Orientador: Ricardo Antunes Azevedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T15:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gaziola_SaleteAparecida_D.pdf: 4051671 bytes, checksum: 69f5c5ae7cb94c0486211b621052970f (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A regulação dependente de Ca2+ da atividade ATPásica da acto-miosina em concentrações fisiológicas de actina, tropomiosina e troponina ocorre exclusivamente na presença de troponina T (TnT). Nosso grupo demonstrou que um polipeptídeo correspondente aos primeiros 191 aminoácidos da TnT ativa a atividade ATPásica da acto-miosina na presença de tropomiosina e na ausência das outras duas subunidades do complexo troponina (TnI/TnC). Com o objetivo de mapear e caracterizar esse domínio ativatório da TnT, construímos fragmentos de TnT correspondentes às regiões compreendidas entre os resíduos de aminoácidos: 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-157 (TnT77-57), 77-191 (TnT77-191) e 158-191 (TnT158-191). Estudos das interações desses fragmentos com actina e tropomiosina demonstraram que: i) o fragmento TnTl-76 não se liga à tropomiosina ou a actina; ii) a região da TnT correspondente aos resíduos 158-191 liga-se à actina cooperativamente, mas não se liga à tropomiosina; iii) a região correspondente seqüência de aminoácidos 77-157 é necessária para a interação da TnT com o resíduo de aminoácido 263 da tropomiosina; iv) TnT77-191 ativa a atividade ATPásica da acto-miosina com a mesma intensidade que TnTl-191. Também observamos que TnTl-157, TnTl-76, TnT77-157, TnT158-91 e combinações de TnT158-191 com TnTl-157 e TnT77-157 não afetam a atividade ATPásica da acto-miosina. Concluímos que a região da TnT delimitada pelos aminoácidos 77 e 191 é essencial para a ativação da atividade ATPásica da actomiosina e que essa ativação é mediada pelas interações dessa região da TnT com a tropomiosina e a actina. / The Ca2+-regulation of the actomyosin ATPase activity at physiological ratios of actin, tropomyosin and troponin occurs only in the presence of troponin T. Our group has previously demonstrated that a recombinant polypeptide corresponding to the first 191 amino acids of TnT (TnTl-191) activates the aetomyosin Mg2+-ATPase activity in the presence of tropomyosin and in the absence of TnI/TnC. In order to further map and characterize this activation domain, we constructed a set of recombinant or synthetic TnT fragments, corresponding to amino acids 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-57 (TnT77-157), 77-191 (TnT77-191) and 158-191 (TnT158-191). Binding assays using these fragments demonstrated that: i) amino acids 1-76 of TnT do not bind to tropomyosin or actin; ii) amino acids 158-191 bind to actin cooperatively, but not to tropomyosin; iii) the sequence 77-157 is necessary for TnT\'s interaction with residue 263 of tropomyosin; iv) TnT77-191 on its own activates de actomyosin ATPase activity to the same extent as previously described for TnTl-191. TnT1-157; TnTl-76; TnT77-157; TnT158-191 and combinations of TnT158-191 with TnTl-157 or TnT77-157 showed no effect on the ATPase activity. We conclude that interactions of amino acids 77-191 of TnT with tropomyosin and actin are essential for the activation of actomyosin ATPase activity, and that this activation may be mediated in part by a direct interaction between TnT residues 158-191 and actin.

