Orientadores: Pedro de Alcantara Pessoa Filho, Everson Alves Miranda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T14:49:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Watanabe_ErikaOhta_D.pdf: 2586256 bytes, checksum: af351628a929312bf64c37235f0a8f20 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A precipitação induzida pela adição de sais (¿salting-out¿) é uma operação unitária freqüentemente empregada na purificação de proteínas. Com a adição de sal, a solução aquosa de proteína separa-se em uma fase pobre e um precipitado rico em proteína, sendo este último efetivamente uma mistura da fase sólida formada (a que chamaremos precipitado verdadeiro) e da fase líquida pobre em proteína, já que uma separação completa das fases não pode ser alcançada. A obtenção de dados completos de equilíbrio de fases na precipitação de proteínas ainda é rara, embora a determinação dos diagramas de fase possa contribuir para a caracterização deste precipitado verdadeiro e para uma melhor compreensão do fenômeno de precipitação. Neste trabalho, o equilíbrio de fases da precipitação de lisozima e albumina de soro bovino (BSA) foi estudado através de ensaios de precipitação, nos quais as composições das fases coexistentes foram analisadas. Os ensaios de precipitação de lisozima foram conduzidos utilizando-se sulfato de amônio e sulfato de sódio a diferentes valores de pH (2,0, 4,0, 7,0 e 10,0) e cloreto de sódio a pH 7,0 e o sal volátil carbamato de amônio a 5,0, 15,0 e 25,0°C como agentes precipitantes. A BSA foi precipitada em sulfato de amônio a pH 2,0, 7,0 e 9,0. A composição do precipitado verdadeiro pode ser obtida através da intersecção de extrapolações das linhas de amarração determinadas experimentalmente, técnica de análise cuja utilização extensiva e sistemática foi realizada pela primeira vez neste trabalho. Os diagramas de fases, para o sistema contendo lisozima e sulfato de amônio e sulfato de sódio, mostraram dois tipos de precipitado verdadeiro: um composto de proteína-água e um complexo de proteína, água e sal. Diferentes valores de pH não influenciaram na composição do precipitado verdadeiro. Para os sistemas lisozima-sulfato de amônioágua a pH 7,0 e a 5,0 e 15,0°C, uma região de ¿salting-in¿ na curva de solubilidade pode ser observada. Duas fases correspondentes a diferentes precipitados foram obtidas para as regiões ¿salting-in¿ e ¿salting-out¿. Os sistemas lisozima-cloreto de sódio e lisozima-carbamato de amônio apresentaram um precipitado verdadeiro composto de proteína-água e apenas proteína, respectivamente. A atividade enzimática da lisozima mostrou-se dependente da concentração de sal, enquanto nenhuma desnaturação foi verificada para a lisozima precipitada em carbamato de amônio. Para o sistema contendo BSA, em cada valor de pH utilizado foi obtido um único precipitado verdadeiro cuja composição é dependente do pH / Abstract: Salt induced protein precipitation (¿salting-out¿) is a unit operation commonly used to protein purification. By adding a salt, an aqueous protein solution is forced to undergo a phase separation into a protein-lean liquid phase and a protein rich phase. Nevertheless, as a complete phase separation cannot be achieved, the protein rich phase is actually a mixture of the solid phase (herein called true precipitate) and the protein-lean liquid phase. The determination of equilibrium diagrams can contribute to the characterization of this true precipitate and to the understanding of the phenomena underlying this so widely used technique but, in spite of this, the experimental determination of phase equilibrium diagrams of protein precipitation is scarce. In this work, phase equilibrium of salt-induced precipitation of lysozyme and bovine serum albumin (BSA) was studied through precipitation assays, in which the compositions ofthe coexisting phases were analysed. Lysozyme precipitation experiments were carried out using ammonium sulfate and sodium sulfate at different values of pH (2.0, 4.0, 7.0 e 10.0) and sodium chloride at pH 7.0 and the volatile salt ammonium carbamate at 5.0, 15.0 and 25.0°C as precipitant agents. Precipitation of BSA was carried out in ammonium sulfate solution at pH 2.0, 7.0 and 9.0. The composition of the true precipitate phase was inferred by the intersection of the extensions of the experimentally determined tie-lines ¿ an analysis not previously carried out to such extent. Phase diagrams of lysozyme-ammonium sulfate and sodium sulfate-water showed two different types of precipitate: a salt-free protein-water phase and a proteinrich phase formed by lysozyme, water and salt. No significant difference was observed in the composition of the true precipitate when the pH value is changed. For systems formed by ammonium sulfate at pH 7.0 at 5.0 and 15.0°C, a salting-in region in the solubility curve was observed. Two different true precipitates were found, corresponding to the salting-in and salting-out regions. The systems lysozyme-sodium chloride and lysozyme-ammonium carbamate showed only one true precipitate composed by protein-water and protein, respectively. Lysozyme activity depends on the salt concentration used to protein precipitation, while no protein denaturation was verified in the lysozyme precipitated by ammonium carbamate. Phase diagrams of BSA-salt-water showed only one true precipitate, whose composition depends on the pH studied. / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

Os compostos de coordenação de rutênio têm recebido grande atenção para tratamento do câncer. Em particular, estudos do grupo mostraram que um metalofármaco de dirutênio(II,III) com o fármaco anti-inflamatório não-esteróide ibuprofeno apresenta boa atividade para tumor cerebral maligno. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo ampliar os estudos com a obtenção de novos complexos, investigar as interações dos metalofármacos com moléculas de interesse biológico e preparar materiais híbridos destes com ciclodextrina. Desenvolveu-se metodologia sintética para a preparação de dois novos metalofármacos de dirutênio(II,III) de fórmula geral [Ru2(O2CR)4Cl], em que O2CR = cetoprofenato (cet) ou fenbufenato, a partir do precursor [Ru2(O2CH3)4Cl]. Os novos complexos foram caracterizados principalmente por meio de técnicas espectroscópicas, difratometria de raios x e análise térmica. Estudos de reatividade foram realizados para a espécie [Ru2(O2CH3)4(H2O)2]+, obtida a partir do precursor [Ru2(O2CH3)4Cl] em solução aquosa. Constantes de equilíbrio e parâmetros termodinâmicos para as reações de substituição axial água-cloreto, e também parâmetros cinéticos das reações deste complexo com os aminoácidos glicina, triptofano, cisteína e histidina, e com os agentes redutores glutationa e ácido ascórbico, foram determinados. Estudos sobre as interações com a proteína albumina do soro humano (HSA) foram efetuados para os complexos [Ru2(O2CH3)4Cl] e [Ru2(cet)4Cl], e também para o derivado análogo de