Nous avons mis au point un fermenteur continu multi-étagé (MSCF) dans le but de reproduire les conditions de la fermentation alcoolique en conditions œnologiques. Ce bioréacteur permet de maintenir les levures dans un milieu stable et contrôlé tout en découplant la croissance et la phase stationnaire. Le système offre donc la possibilité d'obtenir des levures non croissantes dans un milieu de composition stable. Dans un premier temps, nous avons validé la pertinence du MSCF pour reproduire les conditions de fermentation du batch, par approche intégrée (des paramètres cinétiques, des métabolites intra et exo cellulaire et de l'expression génique). Nous avons ensuite utilisé ce bioréacteur pour étudier les mécanismes d'adaptation métabolique des microorganismes suite à un ajout d'azote, pratique largement répandue en œnologie. Plusieurs résultats originaux ont été obtenus concernant, notamment, la réorganisation du cycle TCA, le transport des sources azotées et la synthèse des alcools supérieurs et esters. La fiabilité de l'outil mis au point et l'originalité des données obtenues ouvrent des perspectives à l'utilisation du MSCF pour la compréhension du métabolisme et des mécanismes d'adaptation des levures. / We set up a multi-stage continuous fermentor (MSCF) to mimic the conditions of alcoholic fermentation. In this bioreactor, the yeasts are in a steady and well controlled state representative of the growth and stationary phases of the batch. The ability of the MSCF to reproduce batch fermentation was assessed using an integrated approach (measurement of kinetic parameters, intra and exo-cellular metabolites and gene expression). We then used the MSCF to study the impact of nitrogen supplementation performed during the stationary phase, on yeasts metabolism. Several original results were obtained, concerning the TCA cycle, the transport of nitrogenous sources and the synthesis of higher alcohols and esters. This work points out the interest of using the MSCF to assess the effect of medium perturbations during alcoholic fermentation, especially during the stationary phase. More generally, the accuracy of the MSCF and the originality of the data obtained open new prospects for a better understanding of yeasts metabolism and regulation mechanisms.

L'achèvement de la fermentation alcoolique est corrélé au niveau de formation de biomasse, qui varie selon les souches de levure S. cerevisiae. La maîtrise de cette fermentation passe par une meilleure compréhension des liens entre métabolisme azoté et formation de biomasse ainsi que des mécanismes contribuant aux variations de formation de biomasse entre souches. L'analyse des cinétiques de consommation de 18 composés azotés a montré que l'ordre de consommation des sources d'azote est similaire pour 14 souches et s'explique principalement par les caractéristiques cinétiques et le mode de régulation des perméases impliquées dans leur transport. Par contre, des variations sont observées dans les profils de consommation de l'azote, qui mettent en jeu des mécanismes différents suivant la disponibilité en azote du milieu. En présence d'un excès d'azote, les souches « faibles productrices » présentent une capacité limitée d'assimilation de l'ammonium ; lorsque l'azote est présent en faible quantité, elles métabolisent plus efficacement l'arginine stockée dans la vacuole pendant la phase de croissance. Afin de déterminer la distribution des flux d'azote dans la cellule, nous avons développé une approche quantitative basée sur la filiation isotopique de sources d'azote marquées 13C ou 15N. Cette étude a révélé une incorporation limitée des acides aminés exogènes dans la biomasse au profit de la synthèse de novo, à l'exception de la leucine majoritairement intégrée dans la biomasse et de l'arginine stockée dans la vacuole. Enfin, cette étude a confirmé expérimentalement que les capacités d'assimilation de l'ammonium et de remobilisation de l'arginine sont des éléments clés des différences de production de biomasse entre souches. Cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'efficacité d'utilisation et l'allocation de sources complexes d'azote pendant la fermentation œnologique et sur les mécanismes impliqués dans la variabilité de production de biomasse chez S. cerevisiae. / The completion of alcoholic fermentation is correlated with the level of biomass formation, which varies depending on the S. cerevisiae yeast strain. Achieving a better control of the fermentation requires a better understanding of the relationship between nitrogen metabolism and biomass formation and of the mechanisms contributing to variation in biomass formation between strains. The analysis of the kinetics of consumption of 18 nitrogen compounds showed that the order of consumption of nitrogen sources is similar for 14 strains and is mainly due to the kinetic characteristics and mode of regulation of permeases involved in their transport. By cons, variations are observed in the patterns of nitrogen consumption, which involve different mechanisms depending on the availability of nitrogen in the medium. In the presence of excess nitrogen, "low producing" strains have a limited capacity for assimilation of ammonium; when nitrogen is present in small quantities, they metabolize more efficiently arginine stored in the vacuole during the growth phase. To determine the intracellular distribution of nitrogen fluxes, we developed a quantitative approach based on isotopic filiation of 13C or 15N labeled nitrogen sources. This study revealed a limited incorporation of exogenous amino acids in biomass in favor of de novo synthesis, with the exception of leucine mostly integrated in the biomass and arginine stored in the vacuole. Finally, this study confirmed experimentally that the capacity of ammonium assimilation and remobilization of arginine are key determinant governing the differences of biomass production between strains. This study sheds new light on the efficient use and allocation of complex nitrogen sources during wine fermentation and on the mechanisms involved in the differences in biomass production within the S. cerevisiae species.