A regulação dependente de Ca2+ da atividade ATPásica da acto-miosina em concentrações fisiológicas de actina, tropomiosina e troponina ocorre exclusivamente na presença de troponina T (TnT). Nosso grupo demonstrou que um polipeptídeo correspondente aos primeiros 191 aminoácidos da TnT ativa a atividade ATPásica da acto-miosina na presença de tropomiosina e na ausência das outras duas subunidades do complexo troponina (TnI/TnC). Com o objetivo de mapear e caracterizar esse domínio ativatório da TnT, construímos fragmentos de TnT correspondentes às regiões compreendidas entre os resíduos de aminoácidos: 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-157 (TnT77-57), 77-191 (TnT77-191) e 158-191 (TnT158-191). Estudos das interações desses fragmentos com actina e tropomiosina demonstraram que: i) o fragmento TnTl-76 não se liga à tropomiosina ou a actina; ii) a região da TnT correspondente aos resíduos 158-191 liga-se à actina cooperativamente, mas não se liga à tropomiosina; iii) a região correspondente seqüência de aminoácidos 77-157 é necessária para a interação da TnT com o resíduo de aminoácido 263 da tropomiosina; iv) TnT77-191 ativa a atividade ATPásica da acto-miosina com a mesma intensidade que TnTl-191. Também observamos que TnTl-157, TnTl-76, TnT77-157, TnT158-91 e combinações de TnT158-191 com TnTl-157 e TnT77-157 não afetam a atividade ATPásica da acto-miosina. Concluímos que a região da TnT delimitada pelos aminoácidos 77 e 191 é essencial para a ativação da atividade ATPásica da actomiosina e que essa ativação é mediada pelas interações dessa região da TnT com a tropomiosina e a actina. / The Ca2+-regulation of the actomyosin ATPase activity at physiological ratios of actin, tropomyosin and troponin occurs only in the presence of troponin T. Our group has previously demonstrated that a recombinant polypeptide corresponding to the first 191 amino acids of TnT (TnTl-191) activates the aetomyosin Mg2+-ATPase activity in the presence of tropomyosin and in the absence of TnI/TnC. In order to further map and characterize this activation domain, we constructed a set of recombinant or synthetic TnT fragments, corresponding to amino acids 1-157 (TnTl-157), 1-76 (TnTl-76), 77-57 (TnT77-157), 77-191 (TnT77-191) and 158-191 (TnT158-191). Binding assays using these fragments demonstrated that: i) amino acids 1-76 of TnT do not bind to tropomyosin or actin; ii) amino acids 158-191 bind to actin cooperatively, but not to tropomyosin; iii) the sequence 77-157 is necessary for TnT\'s interaction with residue 263 of tropomyosin; iv) TnT77-191 on its own activates de actomyosin ATPase activity to the same extent as previously described for TnTl-191. TnT1-157; TnTl-76; TnT77-157; TnT158-191 and combinations of TnT158-191 with TnTl-157 or TnT77-157 showed no effect on the ATPase activity. We conclude that interactions of amino acids 77-191 of TnT with tropomyosin and actin are essential for the activation of actomyosin ATPase activity, and that this activation may be mediated in part by a direct interaction between TnT residues 158-191 and actin.

Orientadores: Nelci Fenalti Hoehr, Marcos N. Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vellasco_AdrianaPaula_M.pdf: 26494237 bytes, checksum: e3ca52142658174c0e80e93ec61ac27d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Dentre os aminotiois encontrados no plasma a cisteína, homocisteína e a glutationa constituem um sistema de defesa antioxidante extracelular. Em concentrações elevadas a homocisteína exerce ação oxidante, o que induz a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) sendo que a cisteína participa da autoxidação da homocisteína. Aumento dos níveis de cisteína pode ser um fator de risco cardiovascular bem como de lesões ateroscleróticas, indicando sua associação independente à doenças cardiovasculares. Contudo a associação de altos níveis de cisteína, homocisteína e LDL colesterol podem agir sinergicamente. Níveis alterados de cisteína também estão relacionados a inúmeras condições patológicas como mutações gênicas, doenças neurodegenerativas tais como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Neuromotoras; AIDS e câncer. Assim, o desenvolvimento de novas metodologias com a finalidade de quantificar cisteína em sangue ou urina são úteis no diagnóstico de diversas doenças. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método moderno e viável para quantificação de cisteína sérica. Para isso empregamos uma nova técnica: espectrometria de massas por introdução via membrana (MIMS), utilizando-se uma sonda de membrana DIMP (Direct Introduction Mass Spectrometry) operando no método T&R-MIMS (Trap and Release Membrane Introduction Mass Spectrometry). Analisando os espectros de massas obtidos durante as análises, a escolha do íon para o monitoramento da quantificação de cisterna foi o de m/z 220 que corresponde ao fragmento molecular por perda de um hidrogênio formando o íon '[M -H] POT +'. O íon de m/z 220 é o de maior intensidade (pico base) e presente em uma região do espectro menos suscetível a interferentes. Seu monitoramento por T&R-MIMS operando no modo SIM (monitoramento seletivo de íons) permite determinar a concentração de cisteína. Os resultados obtidos se mostraram satisfatórios: linearidade (r=0,998), repetibilidade com um desvio de 3% entre três medidas realizadas; limite de detecção de 2'mu'M e recuperação acima de 95%. Foram também realizados ensaios com amostras sanguíneas de quarenta doadores voluntários onde a concentração total de Cis em soro ficou entre 87 e 266 'mu' M/L com uma média '+ ou -' de 143, '+ ou -' 52,2 'mu'M/L / Abstract: The amino acid cysteine (Cys) and homocysteine (Hcy) takes part of a group of biological aminothiols in blood and others physiological fluids. These three thiols are involved in cellular homeostasis however altered levels of Cys and Hcy have been implicated in cardiovascular risk factor, and in a number of pathological conditions. A Mass Spectrometry method (DIMP/T&R-MIMS) for determination of cysteine (tCys) and homocysteine (tHcy) concentration directly from human blood after derivatization with ethyl chloroformate based on analyte preconcentration in a capillary silicone membrane and thermal desorbed to the gas phase using the heat radiation from the ionization filament using a new strategy for a trap & release and removable direct introduction membrane probe (DIMP), resulting in an technique with good sensitivity and stability. Cysteine and homocysteine determination was carried sample pumped continuously through the probe of the T&R-MIMS system for quantitation, during fifteen minutes (trapping step). After that occurs thermal desorption step needed for SVOC analysis in contact with the membrane, the volatile compounds permeates the membrane, and is ionized by electron impact (EI) and analyzed in the mass spectrometer. The method uses no chromatographic separation, is linear, reproducible, and displays limit of quantitation (2 'mu¿M) sufficiently below the threshold concentration of tCys and tHcy in plasma. Recovery experiments showed recoveries of 95% by Cys and 97% by Hcy. It also combines chemical, membrane, and mass spectrometric discrimination, and can be used to determine selected amino acids in human plasma simultaneously. After derivatization with ethyl chloroformate, many amino acids in aqueous solution are observed to be efficiently detected; hence T&R-MIMS is promising as a simple and sensitive technique for simultaneous quantitation of selected amino acids in plasma and urine, and in other aqueous matrices. Blood samples was analyzed by direct SIM monitoring and results showed with DIMP/T&R-MIMS potentiality in complex matrices / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Na busca por agonistas, antagonistas e inibidores de natureza peptídica do fator de crescimento de fibroblastos ácido humano (hFGF-1), iniciamos o presente trabalho fazendo uma análise conformacional teórica do peptídeo Ac- WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (107-123 [hFGF-1]). Em trabalho anterior, este composto havia se mostrado um agonista da atividade mitogênica da proteína capaz de inibir a ligação de 125I-hFGF-1 aos seus receptores celulares e de se ligar à resina heparina-Sepharose (Oyama et al. 1996). Os cálculos das propriedades dinâmicas deste peptídeo (I; Tabela 1) demonstraram que ele não adotava nenhuma conformação preferencial, o que poderia justificar a baixa atividade apresentada pelo mesmo (104 vêzes menor do que a da proteína nativa). Este peptídeo foi ressintetizado, purificado, caracterizado química e biologicamente, confirmando os resultados anteriores. Seu comportamento randômico foi comprovado experimentalmente através de uma análise estrutural parcial por 1H-RMN. O resultado desta análise demonstrou que este peptídeo exibe uma configuração random coil, em solução aquosa (Kiyota et al., 1996, 1999). Diante desta constatação e com base em dados descritos na literatura (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Blaber et al., 1996; Ornitz et al., 1996; Zhu et al.,1991, 1995, 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996); desenhamos dezessete peptídeos relacionados ao Sítio 2 (97-132) do hFGF-1 mostrados na Tabela 1 (ver arquivo PDF). Todos os peptídeos foram sintetizados manualmente por síntese em fase sólida, sempre que possível purificados à homogeneidade por RP-HPLC e caracterizados quimicamente por RP-HPLC, análise de aminoácidos e espectrometria de massas. Os peptídeos cíclicos foram