ibuprofenato (ibp), [Ru2(ibp)4Cl]. Novos materiais híbridos contendo os complexos [Ru2(O2CR)4Cl] (O2CR = ibuprofenato ou cetoprofenato) e hidroxipropil-β-ciclodextrina foram obtidos, usando-se a técnica de spray-drying, e caracterizados. / Ruthenium compounds have received great attention for cancer therapy. In particular, studies from our research group have found that a metallodrug of diruthenium(II,III) with the non-steroidal anti-inflammatory drug ibuprofen, has good activity for malignant brain tumor. In this context, the main purposes of this work were to improve these studies, to investigate some interactions of these metallodrugs with biologically relevant molecules, and also to prepare hybrid materials of these complexes with cyclodextrin. Synthetic methodologies were developed to prepare two novel diruthenium(II,III) metallodrugs, with the general formula [Ru2(O2CR)4Cl], where O2CR = ketoprofen (ket) or fenbufen starting from the precursor [Ru2(O2CH3)4Cl]. The novel complexes were characterized mainly by spectroscopical techniques, X-rays difractometry and termal analysis. Reactivity studies were performed for the species [Ru2(O2CH3)4(H2O)2]+ obtained from the precursor [Ru2(O2CH3)4Cl] in aqueous solution. Equilibrium constants and thermodynamic parameters for water-chloride axial substitutions, and also kinetic parameters for the reactions of this complex with the amino acids glycine, tryptophan, cysteine and histidine, and the reducing agents glutathione and ascorbic acid, were determined. Studies on the interactions with the human serum albumin (HSA) protein were performed for the complexes [Ru2(O2CH3)4Cl] and [Ru2(ket)4Cl], and also for the analogue derivative of the ibuprofen drug (ibp), [Ru2(ibp)4Cl]. Novel hybrid materials containing complexes [Ru2(O2CR)4Cl] (O2CR = ibuprofenato or ketoprofenato) and β-hydroxypropyl-cyclodextrin were prepared by using spray-drying technique and characterized.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-06-06T12:34:21Z No. of bitstreams: 1 2010 - Alessandra Medeiros Ribeiro .pdf: 4846590 bytes, checksum: 525d2754e1be01d1117fe6e9f3362d1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T12:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Alessandra Medeiros Ribeiro .pdf: 4846590 bytes, checksum: 525d2754e1be01d1117fe6e9f3362d1f (MD5) Previous issue date: 2010-03-19 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior, CAPES, Brasil. / Spectroscopic studies for several comercial flavonoids (flavone (FVA), alphanaphthoflavone (?-NAF), beta-naphthoflavone (?-NAF), thioflavone (TFA), S,Sdioxythioflavone (SDF), flavanone (FNA) and quercetin (QUE)), natural flavonoids (biflavonoids such as agatisflavone (ATF), 7?-O-methylagatisflavone (OMA), amentoflavone (AMF) and (DOF)) and thiochromanone (TCR) were performed in different solvents (acetonitrile (ACN), ethanol (ETOH), cyclohexane (CEX), dichloromethane (DCM) and milli-Q water (AD)). Irradiation of TFA, SDF and TCR in acetonitrile, employing the nanosecond laser flash photolysis, lead to the formation of their corresponding triplet excited state. Fluorescence emission spectroscopy studies showed that commercial and natural flavonoids and thiochromanone are not fluorescent. UV/visible spectroscopy studies for QUE, ATF, OMA, AMF and DOF, in the same previous solvents, revealed that for these flavonoids the ground-state absorption spectrum in polar solvents, such as water or PBS (pH=7.4), is completely different than the obtained in dichloromethane. This difference is more pronounced for ATF. For DOF the absorption spectrum in water shows remarkable variations when compared to that in PBS. The interaction between BSA and the flavonoids QUE, ATF, OMA, AMF and DOF in PBS solution, pH = 7.4, was studied by UV/visible spectroscopy, fluorescence emission spectroscopy, circular dicroism and molecular modelling. From these studies it was clearly demonstrated that the interaction observed was directly dependent on the flavonoid concentration and almost independent on temperature variation. The ground state absorption spectrum for BSA showed a hypsochromic effect on the absorption band around 208 nm, corresponding to the n?* transition of the BSA ?-helix structure, as a function of flavonoid concentration. Similar behavior was observed for the absorption at 280 nm, corresponding to the tryptophan absorption in BSA. The fluorescence emission spectrum for BSA in the presence of QUE, ATF, OMA, AMF and DOF, in PBS, at T = 22?C, 27?C, 32?C, 37?C and 42?C, shows a blue-shift on the protein emission as a function of flavonoid concentration. These results suggest that the BSA chromophore is in a more hydrophobic environment when compared with that sensed by the protein in the absence of the flavonoid. In this case, quenching of BSA fluorescence (tryptophan residues) was clearly observed with the high values obtained for the quenching rate constant kq (? 1013 to 1014 L/mol.s) indicating a static quenching process. The distance (r) observed for the tryptophan residues and the flavonoids was smaller than 7 nm, which indicates that there is a reasonable probability for a non-radiative energy transfer process between tryptophan and the flavonoids, based on the F?rster theory for energy transfer. Circular dicroism results at T = 25?C, 37?C and 42?C revealed a significant decrease on the ?-helix percentage for BSA at 208 nm and 222 nm, corresponding to the n?* transition for the secondary structure of BSA, as a function of flavonoid concentration. These effects can be attributed to the formation of a complex BSA/flavonoid which can induce conformational variations on the BSA structure. Molecular modelling indicates that the main regions for the interaction between flavonoids and ASB are located in hydrophobic cavities on the sub-domains IB and IIA, which contain tryptophan residues (Trp-158 and Trp-237). A large hydrophobic cavity containing the Trp-237 is present in the sub-domain IIA, which is responsible for the formation of the complex flavonoid-BSA through a strong interaction flavonoid-tryptophan. / Estudos espectrosc?picos para diversos flavon?ides comerciais (flavona (FVA), alfanaftoflavona (?-NAF), beta-naftoflavona (?-NAF), tioflavona (TFA), S,S-di?xidotioflavona (SDF), flavanona (FNA) e quercetina (QUE)), flavon?ides naturais (biflavon?ides como agatisflavona (ATF), 7?