Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5005.pdf: 2296978 bytes, checksum: 77a669d7d6cbf4916130d05c32dc1e39 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / The loss and fragmentation of habitat due to intensive human intervention are the main threats to natural populations. Species with low density and large home range, like felids, are the most threatened species by these changes. In an attempt to minimize this impact, detection of population density and genetic characterization are necessary to propose conservation measures. Thus, the main objective of this study was to characterize the populations of two species of felines, cougars (Puma concolor) and ocelots (Leopardus pardalis) of Caetetus Ecological Station (EEC - SP, one of the last remnants of Atlantic Forest within the state of São Paulo), about their demographic and genetic characteristics from non-invasive samples (feces and hairs).We collected the samples on EEC tracks and identified the species, individualized each sample, sexed each individual and calculated the genetic diversity of the population using molecular markers. Abundance was estimated from the capture-recapture historic, with opened and closed population models. We identified 17 samples of feces cougar and 12 of ocelot. Of these samples, six individuals were individualized as cougar and five as ocelot, these numbers represent the minimum population sizes for the entire sample period (18 months). The values of abundance and density estimated using the model of closed population was more similar to that found in genetic individualization, five individuals for each species and densities of 4.92/100 km2 (P. concolor) and 19.51/100 km2 (L. pardalis). The genetic diversity of the two species was lower than that from other studies, probably due the landscape´s fragmentation, which reduces the gene flow with others populations. Also, the genetic diversity for L. pardalis was lower than P. concolor, which is possibly related to the ocelot behavior of avoid opened and disturbed areas, which can reduce the potential for gene flow. Furthermore, we also observed structure of P. concolor from EEC with populations from other locations, but we also identified gene flow, including relatedness. Thus, the results of genetic diversity and demographics demonstrate the importance of the Ecological Station Caetetus for these species and also underscores the importance of establishing measures to enable the viability of its populations over long term, as facilitating gene flow with individuals from others locations. / A perda e fragmentação do habitat, decorrentes da intensa intervenção antrópica, estão entre as principais ameaças às populações naturais. Espécies com baixa densidade e grandes áreas de vida, como os felinos, são ainda mais prejudicadas por essas mudanças. Na tentativa de minimizar esse impacto, a detecção da densidade populacional e a caracterização genética são necessárias para que medidas de conservação sejam propostas. Nesse sentido, o objetivo principal deste trabalho foi caracterizar populações de duas espécies de felinos, onça-parda (Puma concolor) e jaguatirica (Leopardus pardalis) da Estação Ecológica dos Caetetus (EEC SP, um dos últimos remanescentes de Mata Atlântica no interior do estado de São Paulo), quanto às suas características demográficas e genéticas, a partir de amostras não invasivas (fezes e pelos). Coletamos as amostras nas trilhas da EEC, das quais pudemos identificar as espécies, individualizar, sexar cada indivíduo e calcular a diversidade genética da população utilizando marcadores moleculares. A abundância foi estimada a partir do histórico de captura-recaptura com modelos de população aberta e fechada. Identificamos geneticamente 17 amostras de fezes de onça-parda e 12 de jaguatirica. Dessas amostras, individualizamos seis indivíduos de onça-parda e cinco de jaguatirica, sendo esses os tamanhos populacionais mínimos para todo o período de amostragem (18 meses, entre dezembro de 2010 a maio de 2013). Os valores de estimativa de abundância e densidade utilizando o modelo de população fechada foram mais próximos ao encontrado na individualização genética, sendo cinco indivíduos para cada espécie e densidades de 4,92/100 km2 (P. concolor) e 19,51/100 km2 (L. pardalis). A diversidade genética encontrada para as duas espécies foi menor quando comparada com outros trabalhos, provavelmente ao menor fluxo gênico com outras populações devido à fragmentação da paisagem. Além disso, a diversidade genética encontrada para L. pardalis foi menor quando comparada a P. concolor, possivelmente relacionado ao hábito da espécie em evitar áreas mais abertas e antropizadas, o que pode reduzir o potencial de fluxo gênico. Já para P. concolor foi encontrada estruturação com populações de outras localidades, mas também identificamos fluxo gênico, inclusive com relações de parentesco. Dessa forma, os resultados obtidos de demografia e diversidade genética demostram a importância da Estação Ecológica dos Caetetus para essas espécies e também ressalta a importância da criação de medidas que permitam a viabilidade de suas populações a longo prazo, como as que facilitem fluxo gênico com indivíduos de outras localidades.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RigobertoGC_DISSERT.pdf: 2462609 bytes, checksum: 1753126d41dc7df59645485b6308c3f5 (MD5) Previous issue date: 2011-05-30 / Background. Gaucher Disease (GD) is a hereditary lysosomal storage disorder characterized by the accumulation of glucosylceramide, mainly in the cells of the reticuloendothelial system, due to a deficiency of the enzyme acid &#946;-glucosidase (GBA). Diagnosis is usually based on measurement of GBA activity in peripheral leukocytes. The purpose of this study was to evaluate the ability of screening for GBA and chitotriosidase activity using Dried Blood Spots on Filter Paper (DBS-FP) to identify individuals at high risk for GD in high-risk populations such as that of Tabuleiro do Norte, a small town in Northeastern Brazil. Methods. Between June 1, 2007 and May 31, 2008, 740 consented residents and descendants of traditional families from Tabuleiro do Norte were submitted to screening with DBS-FP. Subjects with GBA activity <2.19 nmol/h/mL were referred to analysis of GBA and chitotriosidase activity in peripheral leukocytes and in plasma, respectively. Subjects at highest risk for GD (GBA activity in peripheral leukocytes <5.6 nmol/h/mg protein) were submitted to molecular analysis to confirm diagnosis. Results. Screening with DBS-FP identified 135 subjects (18.2%) with GBA activity <2.19 nmol/h/mL, 