obtidos por: a) oxidação das sulfidrilas das cisteínas e formação de ponte dissulfeto intramolecular; b) reação entre os grupos amina e carboxila de cadeias laterais de dois diferentes resíduos de aminoácidos com formação de uma ligação lactama. Os testes de atividade mitogênica foram realizados sempre que os peptídeos eram obtidos com pureza ≥90% determinada por RP-HPLC analítica em dois sistemas diferentes de solventes. Os resultados obtidos em culturas de fibroblastos de camundongos Balb/c 3T3 mostraram que: 1) II, III, VI-IX e XIII eram inativos; 2) o cíclico IV era mitogênico (ED50 ~50 µM) ao contrário do seu análogo linear correspondente (III); 3) V, um análogo de IV que apresenta deleção de um resíduo (Asn), exibia uma atividade mitogênica menor do que a de IV; 4) X exibia uma atividade mitogênica menor do que a do I; 5) os cíclicos XII e XV exibiam atividades comparáveis a do I, enquanto que os seus análogos lineares correspondentes (XI e XIV) eram inativos; 6) XVI e XVII exibiam atividades mitogênicas também comparáveis à de I. Paralelamente a estes estudos, foi desenvolvido um modelo teórico dos domínios extracelulares DII e DIII do FGFR-1β. A partir do posicionamento gráfico das moléculas de hFGF-1 e de um hexassacarídeo de heparina junto a este modelo do receptor, foram desenhados os peptídeos Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) e Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX) (Oyama et al., 1997). Estes dois peptídeos cujas seqüências primárias são, respectivamente, relacionadas àquelas dos loops DE e FG do domínio DIII, foram também sintetizados e testados neste trabalho como possíveis ligantes do sítio 2 do hFGF-1.Os testes biológicos demonstraram que o peptídeo XIX, na faixa de concentração testada, não exibia nenhuma atividade inibitória sobre as atividades mitogênicas dos FGFs -1 e -2. Por outro lado, notou-se um claro efeito inibitório de XVIII sobre a atividade mitogênica de ambas as proteínas, sendo este efeito mais significativo para o FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Alguns dos peptídeos estudados foram submetidos a análises espectroscópicas com o objetivo de determinar suas conformações em solução. Este conhecimento forneceria subsídios para o desenho de novos peptídeos mitogênicos e, mais ainda, para determinação dos requisitos estruturais destes peptídeos e, como reflexo, do hFGF1 para expressão de suas atividades mitogênicas. Assim, foi feita uma análise parcial do peptídeo mitogênico IV e de seu análogo linear III inativo em solução aquosa empregando fluorescência e 1HRMN ( (Kiyota et al., 1998). Estes peptídeos foram analisados também por técnicas de CD e 1H-NMR (Kiyota et al., 1999). Os resultados obtidos mostraram que III e IV parece se organizarem de forma semelhante em suas porções N-terminais, em estruturas correspondentes a β-turns. Por outro lado, as conformações das porções C-terminais destes peptídeos diferiram; somente em IV, observouse a presença de uma família de confôrmeros com estruturas helicoidais nessa porção do esqueleto e que eram superponíveis. O mesmo não foi observado na porção C-terminal de III. A análise conformacional do peptídeo XVIII em solução foi também realizada empregando-se CD e 1H-RMN. Os resultados obtidos indicaram que este peptídeo tem forte tendência em assumir uma estrutura helicoidal em solução aquosa contendo 50% CD3OH. O conjunto dos resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que: 1) a presença de W107 e F108 é, de fato, essencial para a expressão da atividade mitogênica de peptídeos derivados do sítio 2 do hFGF-1; 2) a presença de N106 adjacente ao core hidrofóbico constituído pelos resíduos W107F108 é importante; 3) a ciclização do peptídeo IV foi decisiva para a expressão de sua atividade, indicando que, não apenas a presença, mas o posicionamento adequado das cadeias laterais de N106, W107 e F108 são determinantes; 4) apenas uma das lisinas (K112 ou K113) é essencial para a atividade mitogênica (X, XVI e XVII); 5) o importante parece ser a manutenção do posicionamento das cadeias laterais em relação aos dos outros resíduos contidos na seqüência, uma vez que, a substituição do segmento 112KKNGS116 por uma prolina e/ou deleção de 120GPRT123 (XI e XIV) abolem a atividade mitogênica do peptídeo; 6) a ciclização que mantem a distância e as orientações relativas entre WF e KR (considerados essenciais para a atividade) em seqüência (XII e XV), leva à recuperação da atividade; 7) a atividade inibitória específica para o FGF-2 exibida pelo peptídeo XVIII parece ser um indicativo de que a alça DE do domínio DIII do receptor pode estar envolvido na ligação a esta proteína. Estas conclusões são relevantes e essenciais para: 1) o entendimento dos requisitos estruturais