AGUIAR, Valéria Cavalcanti de. Aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta Calotropis procera (Ait.) R. BR. 2006. 182 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2006. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T14:13:28Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:46:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) Previous issue date: 2006 / The latex of the lactiferous plant Calotropis procera (Ait.) R. Br. is an important biologically active compound that displays relevant properties like antiinflammatory and antidiarrhea activities, although the latex has previously been shown to produce considerable toxic effects on animals. Another question is that it is not known yet whether the latex proteins from C. procera induce allergenic effects, just like the latex proteins from Hevea brasiliensis. The potential of the latex as a pharmaceutical, therefore, depends on separating the curative properties from the toxic and allergenic properties, but there has been a lack of scientific investigation in this area. The objective of the present study was to investigate biochemical, toxicological and allergenic aspects of the latex from the plant C. procera, through the study of in vitro and in vivo digestibility, evaluation of acute and subchronic toxicity by oral route, and analysis of immune response induction by subcutaneous and oral route of its fractions. The latex was fractionated into three distinct fractions according to their water solubility and molecular size. The fractions were named as: latex proteins (LP), corresponding to the major latex proteins; dialysis proteins (DP), representing low molecular size substances; and rubber latex (RL), which was highly insoluble in water. LP fraction was investigated in some biochemical aspects, like its protein profile by SDS-PAGE analysis and its amino acid composition determination. Latex proteins were also subjected to in vitro digestion with trypsin, chemotrypsin, pepsin and Streptomyces griseus protease and in vitro digestibility was evaluated by gel filtration and SDS-PAGE analysis. The in vivo digestibility of LP was analyzed when experimental animals ingested this fraction for 35 days. The volume uptake of LP was recorded daily and samples of fecal material from animals were collected, treated and submitted to SDS-PAGE analysis and radial double immunodifusion assays, with polyclonal antibodies raised against LP. In relation to toxicological aspects, LP fraction was orally administered to experimental animals for 35 days, to allow subchronic toxicity evaluation. Increases in body mass were recorded and blood samples were analyzed weekly. After the test period, the animals were sacrificed and a number of biochemical and physiological parameters determined. These included sera determinations of blood glucose, total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides, hepatic function tests (total proteins, albumin, alanine aminotransferase – ALT and aspartate aminotransferase – AST), renal function tests (urea and creatinin), total and differential leukocyte counts in blood and peritoneal fluid and analysis of sera proteins by SDS-PAGE. Animals had internal key organs (liver, kidneys, spleen, small intestine, large intestine, pancreas and stomach) dissected and the relative fresh masses were determined. In the acute toxicity evaluation, LP fraction was administered by oral route to experimental animals and behavioral changes in animals were also monitored. With reference to allergenic aspects, immunological responses of latex from C. procera were investigated by oral and subcutaneous routes in mice. Anti-sera against LP, DP and RL fractions were assayed for IgG and IgA titration by ELISA, while IgE and IgG1 were accessed by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats and mice, respectively. Protein profiles of LP and RL fractions were analyzed by SDS-PAGE. Concerning biochemical aspects results, LP fraction possesses appreciable amount of protein, low content of sulphurated amino acids (methionine and cysteine) and a considerable number of amino acids (arginine, lysine, phenylalanine and tyrosine) that represent cleavage sites to animal proteolytic enzymes studied. LP fraction was digested by the action of pepsin, trypsin and chemotrypsin as revealed by gel filtration and SDS-PAGE analyses. The full LP digestion was easily achieved by S. griseus protease treatment. Rabbit polyclonal antibodies raised against LP failed to detect cross-reactive molecules in faeces of experimental rats. Similar patterns of electrophoresis were observed for the negligible amounts of protein observed in the fecal materials of control and test animals. With relation to subchronic toxicity evaluation results, no death was observed during the experiment. Experimental and control animals presented similar growth rate and key organs exhibited similar relative fresh masses. Hepatic and renal functions, sera glycemic and lipidemic parameters were determined to be at normal levels. Likewise, the electrophoretic protein patterns of sera from untreated and treated animals exhibited quite similar profiles. Uptake of latex proteins did not induce acute inflammation into peritoneal cavity of rats as determined by the total and differential leukocytes counts. The most relevant result discovered was an apparent proliferative effect of the latex proteins upon blood lymphocytes that tended to increase, whilst neutrophils remained at normal level. It should be emphasized that the experimental rats were normal in their behavior, morphological and biochemical aspects, indicating that it is unlikely that they were under any pathological or infectious condition. Therefore, the increment of lymphocytes population in the blood serum should be attributed to the staking effect of the latex proteins rather than any harmful event. LP fraction was unable of presenting acute toxicity in experimental animals, because no behavioral changes in animals were observed. Concerning allergenic aspects results, none of the fractions induced antibodies level increases when mice received latex fractions by oral route and thus, did not develop allergy. Nonetheless, anti-sera of mice sensitized with LP and RL by subcutaneous administration displayed considerable immunological response, while DP did not induce antibodies synthesis. IgG level augmented consistently against LP and RL, while IgA response was detected to LP solely. LP and RL induced very strong PCA reactions suggesting that both fractions would contain latex substances involved in allergenicity. Furthermore, protein analysis of LP and RL suggests that RL still retain residual proteins, co-precipitated with rubber, abundantly found in LP, that could explain its similar allergenicity. No IgG1 reaction was detected in any of the anti-sera tested. It can be concluded that latex proteins were partially susceptible to digestive proteolysis when accessed by in vitro assays, and were digested and absorbed, or were absorbed in its intact form, when ingested and analyzed by in vivo tests. Toxic events or lethality associated with latex, as described in the literature, are not related to LP fraction. Latex proteins produced partial