-O-metilagatisflavona (OMA), amentoflavona (AMF) e diidroochnaflavona (DOF)) e tiocromanona (TCR), foram realizados em diferentes solventes (acetonitrila (ACN), etanol (ETOH), cicloexano (CEX), diclorometano (DCM) e ?gua millliQ (AD)). A irradia??o de TFA, SDF e TCR, em acetonitrila, por fot?lise por pulso de laser de nanossegundo, levou ? forma??o de seus respectivos estados excitados triplete. Por espectroscopia de fluoresc?ncia, verificou-se que os flavon?ides comerciais e naturais, e a tiocromanona n?o apresentam emiss?o de fluoresc?ncia. Por espectroscopia de absor??o no ultravioleta/vis?vel (UV-Vis) para QUE, ATF, OMA, AMF e DOF, nestes solventes, percebeu-se que os espectros em presen?a de solventes polares, como AD, foram bem diferentes dos espectros em DCM, principalmente, para ATF, e os espectros em solu??o de tamp?o PBS (pH = 7,4) foram semelhantes aos em AD, exceto para DOF, apresentando mudan?as substanciais. A intera??o entre ASB e os flavon?ides (QUE, ATF, OMA, AMF e DOF) em solu??o tamponada (PBS, pH = 7,4) foi estudada por espectroscopia no ultravioleta/vis?vel, espectroscopia de emiss?o de fluoresc?ncia, dicro?smo circular e modelagem molecular sendo diretamente dependente da concentra??o adicionada de flavon?ides e muito pouco dependente com a varia??o da temperatura. No UV-Vis ocorreu deslocamento para o azul das bandas de absor??o pr?ximas a 208 nm (correspondente a ASB, referente ?s transi??es n?* da estrutura ?-h?lice da albumina) e 280 nm (correspondente ao triptofano da ASB), em fun??o do aumento de concentra??o dos flavon?ides. Na espectroscopia de fluoresc?ncia (T = 22?C, 27?C, 32?C, 37?C e 42?C) houve deslocamento para o azul na emiss?o da prote?na com o aumento da concentra??o dos flavon?ides, sugerindo que o crom?foro da ASB est? em um ambiente mais hidrof?bico em rela??o ?quele quando para ASB livre. Neste caso, observou-se supress?o da fluoresc?ncia de ASB (res?duos de triptofano), como consequ?ncia de um processo de supress?o est?tica como demonstrado pelos altos valores observados para kq (? 1013 a 1014 L/mol.s). A dist?ncia entre os res?duos de triptofano e os flavon?ides (r) foi menor que 7 nm, um indicativo da grande probabilidade de ocorrer transfer?ncia de energia entre ASB e flavon?ides, de acordo com a teoria de transfer?ncia de energia n?o-radiativa de F?rster (Teoria de F?rster). No dicro?smo circular (T = 25?C, 37?C e 42?C) foi verificada uma diminui??o do % de ?-h?lice da ASB em 208 nm e 222 nm (regi?es de transi??o n?* da estrutura secund?ria ?-h?lice da ASB no espectro de absor??o UV), devido ao aumento de concentra??o dos flavon?ides. Esses efeitos podem ser atribu?dos ? forma??o de um complexo flavon?ide-ASB que pode estar induzindo varia??es conformacionais na ASB. Por modelagem molecular, atrav?s do programa docking, percebeuse que as regi?es principais para a liga??o dos flavon?ides com os s?tios de liga??o da ASB est?o localizadas em cavidades hidrof?bicas nos subdom?nios IB e IIA (consistentes com os s?tios I e II) e os res?duos de triptofano (Trp-158 e Trp-237) de ASB est?o nesses subdom?nios, respectivamente. Existe uma grande cavidade hidrof?bica presente no subdom?nio IIA, onde os flavon?ides podem se ligar com o res?duo de triptofano Trp-237 (melhor s?tio de liga??o), formando o complexo flavon?ide-ASB.

Produtos de glicação avançada (AGE) são prevalentes no diabete melito e alteram o metabolismo de lípides e lipoproteínas. Neste estudo, avaliou-se a influência da albumina, isolada do soro de indivíduos controles (C, n =12) e de portadores de diabete melito tipo 1 (DM 1, n=13) e tipo 2 (DM 2, n=11), com controle glicêmico inadequado, sobre a remoção de colesterol de macrófagos, o acúmulo intracelular de lípides, o conteúdo do receptor de HDL, ABCA-1 e a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL. Além disso, foi determinada a expressão diferencial de genes em macrófagos tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2. A concentração plasmática de albumina glicada foi superior no grupo DM 1 e DM 2 em relação ao C e correlacionou-se positivamente com glicemia, hemoglobina glicada e frutosamina. Albumina sérica foi isolada por cromatografia para separação rápida de proteínas e purificada por extração alcoólica. Albumina DM 1 e DM 2 apresentaram maior conteúdo de carboximetil-lisina e apo A-I quando comparada à albumina C. Macrófagos enriquecidos com LDL acetilada e 14C-colesterol foram tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2 e, a seguir, incubados na presença ou ausência de apo A-I, HDL3 ou HDL2 para determinação do efluxo de colesterol. Apesar de removerem maior quantidade de colesterol celular, as albumina DM 1 e DM 2 reduziram o efluxo de colesterol mediado por apo A-I (70% e 45%, respectivamente) e HDL2 (55% e 54%, respectivamente) em comparação à albumina C. Com HDL3, a queda no efluxo de colesterol só foi observada em macrófagos expostos à albumina DM 2 (55%). Macrófagos incubados apenas com albumina C, DM 1 ou DM 2 apresentaram conteúdo lipídico semelhante, evidenciado por coloração com Oil Red O. A adição de apo A-I, HDL3 ou HDL2 reduziu o conteúdo lipídico apenas nas células tratadas com albumina C, mas não com albumina DM 1 ou DM 2. A expressão de ABCA-1 foi diminuída 82% e 25% em macrófagos expostos, respectivamente, à albumina DM 1 e DM 2, em comparação às células tratadas com albumina C. As albuminas DM 1 e DM 2 reduziram a captação de 3H colesteril oleoil éter de HDL por células que superexpressam o receptor SR-BI. Estes resultados também foram obtidos com albumina humana modificada in vitro por glicação avançada. As albuminas isoladas dos pacientes diabéticos aumentaram a expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificadas e de proteínas que modulam vias da homeostase do colesterol. Os resultados deste estudo evidenciaram que a modificação in vivo da albumina por glicação avançada prejudica o transporte reverso de colesterol no diabete melito, por reduzir a expressão de ABCA-1 e a remoção de colesterol de macrófagos, bem como a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL pelo SR-BI. Independentemente de variação na concentração e composição de HDL, a glicação da albumina pode contribuir para o acúmulo de lípides em macrófagos e gênese da aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products are prevalent in diabetes mellitus and alter lipids and lipoprotein metabolism. In this study we analyzed the role of albumin, isolated from control individuals (C, n = 12) and uncontrolled type 1 (DM 1, n = 13) and type 2 (DM 2, n = 11) diabetes mellitus patients on macrophage cholesterol removal, intracellular lipid accumulation, expression of the HDL receptor protein level, ABCA-1and the uptake of esterified cholesterol from HDL. It was also investigated the differential gene expression in macrophages treated with C, DM 1 or DM 2 albumin. Glycated albumin was higher in DM 1 and DM 2 groups as compared to C and was positivetly correlated with glycemia, glycated hemoglobin and fructosamine. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and alchoolic extraction. DM 1 and DM 2 albumin presented a higher amount of carboxymethyllysine and apo A-I as compared to C albumin. In order to determine cholesterol efflux acetylated LDL and 14C-cholesterol enriched J- 774 macrophages were treated with C, DM 1 or DM 2 albumin and then incubated in the absence or presence of apo A-I, HDL3 or HDL2. Although presenting a higher ability to remove cell cholesterol by itself, DM 1 and DM 2 albumin reduced cholesterol efflux mediated by apo A-I (70% e 45%, respectively) and by HDL2 (55% e 54%, respectively) as compared to C albumin. With HDL3 the reduction of the cholesterol efflux was only observed in macrophages treated with DM 2 albumin (55%) in comparison to C albumin. Macrophages incubated with C, DM 1 or DM 2 albumin alone presented similar amount of intracellular lipids as assessed by Oil Red O staining. The addition of apo A-I, HDL3 or HDL2 reduced the lipid content in cells treated with C albumin, but not in those exposed to DM 1 or DM 2 albumin. The expression of ABCA-1 was reduced 82% and 25% in macrophages treated, respectively, with DM 1 or DM 2 albumin, in comparison to C albumin. DM 1 and DM 2 albumin reduced the uptake of 3H colesteril oleoyl ether from HDL by SR-BI overexpressing cells. These findings also were obtained when cells were treated in vitro with human serum albumin submitted to advanced glycation. DM 1 and DM 2 albumin enhanced the expression of receptors involved in the uptake of modified LDL and cholesterol homeostasis. Our findings showed that the advanced glycation of albumin that takes place in diabetes mellitus impairs the reverse cholesterol transport efficiency by reducing the ABCA-1 expression and cholesterol exportation to HDL and also by diminishing the uptake of esterified cholesterol from HDL. Independently of changes in HDL composition and concentration, advanced glycated albumin contributes to cholesterol accumulation in macrophages and atherogenesis in diabetes mellitus

Orientadores: Luis Antonio Violin Dias Pereira, Lúcia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:05:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbieri_MainaraFerreira_M.pdf: 6077469 bytes, checksum: c80011c6f6fca680e92ac99691a9c348 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A origem da albumina nos órgãos do trato reprodutor masculino tem sido questionada ao longo dos anos sendo sua presença tecidual constantemente atribuída a um mecanismo de extravasamento do plasma sanguíneo para o espaço extravascular intersticial, atribuindo-se ao fígado o papel de sítio de síntese desta proteína no período pós-natal. O padrão de distribuição da proteína albumina nos tecidos epiteliais de órgãos do trato reprodutor masculino reserva questionamentos quanto à veracidade de seu alcance luminal pelo rompimento de suas barreiras hematoteciduais. Carreador de esteroides; estimulador de células de Leydig; mediador do mecanismo parácrino de comunicação entre células de Sertoli e germinativas; promotor de proliferação celular e mediador de mudanças estruturais em membranas celulares, com suposta participação na reação acrossômica e capacitação do espermatozoide são possíveis papéis atribuídos à albumina no trato reprodutor masculino. A associação da proteína albumina a componentes glicídicos não é usual para mamíferos, porém há respaldo a essa hipótese através das PES (glicoproteínas pré-albumínicas epidídimo-específicas de ovinos) e dados de nosso grupo de pesquisa através do epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal (Amc) TRA 54 (testicular germ cells immunized to rat). Essa dissertação de mestrado retoma a polêmica discussão centrada na presença, origem, localização e função da albumina no trato reprodutor masculino e se propôs, através de uma abordagem cronológica pós-natal (períodos neonatal, pré-púbere, púbere, adulto e idoso) a rediscutir os fundamentos teóricos associados à principal proteína sérica de mamíferos bem como o dúbio perfil de expressão dessa proteína em Ratos analbuminêmicos Nagase (NAR). Nesse estudo, a presença da proteína albumina foi evidenciada por immunoblotting em todos os grupos e períodos do desenvolvimento pós-natal, apresentando padrão distinto de bandeamento para testículos e epidídimos NAR. A localização celular da proteína albumina foi identificada em camundongos, por imunohistoquímica, principalmente no tecido intersticial e nas células da linhagem germinativa. Testículos de ratos Sprague Dawley adultos apresentaram marcação adicional para células de Sertoli. Testículos e epidídimos de NAR mantiveram reatividade intersticial, sugerindo, ainda que em níveis extremamente baixos, a expressão de albumina. Para epidídimos, foi identificado amplo espectro de perfis de imunomarcação das células epiteliais e estereocílios. Ductos deferentes apresentaram, na região proximal ao epidídimo, imunomarcação citoplasmática e, na região distal, marcação de estereocílios e espermatozoides luminais. Perfis de imunomarcação citoplasmática também foram observados em vesícula seminal, próstata e uretra peniana, principalmente, no período adulto. Por fim, a presença de transcritos de RNAm detectados por ensaios de RT PCR (reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa) para testículos e epidídimos foi confirmada desde o período neonatal até idoso, mostrando-se também presente para ducto deferente a partir da puberdade. A abordagem do desenvolvimento pós-natal revelou um pico de maior expressão da albumina no período adulto com início do declínio registrado no período idoso. Como ressalva final, a confirmação da presença de RNAm para órgãos do trato reprodutor masculino não invalida a hipótese da também presença de albumina circulante, sintetizada, em primeira instância, pelas células hepáticas / Abstract: The origin of the albumin in the male reproductive tract has been questioned over the years and their presence tissue constantly assigned to a mechanism for extravasation of plasma into the interstitial extravascular space, assigning the role of the liver as the site of synthesis of this protein in the postnatal period. The distribution pattern of the albumin protein in the epithelial tissues of organs of the male reproductive tract reserves inquiries as to the veracity of their luminal reach through the disruption of their tissue blood-barriers. Carrier steroids; stimulator of Leydig cells; mediator of paracrine mechanism of communication between Sertoli and germ cells; promoter of cell proliferation and mediator of structural changes in cell membranes, with alleged involvement in the acrosome reaction and capacitation of sperm are possible roles of albumin in the male reproductive tract. The association of the albumin protein to glycidyl components is unusual for mammals, but there is support to this hypothesis by the PES (prealbumins epididymis-specific glycoproteins of sheep) and data from our research group through the epitope recognized by the monoclonal antibody (mAb) TRA 54 (testicular germ cells immunized to rat). This dissertation takes up the controversial discussion centered on the presence, source, location and function of albumin in the male reproductive tract and proposed, through a chronological postnatal approach (neonatal, prepubertal, puberal, adult and elderly periods) to revisit the theoretical foundations associated with major serum protein of mammals as well as the dubious expression profile of this protein in Nagase