Au Mexique l’état de Tamaulipas est susceptible de devenir l'un des plus grands producteurs de mezcal. Contrairement à d’autres boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est d'un grand intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts d’agave ont une forte nature fructophilique qui serait induite par la composition naturelle riche en fructose du moût. De plus, la caractérisation cinétique des levures et au niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans la consommation de fructose par cette flore est pertinente étant donné que des études sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae n’ont pas montré que les transporteurs de glucose et de fructose étaient différents. Dans ce travail, la population levurienne étudiée était de 17 isolats, à partir de 103 initialement isolés de la mezcaleria "El Palmar" Emilio Lozoya, situé à San Carlos (Tamaulipas, Mexique) au niveau de différentes étapes. Seules les levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ont été retenues et étudiées. En particulier de polymorphismes des 2 gènes des transporteurs principaux de sucres associes au fructose consume HXT1 et HXT3, a été évalué en comparaison à une souche de référence. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin de préciser les liens entre la fructophilie et l'expression et / ou la structure des gènes des transporteurs de sucres lors de la fermentation alcoolique. / The Mexican state of Tamaulipas has the potential to become one of the main producers of mezcal. But contrary to what is known about other alcoholic beverages, the mycoflora involved in this alcoholic fermentation has not been completely identified nor characterised from the metabolic point of view. There is an increasing industrial interest on knowing if the native yeasts associated to agave must fermentations possess a fructophilic behaviour, favoured by the natural high fructose composition of the agave musts. Moreover, the kinetic characterisation of these yeasts and the molecular analysis carried out on the hexose transporters genes reported to be involved in the glucose and fructose consumption is pertinent, and several studies on Saccharomyces cerevisiae have demonstrated a differential preference for each hexose. In this study, a set of 17 yeast isolates were chosen from an original collection of 103 yeast isolated at the mezcalería El Palmar Emilio Lozoya, which is located at San Carlos (Tamaulipas, Mexico) from different stages of the fermentation. Only those belonging to S. cerevisiae specie were studied, mainly concerning the polymorphisms found on their two main hexose transporter genes associated to a preferential consumption of fructose, HXT1 and HXT3, and results compared to a control strain. The results obtained showed that there is no a direct link between the fructophilic phenotype and/or the structure of these genes and that more studies are needed to establish such relationships

A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period

A aplicabilidade do processo de produção de microrganismos fotossintetizantes depende da obtenção de altas concentrações de biomassa e para isso seria interessante o emprego de fotobiorreatores tubulares. Eles permitem redução da área de cultivo e menor perda de CO2 e nitrogênio amoniacal por volatilização. Em uma primeira etapa deste trabalho, Arthrospira platensis foi cultivada por processo contínuo, avaliando-se diferentes valores de vazão específica de alimentação (D = 0,2 a 1,0 dia-1) e diferentes intensidades luminosas (I = 60 e 120 µmol fótons.m-2.s-1). Verificou-se que 120 µmol fótons.m-2.s-1 associada a D igual a 0,2 dia-1 resultou em maior valor de concentração celular em regime permanente (XP = 2446 ± 74 mg.L-1.d-1), mas o mesmo I associado a maior valor de D (0,6 dia-1) levou ao melhor valor de produtividade em células (PX = 938,73 mg.L-1.d-1). Foi possível a obtenção do regime permanente em quase todos os ensaios, o que indica que o cultivo contínuo de A. platensis em fotobiorreator tubular, usando uréia como fonte de nitrogênio, pode levar a resultados satisfatórios. Considerando a preocupação em relação à substituição de combustíveis fósseis por biocombustíveis, é iminente o crescente aumento da produção de etanol ainda nos próximos anos, e esse trabalho propõe o uso do CO2 liberado pela fermentação alcoólica na produção de microrganismos fotossintetizantes como A. platensis. Para isso, em uma segunda etapa, A. platensis foi cultivada por processo contínuo, com I igual a 120 µmol fótons.m-2.s-1, empregando uréia e CO2 proveniente de fermentação alcoólica para manutenção de pH e reposição da fonte de carbono. O uso desse CO2, sem tratamento prévio, associado a D igual a 0,6 dia-1 e concentração de uréia de 3,2 mM no meio de alimentação, permitiu a obtenção de PX igual a 839 ± 25 mg.L-1.d-1, o que está próximo de 938 ± 30mg.L-1.d-1, obtido com CO2 puro de cilindro. Estes resultados mostram que o uso de CO2 de fermentação alcoólica, associado a uréia, é adequado para cultivo contínuo de biomassa fotossintetizante de potencial interesse na área farmacêutica, alimentícia e de cosméticos, promovendo não só a redução no custo de produção mas também outros benefícios relacionados a questões ambientais e sociais. / Appropriately designed tubular photobioreactors seem to be suitable for photosynthetic biomass production. It