proliferative effect upon mononuclear cells, mainly lymphocytes and did not induce an acute inflammatory response, when administered by oral route. Allergenic effects could be detected, by subcutaneous route, with LP and RL fractions, and were not observed by oral route. Evidences for an inducible tolerance acquired to latex proteins by oral route were provided. Latex proteins may act as immune stimulants. The proteins from the latex remain an interesting source of biologically active molecules that should be studied in detail for their structural, functional and applicative properties. / O látex da planta lactífera Calotropis procera (Ait.) R. Br. é um composto biologicamente ativo importante que apresenta propriedades relevantes como as atividades antiinflamatória e antidiarréica, embora já tenha sido previamente mostrado que esse látex produz efeitos tóxicos consideráveis em animais. Um outro fato é que não é sabido, ainda, se as proteínas do látex de C. procera produzem efeitos alergênicos, assim como as proteínas do látex de Hevea brasiliensis. O potencial do látex como um fármaco, por essa razão, depende da separação das propriedades curativas das propriedades tóxicas e alergênicas, mas não existe investigação científica nessa área. O presente estudo teve como objetivo investigar aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta C. procera, através do estudo da digestibilidade in vitro e in vivo, avaliação da toxicidade subcrônica e aguda por via oral e análise da indução de resposta imune pelas vias subcutânea e oral das suas frações. O látex foi fracionado em três frações distintas de acordo com a sua solubilidade em água e tamanho molecular. As frações foram assim denominadas: proteínas do látex (PL), correspondendo às principais proteínas do látex; proteínas da diálise (PD), representando as substâncias de baixa massa molecular; e borracha do látex (BL) que é altamente insolúvel em água. A fração PL foi investigada, com relação a alguns aspectos bioquímicos, como seu perfil protéico por PAGE-SDS e análise da composição de seus aminoácidos. As proteínas do látex também foram submetidas à digestão in vitro com as enzimas proteolíticas pepsina, tripsina, quimiotripsina e protease de Streptomyces griseus e a digestibilidade in vitro foi avaliada por cromatografia de filtração em gel ou PAGE-SDS. A digestibilidade in vivo de PL foi analisada quando animais experimentais ingeriram essa fração por 35 dias. O volume de PL consumido foi registrado diariamente e amostras das fezes dos animais coletadas, tratadas e submetidas à PAGE-SDS e ensaios de imunodifusão radial dupla de Ouchterlony, com anticorpos policlonais contra PL. Com relação aos aspectos toxicológicos, a fração PL foi oralmente administrada a animais experimentais por 35 dias, para a avaliação da toxicidade subcrônica. Aumentos na massa corpórea foram registrados e amostras sangüíneas foram analisadas semanalmente. Após o período experimental, os animais foram sacrificados e um número de parâmetros bioquímicos e fisiológicos foram determinados. Esses incluíram determinações séricas de glicose sangüínea, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídeos, testes da função hepática (proteínas totais, albumina, alanina aminotransferase – ALT e aspartato aminotransferase – AST), testes da função renal (uréia e creatinina), contagens total e diferencial de leucócitos sangüíneos e do fluido peritonial e análise das proteínas séricas por PAGE-SDS. Os animais tiveram seus órgãos vitais (fígado, rins, baço, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas e estômago) dissecados e as massas frescas relativas foram determinadas. Na avaliação da toxicidade aguda, a fração PL foi administrada por via oral a animais experimentais e a monitoração de alterações comportamentais desses animais também foi realizada. Quanto aos aspectos alergênicos, respostas imunológicas do látex de C. procera foram investigadas pelas vias oral e subcutânea em camundongos. Anti-soros contra as frações PL, PD e BL foram analisados quanto a IgG e IgA por ELISA, enquanto IgE e IgG1 foram monitoradas por anafilaxia cutânea passiva (PCA) em ratos e camundongos, respectivamente. Os perfis protéicos das frações PL e BL foram analisados por PAGE-SDS. Com relação aos resultados dos aspectos bioquímicos, a fração PL possui uma quantidade apreciável de proteínas, baixo conteúdo de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) e um número considerável de aminoácidos (arginina, lisina, fenilalanina e tirosina) que representam sítios de clivagem para as enzimas proteolíticas animais usadas. A fração PL foi digerida pela ação da pepsina, tripsina e quimiotripsina como revelado por análises de filtração em gel e PAGE-SDS. A digestão completa das proteínas do látex foi facilmente obtida pelo tratamento com a protease de S. griseus. Anticorpos policlonais de coelho produzidos contra PL não apresentaram reação cruzada com as moléculas presentes nas fezes dos ratos experimentais. Padrões semelhantes de eletroforese foram observados para as quantidades desprezíveis de proteína observadas nos materiais fecais dos animais controle e experimentais. Quanto aos resultados da avaliação da toxicidade subcrônica, nenhuma morte foi observada durante o experimento. Animais controle e experimentais apresentaram taxa de crescimento semelhante e os órgãos vitais exibiram massas frescas relativas similares. As funções hepática e renal, parâmetros glicêmicos e lipidêmicos séricos situaram-se em níveis normais. Os padrões protéicos eletroforéticos dos soros dos animais controle e experimental exibiram perfis muito similares. A fração PL não induziu inflamação aguda na cavidade peritonial dos ratos, como determinado pelas contagens total e diferencial de leucócitos. O resultado mais relevante detectado foi um aparente efeito proliferativo das proteínas do látex sobre os linfócitos sangüíneos que tenderam a aumentar, enquanto os neutrófilos permaneceram em nível normal. Deve ser enfatizado que os animais experimentais exibiram comportamento, aspectos morfológicos e bioquímicos normais, indicando ser improvável que os mesmos estivessem sob qualquer condição patológica ou infecciosa. Portanto, o incremento da população de linfócitos no soro sangüíneo deve ser atribuído a um efeito notável das proteínas do látex e não a qualquer evento prejudicial. A fração PL foi incapaz de induzir toxicidade aguda, pois nenhuma mudança comportamental foi observada nos animais experimentais. Com relação aos resultados dos aspectos alergênicos, nenhuma das frações induziu aumentos nos níveis de anticorpos, quando os camundongos receberam as frações do látex por via oral e, portanto, não desenvolveram alergia. Entretanto, anti-soros de camundongos sensibilizados com PL e BL por administração subcutânea apresentaram resposta imunológica considerável, e PD não induziu síntese de anticorpos. O nível de IgG aumentou consistentemente contra PL e BL, enquanto a resposta de IgA foi detectada unicamente contra PL. PL e BL induziram reações de PCA muito fortes, sugerindo que ambas as frações contêm substâncias do látex envolvidas na alergenicidade. Além disso, a análise protéica de PL e BL sugere que BL ainda retém proteínas residuais, co-precipitadas