para a atividade mitogênica dos peptídeos estudados e, como reflexo, do hFGF-1, 2) o desenho de novos agonistas, antagonistas ou inibidores do sistema FGF. / In our search for small potent agonists or inhibitors related to hFGF-1(97-132), we first investigated the preferred conformation in solution of Ac -WFVGLKKNGSSKRGPRT-NH2 (I), by 1H-NMR. This compound has been described as a weak agonist of the mitogenic activity of this growth factor able to inhibit the binding of 125I-hFGF-1 to their cellular receptors, and to heparin-Sepharose columns (Oyama et al., 1996). We found that this peptide is in a random coil configuration, which could explain its low activity (104 times less potent than the native protein). On the basis on these results and on several data available in the literature (Harper & Lobb 1988; Burgess et al., 1991; Pantoliano et al., 1994, Springer et al., 1994; Thompson et al., 1994; Imamura et al., 1995; Ornitz et al., 1996; Blaber et al., 1996; Zhu et al., 1991, 1995; 1997; Schwizer, 1995; Sieber & Moe, 1996; Rizo et al., 1996), we designed seventeen peptides related to the Site 2 (97-132)[hFGF-1] listed on the Table 1: some were linear and some were cyclic. They were synthesized manually using the solid phase method, purified by RP-HPLC, and chemically characterized by RP-HPLC, amino acid analysis and mass spectrometry. Conformational constraints of certain peptides were achieved by cyclization. Intramolecular dissulfide bonds were formed by the oxidation of the thiol groups of two cysteins residues with air oxigen and/or K2Fe(CN)6. Lactama bonds were formed between the functional side chain group of acidic and basic residue. The synthetic peptides were tested in of their ability to inducing mitogenic response on Balb/c 3T3, A-31 clone fibroblasts cultures. The results obtained were the following: 1) peptides II, III, VI-IX were essentially inactive on Balb/c 3T3 fibroblasts in the range of concentrations used (up to 200 µM), 2) in the same range of concentration, peptide IV showed an ED50 60µM (similar to that found for peptide I) while its correspondent linear analog (III) was inactive; 3) V, analog of IV, that has Asn deleted, exibihited mitogenic activity lower than IV; 4) X showed a mitogenic activity on Balb/c fibroblasts lower than I, 5) cyclic peptides XII and XV showed mitogenic activities similar to that of I, while their correspondent linear (XI and XIV) and cyclic (XIII) analogs were inactive; 6) XVI and XVII showed mitogenic activities similar to that found for I. In parallel, two peptides [Ac-170NTTDKENEVLH180-NH2 (XVIII) and Ac-194SLAGNSIGLSH204-NH2 (XIX)], derived from DIII FGFR-1β and designed as putative ligands of Site2 hFGF-1, were synthesized and tested. In the range of concentration used (up to 200 µM), XIX was inactive and exhibited no inhibitory effect on FGF-1 and FGF-2 mitogenic activities. Nevertheless, XVIII inhibited the mitogenic activity of both proteins, being this effect clearly more significant for the FGF-2 (Kiyota et al., 1998). Some of synthetic peptides have been spectroscopically analyzed in order to disclose the structural features that characterize the active (Kiyota et al., 1999). A detailed analysis was undertaken with peptides III and IV using circular dichroism (CD) and 1H-NMR. Although the similarities in their primary sequences, III has shown inactive when tested on Balb/c 3T3 fibroblasts culture while IV was mitogenic with ED50 values around 50 µM. I was also not capable of inhibiting the binding of hFGF-1 to its cellular receptors, I was inactive while II inhibits it with ID50 values of about 30 µM. Circular dichroism study showed that while at increasing SDS concentrations the spectra of III suggested the presence of an equilibrium among partially structured states, those of IV indicated that this peptide exists in unordered extended conformation, folds into a β-conformation and, finally, assumes a helix rich structure. 1H-NMR analysis revealed the existence of a well defined γ-turn encompassing residues 4-6 that nicely fits with that present in the same portion of the crystallized hFGF-1. Superposition of the final structures of III and IV over the entire sequence revealed that only the C-terminal portion of III has the tendency to fold into a regular structure. Together these data indicate that the turn existence in IV allowed it to acquire the structural determinants for the expression of mitogenicity probably through a more appropriate arrangement of residues 8-10. More importantly, they demonstrate that we have found a short agonist of hFGF-1 able to structurally mimic its corresponding stretch. Conformational analysis of XVIII in solution was undertaken also by using CD e 1HRMN. The results obtained indicated that it has