can reduce the cultivation area and provide lower loss of CO2 and ammoniacal nitrogen by volatilization. In a first step of this study, Arthrospira platensis was cultivated by continuous process, testing different values of dilution rate (D = 0.2 to 1.0 d-1) and light intensities (I = 60 and 120 µmol photons.m-2.s-1). The results of these runs showed that the maximum steady-state cell concentration (XS = 2446 ± 74 mg.L-1.d-1) was achieved at 120 µmol photons.m-2.s-1 and D of 0.2 d-1, but the same light intensity associated to higher dilution rate (0.6 d-1) provided the highest cell productivity (PX = 938 ± 30 mg.L-1.d-1), a value appreciably higher than that reported in other studies. Besides, steady-state conditions were achieved in most of the runs indicating that A. platensis continuous cultivation in the tubular photobioreactor, using urea as nitrogen source, can be performed effectively, thus appearing an interesting alternative for the large scale fixation of carbon dioxide to mitigate the green house effect. Taking into account the concern about the substitution of fossil fuel with biofuels, its evident that the ethanol production is going to increase even more in the next years, and this study propose the use of the CO2 released by the alcoholic fermentation for the production of photosynthetic microorganism such as A. platensis. For this purpose, in a second step, cultivations of A. platensis were carried out with 120 µmol photons.m-2.s-1 by continuous process, using urea and CO2 from Alcoholic fermentation for pH maintenance and carbon source replacement. The use of this CO2, without any treatment, associated with a D of 0.6 d-1 and feed urea concentration of 3.2 mM provide us a PX of 839 ± 25 mg.L-1.d-1, which is slightly lower than 938 ±30 mg.L-1.d-1, obtained with pure CO2 from cylinder. Our results showed that the use of CO2 from alcoholic fermentation, associated with urea, is suitable for the continuous cultivation cyanobacterial biomass, providing not only the production cost reduction but also other benefits related to environmental and social issues.

O Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. A produção de etanol brasileira é quase que exclusivamente por via fermentativa. A fermentação alcoólica é uma etapa do processo industrial que consome grandes quantidades de água para diluir o xarope ou melaço para o preparo do mosto. Ademais, para cada litro de etanol produzido são gerados cerca de 10 a 14 litros de vinhaça. Este resíduo apresenta alto potencial poluente e pode atingir os recursos hídricos. Contudo, é composto por mais de 90% de água. Nesse sentido, uma estratégia para reduzir o potencial poluidor é realizar a produção de biogás através da biodigestão anaeróbia da vinhaça. Após esse processo, a água contida na vinhaça biodigerida pode ser tratada, com o auxílio de processos físico-químicos, e reutilizada em outros processo industriais. Por esses motivos, o objetivo do trabalho foi recuperar a água presente na vinhaça biodigerida e utilizá-la na diluição do xarope para fermentação alcoólica. Na primeira etapa da pesquisa, a vinhaça biodigerida foi submetida aos tratamentos físico-químicos, os quais consistiram em etapas de coagulação, sedimentação, centrifugação, filtragens sucessivas em filtro de areia, filtro de polipropileno (20 e 5 μm), filtro de carvão ativado e microfiltração (0,22 μm). A avaliação do resultado desses tratamentos foi realizada com base nos resultados de pH, condutividade, teor de sólidos totais (ST), sólidos totais voláteis (STV) e sólidos totais fixos (STF), demanda química de oxigênio(DQO), turbidez, teores de cátions e ânions. A segunda etapa, consistiu na realização de fermentação alcoólica com 4 ciclos fermentativos, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram investigados dois tratamentos, a saber: 1) Tratamento 1 (T1) - Controle: o mosto foi preparado com diluição do xarope realizada com o uso de água destilada; e, Tratamento 2 (T2): o mosto foi preparado com a diluição do xarope utilizando água proveniente da vinhaça biodigerida após os tratamentos supracitados. Na 2ª etapa foram avaliados os seguintes parâmetros: açúcares redutores totais (ART), teor alcoólico, teores de cátions e ânions, glicerol, viabilidade celular, concentração de células de levedura, contaminação microbiana, rendimento e produtividade. As amostras de vinhaça biodigerida e amostras de água proveniente da vinhaça biodigerida apresentaram os seguintes resultados: pH 7,68 e a 7,99, respectivamente; turbidez de 2190 (±39,69) NTU e a 729,67(±10,07) NTU, respectivamente; e os teores totais de cátions de 24.984,67 mg L-1 e para 22.930,99 mg L-1, respectivamente. Também foram observadas diminuições nos teores dos seguintes componentes da água recuperada da vinhaça biodigerida: condutividade: diminuição de 39%; o teor de ST: redução de 28,2% e de STV diminuição de 42,5%. Já os teores totais de ânions nas amostras de água recuperada e tratada não apresentaram diferença significativa Na fermentação alcoólica, aquela conduzida sob as condições do T2 apresentou diferenças significativas no rendimento, em que no ciclo 3 a diferença entre os dois tratamentos foi de 12,6% (T1: 83,56% e T2: 70,99%) e no ciclo 4 essa diferença foi de 9,1 % (T1: 80,65% e T2: 71,56%). A produtividade no T2 também foi menor; no ciclo 2, a diferença entre T1 e T2 foi