com a borracha, abundantemente encontradas na fração PL, que poderiam explicar as alergenicidades semelhantes. Nenhuma reação de IgG1 foi detectada em quaisquer dos anti-soros testados. Conclui-se que as proteínas do látex foram parcialmente susceptíveis à proteólise em ensaios in vitro e, ou foram digeridas e absorvidas, ou foram absorvidas íntegras, quando ingeridas em ensaios in vivo. Eventos tóxicos ou letalidade associados ao látex, como descritos na literatura, não estão relacionados com a fração PL. A fração PL produziu efeito proliferativo parcial sobre as células mononucleadas, principalmente linfócitos e não induziu resposta inflamatória aguda, quando administrada pela via oral. Efeitos alergênicos puderam ser detectados, por via subcutânea, com as frações PL e BL, e não foram observados por via oral. Evidências para uma possível tolerância sistêmica às proteínas do látex por via oral foram fornecidas. As proteínas do látex podem atuar como imunoestimulantes. As proteínas do látex permanecem uma fonte interessante de moléculas biologicamente ativas que devem ser estudadas em detalhe quanto às suas propriedades estruturais, funcionais e aplicativas.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T02:53:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VillasBoas_MarianaBattaglin_M.pdf: 1570328 bytes, checksum: 8264ab45a2d69c56c77f60117495628a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O leite bovino contém várias proteínas que são consideradas antigênicas e capazes de induzir resposta imune, dentre elas, a ß-lactoglubulina (ß-Lg) é uma das mais antigênicas. A enzima transglutaminase (TG) é a única enzima utilizada comercialmente que catalisa reação de ligação cruzada inter ou intramolecular em diversas proteínas, formando polímeros de alta massa molar. Até o momento, pouco se conhece sobre a modificação dos epítopos antigênicos na estrutura das proteínas do soro de leite modificada ou polimerizada pela enzima TG. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da reação de polimerização induzida pela TG na atividade antigênica da ß-Lg. A modificação da ß-Lg com a TG foi realizada em dois experimentos: (1) a ß-Lg foi tratada termicamente (80 °C/60 min) em diferentes concentrações (3, 5 e 7%) e polimerizada com TG (5, 10, 25 e 50 U/g de proteína) e (2) a ß-Lg (3, 5 e 7%) foi polimerizada com TG 25 U/g de proteína na presença de agente redutor Cys nas concentrações 0,05, 0,1, 0,25 e 0,4 mol/L. A caracterização da ß-Lg polimerizada foi realizada por eletroforese (SDS-PAGE) e cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (CLAE-EM). A antigenicidade da proteína foi avaliada por métodos imunoquímicos, utilizando soro de camundongos BALB/c e técnicas de Immunoblotting e ELISA. Quando a ß-Lg 3% foi tratada termicamente e polimerizada com TG, 40% da ß-Lg permaneceu nas formas monomérica e dimérica. Já as amostras tratadas com maior concentração de proteína (5% e 7%) apresentaram de 70% a 87% de material com massa molar (MM) > 100 kDa, sendo que ß-Lg 7% polimerizada com 25U TG/g foi a que apresentou maior grau de polimerização. Na presença de Cys, observou-se maior percentual de produtos com MM > 100 kDa que o obtido com o tratamento térmico. Nas amostras ß-Lg 5% e ß-Lg 7%, a presença da Cys possivelmente aumentou a susceptibilidade da ß-Lg à polimerização. As amostras selecionadas para avaliação da antigenicidade foram ß-Lg nativa, ß-Lg 7% tratada termicamente e polimerizada com 25U TG/g de proteína (ß-Lg 7% TT 25TG) e ß-Lg 7% polimerizada com 25 U/g de proteína na presença de Cys 0,25 mol/L (ß-Lg 7% 0,25Cys TG). Os resultados mostraram que os animais sensibilizados com ß-Lg polimerizada na presença de agente redutor Cys apresentaram níveis séricos de IgE e IgG menores, comparados aos grupos imunizados com ß-Lg nativa e ß-Lg tratada termicamente e polimerizada com TG, sugerindo que a polimerização na presença de agente redutor Cys pode reduzir o potencial antigênico da proteína ao modificar .e/ou ocultar regiões de epítopos na proteína / Abstract: The bovine milk contains several proteins that are considered antigenic and capable of inducing immune responses, among them ß-lactoglubulin (ß-Lg) is one of the most antigenic protein. The enzyme transglutaminase (TG) is the only enzyme commercially used that catalyzes reaction of crosslinking inter or intramolecular in several proteins, forming polymer of high molecular mass. Up to now, little is known about modification of epitopes of whey proteins by the TG. The present study examines the effect of the polymerization reaction induced by TG on the antigenic activity of ß-Lg. The ß-Lg was modified by TG in two experiments: (1) ß-Lg was heat treated (80 °C/60 min) at different concentrations (3, 5 and 7%) and modified with TG (5, 10 , 25 and 50U / g protein), and (2) ß-Lg (3, 5 and 7%) was modified with TG 25U / g of protein in the presence of reducing agent Cys ( 0.05, 0.1, 0.25, 0.4 mol/L). The characterization of the modified ß-Lg was performed by electrophoresis (SDSPAGE) and high performance liquid chromatography molecular exclusion (HPLCMS). The antigenicity of the protein was measured by Immunoblotting and ELISA, using serum from BALB/c mices. When ß-Lg 3% was heat treated and modified by TG, 40% of the ß-Lg remained as monomeric and dimeric forms. However, the samples treated at higher protein concentration (5% and 7%) showed 70% to 87% of material with molecular weigh > 100 kDa. ß-Lg 7% modified with 25U TG / g presented the greatest degree of polymerization. In the presence of Cys, higher percentage of products with MW > 100 kDa was obtained than with the previous heat treatment. The presence of Cys increased the susceptibility of ß-Lg for polymerization, especially those treated at protein 5 and 7% concentrations. The samples selected for evaluation of the antigenicity were native ß-Lg, 7% ß-Lg treated with 25U TG / g of protein (ß-Lg 7% TT 25TG) and 7% ß-Lg treated with 25U TG / g protein in the presence of Cys 0.25 mol / L (ß-Lg 7% 0.25 Cys TG). The results showed that animals sensitized with ß-Lg in the presence of reducing the agent Cys had lower levels of IgG and IgE, compared to the groups immunized with native ß-Lg and ß-Lg treated with high temperature and modified with TG, suggesting that the polymerization in the presence of reducing agent Cys can modify or hide epitopes and reduce the potential antigenic of the protein / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O lÃtex da planta lactÃfera Calotropis procera (Ait.) R. Br. à um composto biologicamente ativo importante que apresenta propriedades relevantes como as atividades antiinflamatÃria e antidiarrÃica, embora jà tenha sido previamente mostrado que esse lÃtex produz efeitos tÃxicos considerÃveis em animais. Um outro fato à que nÃo à sabido, ainda, se as proteÃnas do lÃtex de C. procera produzem efeitos alergÃnicos, assim como as proteÃnas do lÃtex de Hevea brasiliensis. O potencial do lÃtex como um fÃrmaco, por essa razÃo, depende da separaÃÃo das propriedades curativas das propriedades tÃxicas e alergÃnicas, mas nÃo existe investigaÃÃo cientÃfica nessa Ãrea. O presente estudo teve como objetivo investigar aspectos bioquÃmicos, toxicolÃgicos e alergÃnicos do lÃtex da planta