131 of whom remained in the study. In 10 of these (7.6%), GBA activity in leukocytes was 2.6 5.5 nmol/h/mg protein. Subsequent molecular analysis confirmed 6 cases of heterozygosity and 4 normals for GD. Conclusion. DBS-FP assay was shown to be an effective initial GD screening strategy for high-prevalence populations in developing regions. Diagnosis could not be established from GBA activity in leukocytes alone, but required confirmation with molecular analysis / A doen?a de Gaucher (DG) ? uma patologia de dep?sito de gordura nos lisossomos, de heran?a autoss?mica recessiva, caracterizada pelo ac?mulo do substrato glicosilceramida, principalmente nas c?lulas do sistema reticuloendotelial, em raz?o da defici?ncia da enzima &#946;-glicosidase ?cida (GBA). O diagn?stico, comumente, ? feito pela dosagem da atividade da GBA em leuc?citos perif?ricos. Tabuleiro do Norte (TN), Cear?, Brasil, ? um munic?pio com cerca de 28.000 habitantes com a preval?ncia da DG de 1:4.000 habitantes, possivelmente a mais elevada do Brasil. O objetivo da disserta??o ? avaliar o rastreamento para DG realizado em TN com base na an?lise das atividades enzim?ticas da GBA e da quitotriosidase em amostras Sangue Seco em Papel de Filtro (SSPF). Entre 01 de junho de 2007 a 31 de maio de 2008, 740 indiv?duos residentes e descendentes de fam?lias de TN participaram do rastreamento para DG a partir de amostras de SSPF. Indiv?duos com atividade GBA<2,19 nmol/h/mL foram selecionados para an?lise da atividade da GBA e da quitotriosidase em leuc?citos perif?ricos e no plasma, respectivamente. Os indiv?duos com maiores riscos de DG (atividade de GBA em leuc?citos perif?ricos <5,6 nmol/h/mg de prote?na) foram referenciados para an?lise molecular para confirma??o diagn?stica. A triagem com amostras de SSPF identificou 135 indiv?duos (18,2%) com atividade da GBA<2,19 nmol/h/mL, dos quais 131 permaneceram no estudo. Em dez destes (7,6%), a atividade da GBA em leuc?citos variou de 2,6-5,5 nmol/ h/mg de prote?na, considerados suspeitos da DG. A an?lise molecular subsequente revelou, entretanto, que se tratava de seis indiv?duos heterozigotos para a muta??o G377S e, em quatro deles, n?o foram identificadas muta??es da DG. A an?lise enzim?tica de amostras de SSPF mostrou ser uma estrat?gia eficaz de triagem da DG em popula??es com alto risco, mas a medida da atividade da GBA em leuc?citos deve ser realizada para confirma??o diagn?stica. O diagn?stico de DG em indiv?duos assintom?ticos n?o deve ser firmado baseando-se apenas na an?lise da atividade da GBA em leuc?citos, sendo necess?ria, tamb?m, a confirma??o diagn?stica pela an?lise molecular

O Herpesvírus equino tipo -1 (EHV-1) pertence ao gênero Varicellovírus da subfamília Alphaherpesvirinae pertencente à Família Herpesviridae. É um vírus envelopado, de DNA linear fita dupla, composto por 76 genes distintos. O EHV-1 é responsável por grandes prejuízos econômicos na equinocultura mundial. Responsável por doença neonatal fatal, mieloencefalopatia, rinopneumonite e abortamento, encontra-se amplamente distribuído pela população equina do território nacional. O objetivo do presente estudo foi o de padronizar uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do EHV-1 em tecidos incluídos em parafina a fim de permitir estudos retrospectivos em arquivos de amostras histopatológicas. Assim, foram inoculados experimentalmente 12 camundongos com 21 dias de idade da linhagem CH3/Rockfeller com três diferentes isolados de EHV-1, dois provenientes da Argentina e um do Brasil. Esses animais foram observados por quatro dias e, após sacrifício por sobre dose de uma associação de ketamina e xilazina, foram submetidos à necropsia e colhidos o pulmão e sistema nervoso central (SNC). Os órgãos colhidos foram divididos em duas partes aproximadamente iguais: uma mantida a -20ºC até processamento e a outra fixada em formalina 10% tamponada e posteriormente incluída em parafina. A extração foi realizada com nove fragmentos contínuos de 4µm cada, a partir do protocolo de extração com proteinase K/ fenol/ clorofórmio. Foi realizada avaliação da sensibilidade analítica da PCR com oito diluições na base 10 para os três isolados utilizados. A amplificação do DNA viral foi realizada utilizando primers direcionados para a ORF64. A fim de descartar a eventual presença de inibidores da reação de PCR e assegurar a adequada extração de DNA, foram incluídos primers direcionados para o gene da beta-actina. A PCR mostrou-se capaz de amplificar DNA viral alvo numa diluição de até 10-5, sendo positiva entre 10-1 a 10-2 DICT50/25µL. Com a PCR padronizada, foi possível detectar o DNA do EHV-1 em: a) 100% (12/12) das amostras de pulmão congeladas e 100% (12/12) das amostras de pulmão incluídas em parafina; b) em 91% (11/12) das amostras de SNC congeladas e 41% (5/12) das amostras de SNC incluídas em parafina. A aplicação da PCR padronizada em uma coleção de amostras incluídas em parafina do Laboratório de Anatomia Patológica do IB/SP, colhidas de cinco casos de abortamento em equinos, revelou que o DNA do EHV-1 foi detectado em: a) um caso em que originalmente foi possível isolar o EHV-1; b) em 4/4 amostras que revelaram-se originalmente negativas. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que a PCR padronizada teve bom desempenho na detecção de DNA viral em amostras incluídas em parafina de animais experimentalmente infectados e, provavelmente, uma sensibilidade diagnóstica mais elevada que os métodos utilizados para o diagnóstico do EHV-1 na coleção de amostras de equino testada. / The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) belongs to Varicellovírus genus, Alphaherpesvirinae subfamíly of the Herpesviridae Famíly. It is an enveloped virus, double stranded linear DNA, composed of 76 distinct genes. The EHV-1 is responsible for great losses in horsebread world. Responsible for neonatal death, mieloencephalopaty, rinopneumonite and abortion, it is widely distributed into brasilian equine population. The purpose of this study was to standardize a polymerase chain reaction (PCR) for EHV-1detection in paraffin- embedded tissues allowing retrospective studies based on the collection histopatological samples. Thus, 12 mice (CH3/Rockfeller) with 21 days of age were inoculated with 3 different isolates of EHV-1, 2 from Argentina and one from Brazil. These mice were observed for 4 days and, after sacrifice by overdose of a combination of ketamine and xylazina, it were subjected to necropsy and collected the lung and central nervous system (SNC). The collected tissues were divided into 2 approximately equal parts: 1one stored at -20ºC until