analbuminemic rats (NAR). In this study, the presence of albumin protein was detected by immunoblotting in all groups and periods of postnatal development, with distinct banding pattern in testis and epididymis of NAR. The cellular localization of the albumin protein has been identified in mice by immunohistochemistry mainly in the interstitial tissue and in germline cells. Testes of Sprague Dawley rats showed additional labeling of Sertoli cells. Testes and epididymides of NAR maintained interstitial reactivity, suggesting the expression of albumin even at extremely low levels. To epididymis a broad spectrum of immunostaining of epithelial cells and stereocilia profiles were identified. Vas deferens showed cytoplasmic immunostaining in the region proximal to epididymis, and in the distal region, stereocilia and luminal spermatozoa labeling. Cytoplasmic immunostaining profiles were also observed in the seminal vesicle, prostate and penile urethra, especially in adult period. Finally, the presence of mRNA transcripts detected by RT PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) assays to testis and epididymis was confirmed from neonates to the elderly, being also present in vas deferens from puberty. The approach of postnatal development revealed a peak with the highest expression of albumin in the adult period beginning to decline at elderly. As a final caveat, the presence of mRNA confirmed for organs of the male reproductive tract does not invalidate the hypothesis of the also presence of circulating albumin in reproductive tissue, which must be synthesized at first instance, by liver cells / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The advanced oxidation protein products (AOPPs) are a new class of compounds identified as markers of oxidative damage to proteins. The physiology role of these products is not limited to assess the oxidative stress, and these products may actively participate in the inflammatory process, promoting different cell disorders, including induction of apoptosis and alterations in the processes of cell proliferation and differentiation. Myeloperoxidase (MPO)-derived hypochlorous acid (HOCl) produced by activated neutrophils contribute significantly to AOPP formation, and human serum albumin (HSA) is considered the main protein responsible for the generation of AOPPs However, the molecular composition of AOPPs is unclear. Additional pathways and protein targets for AOPP formation are largely unknown. The aim of this study was to induce the formation of AOPPs in vitro through Fenton reaction and to investigate whether this generation could be counteracted by N-acetylcysteine (NAC) and fructose-1,6-bisphosphate (FBP). In addition, this study aimed to examine whether AOPPs produced by Fenton reaction may induce the activation of the gene transcription of inflammatory molecules, including the nuclear factor-κB (NF-κB), cyclooxygenase-2 (COX-2) and interleukin-6 (IL-6) in human embryonic kidney cells (HEK 293). Additionally, it was investigated the collagen as a potential source of AOPPs via its exposure to HOCl. The HOCl-modified collagen stimulated the production of oxidants, such as HOCl and superoxide anion radical (O2 -), and pro-inflammatory agents, such as nitric oxide (NO) and AOPPs in human neutrophil. Furthermore, HOCl-modified collagen induced a decrease in cell viability and an increase of apoptosis in these cells. Finally, alpha-tocopherol inhibited the release of oxidants, decreased cell viability and apoptosis, suggesting a therapeutic potential means to prevent deleterious effects caused by AOPPs. Furthermore, these findings indicate that alternative pathways can form AOPPs, and these new products may contribute to the pathogenesis of several clinical conditions related to the accumulation of AOPPs. / Os produtos proteicos de oxidação avançada (AOPPs) são uma nova classe de compostos formados em consequência do estresse oxidativo e considerados biomarcadores úteis na detecção de dano oxidativo proteico. No entanto, o papel desses produtos não se limita apenas a refletir o grau oxidativo de proteínas, mas também podem participar de forma ativa no processo inflamatório, promovendo diferentes perturbações celulares, incluindo a indução de apoptose e alterações nos processos de proliferação e diferenciação celular. O principal mecanismo de formação dos AOPPs é através do ácido hipocloroso (HOCl) produzido pela enzima mieloperoxidase (MPO), sendo a albumina, a principal fonte proteica para a formação desses produtos. No entanto, a via MPO/HOCl parece não ser a única responsável pela formação de AOPPs, e uma série de estudos indicam que há vias alternativas que podem contribuir para formação de AOPPs. Outro fator importante, que também não está totalmente esclarecido, é se a albumina é a única proteína suscetível a formação dos AOPPs, uma vez que a composição molecular desses produtos ainda não está totalmente definida. Além dessas questões, é de interesse avaliar se os AOPPs formados por outra via mantém as características pró-infamatórias e pró-apoptóticas dos AOPPs originados pela via MPO/HOCl. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar se a reação de Fenton, importante geradora de radicais hidroxilas (OH ), é uma potencial via de formação de AOPPs, bem como se o colágeno, principal proteína da matriz extracelular, é uma proteína suscetível a formação desses produtos. Em um primeiro momento, foi demonstrado que a reação de Fenton induziu a formação de AOPPs e esse processo foi inibido por agentes antioxidantes, como N-acetilcisteína (NAC) e frutose-1,6-bisfosfato (FBP). Além disso, os AOPPs gerados através da reação de Fenton induziram um aumento da transcrição gênica de agentes envolvidos no processo inflamatório, incluindo o fator de transcrição κB (NF-κB), a cicloxigenase-2 (COX-2) e a interleucina-6 (IL-6), em células renais embrionárias (HEK 293) através de ensaio de transfecção celular e atividade da Luciferase. Outro importante achado deste estudo foi demonstrar que o colágeno exposto ao HOCl também é uma fonte proteica para a formação de AOPPs. Os AOPPs formados a partir do colágeno estimularam a produção de oxidantes, como o HOCl e radical ânion superóxido (O2 -), e de agentes inflamatórios, como óxido nítrico (NO) e AOPPs, em neutrófilos humanos isolados. Além disso, os AOPPs derivados do colágeno induziram uma diminuição da viabilidade celular e um aumento do processo apoptótico nessas células. Por fim, o alfa-tocoferol inibiu a liberação de oxidantes, preveniu a diminuição da viabilidade celular e o aumento do processo apoptótico, sugerindo que esse composto pode ser uma potencial ferramenta terapêutica para prevenir os efeitos deletérios promovidos pelos AOPPs. Do mesmo modo, esses achados indicam que os AOPPs podem ser formados por vias alternativas, e esses novos produtos podem contribuir na fisiopatogênese de diversas condições clínicas relacionadas com o acúmulo de AOPPs.