C. procera, atravÃs do estudo da digestibilidade in vitro e in vivo, avaliaÃÃo da toxicidade subcrÃnica e aguda por via oral e anÃlise da induÃÃo de resposta imune pelas vias subcutÃnea e oral das suas fraÃÃes. O lÃtex foi fracionado em trÃs fraÃÃes distintas de acordo com a sua solubilidade em Ãgua e tamanho molecular. As fraÃÃes foram assim denominadas: proteÃnas do lÃtex (PL), correspondendo Ãs principais proteÃnas do lÃtex; proteÃnas da diÃlise (PD), representando as substÃncias de baixa massa molecular; e borracha do lÃtex (BL) que à altamente insolÃvel em Ãgua. A fraÃÃo PL foi investigada, com relaÃÃo a alguns aspectos bioquÃmicos, como seu perfil protÃico por PAGE-SDS e anÃlise da composiÃÃo de seus aminoÃcidos. As proteÃnas do lÃtex tambÃm foram submetidas à digestÃo in vitro com as enzimas proteolÃticas pepsina, tripsina, quimiotripsina e protease de Streptomyces griseus e a digestibilidade in vitro foi avaliada por cromatografia de filtraÃÃo em gel ou PAGE-SDS. A digestibilidade in vivo de PL foi analisada quando animais experimentais ingeriram essa fraÃÃo por 35 dias. O volume de PL consumido foi registrado diariamente e amostras das fezes dos animais coletadas, tratadas e submetidas à PAGE-SDS e ensaios de imunodifusÃo radial dupla de Ouchterlony, com anticorpos policlonais contra PL. Com relaÃÃo aos aspectos toxicolÃgicos, a fraÃÃo PL foi oralmente administrada a animais experimentais por 35 dias, para a avaliaÃÃo da toxicidade subcrÃnica. Aumentos na massa corpÃrea foram registrados e amostras sangÃÃneas foram analisadas semanalmente. ApÃs o perÃodo experimental, os animais foram sacrificados e um nÃmero de parÃmetros bioquÃmicos e fisiolÃgicos foram determinados. Esses incluÃram determinaÃÃes sÃricas de glicose sangÃÃnea, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerÃdeos, testes da funÃÃo hepÃtica (proteÃnas totais, albumina, alanina aminotransferase â ALT e aspartato aminotransferase â AST), testes da funÃÃo renal (urÃia e creatinina), contagens total e diferencial de leucÃcitos sangÃÃneos e do fluido peritonial e anÃlise das proteÃnas sÃricas por PAGE-SDS. Os animais tiveram seus ÃrgÃos vitais (fÃgado, rins, baÃo, intestino delgado, intestino grosso, pÃncreas e estÃmago) dissecados e as massas frescas relativas foram determinadas. Na avaliaÃÃo da toxicidade aguda, a fraÃÃo PL foi administrada por via oral a animais experimentais e a monitoraÃÃo de alteraÃÃes comportamentais desses animais tambÃm foi realizada. Quanto aos aspectos alergÃnicos, respostas imunolÃgicas do lÃtex de C. procera foram investigadas pelas vias oral e subcutÃnea em camundongos. Anti-soros contra as fraÃÃes PL, PD e BL foram analisados quanto a IgG e IgA por ELISA, enquanto IgE e IgG1 foram monitoradas por anafilaxia cutÃnea passiva (PCA) em ratos e camundongos, respectivamente. Os perfis protÃicos das fraÃÃes PL e BL foram analisados por PAGE-SDS. Com relaÃÃo aos resultados dos aspectos bioquÃmicos, a fraÃÃo PL possui uma quantidade apreciÃvel de proteÃnas, baixo conteÃdo de aminoÃcidos sulfurados (metionina e cisteÃna) e um nÃmero considerÃvel de aminoÃcidos (arginina, lisina, fenilalanina e tirosina) que representam sÃtios de clivagem para as enzimas proteolÃticas animais usadas. A fraÃÃo PL foi digerida pela aÃÃo da pepsina, tripsina e quimiotripsina como revelado por anÃlises de filtraÃÃo em gel e PAGE-SDS. A digestÃo completa das proteÃnas do lÃtex foi facilmente obtida pelo tratamento com a protease de S. griseus. Anticorpos policlonais de coelho produzidos contra PL nÃo apresentaram reaÃÃo cruzada com as molÃculas presentes nas fezes dos ratos experimentais. PadrÃes semelhantes de eletroforese foram observados para as quantidades desprezÃveis de proteÃna observadas nos materiais fecais dos animais controle e experimentais. Quanto aos resultados da avaliaÃÃo da toxicidade subcrÃnica, nenhuma morte foi observada durante o experimento. Animais controle e experimentais apresentaram taxa de crescimento semelhante e os ÃrgÃos vitais exibiram massas frescas relativas similares. As funÃÃes hepÃtica e renal, parÃmetros glicÃmicos e lipidÃmicos sÃricos situaram-se em nÃveis normais. Os padrÃes protÃicos eletroforÃticos dos soros dos animais controle e experimental exibiram perfis muito similares. A fraÃÃo PL nÃo induziu inflamaÃÃo aguda na cavidade peritonial dos ratos, como determinado pelas contagens total e diferencial de leucÃcitos. O resultado mais relevante detectado foi um aparente efeito proliferativo das proteÃnas do lÃtex sobre os linfÃcitos sangÃÃneos que tenderam a aumentar, enquanto os neutrÃfilos permaneceram em nÃvel normal. Deve ser enfatizado que os animais experimentais exibiram comportamento, aspectos morfolÃgicos e bioquÃmicos normais, indicando ser improvÃvel que os mesmos estivessem sob qualquer condiÃÃo patolÃgica ou infecciosa. Portanto, o incremento da populaÃÃo de linfÃcitos no soro sangÃÃneo deve ser atribuÃdo a um efeito notÃvel das proteÃnas do lÃtex e nÃo a qualquer evento prejudicial. A fraÃÃo PL foi incapaz de induzir toxicidade aguda, pois nenhuma mudanÃa comportamental foi observada nos animais experimentais. Com relaÃÃo aos resultados dos aspectos alergÃnicos, nenhuma das fraÃÃes induziu aumentos nos nÃveis de anticorpos, quando os camundongos receberam as fraÃÃes do lÃtex por via oral e, portanto, nÃo desenvolveram alergia. Entretanto, anti-soros de camundongos sensibilizados com PL e BL por administraÃÃo subcutÃnea apresentaram resposta imunolÃgica considerÃvel, e PD nÃo induziu sÃntese de anticorpos. O nÃvel de IgG aumentou consistentemente contra PL e BL, enquanto a resposta de IgA foi detectada unicamente contra PL. PL e BL induziram reaÃÃes de PCA muito fortes, sugerindo que ambas as fraÃÃes contÃm substÃncias do lÃtex envolvidas na alergenicidade. AlÃm disso, a anÃlise protÃica de PL e BL sugere que BL ainda retÃm proteÃnas residuais, co-precipitadas com a borracha, abundantemente encontradas na fraÃÃo PL, que poderiam explicar as alergenicidades semelhantes. Nenhuma reaÃÃo de IgG1 foi detectada em quaisquer dos anti-soros testados. Conclui-se que as proteÃnas do lÃtex foram parcialmente susceptÃveis à proteÃlise em ensaios in vitro e, ou foram digeridas e absorvidas, ou foram absorvidas Ãntegras, quando ingeridas em ensaios in vivo. Eventos tÃxicos ou letalidade associados ao lÃtex, como descritos na literatura, nÃo estÃo relacionados com a fraÃÃo PL. A fraÃÃo PL produziu efeito proliferativo parcial sobre as cÃlulas mononucleadas, principalmente linfÃcitos e nÃo induziu resposta inflamatÃria aguda, quando administrada pela via oral. Efeitos alergÃnicos puderam ser detectados, por via subcutÃnea, com as fraÃÃes PL e BL, e nÃo foram observados por via oral. EvidÃncias para uma possÃvel tolerÃncia sistÃmica Ãs proteÃnas do lÃtex por via oral foram fornecidas. As proteÃnas do lÃtex podem atuar como imunoestimulantes. As proteÃnas do lÃtex permanecem uma fonte interessante de molÃculas biologicamente ativas que devem ser estudadas em detalhe quanto Ãs suas propriedades estruturais, funcionais e aplicativas. / The latex of the lactiferous plant Calotropis procera (Ait.) R. Br. is an important biologically active compound that displays relevant properties like antiinflammatory and antidiarrhea