de 1,6 mL L-1 h-1 (T1: 8,83 ml L-1 h-1 e T2: 7,25 ml L-1 h-1); no ciclo 3 a diferença foi ainda maior atingindo 2,96 mL L-1 h-1 (T1: 10,0 mL L-1 h-1 e T2: 7,04 mL L-1 h-1). Esse comportamento também foi observado no ciclo 4, quando a produtividade de T1 foi 2,47 mL L-1 h-1 maior do que T2, ou melhor, T1: 10,25 mL L-1 h-1 e T2: 7,78 mL L-1 h-1. Essas diferenças nos resultados de T2 em relação aos do Tratamento Controle podem ser atribuídos altos teores de cátions no mosto, uma vez que as diferenças foram muito grandes, pois em T1 foram encontrados teores médios de 11206,86 ±123,99 mg L-1 e em T2, os resultados encontrados foram de 29.521,14 ±597,29 mg L-1. Isso pode ter induzido estresse osmótico às leveduras submetidas ao T2, de modo que, afetou negativamente a produtividade da fermentação. Portanto, conclui-se que é possível utilizar a água proveniente da vinhaça biodigerida no preparo do mosto para a fermentação alcoólica. Contudo, há necessidade de tratamento complementar aos realizados no presente estudo, visando reduzir a concentração de sais e por consequência o estresse osmótico às leveduras. / Brazil is the second largest producer of ethanol in the world. Brazilian ethanol production is almost exclusively via fermentation. Alcoholic fermentation is a stage of the industrial process that consumes large amounts of water to dilute the syrup or molasses for the preparation of the must. In addition, about 10 to 14 liters of vinasse are generated for each liter of ethanol produced. This residue presents high polluting potential and can reach water resources. However, it is composed of more than 90% water. In this sense, a strategy to reduce the polluting potential is to realize biogas production through anaerobic biodigestion of vinasse. After this process, the water contained in biodigested vinasse can be treated with the support of physico-chemical processes and reused in other industrial processes. For these reasons, the objective of the work was to recover the water present in the biodigested vinasse and to use it in the dilution of syrup for alcoholic fermentation. In the first phase of the research, biodigested vinasse was submitted to physical-chemical treatments, which consisted of coagulation, sedimentation, centrifugation, successive sand filtration, polypropylene filter (20 and 5 μm), activated carbon filter and microfiltration (0, 22 μm). The evaluation results of these treatments were carried out based on the results of pH, conductivity, total solids (TS), total volatile solids (STV), and fixed total solids (FTS), chemical oxygen demand (COD), turbidity, content of cations and anions. The second stage consisted of alcoholic fermentation with 4 fermentation cycles, using Saccharomyces cereviasiee yeasts. Two treatments were investigated: 1) Treatment 1 (T1) - Control: the wort was prepared with dilution of the syrup performed with the use of distilled water; and Treatment 2 (T2): the wort was prepared by diluting the syrup using water from the biodigested vinasse after the above treatments. In the second stage, the following parameters were evaluated: total reducing sugars (ART), alcohol content, cation and anion contents, glycerol, cell viability, yeast cell concentration, microbial contamination, yield and productivity. Samples of biodigested vinasse and samples of water from biodigested vinasse presented the following results: pH 7.68 and 7.99, respectively; turbidity of 2190 (± 39.69) NTU and 729.67 (± 10.07) NTU, respectively; and the total cation contents of 24,984.67 mg L-1 and 22930.99 mg L-1, respectively. Reductions of the following proportions were also observed in the water recovered from biodigested vinasse: conductivity: 39% decrease; the ST content: reduction of 28.2% and STV decrease of 42.5%. The total amount of anions in the samples of recovered and traded water did not present significant difference. In the alcoholic fermentation, the one conducted under T2 conditions presented significant differences in the yield; , in which in cycle 3 the difference between the two treatments was 12.6% (T1: 83.56% and T2: 70.99%) and in cycle 4 this difference was 9.1% (T1: 80, 65% and T2: 71.56%). Productivity in T2 was also lower; in cycle 2 the difference between T1 and T2 was 1.6 mL L-1 h-1 (T1: 8.83 mL L-1 h-1 and T2: 7.25 mL L-1 h-1); in cycle 3 the difference was even higher reaching 2.96 mL L-1 h-1 (T1: 10.0 mL L-1 h-1 and T2: 7.04 mL L-1 h-1). This behavior was also observed in cycle 4, when the productivity of T1 was 2.47 mL L-1 h-1 higher than T2, or better, T1: 10.25 mL L-1 h-1 and T2: 7.78 mL L-1 h-1. These differences in the results of T2 in relation to the Control Treatment can be attributed high levels of cations in the wort, since the differences were very large, because in T1 were found average contents of 11206.86 ± 123.99 mg L-1 and in T2, the results found were 29,521.14 ± 597.29 mg L-1. This may have induced osmotic stress to the yeasts submitted to T2, so that it negatively affected the fermentation productivity. Therefore, it is concluded that it is possible to use water from the biodigested vinasse in the preparation of the must for alcoholic fermentation. However, there is a need for complementary treatment to those carried out in the present study, in order to reduce the concentration of salts and consequently the osmotic stress to the yeasts.