The aim of this study was to assess the dissociation between the presence of cardiovascular risk factors, and the lack of premature atherosclerosis and left venticular hipertrophy (LVH) in isolated GH deficiency (IGHD) due to a mutation in the GH releasing hormone receptor gene. A two step protocol was performed. In the first experiment, serum adiponectin and leptin, and urinary albumin excretion (UAE) were studied in 20 IGHD individuals (7 M/ 13 F; 50,8 ± 14,6 years) and 22 control subjects (C) (8 M/ 14 F; 49,9 ± 11.5 years). IGHD subjects in comparison to C presents high adiponectin levels (p= 0,041) whereas leptin and UAE were similar. In the second experiment, oral glucose tolerance test (1,75 g/Kg in IGHD and 75 g in C) with glucose and insulin mesuarements at 0, 30, 60, 90, 120 e 180 minutes was performed in 24 IGHD subjects (12 M/ 12 F; 39,25 ± 11,73 years) and 25 C subjects (14 M/ 11 F; 39,96 ± 12,49 years). Insulin sensitivity (IS) was assessed by HOMAir, lower values, higher IS; QUICKI, OGIS 2 and OGIS, higher values, higher IS (for the three parameters). Beta cell function was assayed by HOMA-beta, insulinogenic index and area under the curve of the relation between insulin and glucose (AUC I/G). ANOVA indicated glucose response was higher (p<0,0001) and insulin response presented a trend of reduction (p=0,08) in the IGHD gruop. The number of pacients with glucose intolerance was higher (p= 0,001) in the IGHD group. HOMAir was lower (p= 0,041), QUICKI and OGIS 2 showed a trend of elevation (p= 0,066 and p= 0,09, respectively) in the IGHD subjects, whereas OGIS 3 showed no difference between both groups. IGDH presented reduction in HOMA-beta (p= 0,015), insulinogenic index (p<0,0001) and AUC I/G (p=0,02). These different adipokine profile with high adiponectin and normal leptin levels, linked to normal insulin sentitivity may delay vascular damage, LVH and lesions of the renal endothelium (normal UAE). Normal IS and reduced beta cell function featured this IGDH model. / O objetivo deste trabalho foi aprofundar a avaliação da dissociação entre a presença de marcadores de risco cardiovascular (CV) e a ausência de doença CV (DCV) na deficiência isolada do GH (DIGH) por mutação no gene do receptor do hormônio liberador do GH. Foi realizado um protocolo com duas etapas. No primeiro experimento, foram avaliados os níveis séricos de adiponectina e leptina e a excreção urinária de albumina (EUA) em 20 indivíduos com DIGH (7 M/ 13 F; 50,8 ± 14,6 anos) e 22 controles (C) (8 M/ 14 F; 49,9 ± 11.5 anos). Os indivíduos com DIGH em comparação a C apresentaram adiponectina mais elevada (p= 0,041) sem alteração nos níveis de leptina e EUA. No segundo experimento, foi realizado teste de tolerância à glicose oral de glicose (1,75 g/kg no DIGH e 75 g no C) com dosagens de glicose e insulina nos tempos 0, 30, 60, 90, 120 e 180 minutos em 24 indivíduos DIGH (12 M/ 12 F; 39,25 ± 11,73 anos) e 25 C (14 M/ 11 F; 39,96 ± 12,49 anos). A sensibilidade à insulina (SI) foi avaliada pelo HOMAir, onde menores valores, indicam maior SI; e pelos QUICKI, OGIS 2 e OGIS 3, onde maiores valores, indicam maior SI. A função da célula beta foi avaliada pelo HOMA-beta, índice insulinogênico e área sobre a curva da razão insulina/ glicose (ASC I/G). ANOVA indicou que a resposta glicêmica (p< 0,0001) foi maior e a insulinêmica apresentou uma tendência de redução (p= 0,08) no grupo DIGH. O número de pacientes com intolerância à glicose foi maior (p= 0,001) no grupo DIGH. HOMAir foi mais baixo (p= 0,031), e QUICK e OGIS 2 apresentaram uma tendência de elevação (p= 0,066 e p= 0,09, respectivamente) no grupo DIGH, enquanto o OGIS 3 foi semelhante nos dois grupos. DIGH apresentou HOMA-beta (p= 0,015), índice insulinogênico (p< 0,0001) e ASC I/G (p= 0,02) menores. O perfil de adipocinas caracterizado por adiponectina elevada e leptina normal, associado à SI normal pode retardar DCV e disfunção endotelial (EUA normal). SI normal e menor função da célula beta caracterizam este modelo de DIGH.

Novos sistemas biocompatíveis para aplicações biotecnológicas são relevantes não só do ponto de vista tecnológico, mas também para avanços científicos. A presente dissertação visou à criação e caracterização de filmes finos (espessura de até 100 nm) ou micrométricos (espessura de 50 &#181;m a 100 &#181;m) formados por goma xantana (GXT), poli(cloreto de dimetil dialil amônio), (PDDA), albumina bovina sérica (BSA), e nanopartículas de magnetita (NPM). A incorporação de amoxicilina (Amox), um antibiótico amplamente utilizado contra muitas infecções, nos filmes foi realizada durante a formação dos sistemas. Os filmes finos foram caracterizados através de elipsometria e microscopia de força atômica. Em solução, as interações favoráveis entre o Amox e a BSA foram evidenciadas por mudanças substanciais na estrutura secundária da BSA, como revelado pelo dicroísmo circular. Os filmes micrométricos (patches) de GXT e GXT/NPM/BSA foram imersos em Amox 2 g/L, levando a incorporação de 10 ± 3 e 17 ± 4 &#181;g/cm³ de Amox, respectivamente. Sua caracterização compreendeu espectroscopia vibracional no infravermelho por transformada de Fourier no modo de refletância total atenuada (FTIR-ATR), microscopia eletrônica de varredura (MEV), medidas de sorção e espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES). A incorporação de 0,2% em massa de Fe3O4 nos \"patches\" e sua exposição a um campo magnético externo, viabilizou a liberação total in vitro de Amox, em pH 5,5 e em 0,02 mol/L de NaCl, seguindo o comportamento quasi-Fickiano. A difusão da Amox dos \"patches\" de GXT/NPM/BSA em ágar contendo Staphylococcus aureus e Escherichia coli, levou halos de inibição consideráveis. A inibição do crescimento de E. coli foi particularmente eficiente sob efeito de campo magnético externo. / New biocompatible systems for biotech applications are relevant not only from a technological point of view, but also for scientific advances. The present project aimed at the creation and characterization of thin films (thickness up to 100 nm) or micrometric patches (thickness of 50 &#181;m to 100 &#181;m) formed by the deposition of xanthan gum (GXT), poly (dimethyl diallyl ammonium chloride) (PDDA), bovine serum albumin (BSA), and magnetite nanoparticles (NPM). The incorporation of amoxicillin (Amox), a widely used antibiotic against many infections, in the films was performed during the formation of the systems. Thin films were characterized by means of ellipsometry and atomic force microscopy. In solution, favorable interactions between Amox and BSA were evidenced by substantial changes in the secondary structure of BSA, as revealed by circular dichroism spectra. Patches of GXT and GXT/NPM/BSA were immersed into Amox solution at 2 g/L, leading to the Amox incorporation of 10 ± 3 and 17 ± 4 &#181;g/cm3, respectively. The patches characterization included Fourier Transform Infrared vibration spectroscopy in the attenuated total reflectance mode (FTIR-ATR), scanning electron microscopy (MEV), sorption measurements and inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES). The incorporation of 0.2 wt% of Fe3O4 in the patches and their exposure to an external magnetic field, allowed the total in vitro release of Amox, at pH 5.5 and 0.02 mol/L NaCl, following the behavior quasi-Fickian. Amox diffusion from GXT/NPM/BSA patches in agar containing Staphylococcus aureus and Escherichia coli led to a considerable zone of inhibition. Inhibition of E. coli growth was particularly efficient under the effect of external magnetic field.