activities, although the latex has previously been shown to produce considerable toxic effects on animals. Another question is that it is not known yet whether the latex proteins from C. procera induce allergenic effects, just like the latex proteins from Hevea brasiliensis. The potential of the latex as a pharmaceutical, therefore, depends on separating the curative properties from the toxic and allergenic properties, but there has been a lack of scientific investigation in this area. The objective of the present study was to investigate biochemical, toxicological and allergenic aspects of the latex from the plant C. procera, through the study of in vitro and in vivo digestibility, evaluation of acute and subchronic toxicity by oral route, and analysis of immune response induction by subcutaneous and oral route of its fractions. The latex was fractionated into three distinct fractions according to their water solubility and molecular size. The fractions were named as: latex proteins (LP), corresponding to the major latex proteins; dialysis proteins (DP), representing low molecular size substances; and rubber latex (RL), which was highly insoluble in water. LP fraction was investigated in some biochemical aspects, like its protein profile by SDS-PAGE analysis and its amino acid composition determination. Latex proteins were also subjected to in vitro digestion with trypsin, chemotrypsin, pepsin and Streptomyces griseus protease and in vitro digestibility was evaluated by gel filtration and SDS-PAGE analysis. The in vivo digestibility of LP was analyzed when experimental animals ingested this fraction for 35 days. The volume uptake of LP was recorded daily and samples of fecal material from animals were collected, treated and submitted to SDS-PAGE analysis and radial double immunodifusion assays, with polyclonal antibodies raised against LP. In relation to toxicological aspects, LP fraction was orally administered to experimental animals for 35 days, to allow subchronic toxicity evaluation. Increases in body mass were recorded and blood samples were analyzed weekly. After the test period, the animals were sacrificed and a number of biochemical and physiological parameters determined. These included sera determinations of blood glucose, total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides, hepatic function tests (total proteins, albumin, alanine aminotransferase â ALT and aspartate aminotransferase â AST), renal function tests (urea and creatinin), total and differential leukocyte counts in blood and peritoneal fluid and analysis of sera proteins by SDS-PAGE. Animals had internal key organs (liver, kidneys, spleen, small intestine, large intestine, pancreas and stomach) dissected and the relative fresh masses were determined. In the acute toxicity evaluation, LP fraction was administered by oral route to experimental animals and behavioral changes in animals were also monitored. With reference to allergenic aspects, immunological responses of latex from C. procera were investigated by oral and subcutaneous routes in mice. Anti-sera against LP, DP and RL fractions were assayed for IgG and IgA titration by ELISA, while IgE and IgG1 were accessed by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats and mice, respectively. Protein profiles of LP and RL fractions were analyzed by SDS-PAGE. Concerning biochemical aspects results, LP fraction possesses appreciable amount of protein, low content of sulphurated amino acids (methionine and cysteine) and a considerable number of amino acids (arginine, lysine, phenylalanine and tyrosine) that represent cleavage sites to animal proteolytic enzymes studied. LP fraction was digested by the action of pepsin, trypsin and chemotrypsin as revealed by gel filtration and SDS-PAGE analyses. The full LP digestion was easily achieved by S. griseus protease treatment. Rabbit polyclonal antibodies raised against LP failed to detect cross-reactive molecules in faeces of experimental rats. Similar patterns of electrophoresis were observed for the negligible amounts of protein observed in the fecal materials of control and test animals. With relation to subchronic toxicity evaluation results, no death was observed during the experiment. Experimental and control animals presented similar growth rate and key organs exhibited similar relative fresh masses. Hepatic and renal functions, sera glycemic and lipidemic parameters were determined to be at normal levels. Likewise, the electrophoretic protein patterns of sera from untreated and treated animals exhibited quite similar profiles. Uptake of latex proteins did not induce acute inflammation into peritoneal cavity of rats as determined by the total and differential leukocytes counts. The most relevant result discovered was an apparent proliferative effect of the latex proteins upon blood lymphocytes that tended to increase, whilst neutrophils remained at normal level. It should be emphasized that the experimental rats were normal in their behavior, morphological and biochemical aspects, indicating that it is unlikely that they were under any pathological or infectious condition. Therefore, the increment of lymphocytes population in the blood serum should be attributed to the staking effect of the latex proteins rather than any harmful event. LP fraction was unable of presenting acute toxicity in experimental animals, because no behavioral changes in animals were observed. Concerning allergenic aspects results, none of the fractions induced antibodies level increases when mice received latex fractions by oral route and thus, did not develop allergy. Nonetheless, anti-sera of mice sensitized with LP and RL by subcutaneous administration displayed considerable immunological response, while DP did not induce antibodies synthesis. IgG level augmented consistently against LP and RL, while IgA response was detected to LP solely. LP and RL induced very strong PCA reactions suggesting that both fractions would contain latex substances involved in allergenicity. Furthermore, protein analysis of LP and RL suggests that RL still retain residual proteins, co-precipitated with rubber, abundantly found in LP, that could explain its similar allergenicity. No IgG1 reaction was detected in any of the anti-sera tested. It can be concluded that latex proteins were partially susceptible to digestive proteolysis when accessed by in vitro assays, and were digested and absorbed, or were absorbed in its intact form, when ingested and analyzed by in vivo tests. Toxic events or lethality associated with latex, as described in the literature, are not related to LP fraction. Latex proteins produced partial proliferative effect upon mononuclear cells, mainly lymphocytes and did not induce an acute inflammatory response, when administered by oral route. Allergenic effects could be detected, by subcutaneous route, with LP and RL fractions, and were not observed by oral route. Evidences for an inducible tolerance acquired to latex proteins by oral route were provided. Latex proteins may act as immune stimulants. The proteins from the latex remain an interesting source of biologically active molecules that should be studied in detail for their structural, functional and applicative properties.