processing, and another set at 10% buffering formalin and later paraffin-embedded. The extraction was performed with continuous 9 fragments of 4µm each, using the extration protocol with proteinase K/ fenol/ clorofórmio. The assessment of analytical sensitivity of PCR were determined using 8 dilutions for all 3 virus isolates. The viral DNA amplification was performed using primers targeted to ORF64. In order to rule out the possible presence of PCR inhibitors and to ensure adequate extraction of DNA, primers directed to the gene for beta-actin were included It was possible to amplify viral DNA until 10-5 dilution, corresponding to 10-1 to 10-2 DICT50/25µL. With the standardized PCR, it was possible to detect the EHV-1 DNA in: a) 100% (12/12) of lung frozen sample and 100% (12/12) of the paraffin-embedded lung; b) 91% (11/12) of the frozen CNS and 41% (5/12) CNS paraffin-embedded. Moreover, the standardized PCR was tested in a collection of paraffin-embedded specimens from Pathological Anatomy Laboratory od Biological Institute Sao Paulo State, taken 5 cases of the abortion in horses. It were possible to detect EHV-1 DNA in: a) 1 sample from a case in that originally was possible to isolate the EHV-1, b) 4/4 sample originally negative diagnosed. Based on these results, it is possible to conclude that the standardized PCR performed well for detection viral DNA in paraffin-embedded tissues of experimentally infected animals, and probably a higher diagnostic sensitivity than the methods used for diagnosis of EHV-1 in the collection samples tissues tested for equine.

Atualmente, um dos grandes problemas relacionados à leishmaniose é a falta de um diagnóstico específico capaz de indentificar e diferenciar espécies de Leishmania com rapidez e precisão. O desenvolvimento de métodos moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), possibilita que o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) possa se tornar mais preciso e, eventualmente, de fácil execução, uma vez que limitações importantes relacionadas à sensibilidade e especificidade desta técnica ainda são descritas, principalmente quando se utiliza amostras clínicas. Com o intuito de melhor avaliar a eficiência da PCR para o diagnóstico da LVC, foram selecionadas diferentes amostras clínicas (baço, aspirado de linfonodo, pele sem lesão, pele com lesão e amostras de sangue) de 26 cães com sorologia positiva para leishmaniose submetidos à eutanásia pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica do município de Embu das Artes - SP. Realizamos uma análise comparativa entre a PCR-RFLP kDNA-HaeIII e PCR-RFLP hsp70-BsaJI/EcoRII com dois métodos diagnósticos tradicionais (parasitológico direto, e cultura in vitro). Amostras clínicas de 28 cães com sorologia negativa para LVC da mesma região foram utilizadas como controle negativo das reações. Notamos que a PCR aprensentou maior sensibilidade em todas as amostras clínicas testadas quando comparadas aos métodos tradicionais. Os resultados apontam que a PCR-RFLP kDNA-HaeIII é a mais eficiente para o diagnóstico da LVC, com um índice de 96,15% de positividade nas amostras de pele com lesão. Quanto à discriminação da espécie de Leishmania envolvida na infecção, nossos resultados de PCR-RFLP kDNA-HaeIII indicam Leishmania chagasi-infantum como o agente etiológico envolvido na infecção e transmissão canina na cidade de Embu das Artes. Por outro lado, a análise da PCR em Tempo Real (qPCR), mostrou que algumas amostras de sangue não apresentavam o padrão associado à Leishmania chagasi-infantum, podendo indicar uma co-infecção com outras parasitoses caninas. Nosso grupo também acompanhou 184 crianças de 4 a 10 anos de idade (população de risco) residentes da mesma região de transmissão autóctone da doença canina, como também foi realizado um levantamento das espécies de flebotomíneos da região (pela SUCEN). Até o momento, não foi encontrado nenhum caso da doença humana, nem a principal espécie transmissora do parasito (Lutzomiya longipalpis). Acreditamos que esses resultados possam contribuir significativamente para aprimorar o diagnóstico e a identificação das espécies Leishmania na LVC. / Currently, one of the major problems related to leishmaniasis is the lack of a specific diagnosis capable of identifying and differentiating Leishmania species quickly and accurately. The development of molecular methods such as Polymerase Chain Reaction ( PCR ) allows the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) to become more accurate and eventually, easy to perform, since that important limitations in terms of sensitivity and specificity of this technique are being described especially when using clinical samples. In order to better evaluate the efficiency of PCR for the diagnosis of CVL, we selected different clinical samples (spleen, lymph node aspirate, skin with and without lesions and blood samples) from 26 dogs with positive serology for leishmaniasis submitted to euthanasia by the Agency of Epidemiological Surveillance of Embu das Artes - SP. Therefore, we performed a comparative analysis between the kDNAPCR-RFLP HaeIII and hsp70PCR-RFLP BsaJI/EcoRII with two traditional diagnostic methods (direct parasitological test, and in vitro culture). Additionally, clinical samples from 28 dogs with negative serology for CVL in the same region were used as negative reactions control. We noted that the PCR showed greater sensitivity in all clinical samples tested when compared with traditional methods. The results indicate that the kDNAPCR-RFLP HaeIII is the most efficient test for the diagnosis of CVL, with a positivity index of 96.15 % in skin lesions samples. Related to the discrimination of the Leishmania species involved in the infection, our results of kDNAPCR-RFLP HaeIII indicate Leishmania infantum chagasi as the agent involved in canine infection in Embu das Artes city. Moreover, the analysis of real-time PCR (qPCR) showed that some blood samples has not showed the same pattern associated with Leishmania infantum chagasi suggesting a possible co-infection with other canine parasite. Our group also followed 184 children between 4 to 10 years old (risk population) living in the same region of autochthonous transmission of canine disease, as well a survey was conducted on the sandfly species in the region (by SUCEN). So far, we found no human infection, nor the main species involved in the transmission of the parasite (Lutzomyia longipalpis). We believe that these results can significantly contribute to the improvement of the diagnosis and identification of Leishmania species involved in the CVL worldwide.