a strong tendency to assume helicoidal configuration in aqueous solution containing 50% CD3OH. Altogether these data led us to conclude that: 1) the presence of Asn106 adjacent to hydrophobic core constituted by W107F108 is essential for the mitogenic activity of IV; 2) conformation constraint by cyclization was efficient for the correct N106, W107 and F108 side chains orientation in peptide IV for an effective cellular receptors binding; 3) peptides related to hFGF-1 (114-123) seem to be promising mitogenic agonists; 4) the only one lysine between L126 and N129 is enough for the mitogenic activity expression (X, XVI and XVII); 5) deletions of residues, replacement of deleted fragment by Pro followed by restriction of peptide conformation might keep the frame of the residues considered essential for the mitogenic activity along the peptides backbones; 6)The inhibitory effect on the FGF-2 mitogenic activity observed in peptide XVIII was indicative that the loop DE of DIII FGFRs seems to be involved in the binding of this protein.These conclusions are very relevant in terms of the knowledge of the structural requirements for the mitogenic activity of studied peptides and, as a reflex, of the hFGF-1. Furthermore, they constitute additional guidelines for designing new constrained peptides derived from this segment of FGF-1, which may result in more potent agonists, antagonists or inhibitors of such important target.

Nível elevado de homocisteína (Hcy) no plasma é considerado fator de risco de doença cardiovascular. Consumo reduzido de vitaminas B6, B12 e ácido fólico tem sido relacionado com hiperhomocisteinemia. O objetivo desse estudo foi verificar o consumo de vitaminas B6, B12 e ácido fólico nas populações urbana e rural, bem como a correlação dos níveis plasmáticos dessas vitaminas com os níveis plasmáticos de Hcy. Também determinamos os níveis séricos de lipídeos e avaliamos o risco cardiovascular das populações frente a hiperlipemia. O consumo de B6 e ácido fólico é maior na população urbana, com p=0,00 e p=0,04 respectivamente, sendo o consumo de B12 maior na população rural, com p=0,47. As correlações são significativamente negativa entre Hcy e as vitaminas B12 e ácido fólico . A população rural apresenta Hcy com valor médio de 16,5±9,2µmol/L, classificada como hiperhomocisteinemia moderada, e a população urbana 12,8±5,5 µmol/L, o qual está dentro da faixa de referência. O valor médio de LDL sérica é maior na população urbana (3,4±0,8mmoI/L) do que na população rural (2,8±0,9mmoI/L), com valor de p=0,00. Como fator de risco cardiovascular, consideramos Hcy plasmática >14µmol/L e LDL sérica >3,38mmol/L. Neste caso, 41,4% da população rural e 7,4% população urbana apresentam Hcy maior que 14µmol/L. O inverso ocorre em relação a LDL, onde 43,2% da população urbana e 11% na população rural apresentam níveis acima de 3,38mmol/L. Concluímos que o risco cardiovascular decorrente de hiperhomocisteinemia é maior na população rural que na urbana e este risco poderia reduzir mediante o consumo de vitaminas. / Elevated levels of plasma homocysteine (Hey) are considered a risk factor for cardiovascular diseases. Low intake of vitamins 86, 812 and folic acid have been related to hyperhomocysteinemia. The purpose of the present study is to determine the consumption of the vitamins B6, B12 and folic acid in two Brazilian urban and rural populations, along with the plasmatic levels of these vitamins and plasmatic homocysteine. In addition, the serum levels of lipids have been determined to evaluate the cardiovascular risk in the two populations regarding their hyperlipidemie comdition. The consumption of B6 and folic acid is higher in the urban population (p=0.00 and p=0.04 respective/y), while the consumption of B12 is not significantly different (p=0.47). There is a negative correlation between B12 and folic acid with Hcy. The rural population shows mean Hcy value of 16.5±9.2µmol/L and is classified as having moderate hyperhomocysteinemia, while for the urban population, the mean value is 12.8±5.5µmol/L and is well within the normal range. The mean value of the serum LDL is higher in the urban population (3.4±0.8mmol/L) compared to the rural population (2.8±0.9mmol/lL) with a significance of p=0.00. Plasma Hcy values >14µmol/L and serum LDL >3.38mmol/L were considered as the risk factors for cardiovascular disease. With in the reference values, 41.4% of the rural population and 7.4% of the urban population showa Hcy as a risk factor. For LDL, the inverse is true, i.e 43.2% of urban and 11% of the rural population are at risk. We conclude that the cardiovascular risk arising from hyperhomocysteinemia is higher in the rural population and that this can be reduced by increased consumption of vitamins.