Os parâmetros de avaliação de segurança de alimentos geneticamente modificados fundamentam-se na comparação de equivalência substancial entre as variedades e pela inocuidade de proteínas da planta GM com as proteínas encontradas nas plantas convencionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança alimentar de três cultivares de sojas geneticamente modificadas para tolerarem o herbicida glifosato através da determinação da equivalência substancial e do potencial alergênico das mesmas quando comparadas às suas respectivas parentais isogênicas. Seis amostras de soja foram analisadas, sendo três convencionais parentais e três GM, referentes ao cultivo de 2004-2005, em Goiás. Para a composição química foram realizadas análises em triplicata de proteínas, lipídeos, umidade, minerais e fibra alimentar. Análises complementares para determinação de aminoácidos, ácidos graxos, isoflavonas e ácido fítico também foram realizadas. O potencial de alergenicidade foi avaliado em extratos protéicos brutos de três cultivares convencionais e suas correspondentes GM. Os mesmos extratos protéicos foram fracionados para obter as globulinas 7S e 11S por precipitação e posterior purificação em coluna de bioafinidade Sepharose 4B. A glicoproteína 7S foi obtida a partir da eluição com tampão contendo -D-mannopyranoside. A resistência à proteólise foi realizada a partir de dois fluidos gástricos simulados com pepsina nas proporções 2,5:100 e 13:1 de enzima/substrato. As amostras foram submetidas à eletroforese dissociante para se estimar a resistência à ação da pepsina em função da concentração da enzima e do tempo de incubação. Extratos brutos protéicos e frações hidrolisadas foram testados contra soros de pacientes comprovadamente alérgicos e não alérgicos à soja nas concentrações de 1/20 em ensaios imunoquímicos do tipo ELISA e 1/10 em ensaios do tipo Western blotting. Os resultados da composição básica de nutrientes mostraram dispersões normais esperadas entre as amostras de mesma origem, com tendências de níveis superiores de proteínas de 9 a 16% nas amostras GM. As análises de fibras insolúveis e isoflavonas revelaram valores de decréscimo das amostras GMs em relação aos teores das variedades convencionais, contrastando com o acréscimo de valores de ácido fítico nas mesmas cultivares. Quanto à proteólise, foi possível observar estabilidade de bandas protéicas com pesos moleculares em torno de 50 e 18 KDa nos extratos brutos, 10 KDa nos extratos de 11S e 50 KDa nos extratos de 7S, em geral similares entre as parentais isogênicas e GMs. Os testes de reatividade dos soros de pacientes alérgicos e não alérgicos em extratos brutos protéicos das cultivares GM demonstraram reatividade similar quando comparados às suas respectivas parentais isogênicas. Com a observação dos resultados pode-se concluir que as diferenças significativas apresentadas pelas amostras GM não as tornam inseguras para o consumo humano e animal. Da mesma forma que não foram observadas alterações na alergenicidade das amostras GM em relação às amostras parentais isogênicas por apresentarem perfis semelhantes de proteólise frente à pepsina e aos testes imunológicos contra soros de pacientes alérgicos. / The parameters of security evaluation of genetically modified foods are based on the substantial equivalence among varieties and the innocuity of GM vegetal proteins compared with conventional vegetal proteins. The aim of this work was to evaluate the food safety of three genetically modified soybean cultivars to tolerate glyphosate herbicide through substantial equivalence determination and allergenic potential when compared to their respective isogenic parental. Six samples analyzed were three parental soybean (conventional) and the others GM, regarding to the crop of 2004-2005, grown in Goiás state. The chemical composition was performed in triplicate and the content of moisture, minerals, proteins, lipids and fiber were determined. Additional compounds like aminoacids, fatty acids, isoflavons and phytates were analyzed. The potential of allergenic reactions was evaluated in crude protein extracts of three conventional and their corresponding GM cultivars. The same protein extracts were fractionated to obtain 7S and 11S globulins by precipitation and posterior purification on Sepharose 4B bioaffinity column. The 7S glycoprotein was obtained by elution with -D-mannopyranoside buffer. The resistance to proteolysis was performed by two simulated gastric fluids with pepsin at the proportions 2,5:100 and 13:1 enzyme/substrate. The samples were run by SDS electrophoresis to estimate the resistance to pepsin action according to enzyme concentration and incubation time. Crude protein extracts and hydrolyzed fractions were tested against serum of allergic and non-allergic patients through ELISA immunochemistry essays at concentrations of 1/20 and Western blotting, 1/10. The results of chemical composition of nutrients showed an expected normal dispersion among samples from the same origin, with tendencies for superior levels of proteins from 9 to 16% by GM samples. The analyses of insoluble fibers and isoflavons revealed decreased values at GM samples regarding to the contents on conventional varieties, contrasting with the increase of the phytic acid values in the same cultivars. After the proteolysis, some protein bands remained apparently stable, that correspond to molecular weights around 50 and 18 KDa for crude extracts, 10 KDa for 11S extracts and 50 KDa for 7S extracts. The undigested proteins are similar in both set of samples, the parental isogenic and GM soybeans. Immuno-reactivity of proteins from crude extracts with serum from allergic and non allergic patients were also similar for isogenic and GM cultivars. These results allow us to state that the significant differences observed in the composition of GM samples will neither affect the nutrient levels nor the safety of their consumption as food or feed. As well as there were no observed changes at the potential allergenicity of GM samples regarding to parental isogenic samples by exhibit similar proteolysis profile related to pepsin and immunological essays against allergic patient serums.