No processo de produção de etanol a partir de cana-de-açúcar, a destilação do mosto fermentado resulta na geração de grande volume de vinhaça. Em média, para cada litro de etanol produzido são gerados aproximadamente 12 litros de vinhaça. Devido ao volume de vinhaça produzido e ao limite de aplicação de vinhaça por área, estabelecido pela CETESB, os gastos com o gerenciamento deste resíduo tornaram-se muito altos (R$ 17,33 por m3, considerando a distribuição por caminhão para uma distância de 20 a 25 Km). Isso levou o setor sucroenergético a buscar alternativas visando diminuir do volume de vinhaça produzida. Dentre essas alternativa, destaca-se o processo de fermentação com alto teor alcoólico. Este processo pode diminuir em até 50% o volume de vinhaça gerado, além de apresentar inúmeras vantagens técnicas, econômicas e ambientais. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi realizar a adaptação das linhagens de leveduras C22 e Y904 para fermentações com altos teores alcoólicos e verificar as alterações morfológicas das linhagens C22 e Y904 ao longo do processo de adaptação e após a fermentação com alto teor alcoólico, por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para tal, foram realizadas fermentações com concentrações crescentes de açúcares nos mostos (50 à 274,52 g L-1). No ciclo de fermentação com alto teor alcoólico, a viabilidade das leveduras C22 e Y904 adaptadas foi 70,1% (83,5% e 56,7%, respectivamente); já a viabilidade média das leveduras C22 e Y904 não adaptadas foi 62% (68,8% e 55,2%, respectivamente). As imagens do MEV mostraram que a linhagem C22 adaptada apresentou aspecto morfológico de melhor resposta ao estresse exposto do que as demais leveduras. Conclui-se que a escolha da linhagem e sua adaptação prévia são fundamentais para a condução de fermentações com alto teor alcoólico. / In ethanol production process, the distillation of sugarcane fermented must result in large volume of vinasse. For each liter of ethanol produced around 12 liters of vinasse are generated. Due to the vinasse application limit per area, established by CETESB, the costs to manage this waste became very high (R$ 17,33 per m3, considering the distribution by truck for a distance of 20 to 25 km). This led the sugarcane industry to seek alternatives to reduce the volume of vinasse produced. The process of fermentation with high alcohol content is one of the options; it can reduce by 50% the volume of vinasse generated and presents numerous technical, economic and environmental advantages. For these reasons, the aim of this study was to adapt the yeasts strains C22 and Y904 for fermentations with high alcohol levels and verify the morphological changes of C22 and Y904 strains in the process of adaptation and fermentation with high alcohol content, by scanning electron microscopy (SEM). For this purpose, fermentations with increasing concentrations of sugar in the must (50 to 274.52 g L-1) were performing. In the fermentation cycle with high alcohol content, the viability of C22 and Y904 yeast adapted was 70.1% (83.5% and 56.7%, respectively); the viability of the yeast C22 and Y904 unadapted was 62% (68.8% and 55.2%, respectively). The SEM images showed that the C22 adapted strain presented better morphological response to stress exposure than other yeast strains. We conclude that the choice of yeast strain and his previous adaptation are essential for conducting fermentations with high alcohol content.

O Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. A produção de etanol brasileira é quase que exclusivamente por via fermentativa. A fermentação alcoólica é uma etapa do processo industrial que consome grandes quantidades de água para diluir o xarope ou melaço para o preparo do mosto. Ademais, para cada litro de etanol produzido são gerados cerca de 10 a 14 litros de vinhaça. Este resíduo apresenta alto potencial poluente e pode atingir os recursos hídricos. Contudo, é composto por mais de 90% de água. Nesse sentido, uma estratégia para reduzir o potencial poluidor é realizar a produção de biogás através da biodigestão anaeróbia da vinhaça. Após esse processo, a água contida na vinhaça biodigerida pode ser tratada, com o auxílio de processos físico-químicos, e reutilizada em outros processo industriais. Por esses motivos, o objetivo do trabalho foi recuperar a água presente na vinhaça biodigerida e utilizá-la na diluição do xarope para fermentação alcoólica. Na primeira etapa da pesquisa, a vinhaça biodigerida foi submetida aos tratamentos físico-químicos, os quais consistiram em etapas de coagulação, sedimentação, centrifugação, filtragens sucessivas em filtro de areia, filtro de polipropileno (20 e 5 μm), filtro de carvão ativado e microfiltração (0,22 μm). A avaliação do resultado desses tratamentos foi realizada com base nos resultados de pH, condutividade, teor de sólidos totais (ST), sólidos totais voláteis (STV) e sólidos totais fixos (STF), demanda química de oxigênio(DQO), turbidez, teores de cátions e ânions. A segunda etapa, consistiu na realização de fermentação alcoólica com 4 ciclos fermentativos, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram investigados dois tratamentos, a saber: 1) Tratamento 1 (T1) - Controle: o mosto foi preparado com diluição do xarope realizada com o uso de água destilada; e, Tratamento 2 (T2): o mosto foi preparado com a diluição do xarope utilizando água proveniente da vinhaça biodigerida após os tratamentos supracitados. Na 2ª etapa foram avaliados os seguintes parâmetros: açúcares redutores totais (ART), teor alcoólico, teores de cátions e ânions, glicerol, viabilidade celular, concentração de células de levedura, contaminação microbiana, rendimento e produtividade. As amostras de vinhaça biodigerida e amostras de água proveniente da vinhaça biodigerida apresentaram os seguintes resultados: pH 7,68 e a 7,99, respectivamente; turbidez de 2190 (±39,69) NTU e a 729,67(±10,07) NTU, respectivamente; e os teores totais de cátions de 24.984,67 mg L-1 e para 22.930,99 mg L-1, respectivamente. Também foram observadas diminuições nos teores dos seguintes componentes da água recuperada da vinhaça biodigerida: condutividade: diminuição de 39%; o teor de ST: redução de 28,2% e de STV diminuição de 42,5%. Já os teores totais de ânions nas amostras de água recuperada e tratada não apresentaram diferença significativa Na fermentação alcoólica, aquela conduzida sob as condições do T2 apresentou diferenças significativas no rendimento, em que no ciclo 3 a diferença entre os dois tratamentos foi de 12,6% (T1: 83,56% e T2: 70,99%) e no ciclo 4 essa diferença foi de 9,1 % (T1: 80,65% e T2: 71,56%). A produtividade no T2 também foi menor; no ciclo 2, a diferença entre T1 e T2 foi de 1,6 mL L-1 h-1 (T1: 8,83 ml L-1 h-1 e T2: 7,25 ml L-1 h-1); no ciclo 3 a diferença foi ainda maior atingindo 2,96 mL L-1 h-1 (T1: 10,0 mL L-1 h-1 e T2: 7,04 mL L-1 h-1). Esse comportamento também foi observado no ciclo 4, quando a produtividade de T1 foi 2,47 mL L-1 h-1 maior do que T2, ou melhor, T1: 10,25 mL L-1 h-1 e T2: 7,78 mL L-1 h-1. Essas diferenças nos resultados de T2 em relação aos do Tratamento Controle podem ser atribuídos altos teores de cátions no mosto, uma vez que as diferenças foram muito grandes, pois em T1 foram encontrados teores médios de 11206,86 ±123,99 mg L-1 e em T2, os resultados encontrados foram de 29.521,14 ±597,29 mg L-1. Isso pode ter induzido estresse osmótico às leveduras submetidas ao T2, de modo que, afetou negativamente a produtividade da fermentação. Portanto, conclui-se que é possível utilizar a água proveniente da vinhaça biodigerida no preparo do mosto para a fermentação alcoólica. Contudo, há necessidade de tratamento complementar aos realizados no presente estudo, visando reduzir a concentração de sais e por consequência o estresse osmótico às leveduras. / Brazil is the second largest producer of ethanol in the world. Brazilian ethanol production is almost exclusively via fermentation. Alcoholic fermentation is a stage of the industrial process that consumes large amounts of water to dilute the syrup or molasses for the preparation of the must. In addition, about 10 to 14 liters of vinasse are generated for each liter of ethanol produced. This residue presents high polluting potential and can reach water resources. However, it is composed of more than 90% water. In this sense, a strategy to reduce the polluting potential is to realize biogas production through anaerobic biodigestion of vinasse. After this process, the water contained in biodigested vinasse can be treated with the support of physico-chemical processes and reused in other industrial processes. For these reasons, the objective of the work was to recover the water present in the biodigested vinasse and to use it in the dilution of syrup for alcoholic fermentation. In the first phase of the research, biodigested vinasse was submitted to physical-chemical treatments, which consisted of coagulation, sedimentation, centrifugation, successive sand filtration, polypropylene filter (20 and 5 μm), activated carbon filter and microfiltration (0, 22 μm). The evaluation results of these treatments were carried out based on the results of pH, conductivity, total solids (TS), total volatile solids (STV), and fixed total solids (FTS), chemical oxygen demand (COD), turbidity, content of cations and anions. The second stage consisted of alcoholic fermentation with 4 fermentation cycles, using Saccharomyces cereviasiee yeasts. Two treatments were investigated: 