A restrição calórica (RC) é uma intervenção dietética capaz de estender a longevidade de vários organismos. O modelo para RC em Saccharomyces cerevisiae consiste da diminuição da concentração de glicose no meio de cultura e mostra um aumentado tanto do tempo de vida cronológico quanto replicativo. Nosso objetivo foi investigar experimentalmente a ação da RC, focando principalmente nas causas e consequências das modificações de geração de EROs mitocondriais e como estas estão associadas ao processo de envelhecimento. Em um primeiro período de estudos, verificamos quais as fontes mitocondriais de EROs, e comprovamos que uma quantidade significativa se origina de proteínas da matriz mitocondrial, e não da cadeia de transporte de elétrons. Nós estudamos a participação de glicose e de outras fontes de carbono sobre o tempo de vida cronológico em leveduras e mostramos que o aumento da longevidade promovida pela RC está associado à uma mudança de metabolismo fermentativo para respiratório, com participação da via de sinalização de glicose. No estágio realizado no laboratório do Professor Francis Sluse na Université de Liegè, Bélgica, estudamos a ação da RC em leveduras focando nas consequências das modificações no proteoma mitocondrial. Em nosso estudo proteômico, encontramos grandes modificações em proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos. Monitoramos a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e o tempo de vida cronológico de S. cerevisiae e as mutantes nulas bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ e gdh3Δ, que codificam a aminotransferase de aminoácidos de cadeia ramificada citosólica, NADP glutamato desidrogenase citosólica, a NAD glutamato desidrogenase mitocondrial, e a NADP glutamato desidrogenase mitocondrial, respectivamente. A atividade da NAD glutamato desidrogenase é aumentada em RC, mas a de NADP glutamato desidrogenase decresce em células controle. Aumentos do tempo de vida cronológico foram observados nas mutantes bat2Δ e gdh1Δ devido a RC, mas nenhuma diferença significativa foi encontrada nas mutantes nulas para Gdh2p e Gdh3p em fase estacionária, indicando que essas proteínas são essenciais para os efeitos benéficos da RC. Nessas células WT crescidas em condições normais e as mutantes nulas apresentam iguais longevidades. Juntos, nossos resultados indicam que o aumento da longevidade em S. cerevisiae promovida pela RC depende da interação entre o sinal de glicose e o metabolismo de aminoácidos. / Calorie restriction (CR) is a dietary intervention capable of extending lifespans in a wide range of organisms. A yeast model of CR has been developed in which limiting the concentration of glucose in growth media of Saccharomyces cerevisiae leads to enhanced chronological and replicative life spans. Our aim was to experimentally investigate the effects of CR, focusing mainly on the causes and consequences of changes in mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation and how these are associated with the aging process. Initially, we looked for sources of mitochondrial ROS, and found that a significant amount of ROS comes from mitochondrial matrix enzymes and not from the electron transport chain. We studied the participation of glucose and other carbon sources in chronological lifespan and show that increased longevity promoted by CR is associated with a metabolism change from fermentation to respiration, with participation of glucose repression pathway. During studies performed in the laboratory of Professor Francis Sluse at the Université de Liège, Belgium, we studied the effect of CR in yeast with focus on the consequences of changes in the mitochondrial proteome. We found large proteomic changes in proteins involved in amino acid metabolism. We monitored the activity of enzymes related to amino acid metabolism and chronological life span of S. cerevisiae null mutants bat2Δ, gdh1Δ, gdh2Δ, and gdh3Δ, which encode for the cytosolic branched-chain amino acid aminotransferase, cytosolic NADP glutamate dehydrogenase, mitochondrial NAD glutamate dehydrogenase and mitochondrial NADP glutamate dehydrogenase, respectively. The activity of NAD glutamate dehydrogenase is increased in CR, but NADP glutamate dehydrogenase decreases in control cells. Increases in chronological life span due to RC were observed in bat2Δ and gdh1Δ mutants, but no significant difference was found in Gdh2p and Gdh3p null mutants in the stationary phase, indicating that these proteins are essential for the beneficial effects of CR. In rich medium, WT cells and null mutants have similar life spans. Together, our results indicate that longevity enhancement by CR in S. cerevisiae depends on the interaction between glucose signals and amino acid metabolism