Os parâmetros de avaliação de segurança de alimentos geneticamente modificados fundamentam-se na comparação de equivalência substancial entre as variedades e pela inocuidade de proteínas da planta GM com as proteínas encontradas nas plantas convencionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança alimentar de três cultivares de sojas geneticamente modificadas para tolerarem o herbicida glifosato através da determinação da equivalência substancial e do potencial alergênico das mesmas quando comparadas às suas respectivas parentais isogênicas. Seis amostras de soja foram analisadas, sendo três convencionais parentais e três GM, referentes ao cultivo de 2004-2005, em Goiás. Para a composição química foram realizadas análises em triplicata de proteínas, lipídeos, umidade, minerais e fibra alimentar. Análises complementares para determinação de aminoácidos, ácidos graxos, isoflavonas e ácido fítico também foram realizadas. O potencial de alergenicidade foi avaliado em extratos protéicos brutos de três cultivares convencionais e suas correspondentes GM. Os mesmos extratos protéicos foram fracionados para obter as globulinas 7S e 11S por precipitação e posterior purificação em coluna de bioafinidade Sepharose 4B. A glicoproteína 7S foi obtida a partir da eluição com tampão contendo -D-mannopyranoside. A resistência à proteólise foi realizada a partir de dois fluidos gástricos simulados com pepsina nas proporções 2,5:100 e 13:1 de enzima/substrato. As amostras foram submetidas à eletroforese dissociante para se estimar a resistência à ação da pepsina em função da concentração da enzima e do tempo de incubação. Extratos brutos protéicos e frações hidrolisadas foram testados contra soros de pacientes comprovadamente alérgicos e não alérgicos à soja nas concentrações de 1/20 em ensaios imunoquímicos do tipo ELISA e 1/10 em ensaios do tipo Western blotting. Os resultados da composição básica de nutrientes mostraram dispersões normais esperadas entre as amostras de mesma origem, com tendências de níveis superiores de proteínas de 9 a 16% nas amostras GM. As análises de fibras insolúveis e isoflavonas revelaram valores de decréscimo das amostras GMs em relação aos teores das variedades convencionais, contrastando com o acréscimo de valores de ácido fítico nas mesmas cultivares. Quanto à proteólise, foi possível observar estabilidade de bandas protéicas com pesos moleculares em torno de 50 e 18 KDa nos extratos brutos, 10 KDa nos extratos de 11S e 50 KDa nos extratos de 7S, em geral similares entre as parentais isogênicas e GMs. Os testes de reatividade dos soros de pacientes alérgicos e não alérgicos em extratos brutos protéicos das cultivares GM demonstraram reatividade similar quando comparados às suas respectivas parentais isogênicas. Com a observação dos resultados pode-se concluir que as diferenças significativas apresentadas pelas amostras GM não as tornam inseguras para o consumo humano e animal. Da mesma forma que não foram observadas alterações na alergenicidade das amostras GM em relação às amostras parentais isogênicas por apresentarem perfis semelhantes de proteólise frente à pepsina e aos testes imunológicos contra soros de pacientes alérgicos. / The parameters of security evaluation of genetically modified foods are based on the substantial equivalence among varieties and the innocuity of GM vegetal proteins compared with conventional vegetal proteins. The aim of this work was to evaluate the food safety of three genetically modified soybean cultivars to tolerate glyphosate herbicide through substantial equivalence determination and allergenic potential when compared to their respective isogenic parental. Six samples analyzed were three parental soybean (conventional) and the others GM, regarding to the crop of 2004-2005, grown in Goiás state. The chemical composition was performed in triplicate and the content of moisture, minerals, proteins, lipids and fiber were determined. Additional compounds like aminoacids, fatty acids, isoflavons and phytates were analyzed. The potential of allergenic reactions was evaluated in crude protein extracts of three conventional and their corresponding GM cultivars. The same protein extracts were fractionated to obtain 7S and 11S globulins by precipitation and posterior purification on Sepharose 4B bioaffinity column. The 7S glycoprotein was obtained by elution with -D-mannopyranoside buffer. The resistance to proteolysis was performed by two simulated gastric fluids with pepsin at the proportions 2,5:100 and 13:1 enzyme/substrate. The samples were run by SDS electrophoresis to estimate the resistance to pepsin action according to enzyme concentration and incubation time. Crude protein extracts and hydrolyzed fractions were tested against serum of allergic and non-allergic patients through ELISA immunochemistry essays at concentrations of 1/20 and Western blotting, 1/10. The results of chemical composition of nutrients showed an expected normal dispersion among samples from the same origin, with tendencies for superior levels of proteins from 9 to 16% by GM samples. The analyses of insoluble fibers and isoflavons revealed decreased values at GM samples regarding to the contents on conventional varieties, contrasting with the increase of the phytic acid values in the same cultivars. After the proteolysis, some protein bands remained apparently stable, that correspond to molecular weights around 50 and 18 KDa for crude extracts, 10 KDa for 11S extracts and 50 KDa for 7S extracts. The undigested proteins are similar in both set of samples, the parental isogenic and GM soybeans. Immuno-reactivity of proteins from crude extracts with serum from allergic and non allergic patients were also similar for isogenic and GM cultivars. These results allow us to state that the significant differences observed in the composition of GM samples will neither affect the nutrient levels nor the safety of their consumption as food or feed. As well as there were no observed changes at the potential allergenicity of GM samples regarding to parental isogenic samples by exhibit similar proteolysis profile related to pepsin and immunological essays against allergic patient serums.

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou diferença estatística entre as amostras analisadas, expresso em maior concentração nas amostras GM do que nas parentais. Nos testes de alergenicidade, os extratos protéicos das variedades GM demonstraram reatividade similar em relação as suas respectivas variedades parentais. A proteína de 115 kDa foi sequenciada e identificada como a proteína precursora da cadeia α da β-conglicinina e o spot das amostras GM que apresentou diferença estatística significativa foi identificado como a proteína precursora de G4 glicinina. A diferença observada entre as variedades parentais e GM para as subunidades α de β-conglicinina e G4 glicinina pode ter ocorrido devido a variações normais observadas entre diferentes variedades de soja. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação das ferramentas proteômicas na identificação de alterações de perfis protéicos de amostras de soja parentais e GM. Pelos dados obtidos podemos concluir que as diferenças apresentadas não comprometem a inocuidade alimentar das amostras de soja GM em relação a suas respectivas variedades parentais. / Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM varieties protein extracts showed similar reactivity in respect of their parental varieties. 