1) Treatment 1 (T1) - Control: the wort was prepared with dilution of the syrup performed with the use of distilled water; and Treatment 2 (T2): the wort was prepared by diluting the syrup using water from the biodigested vinasse after the above treatments. In the second stage, the following parameters were evaluated: total reducing sugars (ART), alcohol content, cation and anion contents, glycerol, cell viability, yeast cell concentration, microbial contamination, yield and productivity. Samples of biodigested vinasse and samples of water from biodigested vinasse presented the following results: pH 7.68 and 7.99, respectively; turbidity of 2190 (± 39.69) NTU and 729.67 (± 10.07) NTU, respectively; and the total cation contents of 24,984.67 mg L-1 and 22930.99 mg L-1, respectively. Reductions of the following proportions were also observed in the water recovered from biodigested vinasse: conductivity: 39% decrease; the ST content: reduction of 28.2% and STV decrease of 42.5%. The total amount of anions in the samples of recovered and traded water did not present significant difference. In the alcoholic fermentation, the one conducted under T2 conditions presented significant differences in the yield; , in which in cycle 3 the difference between the two treatments was 12.6% (T1: 83.56% and T2: 70.99%) and in cycle 4 this difference was 9.1% (T1: 80, 65% and T2: 71.56%). Productivity in T2 was also lower; in cycle 2 the difference between T1 and T2 was 1.6 mL L-1 h-1 (T1: 8.83 mL L-1 h-1 and T2: 7.25 mL L-1 h-1); in cycle 3 the difference was even higher reaching 2.96 mL L-1 h-1 (T1: 10.0 mL L-1 h-1 and T2: 7.04 mL L-1 h-1). This behavior was also observed in cycle 4, when the productivity of T1 was 2.47 mL L-1 h-1 higher than T2, or better, T1: 10.25 mL L-1 h-1 and T2: 7.78 mL L-1 h-1. These differences in the results of T2 in relation to the Control Treatment can be attributed high levels of cations in the wort, since the differences were very large, because in T1 were found average contents of 11206.86 ± 123.99 mg L-1 and in T2, the results found were 29,521.14 ± 597.29 mg L-1. This may have induced osmotic stress to the yeasts submitted to T2, so that it negatively affected the fermentation productivity. Therefore, it is concluded that it is possible to use water from the biodigested vinasse in the preparation of the must for alcoholic fermentation. However, there is a need for complementary treatment to those carried out in the present study, in order to reduce the concentration of salts and consequently the osmotic stress to the yeasts.

No processo de produção de etanol a partir de cana-de-açúcar, a destilação do mosto fermentado resulta na geração de grande volume de vinhaça. Em média, para cada litro de etanol produzido são gerados aproximadamente 12 litros de vinhaça. Devido ao volume de vinhaça produzido e ao limite de aplicação de vinhaça por área, estabelecido pela CETESB, os gastos com o gerenciamento deste resíduo tornaram-se muito altos (R$ 17,33 por m3, considerando a distribuição por caminhão para uma distância de 20 a 25 Km). Isso levou o setor sucroenergético a buscar alternativas visando diminuir do volume de vinhaça produzida. Dentre essas alternativa, destaca-se o processo de fermentação com alto teor alcoólico. Este processo pode diminuir em até 50% o volume de vinhaça gerado, além de apresentar inúmeras vantagens técnicas, econômicas e ambientais. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi realizar a adaptação das linhagens de leveduras C22 e Y904 para fermentações com altos teores alcoólicos e verificar as alterações morfológicas das linhagens C22 e Y904 ao longo do processo de adaptação e após a fermentação com alto teor alcoólico, por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para tal, foram realizadas fermentações com concentrações crescentes de açúcares nos mostos (50 à 274,52 g L-1). No ciclo de fermentação com alto teor alcoólico, a viabilidade das leveduras C22 e Y904 adaptadas foi 70,1% (83,5% e 56,7%, respectivamente); já a viabilidade média das leveduras C22 e Y904 não adaptadas foi 62% (68,8% e 55,2%, respectivamente). As imagens do MEV mostraram que a linhagem C22 adaptada apresentou aspecto morfológico de melhor resposta ao estresse exposto do que as demais leveduras. Conclui-se que a escolha da linhagem e sua adaptação prévia são fundamentais para a condução de fermentações com alto teor alcoólico. / In ethanol production process, the distillation of sugarcane fermented must result in large volume of vinasse. For each liter of ethanol produced around 12 liters of vinasse are generated. Due to the vinasse application limit per area, established by CETESB, the costs to manage this waste became very high (R$ 17,33 per m3, considering the distribution by truck for a distance of 20 to 25 km). This led the sugarcane industry to seek alternatives to reduce the volume of vinasse produced. The process of fermentation with high alcohol content is one of the options; it can reduce by 50% the volume of vinasse generated and presents numerous technical, economic and environmental advantages. For these reasons, the aim of this study was to adapt the yeasts strains C22 and Y904 for fermentations with high alcohol levels and verify the morphological changes of C22 and Y904 strains in the process of adaptation and fermentation with high alcohol content, by scanning electron microscopy (SEM). For this purpose, fermentations with increasing concentrations of sugar in the must (50 to 274.52 g L-1) were performing. In the fermentation cycle with high alcohol content, the viability of C22 and Y904 yeast adapted was 70.1% (83.5% and 56.7%, respectively); the viability of the yeast C22 and Y904 unadapted was 62% (68.8% and 55.2%, respectively). The SEM images showed that the C22 adapted strain presented better morphological response to stress exposure than other yeast strains. We conclude that the choice of yeast strain and his previous adaptation are essential for conducting fermentations with high alcohol content.