O diagnóstico rotineiro da dengue é realizado com amostra de sangue dos casos suspeitos. A coleta tradicional de sangue (por punção venosa) é um procedimento que dificulta a realização de exames e pesquisas por ser um procedimento invasivo que nem sempre é prático para crianças e bebês, requer pessoal especializado e necessita de um local para armazenamento da amostra sob refrigeração ou congelamento. O propósito deste estudo foi coletar amostras por punção digital com uma nova tecnologia (FTA Card) e compará-la com amostras coletadas por punção venosa, avaliando-as através de uma técnica molecular de PCR em tempo real. Sendo o PCR em Tempo Real a técnica molecular atualmente disponível de maior rapidez, sensibilidade e especificidade, padronizamos uma metodologia de passo único de PCR em Tempo Real com SYBR green baseando-se na região 3 não codificante do vírus e utilizando primers degenerados, capazes de detectar os quatro sorotipos de uma só vez. A avaliação das técnicas de coleta e amplificação foram feitas com amostras suspeitas de dengue, obtidas em Goiânia durante surto ocorrido no ano de 2008. O limite de detecção da reação padronizada no presente estudo foi de aproximadamente 100 cópias/ml e uma especificidade de 100%. Para tipagem das amostras positivas a técnica empregada foi o PCR multipex. Dentre as 89 amostras coletadas 60 (67%) foram positivas para àquelas coletadas por punção venosa e 14 (16%) para àquelas coletadas por punção digital. Dentre as 89 amostras para o PCR em Tempo Real, apenas 29 (32%), foram tipadas pelo método de PCR multiplex, sendo 3 casos do vírus da dengue 1 (10%), 16 casos do vírus da dengue 2 (55%), e 10 casos do vírus da dengue 3 (35%). Descritores: Dengue/diagnóstico, coleta de amostras sanguíneas, reação em cadeia da polimerase, corantes fluorescentes / The collection by venipuncture is a procedure that is difficult to carry out in diagnosis and research because it is an invasive procedure that is not always practical for children and babies , requires specialized staff, needs a place to store the sample under refrigeration or forzen, This study aimed to collect samples by fingerstick puncture with a new technology named FTA card and compare it with samples collected by venipuncture, using a realtime PCR to evaluate if FTA card collection would have a similar performance to standard blood sampling. Towards that, we obtained viral load values in order to estimate the differences not only qualitatively (e.g. pos or neg) but also in numbers.. We used an one-step SYBR Green I Real-Time PCR based on the region 3 \'noncoding virus using degenerate primers which was able to detected all four serotypes of dengue virus. Among the 89 samples collected 60 (67%) were positive for those collected by venipuncture and 14 (16%) to those collected by fingerstick, Only 29 (32%) were possible to be typed by PCR multiplex. Three cases were dengue virus 1 (10%), 16 cases were dengue virus 2 (55%) and 10 cases were dengue virus 3 (35%). The limit of detection obtained was approximately 100 copies / ml and aspecificity of 100% was observed. Keywords: Dengue / diagnosis, collection of blood samples, polymerase chain reaction, fluorescent dyes

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a esquizofrenia é reconhecida como um transtorno neuropsiquiátrico grave que afeta mais de 21 milhões de pessoas em todo o mundo. Para diminuir os sintomas associados a esta doença, a maioria dos pacientes esquizofrênicos fazem uso concomitantemente de antipsicóticos, antidepressivos, ansiolíticos e anticonvulsivantes. O desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação desses fármacos em fluidos biológicos é importante para ajustar as doses administradas, minimizar os efeitos adversos e verificar a anuência do paciente à terapia. A química analítica moderna tem se direcionado para a simplificação, através da miniaturização dos sistemas analíticos. Neste contexto, pode-se destacar a técnica de microextração em sorvente empacotado (MEPS). O desenvolvimento de novas fases extratoras para MEPS, como, os monolitos de sílica híbrida permitem pré-concentração seletiva dos analitos. Neste projeto monolitos de sílica híbrida funcionalizados com grupos aminopropil ou cianopropil foram sintetizados pelo processo sol-gel. Estes monolitos apresentaram estrutura contínua, uniforme e porosa, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos monolitos de sílica híbrida exibiram picos facilmente identificáveis, característicos dos grupos cianopropil e aminopropil. Estes monolitos foram avaliados como fase estacionária para a MEPS para a determinação de fármacos em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em Tandem (LC-MS/MS). As variáveis MEPS (influência do pH na sorção dos analitos, número de ciclos aspirar/dispensar, etapa de limpeza do sorvente e solvente de eluição) foram otimizadas para aumentar a eficiência da extração. Em comparação com a fase de sílica híbrida aminopropil, a fase de sílica híbrida cianopropil apresentou maior capacidade de sorção para os fármacos em estudo. O método desenvolvido, MEPS/LC-MS/MS, empregando a fase extratora de sílica híbrida cianopropil, apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram desde o limite inferior de quantificação (0,05-1,00 ng.mL-1) até o limite superior de quantificação (40-10.500 ng.mL-1) com coeficientes de determinação (R2) maiores do que 0,9955. Este método apresentou precisão com coeficientes de variação (CV) inferiores a 14% e exatidão com erro padrão relativo (EPR) de -12 a 14%. O método MEPS/LC-MS/MS foi aplicado com êxito para análise simultânea de cinco antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), em combinação com sete antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), dois anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina) e dois ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. / According to World Health Organization (WHO), schizophrenia is recognizably a devastating