INTRODUÇÃO: Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito e contribuem independentemente para o risco cardiovascular. O reconhecimento dos AGE pelo receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) potencializa vias de sinalização pró-aterogênicas. Antagonistas do receptor de angiotensina II (ANGII) do tipo 1 (AT-1) diminuem a expressão de RAGE em área de lesão aterosclerótica. No presente projeto, avaliou-se, na aorta de camundongos dislipidêmicos (knockout para apoE) tratados ou não com inibidor do receptor AT-1 (losartana, LOS), o efeito do tratamento crônico com albumina-AGE sobre o infiltrado de lípides, a expressão de mRNA e proteínas envolvidas no eixo AGE/RAGE, ANGII/AT-1, modulação da resposta inflamatória e fluxo de lípides, além da secreção de citocinas inflamatórias por macrófagos tratados com albumina controle ou AGE, concomitantemente ou não a losartana, isolados da cavidade peritoneal de camundongos apoE knockout. MÉTODOS: Camundongos machos knockout para apoE de 12 semanas de idade foram mantidos em dieta padrão e divididos, aleatoriamente, em quatro grupos experimentais (n = 20/grupo): grupo Controle (C), C+LOS, albumina-AGE (AGE) e AGE+LOS. Os animais receberam injeção intraperitoneal diária, durante 30 dias, de 2 mg de albumina controle (grupos C e C+LOS) ou albumina AGE (AGE e AGE+LOS). Os animais C+LOS e AGE+LOS foram tratados durante todo o período experimental com losartana (100 mg/L água). Secções do arco aórtico foram utilizadas para imunofluorescência para RAGE, carboximetil-lisina (CML), AT-1 e 4-hidroxinonenal (4-HNE) e determinação infiltrado lipídico por coloração com Oil Red-O. Análise do mRNA de Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogênio) foi realizada por de qRT-PCR. Ensaio in vitro para secreção de IL-6 por ELISA e expressão de Il1b (IL-1beta) e Il18 (IL-18) por alfaRT-PCR, foi realizado com macrófagos peritoneais isolados camundongos apoE knockout incubados com albumina C ou AGE (2 mg/mL), concomitante ou não ao tratamento com losartana (1 uM). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação ao peso corporal, colesterol total, triglicérides e glicose plasmáticos, no período basal e final. A pressão arterial sistólica foi reduzida nos animais tratados com losartana quando comparados aos não tratados (p < 0,05). Não foi detectada a presença de infiltrado macrofágico na aorta por meio de ensaios de imunofluorescência para CD-68 e pela análise de coloração com hematoxilina-eosina. Todavia, o infiltrado de lípides foi 5,3 e 2 vezes maior no grupo AGE quando comparado, respectivamente, ao grupo C e AGE+LOS (p < 0,05). O conteúdo proteico de RAGE e CML, assim como do marcador de peroxidação lipídica (4-HNE) foi maior no grupo AGE em comparação aos demais grupos, o que não prevenido no grupo AGE+LOS (p < 0,05). A expressão do mRNA de Ager, Orl1 e Tnf foi maior no grupo AGE em comparação ao C, ao passo que o tratamento com losartana impediu o aumento da expressão destes genes (p < 0,05). Isto não foi observado para aumento de Cybb estimulado por albumina-AGE. A losartana diminuiu o mRNA de Agtr1a (AT-1) em ambos os grupos tratados. Não foram observadas diferenças na expressão do mRNA de Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt e Nfkb. Macrófagos tratados com albumina-AGE apresentaram secreção de IL-6 aumentada em 1,4 vezes em comparação ao grupo C, o que foi prevenido pela losartana (p < 0,05). Nestas mesmas células, a albumina-AGE aumentou a expressão de Il1b e Il18, em comparação à albumina-C, o que não foi prevenido pela losartana. CONCLUSÃO: A administração crônica de albumina-AGE em modelo animal de dislipidemia isento de DM, aumentou o infiltrado de lípides no aorco aórtico, independentemente de variação na pressão arterial, lípides plasmáticos e da modulação local de componentes do sistema renina-angiotensina. A ação da albumina-AGE foi consequente ao maior insulto oxidativo e inflamatório associado ao maior conteúdo de RAGE e CML. A losartana, por reduzir o insulto oxidativo e inflamatório contrapõe-se à albumina-AGE, contribuindo para prevenção da aterogênese / INTRODUCTION: Advanced glycated end-products (AGE) elevated in diabetes mellitus and independently contribute to cardiovascular risk. The AGE binding to the receptor for AGE (RAGE) potentializes pro-atherogenic signaling pathways. Antagonists of angiotensin II receptor type 1 (AT-1) diminish RAGE expression in atherosclerotic plaques. In this study, we evaluated in the aortic arch of dyslipidemic mice (apoE knockout), treated or not with AT-1 blocker losartan (LOS), the effect of chronic treatment with AGE-albumin in aortic root lipid infiltration, mRNA expression and protein content of components of AGE/RAGE, ANGII/AT-1 axes and modulators of lipid flux and inflammation, and also the secretion of inflammatory cytokines by peritoneal macrophages treated either with control (C) or AGE-albumin, together with or not by losartan treatment,. METHODS: 12-week old male apoE knockout mice were fed chow diet and ramdomly assigned into four groups (n = 20/group): Control (C), C+LOS, AGE-albumin (AGE) and AGE+LOS. Animals received daily intraperitoneal injection of 2 mg of C- albumin (C and C+LOS) or AGE-albumin (AGE and AGE+LOS) during 30 days. LOS groups were treated with losartan (100 mg/L water). Immufluorescence for RAGE, AT-1, carboxymethyllysine (CML) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), and Oil red-O staining for lipid infiltration was performed in sections from the aortic arch. mRNA expression of Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogen) was evaluated by qRT-PCR. In vitro assay for IL-6 secretion was performed by ELISA and Il1b (IL-1beta) and Il18 (IL-18) mRNA expression was performed by qRT-PCR in peritoneal macrophages from of apoE knockout mice after treatment with C or AGE-albumin (2 mg/mL), with or without losartan (1 ?M). RESULTS: No differences among groups were observed in body weight, plasma total cholesterol, triglycerides and glucose in basal and final periods. Sistolic blood pressure was reduced in both LOS groups when compared to non-treated groups (p < 0.05). It was not observed CD-68 infiltration in the arterial wall. However, lipid infiltration was, respectively, 5.3 and 2 times greater in AGE group in comparison to C and AGE+LOS groups (p < 0.05). RAGE and CML protein and the lipid peroxidation marker (4-HNE) were greater in AGE group when compared to other groups, which was prevented in AGE+LOS (p < 0.05). Ager, Orl1 and Tnf mRNA expression was increased in AGE group when compared to C, and losartan was able to prevent this event (p < 0.05), except for Cybb. Losartan decreased Agtr1a mRNA expression in both groups (p < 0.05). No differences were observed among groups for Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt and Nfkb mRNA expression. Macrophages treated with AGE-albumin presented 1.4 times great IL-6 secretion, which was prevented by losartan (p < 0.05). In these cells, AGE-albumin increased Il1b and Il18 mRNA expression in AGE group, but this was not prevent by losartan. CONCLUSION: Chronic administration of AGE-albumin in non diabetic dyslipidemic mice increased aortic lipid infiltration, independently of changes in blood pressutre, plasma lipids and local modulation of renin angiotensin system components. The role of AGE-albumin was consequent to the enhanced inflammatory and oxidative insult associated to the higher content of CML and RAGE. Losartan by reducing oxidation and inflammation counteracts the effects of AGE-albumin contributing to prevent atherogenesis

Metalofármacos baseados em rutênio têm se mostrado promissores com relação à atividade anticancerígena frente a diversos tipos de tumores. Nosso grupo de pesquisa dedica-se ao estudo de compostos contendo o centro dimetálico de valência mista Ru2(II,III) coordenado a ligantes derivados de Faines (Fármacos anti-inflamatórios não esteroides), tendo demostrando o potencial desses complexos frente a glioma. O entendimento do modo de ação destes complexos requer o estudo de suas interações com biomoléculas presentes no meio biológico. Neste cenário, o presente trabalho teve por objetivo investigar a interação de três complexos de dirutênio-Faines, ou RuFaines, [Ru2(ibp)4Cl], [Ru2(ceto)4Cl] e [Ru2(npx)4(H2O)2]PF6 (ibp = ibuprofenato, ceto = cetoprofenato e npx = naproxenato), e também do precursor [Ru2(O2CCH3)4Cl], RuAc, com as principais proteínas presentes no soro humano, transferrina e albumina. Os complexos foram sintetizados e caracterizados conforme metodologias desenvolvidas no grupo. A interação destes complexos com a transferrina, em suas formas apo e holo, e com a albumina foi avaliada por técnicas como espectroscopia eletrônica, dicroísmo circular, fluorescência, e realizaram-se estudos de ultrafiltração com análise do aduto formado por ICP-OES e espectrometria de massas. Além disso, fez-se um estudo de captação celular dos complexos RuFaines por células de glioma humano da linhagem U-87. Os resultados demonstraram que os complexos de dirutênio-Faines interagem com ambas as proteínas séricas (transferrina (apo e holo) e albumina), de modo semelhante, mas que é distinto daquele observado para o complexo RuAc. A presença de íons Fe(III) nos sítios específicos da transferrina não afetou a interação dos complexos RuFaines, enquanto que um comportamento diferente foi observado para o RuAc. Verificou-se que todas as proteínas avaliadas (albumina, apo-transferrina e holo-transferrina) apresentam capacidades similares de retenção dos complexos (~ 70% da quantidade de Ru adicionada inicialmente), independentemente da natureza do ligante carboxilato coordenado. Estudos de captação celular mostraram que a interação dos complexos RuFaines com a transferrina não contribuiu para modificar a capacidade de entrada desses complexos na célula, em comparação com os metalofármacos livres. Em alguns casos, inclusive, a formação de aduto com a apo-transferrina teve um efeito contrário, diminuindo a captação de rutênio. Dessa forma, concluiu-se que o ciclo da transferrina provavelmente não é a principal rota de entrada nas células para os complexos estudados. / Ruthenium metallodrugs have shown promising antitumor activity against to several tumor types. Our research group is dedicated to study compounds containing the mixed-valence Ru2(II,III) dimetallic center coordinated to NSAIDs (nonsteroidal anti-inflammatory drugs) derived ligands, and have demonstrated the potential of these complexes against glioma. The understanding of the mode of action of these complexes requires the study of their interactions with biomolecules present in biological environment. In this scenario, the present work aimed to investigate the interaction of three complexes of diruthenium-NSAIDs, or RuNSAIDs, [Ru2(ibp)4Cl], [Ru2(ceto)4Cl] and [Ru2(npx)4(H2O)2]PF6 (ibp = ibuprofenate, ceto = ketoprofenate, npx = naproxenate), and also of the precursor [Ru2(O2CCH3)4Cl], RuAc, with the major proteins present in the human serum, transferrin and albumin. The complexes were synthesized and characterized according to methods developed in our group. The interaction of these complexes with transferrin, in the two forms apo and holo, and with albumin was evaluated by techniques as electronic spectroscopy, circular dichroism, fluorescence, and ultrafiltration studies accompanied by analysis of adducts by ICP-OES and mass spectrometry. Moreover, cellular uptake studies of the RuNSAIDs complexes by U-87 human glioma cells line were performed. The results demonstrated that the diruthenium-NSAIDs complexes interact with both proteins (transferrin (apo and holo) and albumin), in a similar way, but that is distinct of that observed for the RuAc complex. The presence of Fe(III) ions in transferrin specific binding sites did not affect the interaction of the RuNSAID complexes with the protein, while a different behavior was shown by RuAc. All the proteins studied here (albumin, apo-transferrin and holo-transferrin) showed similar capabilities for retention of the complexes (~ 70 % of the initial amount of Ru added), independently of the nature of the coordinated carboxylate ligand. Cellular uptake studies showed that the interaction of the RuNSAIDs complexes with transferrin did not contribute to modify the internalization capacity of these complexes, in comparison with the free metallodrugs. In some cases, the adduct formation with apo-transferrin showed an opposite effect, leading to the decrease of ruthenium uptake. The findings led to the conclusion that transferrin cycle probably is not the main entry way to the cells for the studied complexes.