115 KDa protein was sequenced and identified as the protein precursor of α subunit of β-conglicinina and the spot that GM samples presented significant statistical difference was identified as the G4 glicinina protein precursor. The difference between parental and GM varieties for subunits α of β-conglicinina and G4 glicinina may have occurred due to normal variation between different varieties of soy. The results demonstrate the viability of applying the tools Proteomics in identification of protein profiles changes of soya samples parental and GM. By data obtained can be concluded that the differences do not compromise the safety of food GM soybean samples with regard to their parental varieties.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / This work reports the biochemical characterization, cytotoxic and allergenic effects of a lipid transfer protein isolated from M. citrifolia seeds (McLTP1), with trypsin and alpha-amylase inhibition properties. McLTP1 was purified with a procedure involving trichloroacetic acid precipitation and gel filtration chromatography. This protein showed significant inhibitory activities against trypsin (767,10  8,36 TIU/mgP), chymotrypsin (25,36  0,86 IU/mgP), papain (65,419  0,152 IU/mgP) and alpha-amylase (24,40%). Atomic force microscopy displayed that McLTP1 oligomerized in tetramers showing a central channel. Fluorescence and CD assays revealed that the McLTP1 structure is highly stable, regardless of pH and temperature levels. In vitro, McLTP1 presented a selective cytotoxic effect to human ovarian cancer cells (OVCAR-8; IC50 of 16,6 μg/mL) and demonstrated hemolytic effect against fresh rabbit red blood cels. Similarly to other non-specific lipid transfer protein reported, McLTP1 showed allergenic properties in mice, being considered as a true food allergen since it was able to sensitize the animals via the gastrointestinal tract. / Morinda citrifolia L. à uma espÃcie nativa do Sudeste da Ãsia intensamente investigada em funÃÃo de suas propriedades terapÃuticas reportadas hà mais de 2.000 anos. Recentemente, uma proteÃna transferidora de lipÃdeos denominada McLTP1 (UniProt Accession Number: C0HJH5) foi isolada de sementes de noni pelo nosso grupo de pesquisa. McLTP1 à uma proteÃna termoestÃvel de massa molecular 9,4 kDa, resistente à proteÃlise e dotada de atividades moduladoras da inflamaÃÃo e da dor pela via oral, promissoras e inÃditas para esse grupo de molÃculas. Este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente McLTP1, bem como avaliar o seu potencial alergÃnico em camundongos, como etapas bÃsicas para o seu uso racional e seguro do ponto de vista farmacolÃgico. Em adiÃÃo, as propriedades terapÃuticas de McLTP1 foram tambÃm ampliadas, atravÃs da investigaÃÃo de seu efeito citotÃxico em diferentes linhagens de cÃlulas tumorais. A proteÃna em estudo foi isolada utilizando o protocolo jà estabelecido, envolvendo as etapas de precipitaÃÃo seletiva de proteÃnas do extrato total das sementes de noni com Ãcido tricloroacÃtico 2,5% e cromatografia de exclusÃo molecular. O ensaio de alergenicidade in vivo foi conduzido apÃs prÃvia aprovaÃÃo pelo Comità de Ãtica para Uso de Animais da Universidade Federal do Cearà e utilizou fÃmeas nulÃparas com massa corporal entre 25 e 30 g. McLTP1 apresentou in vitro atividades inibitÃrias de tripsina (767,10  8,36 UIT/mgP), quimotripsina (25,36  0,86 UI/mgP), papaÃna (65,419  0,152 UI/mgP) e alfa-amilase (24,40%). A atividade inibitÃria de tripsina de McLTP1 foi reduzida significativamente em temperaturas superiores a 37 ÂC, apresentando atividade residual de apenas 5,91% quando aquecida a 100 ÂC por 30 min. Essa atividade foi tambÃm influenciada pelo pH, sendo de apenas 30,13% e 39,05% quando a proteÃna foi incubada em tampÃes de pH 3,0 e 12,0. O padrÃo de oligomerizaÃÃo de McLTP1 demonstrou a formaÃÃo de agregados dimÃricos/tetramÃricos delimitando um canal central de diÃmetro de 4,4 nm. As anÃlises espectroscÃpicas mostraram que McLTP1 apresenta espectro de CD similar Ãquele apresentado por outras proteÃnas transferidoras de lipÃdeos e caracterÃstico de proteÃnas ricas em alfa-hÃlice. Espectro de CD de McLTP1 nÃo mostrou alteraÃÃes significativas em diferentes temperaturas e pHs, corroborando com os dados de estabilidade obtidos anteriormente. Diferentemente, em condiÃÃes redutoras (DTT 1 mM) o espectro de CD mostrou alteraÃÃo na estrutura secundÃria da proteÃna e os mÃnimos e mÃximos de elipticidade molar foram tambÃm alterados na presenÃa de micelas iÃnicas de SDS (10 mM). McLTP1 apresentou atividade citotÃxica seletiva contra cÃlulas de cÃncer de ovÃrio (Ovcar-8; CI50: 16,6 μg/mL), nÃo sendo citotÃxica para as cÃlulas tumorais de cÃlon humano (HCT-116), leucemia humano (HL-60) e glioblastoma humano (SF-295) testadas. McLTP1 foi capaz de promover hemÃlise significativa em hemÃcias de coelho a partir da concentraÃÃo de 0,005 mgP/mL. McLTP1 apresentou potencial efeito alergÃnico in silico e em camundongos imunizados pela via oral, induzindo a sÃntese de anticorpos IgG e IgG1. Tal como descrito na literatura para outras LTPs, anticorpos anti-McLTP1 produzidos em coelho foram tambÃm capazes de reconhecer proteÃnas presentes em extratos de Rosaceae, Cucurbitaceae e na polpa do fruto de noni. Os dados obtidos permitiram caracterizar parcialmente a proteÃna em estudo, bem como avaliar o seu potencial imunogÃnico apÃs administraÃÃo oral. Novos testes serÃo conduzidos objetivando avaliar a importÃncia clÃnica dessas respostas, uma vez que testes de toxicidade demonstraram que McLTP1 nÃo foi capaz de promover reaÃÃes adversas em camundongos, mesmo apÃs administraÃÃo da dose de 8 mg/kg por 28 dias.

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou diferença estatística entre as amostras analisadas, expresso em maior concentração nas amostras GM do que nas parentais. Nos testes de alergenicidade, os extratos protéicos das variedades GM demonstraram reatividade similar em relação as suas respectivas variedades parentais. A proteína de 115 kDa foi sequenciada e identificada como a proteína precursora da cadeia α da β-conglicinina e o spot das amostras GM que apresentou diferença estatística significativa foi identificado como a proteína precursora de G4 glicinina. A diferença observada entre as variedades parentais e GM para as subunidades α de β-conglicinina e G4 glicinina pode ter ocorrido devido a variações normais observadas entre diferentes variedades de soja. Os resultados demonstram a viabilidade de aplicação das ferramentas proteômicas na identificação de alterações de perfis protéicos de amostras de soja parentais e GM. Pelos dados obtidos podemos concluir que as diferenças apresentadas não comprometem a inocuidade alimentar das amostras de soja GM em relação a suas respectivas variedades parentais. / Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM varieties protein extracts showed similar reactivity in respect of their parental varieties. 115 KDa protein was sequenced and identified as the protein precursor of α subunit of β-conglicinina and the spot that GM samples presented significant statistical difference was identified as the G4 glicinina protein precursor. The difference between parental and GM varieties for subunits α of β-conglicinina and G4 glicinina may have occurred due to normal variation between different varieties of soy. The results demonstrate the viability of applying the tools Proteomics in identification of protein profiles changes of soya samples parental and GM. By data obtained can be concluded that the differences do not compromise the safety of food GM soybean samples with regard to their parental varieties.