neuropsychiatric disorder that affects more than 21 million people worldwide. To lessen the symptoms associated with the disease, most schizophrenic patients use other classes of drugs such as antidepressants, anxiolytics, and anticonvulsants concomitantly with antipsychotics. Developing analytical methods to quantify these drugs in biological fluids is important in therapeutic drug monitoring (TDM) to adjust doses, minimize adverse effects, and check patient adherence to the therapy. Regarding miniaturization and automation, microextraction by packed sorbent (MEPS) is a promising sample preparation technique. Sample preparation of biological matrixes is an important step in analytical processes: it removes endogenous components from the sample and pre-concentrates trace-level analytes. The development of new phases for MEPS such as the hybrid silica monoliths allows selective pre-concentration of the analytes. The present study reports on the synthesis of two hybrid silica monoliths functionalized with aminopropyl or cyanopropyl groups by the solgel process; evaluates these monoliths as selective stationary phase for MEPS to determine drugs in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and discusses important factors (influence of pH on the sorption of analytes, number of draw/eject cycles, washing step, and elution solvent) related to the optimization of MEPS efficiency. The prepared hybrid silica monoliths consisted of a uniform, porous, and continuous silica monolithic network, as shown by scanning electron microscopy (MEV) images. The Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of the hybrid silica monoliths displayed readily identifiable peaks, characteristic of the cyanopropyl and aminopropyl groups. Compared with the aminopropyl hybrid silica phase, the cyanopropyl hybrid silica phase exhibited higher binding capacity for most of the target drugs. The developed method, MEPS/LC-MS/MS, afforded adequate linearity at concentrations ranging from the lower limit of quantification (0.05 to 1.00 ng.mL-1) to the upper limit of quantification (40 to 10500 ng.mL-1); the coefficients of determination (R2) were higher than 0.9955. The precision of the method presented coefficients of variation (CV) lower than 14%; the relative standard error (RSE) of the accuracy ranged from -12 to 14%. The developed MEPS/LC-MS/MS method allowed for simultaneous analysis of five antipsychotics (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine) in combination with seven antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, fluoxetine), two anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and two anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples from schizophrenic patients, which should be valuable for TDM purposes.

Neste trabalho, o método de extração em fase sólida (SPE) com análises por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi desenvolvido para a determinação de levoglucosano em amostras de água de chuva da região de Ribeirão Preto-SP, Brasil. O monossacarídeo levoglucosano foi proposto como um marcador específico para queima de biomassa, uma vez que o mesmo é liberado durante a pirólise da celulose em temperaturas acima de 300ºC. Após a otimização das variáveis SPE, as melhores condições dentre as avaliadas foram as seguintes: cartuchos SPE recheados com a fase extratora quitosana (1,0 g), volume de amostra igual a 5,0 mL, vazão de 1,0 mL min-1, solvente de eluição: metanol (volume igual a 2,5 mL), sem a adição de sal. O método SPE/GC-MS para a determinação de levoglucosano em amostras de chuva apresentou faixa linear no intervalo de concentração de 0,05 µg mL-1 a 0,50 µg mL-1, r 0,9967, exatidão de 95 a 110% e precisão inter ensaios com coeficientes de variação (CV) menores que 15%, exceto para o limite de quantificação (0,05 µg mL-1) o qual apresentou CV inferior a 20%. Segundo as determinações (SPE/GC-MS) de levoglucosano em amostras de água de chuva coletadas no período 03/08/2011 à 09/04/2012, as concentrações médias de levoglucosano na safra de cana-de-açúcar são aproximadamente quatro vezes superior ao período de entressafra. Este fato é justificado pela elevada taxa de queima da palha da cana-de-açúcar na região de Ribeirão Preto-SP no período safra, e consequentemente, maior emissão de material particulado para a atmosfera incluindo levoglucosano, COD, entre outros. / In this work, the method of solid phase extraction (SPE) with gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) analysis was developed for the determination of levoglucosan in rainwater samples collected in the region of Ribeirão Preto-SP, Brazil. The monosaccharide levoglucosan (1,6-Anhydro--D- Glucopyranose) was proposed as a specific marker for biomass burning, since it is released during the pyrolysis of cellulose at temperatures above 300 ° C. After optimization of the SPE variables, the best conditions were found to be as follows: SPE cartridges filled with the extraction phase chitosan (1,0 g), sample volume equal to 5,0 mL, flow rate of 1,0 mL.min-1 and elution with methanol (volume of 2,5 mL) without added salt. The use of the method SPE/GC-MS for to determination of levoglucosan in rainwater samples was in the range of concentration going from 0,05 to 0,50 g.mL-1, r 0,9967. The accuracy was 95-110%, determination of the inter assay precision gare coefficients of variation (CV) less than 15%, except for the limit of quantification (0,05 g.mL-1), for which CV was less than 20%. According to SPE/GC-MS determinations of levoglucosan in rainwater samples collected between 03/08/2011 and 09/04/2012, the average concentrations of this compound found during the harvest of sugar cane were approximately four times those obtained during the off-season. This fact is explained by the high rate of sugar cane burning in Ribeirão Preto-SP during harvest, which culminates in larger emissions of particulate matter to the atmosphere, including levoglucosano and COD, among others.