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-16T16:18:56Z No. of bitstreams: 1 ana_carolina_r_guimaraes_ioc_bcm_0008_2010.pdf: 7783704 bytes, checksum: c55aa365e04b94c51640b1937be9e63d (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-16T16:18:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_carolina_r_guimaraes_ioc_bcm_0008_2010.pdf: 7783704 bytes, checksum: c55aa365e04b94c51640b1937be9e63d (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O estudo da reconstrução metabólica em diversos organismos expõe a existência de compostos cruciais para a sua sobrevivência. Dentre estes compostos, estão as enzimas, responsáveis pela catálise das reações bioquímicas em vias metabólicas. Diferentemente das enzimas homólogas, as enzimas análogas (também conhecidas como enzimas isofuncionais não homólogas) são capazes de catalisar as mesmas reações, mas sem apresentar similaridade de sequência significativa no nível primário e, possivelmente, com diferentes estruturas tridimensionais. Um estudo detalhado destas enzimas pode desvendar novos mecanismos catalíticos, adicionar informações sobre a origem e evolução de vias bioquímicas e revelar alvos potenciais para o desenvolvimento de drogas. Para muitas enfermidades causadas por parasitas, as opções terapêuticas permanecem ineficientes ou inexistentes, exigindo a busca de novos alvos. Estes podem ser proteínas específicas do parasita ausentes no hospedeiro ou compostos presentes em ambos, mas com estrutura tridimensional substancialmente diferente, como as enzimas análogas. A ferramenta AnEnPi, capaz de identificar, anotar e comparar enzimas homólogas e análogas, foi desenvolvida e utilizada para reconstruir computacionalmente as vias metabólicas de alguns organismos modelo, como os tripanossomatídeos. Uma análise mais focada no metabolismo de aminoácidos de Trypanosoma cruzi identificou alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas. Além disso, uma revisão do metabolismo geral de T. cruzi foi realizada em outras vias metabólicas, levando em consideração esta nova abordagem de busca por potenciais alvos terapêuticos. Uma vez que a estrutura tridimensional é importante no estudo de analogia, a ferramenta MHOLline foi utilizada para a obtenção de modelos 3D a partir de homólogos, análogos e proteínas específicas de T. cruzi versus Homo sapiens. As estratégias utilizadas nesse trabalho apóiam o conceito de análise estrutural, juntamente com a análise funcional de proteínas, como uma interessante metodologia computacional para detectar potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas. / The study of metabolic reconstruction in different organisms exposes the existence of crucial compounds for its survival. Examples of these compounds are the enzymes that are responsible for the catalysis of biochemical reactions in metabolic pathways. Unlike the homologous enzymes, the analogous enzymes (also known as non- homologous isofunctional enzymes) are able to catalyze the same reactions, but without significant sequence similarity at the primary level and possibly with different three-dimensional structures. A detailed study of these enzymes may exhibit new catalytic mechanisms, add information about the origin and evolution of biochemical pathways and reveal potential targets for drug development. For many diseases caused by parasites, therapeutic options remain inefficient or nonexistent, requiring the search for new drug targets. These targets may be specific proteins of the parasite (absent in the host) or compounds present in the both organisms but with different three-dimensional structure, like analogous enzymes. The tool AnEnPi approach was able to identify, annotate and compare homologous and analogous enzymes. It was developed and used to reconstruct computationally the metabolic pathways of some model organisms such as trypanosomes. A more focused analysis on the amino acids metabolism of Trypanosoma cruzi identified promising targets for the development of new drugs. Furthermore, a review of the general metabolism of T. cruzi was carried out in other metabolic pathways, taking into account this new approach in the search for potential therapeutic targets. Since the three-dimensional structure is important in the study of analogy, the tool MHOLline was used to obtain 3D models for homologous, analogous and specific proteins of T. cruzi versus Homo sapiens. The strategies used in this study support the concept that structural analysis together with protein functional analysis could be an interesting computational methodology to detect potential targets for structure-based rational drug design.