O gênero Eucalyptus é uma das principais espécies arbóreas comercialmente plantadas em todo o mundo. Apresenta inúmeras características favoráveis para a produção e comercialização de sua madeira, tais como o rápido crescimento, rotação de ciclo curto e produção de biomassa renovável, com potencial para geração de biocombustível. Apesar de sua grande importância econômica, pouco é conhecido sobre os processos moleculares que envolvem a formação da madeira e casca, principalmente no que diz respeito ao metabolismo primário. Ademais, não se têm muitas informações sobre mudanças moleculares que ocorrem durante a formação desses tecidos em resposta a variações sazonais. Sabe-se que a região cambial das árvores apresenta maior atividade metabólica durante o verão, quando comparada ao inverno. Deste modo, visando compreender mudanças dinâmicas ao nível transcricional, protéico e metabólico, principalmente em relação ao metabolismo primário, o presente trabalho teve por objetivo comparar os tecidos da região cambial e casca, coletados em diferentes períodos climáticos (verão e inverno). A expressão do padrão transcricional foi analisada por PCR em tempo real, seguido de normalização e análise estatística, usando os programas NormFinder e Rest, respectivamente. O perfil protéico foi obtido por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), seguido de análise por espectrometria de massas associada a cromatografia líquida (LC-MS/MS) e posterior identificação das proteínas pelo programa Mascot Daemon. Já o perfil metabólico foi obtido por espectrometria de massas associada à cromatografia gasosa (GC/MS), com posterior análise dos picos identificados pelo programa MatLab. Em seguida, as análises estatísticas foram geradas pelo programa SIMCA P+ e \"R\". Para os transcritos, foi possível observar tanto para a região cambial quanto para a casca padrão diferencial na expressão dos genes analisados, principalmente aqueles atuantes na glicólise, durante os dois períodos sazonais. Quanto ao perfil protéico, foram identificadas um total de 77 e 75 proteínas estatisticamente significativas na região cambial e casca, respectivamente. Proteínas pertencentes ao metabolismo primário foram identificadas em ambos os tecidos. Metabólitos relacionados ao metabolismo de açúcares também foram encontrados. / Eucalyptus genus is the most widely planted hardwood crop in the world because of its superior growth, broad adaptability and multipurpose wood properties. In today\'s \"new carbon economy\", eucalypts are receiving attention as fast-growing, short-rotation, renewable biomass crop for energy production. In spite of its economical importance, little information is available about the molecular changes that occur in primary metabolism in the wood and bark forming tissues. Furthermore, there is less information about molecular changes that occur during wood and bark formation in response to seasonal variation. It\'s known that Eucalyptus cambial region presents higher metabolic activity in summer than in winter. Thus, in order to observe the dynamic changes in transcript, protein and metabolite levels, mainly related to primary metabolism, we compared cambial tissue and bark collected in two different seasons (summer high temp + high rainfall) and winter (lower temp and little rainfall). Transcript expression patterns were analyzed by Real-Time PCR, normalization chosen by NormFinder and statistical analysis carried out using REST. The protein profile was obtained by bidimensional electrophoresis (2D-PAGE) followed by liquid chromatography associated with mass spectrometry (LC-MS/MS) and analyzed by Mascot Daemon. Metabolite profile was obtained by GC-TOF/MS, peaks were analyzed in MatLab and statistical analyses were done using SIMCA and \"R\". The results obtained with transcripts indicate differential gene expression in the cambial region and bark during summer and winter. A total of 77 and 75 proteins in cambium and bark, respectively, presented statistically significant alterations and were identified and classified into functional categories. We identified many proteins from primary metabolism. Metabolites from carbohydrate metabolism were also identified.