Depois dos hidrocarbonetos, os aldeídos de baixa massa molar são os mais abundantes dos gases orgânicos encontrados na atmosfera. Os aldeídos provêm de diversas fontes como as atividades industriais, incompleta combustão de combustível fóssil e biomassa e como resultado de reações fotoquímicas na atmosfera. Os aldeídos são potentes precursores de importantes oxidantes como o nitrato de peroxiacetila (PAN) e ozônio. Eles são reconhecidamente irritante dos olhos e trato respiratório, além de possuir características mutagênicas e carcinogênicas em animais. Considerando o impacto toxicológico e ambiental destes compostos, a prevenção e controle dos aldeídos requerem o uso de novas e versáteis metodologias analíticas. Neste sentido, a eletroforese capilar tem mostrado ser uma técnica alternativa para a análise de aldeídos em amostras ambientais. Este trabalho descreve diferentes metodologias desenvolvidas, em eletroforese capilar, para a separação e análise de aldeídos em amostras de ar (indoor, outdoor) e emissão veicular. As metodologias incluem a separação dos adutos aniônicos bissulfito-aldeído e das hidrazonas aniônicas formadas a partir da reação dos aldeídos com dansilhidrazina (DNSH) e ácido 4-hidrazino benzóico (HBA) por eletroforese capilar em solução livre (free solution capillary electrophoresis, FSCE), bem como a separação das hidrazonas formadas a partir da reação dos aldeídos com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNFH) e 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH), utilizando a cromatografia eletrocinética micelar (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) . As metodologias foram comparadas em termos de sensibilidade, limite de detecção, procedimento de amostragem, necessidade de purificação dos reagentes derivatizantes e aplicação em amostras de ar. O método do bissulfito apresentou algumas vantagens sobre os métodos estabelecidos na literatura como boa sensibilidade (limite de detecção de 3,4 - 36,9 ng mL-1), rapidez, facilidade de aplicação e pequena manipulação da amostra. A desvantagem é que requer longos tempos de amostragem para a análise de traços (ng mL-1). A metodologia com DNFH apresentou baixa sensibilidade (limite de detecção 0,14 - 2,59 &#181;g mL-1) , necessidade de purificação dos reagentes e solventes. No entanto, o sistema de pré-concentração, na coleta, tornou possível a aplicação do método a amostras de ar indoor. Usando MBTH como agente derivatizante foi possível obter limites de detecção na faixa de 3,1 - 21,1 ng mL-1, análise rápida e pouca manipulação da amostra. O reagente não requer purificação. O principal problema do método é o decréscimo do sinal analítico em função do aumento da cadeia carbônica. O método da DNSH mostrou boa sensibilidade com limites de detecção na faixa de 2,1 - 14,1 ng mL-1 para a detecção UVe 0,96 - 2,6 ng mL-1 para a detecção LIF. O reagente sofre oxidação quando as amostras não são preparadas em acetonitrila ou em outro solvente orgânico. A purificação dos solventes é necessária. O método do HBA mostrou boa sensibilidade com limites de detecção na faixa de 2,7 - 8,8 ng mL-1, rapidez e simplicidade. O solvente deve ser purificado. As hidrazonas sofrem degradação na presença de água e luz. As metodologias estudadas foram aplicadas a amostras reais de emissão veicular, ar indoor e outdoor. Foram verificadas as presenças de formaldeído, acetaldeído e acetona para amostras de ar indoor e outdoor, em concentrações na faixa de ppbv e em amostras veiculares foram encontradas formaldeído e acetaldeído em concentrações na faixa de ppmv. / After the hydrocarbons, the low molecular-weight aldehydes are the most abundant of the organic gases of the atmosphere. The aldehydes are produced from many sources such as industrial activities, incomplete combustion of fossil fuels and biomass or as result of photochemical reactions. Aldehydes are important precursor compounds of photochemical smog and their chemistry has been associated to the generation of harmful oxidants, peroxyacetylnitrate (PAN) and ozone. Aldehydes are recognized irritants of the eyes and respiratory tracts of animais and humans and often carcinogenic and mutagenic characteristics are attributed to them. Because of the toxicological and environmental importance of these compounds, prevention and control of aldehydes have demanded new and versatile analytical methodologies. In this context, capillary electrophoresis has become an interesting alternative technique for environmental analysis. This work describes different CE methodologies developed for the separation and analysis of aldehydes in environmental samples of air (indoors and outdoors) and vehicle exhaust. The methodologies comprise the free solution capillary electrophoresis separation of anionic bissulfite-aldehyde adducts, anionic aldehyde-DNSH derivatives and anionic aldehyde-HBA derivatives as well as the micellar chromatographic separation of aldehyde-DNPH derivatives and aldehyde-MBTH derivatives. These methodologies were contrasted in terms of sensitivity, Iimit of detection, sampling procedure, need for reagent purification and application to air samples. The bissulfite methodology is a novel approach with several advantages over established methods in the literature, such as good sensitivity (range from 3.4 to 36.9 ng mL-1), very easy to implement, speed of analysis and lack of sample manipulation, but it requires long collection volume of air to achieve ng mL-1 detection level. The aldehyde-DNFH derivatives methodology presented poor sensitivity (range from 0.14 to 2.59 &#181;g mL-1). The reagents and solvents must be purified to avoid contamination which will completely interfere with the sample components during analysis. However, the preconcentration achieved during sampling allowed to evaluate aldehyde levels in air samples. Using the MBTH methodology it was possible to obtain a limit of detection range from 3.1 to 21.1 ng mL-1, fast analysis and very little sample manipulation. There is not need for purification of the reagent since it is obtained in grade purity. The main problem with this reaction is that as the length of the aldehyde chain increases, the sensitivity decreases. The aldehyde-DNSH derivatives method presented good sensitivity with a limit of detection range from 2.1 to 14.1 ng mL-1 (UV detection) and 0.96 to 2.6 ng mL-1 (LIF detection). The reagent shows substantial oxidation when the sample is not prepared in acetonitrile or other organic solvent. The aldehyde-HBA derivatives method showed good sensitivity with a limit of detection range from 2.7 to 8.8 ng mL-1, it is fast and simple. However, the solvents must be purified and the derivatives shows substantial degradation in presence of water and light. The developed methodologies were then applied to real samples of indoor, outdoor and automobile emissions. The presence of formaldehyde, acetaldehyde and acetone in indoor and outdoor samples was verified at the low ppbv level and the presence of formaldehyde and acetaldehyde, in automobile samples, was at the ppmv level.

