in vitro alkaline phosphatase activity showed inhibition of enzymatic activity in 42% in the presence of the RX ligand and 5% in the AC ligand, giving indications of more detrimental effects for RX when compared to AC. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A albumina do soro bovino (BSA) é a proteína mais abundante do plasma e responsável pelo transporte da maioria dos compostos exógenos e endógenos presentes no sangue. Roxarsone (RX) e seu metabólito acetarsone (AC) são compostos orgânicos de arsênio(V) empregados na avicultura como aditivo alimentar. Neste sentido, o processo de interação dos compostos RX e AC com a BSA foi avaliado sob condições fisiológicas utilizando técnicas espectroscópicas. Empregando fluorescência molecular foi possível determinar a formação do complexo supramolecular para os ligantes RX e AC. O grau de interação foi moderado, com constante de ligação (Kb) de 4,27x105 L mol-1 e 0,27x105 L mol-1 para RX e AC, respectivamente. O tipo de quenching envolvido no processo de interação para ambos os ligantes foi estático e, preferencialmente, por interações de natureza eletrostática para o complexo BSA-RX e ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals para BSA-AC.Tanto a formação do complexo quanto o tipo de quenching foram confirmados por espectroscopia de UV-vis. A análise por fluorescência 3D evidenciou mudanças estruturais na cadeia polipeptídica da BSA, sendo mais pronunciadas na presença do ligante RX em comparação ao AC. Ademais, o processo de interação BSA-RX modificou a superfície da BSA, levando à redução de regiões hidrofóbicas de forma mais efetiva em comparação à BSA-AC. Com relação ao sítio de ligação, ambos os ligantes encontram-se preferencialmente no sítio II da BSA. A partir dos resultados obtidos por RMN 1H observou-se maior deslocamento químico na presença do ligante AC, estando a porção próxima ao grupamento amida interagindo com a BSA. Enquanto que o ligante RX possivelmente interage mais superficialmente na proteína. Além disso, os ligantes RX e AC não favorecem a cinética de fibrilação protéica, dando indícios que os possíveis efeitos deletérios no sistema in vitro avaliado não estão relacionados a este processo. A cinética de inibição da fostatase alcalina demonstrou inibição da atividade enzimática a partir de 5 min e estabilização do sinal em 55 min de análise tanto para o RX quanto para o arseniato (controle positivo). Por fim, a avaliação da inibição da atividade da fosfatase alcalina in vitro evidenciou inibição da atividade enzimática em 42% na presença do ligante RX e 5% para o ligante AC, dando indícios de efeitos mais prejudiciais para o RX quando comparado ao AC.