Os estudos de bioequivalência são realizados em humanos, por meio da administração dos medicamentos em estudo pela mesma via extravascular, sob condições experimentais padronizadas, seguida pela determinação das concentrações plasmáticas do fármaco em função do tempo. Nestes estudos considera-se que curvas estatisticamente semelhantes de decaimento sanguíneo de fármacos produzem o mesmo resultado em termos de eficácia e segurança. A partir das curvas de concentração em função do tempo obtidas, determinam-se os parâmetros farmacocinéticos Cmax, tmax e ASC. A bioequivalência entre dois produtos é estabelecida por meio do IC 90%, que deve estar entre 80 a 125% para os parâmetros farmacocinéticos Cmax e ASC. O cronograma de coleta de amostras biológicas é um dos aspectos mais críticos no planejamento de estudos de bioequivalência, pois este afeta diretamente a determinação dos parâmetros farmacocinéticos utilizados na avaliação da bioequivalência. Outro aspecto importante relacionado a este tipo de estudo é a diferença de teor entre os produtos a serem submetidos ao estudo de bioequivalência, que segundo a legislação brasileira vigente, deve ser menor ou igual a 5%. Neste trabalho foram avaliados diferentes cronogramas de coleta de amostras sangue, avaliando-se o impacto destes no resultado final de um estudo de bioequivalência e, além disso, a influência da diferença de teor de fármaco entre dois produtos que levaria à bioinequivalência também foi investigada. Para tanto simulações matemáticas e um estudo in vivo foram conduzidos. O fármaco modelo escolhido foi a cefadroxila, por apresentar características farmacocinéticas e farmacodinâmicas ideais. O programa Microsoft Office Excel 2003 foi utilizado para simular as concentrações plasmáticas e determinar o IC 90%. As simulações foram feitas por meio de dois modelos: modelo baseado em máximos e mínimos de parâmetros farmacocinéticos, e modelo baseado em coeficientes de variação intra e inter-individuais do fármaco. Dez diferentes doses, entre -10% a 20% da dose referência, e 6 cronogramas de coleta foram avaliados. O estudo in vivo foi realizado com quatro doses diferentes de cefadroxila. A bioequivalência entre as doses e em diferentes cronogramas de coleta foi avaliada em 24 voluntários sadios do sexo masculino. Os voluntários receberam as quatro doses do estudo em desenho cruzado, em quatro períodos e quatro seqüências, com washout de 7 dias entre as doses. As concentrações plasmáticas de cefadroxila, até 8 horas após a administração, foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção DAD. Os parâmetros farmacocinéticos tmax, Cmax e AUC0-t foram determinados nas diferentes doses e cronogramas de coleta, sendo que o critério para estabelecer-se a bioequivalência foi baseada nos resultados do IC 90% dos parâmetros farmacocinéticos Cmax e AUC0-t. Os resultados obtidos nas simulações mostraram boa correlação com os dados reais obtidos a partir de estudos in vivo. As simulações baseadas em coeficientes de variação intra e inter-individuais descreveram melhor os resultados observados no estudo in vivo. De acordo com os resultados obtidos no estudo in vivo pode-se concluir que cronogramas de coletas com menos amostras são tão eficientes quanto cronogramas de coletas com mais amostras, desde que o tempo de tmax esteja incluído. Em relação ao teor de fármaco, concluiu-se que dois produtos com diferença de teor menor ou igual a 11% ainda são bioequivalentes e que diferença maior ou igual a 14% resultam em bioinequivalência. Observou-se ainda que o parâmetro farmacocinético ASC0-t é mais sensível que Cmax para detectar diferenças. / Bioequivalence studies are designed to compare the in vivo performance of different formulations of the same drug or different drug products by a randomized crossover study. Pharmacokinetic parameters are obtained from the drug concentration-time profile in blood, serum, or plasma. The most frequently used pharmacokinetic parameters are area under the plasma or blood concentration-time curve (AUC), maximum concentration (Cmax) and time to achieve maximum concentration (tmax). Bioequivalence is concluded if the average bioavailability of the test formulation is within (80%, 125%) that of the reference formulation, with a certain assurance, that is, an equivalence criterion of 80% to 125% for assessment of bioequivalence based on the ratio of average bioavailability is employed. The logarithmic transformation is used for AUC and Cmax. Accuracy in measuring pharmacokinetics parameters directly affects accuracy of bioequivalence tests. Since the number of blood samples per patient is limited, sampling points should be chosen such that the time concentration profile is adequately defined so as to allow the calculation of relevant parameters. According to guidelines proposed by the National Agency of Sanitary Vigilance of Brazil (ANVISA), bioequivalence studies can be conducted only if the difference in drug content between the reference and test product is less than or equal to 5%. The goals of this study are to evaluate the influence of differences in amount of active moiety present in the formulation and possibility of reducing the number of sampling points in bioequivalence studies and to discuss the impact of these parameters in bioequivalence conclusions. For these approaches, simulations and an in vivo study were done. The drug selected was cefadroxil. Cefadroxil presents ideal pharmacokinetics and pharmacodynamics characteristics for this kind of study, such as high bioavailability, low intra and intersubject variability, short elimination rate and wide therapeutic range. Microsoft Office Excel 2003 software was used to simulate drug concentration-time profiles for different doses and several sampling schedules, and to determine 90% confidence interval. Simulations were done by two models: a) based on assumed maximum and minimum pharmacokinetic parameters values; b) based on assumed intra and intersubject variability. Ten different doses, ranging from -10% to 20% of the reference dose, and six sampling schedules were evaluated. The in vivo study was performed with four different cefadroxil doses. Their relative bioavailability were evaluated in 24 healthy volunteers who received a single oral dose of each preparation. An open, randomized clinical trial designed as four-periods and four sequences crossover with 7-days washout between doses was employed. Plasma samples for assessments of their cefadroxil concentration by HPLC-DAD were obtained over 8 h after administration. Pharmacokinetics parameters tmax, Cmax and AUC0-t were evaluated using different doses and sampling schedules. For the purpose of bioequivalence analysis Cmax and AUC0-t were considered. For each schedule, to claim bioequivalence in average bioavailability, a 90% confidence interval was constructed for ratio of average between test and reference products and compared with (80%, 125%) limits. If the constructed confidence interval falls within the limits, then the two formulations are considered bioequivalent. The results obtained by simulate time-concentration profiles, showed good correlation with real data. Comparing the results obtained through in vivo study and the two simulations models, the simulations based in intra and intersubject variability was more predictive. In conclusion, no significant differences were found between sampling schedules evaluated, since the sampling time around tmax were maintained in sampling schedules. Bioinequivalence was observed when the difference between cefadroxil doses was higher than 14%. The parameter AUC0-t was more sensitive than Cmax to detect differences.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work aimed to explore the speciation analysis of chromium, selenium and antimony, elements of clinical and geochemical relevance, in the saline samples seawater, hydrothermal fluid and hemodialysis fluid. These samples, although linked to different research areas, have many similarities relating to their chemical compositions or the presence of metallic species as contaminants as well as major components. Voltammetric methods were used to the determination of the analytes in high salt media without the use of dilution, masking agents or separation steps. Since changes in the matrix composition may affect the analyte peak current magnitude, factors affecting the voltammetric behavior of the species related to sample composition (e.g., presence of dissolved organic matter and ionic strength) were evaluated. The chromium speciation analysis was performed by the adsorptive collection of the Cr-DTPA complex on the mercury working electrode, followed by stripping in combination to a catalytic step. Cr(III) species was found as predominant in the hydrothermal fluid sample and, Cr(VI), in the seawater sample, whereas in hemodialysis fluids an ignorable concentration was determined. Selenium was determined by the co-electrolysis of Cu2Se followed by a cathodic stripping in acidic medium. The UV-irradiation pre-treatment step was used for the reductively conversion of non-electroactive species into Se(IV) as well as for dissolved organic matter photo-oxidation, and the speciation was applied to the real sample analysis, where no selenium species were found. The combined use of adsorptive and anodic stripping voltammetry was employed for antimony determination. Chloranilic acid was chosen as the Sb(III) complex forming reagent (pH 3.0) and the total antimony concentration was evaluated by anodic stripping voltammetry in a 5.0 mol L-1 HCl medium. Sb(III) was found as the predominant species in the hydrothermal fluid sample, whereas Sb(V) is predominant in the seawater sample. No antimony species were found in the hemodialysis fluid. Concerning chromium, selenium and antimony species, remarkable peak current dependences on peak potential, deposition potential, deposition time and scan rate were observed for all investigated media. The limit of detection values were appropriate to the analytes determination, so that the present techniques consist in simple, fast and low cost procedures for the speciation analysis of elements of clinical and geochemical relevance in high salt content samples with accuracy and sensitivity. / Este trabalho teve como objetivo explorar a análise de especiação de cromo, selênio e antimônio, elementos de relevância clínica e geoquímica, em amostras salinas água do mar, fluido hidrotermal e concentrado salino de hemodiálise. Tais amostras, embora ligadas a diferentes áreas de pesquisa, apresentam similaridades relacionadas à presença de espécies metálicas como contaminantes, assim como a componentes majoritários. Métodos voltamétricos foram usados na determinação dos analitos em meios de alta concentração salina sem diluição, agentes mascarantes ou etapas de separação. Uma vez que mudanças na composição da matriz em análise podem afetar a magnitude da corrente de pico para os analitos, fatores que influenciam o comportamento voltamétrico das espécies e relacionados à composição das amostras (presença de matéria orgânica dissolvida e força iônica) foram avaliados. A análise de especiação de cromo foi executada pela adsorção de complexos Cr-DTPA no eletrodo de trabalho de mercúrio seguida de redissolução aliada a um passo catalítico. Observou-se a predominância de Cr(III) em fluido hidrotermal e, de Cr(VI), em água do mar, sendo o analito determinado em concentração desprezível na amostra de concentrado salino de hemodiálise. Determinou-se selênio por uma etapa de co-eletrólise de Cu2Se com posterior redissolução catódica do composto em meio ácido. Empregou-se o pré-tratamento por irradiação UV para a redução fotolítica de espécies não-eletroativas em Se(IV), assim como para a foto-oxidação da matéria orgânica, sendo a análise de especiação aplicada a amostras reais, para as quais não se evidenciou a presença de espécies de selênio. Fez-se o uso combinado de voltametria adsortiva e voltametria anódica de redissolução, para a determinação de antimônio. Escolheu-se o reagente ácido cloranílico para a formação de complexos com Sb(III) (pH 3,0), sendo a concentração total de antimônio avaliada por voltametria de redissolução anódica em HCl 5,0 mol L-1. Observou-se a predominância de Sb(III) em fluido hidrotermal e, de Sb(V), em água do mar. Não se evidenciou a presença de espécies de antimônio na amostra de concentrado salino de hemodiálise. Levando-se em conta as espécies de cromo, selênio e antimônio, uma dependência entre corrente de pico, potencial de deposição, tempo de deposição e velocidade de varredura foi observada em todos os meios investigados. Obtiveram-se limites de detecção adequados para a determinação dos analitos, sendo que as técnicas otimizadas consistem em procedimentos simples, rápidos e de baixo custo, aplicados à análise de especiação de elementos de relevância clínica e geoquímica, em amostras de alta concentração salina, com exatidão e sensibilidade.