Bacillus subtilis é uma alternativa ao emprego de Escherichia coli para a produção de proteínas recombinantes. O principal entrave à utilização de B.subtilis para esse fim é a baixa disponibilidade de sistemas de expressão. Nesse trabalho, testamos diferentes plasmídeos e promotores com o objetivo de desenvolver sistemas de expressão heteróloga eficientes. Ao fim do trabalho, propomos dois novos sistemas de expressão baseados do arcabouço do plasmídeo pMTL500E e nos promotores dos genes cdd e gsiB, ambos de B.subtilis. Os dois plasmídeos construídos apresentam expressão constitutiva e demonstraram desempenho superior no tocante à produção de proteínas heterólogas quando comparados ao único sistema comercialmente disponível, conhecido como pHT01. Em uma segunda parte do trabalho, propomos a utilização de Listeria innocua como veículo de entrega para antígenos vacinais. Por meio de ensaios ex-vivo e in vivo, demonstramos que essa bactéria possui potencial promissor para aplicações vacinais, inclusive quando comparada ao bem estabelecido B.subtilis. / Bacillus subtilis is an alternative to the use of Escherichia coli for the production of recombinant proteins. The main bottleneck to the use of B. subtilis for this purpose is the low availability of expression systems. In this study, we evaluated different plasmids and promoters with the aim of developing efficient heterologous expression systems. At the end of this work, we propose two new expression systems based on plasmid pMTL500E and the promoters from cdd and gsiB genes, both of them from B.subtilis. The two plasmids constructed exhibit constitutive expression and demonstrated superior performance regarding the production of heterologous proteins compared to the unique commercially available system, which is known as pHT01. In a second part of the work, we propose the use of Listeria innocua as a delivery vehicle for vaccine antigens. After ex-vivo and in-vivo experiments, we demonstrated that this bacterium has a promising potential for vaccine applications, even when compared to well established B.subtilis.

A leptospirose é uma doença endêmica causada por Leptospiras. O genoma da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi analisado para seleção de potenciais antígenos vacinais. Oito genes foram selecionados e clonados para expressão e purificação dos antígenos. A salmonela SL3261 foi usada como carregadora dos genes de leptospira em vetor pAEsox para expressão das proteínas in vivo. As salmonelas recombinantes induziram resposta imune quando administradas em camundongos por via intraperitoneal. Hamsters foram imunizados com as salmonelas, observando-se que a SLLIC10191 induziu proteção parcial no desafio com L. interrogans sorovar Pomona. Vetores híbridos foram construídos para expressão simultânea de dois antígenos em salmonelas in vivo. Observamos indução de anticorpos específicos, porém, os ensaios de desafio não foram conclusivos. Vários parâmetros do desafio com sorovar Copenhageni foram estudados, como contagem das bactérias e ajuste de dose, variação de virulência por passagens em cultivo e interferência da idade dos animais. / Leptospirosis is an endemic disease caused by Leptospira. The genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni was analyzed for screening potential vaccine antigens. Eight genes were selected and cloned for expression and purification. Salmonella SL3261 was used as carrier of the genes of leptospira in pAEsox vector for in vivo proteins expression of proteins in vivo. Recombinant Salmonella induced immune response when administered intraperitoneally in mice intraperitoneally. Hamsters were immunized with salmonella, resulting we observed that the SLLIC10191 induced partial protection against on challenge with L. interrogans serovar Pomona. Hybrid vectors were constructed for expression of two antigens simultaneously by salmonella in vivo. We observed induction of specific antibodies, however, the challenge tests were not conclusive. Several parameters of the challenge assay with serovar Copenhageni were studied, such as the counting of bacteria count and dose adjustment, changes in virulence by passages in culture and interference backgroundof from the age of animals.

A malária transmitida por transfusão (MTT), embora seja um evento raramente relatado em áreas não endêmicas ou de baixa endemicidade, representa um desafio devido à ocorrência de infecções assintomáticas e à possibilidade de sobrevivência de Plasmodium em hemácias estocadas por até três semanas a temperaturas entre 2 e 6ºC. No Estado de São Paulo, quatro casos de MTT foram relatados, incluindo uma morte. Os doadores infectados foram identificados como portadores assintomáticos que viviam ou haviam se deslocado para o bioma Mata Atlântica do estado. Nesses doadores, geralmente as densidades parasitárias são baixas e indetectáveis pela gota espessa ou testes rápidos. O uso de plataformas incluindo testes sorológicos poderia detectar doadores suspeitos de infecção por Plasmodium, minimizando a possibilidade de MTT. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi padronizar a produção de antígeno recombinante MSP119 de P. vivax, que é a espécie mais prevalente no Brasil, e validar o teste ELISA-PvMSP119, visando à aplicação em serviços hemoterápicos brasileiros de áreas não endêmicas para malária. O antígeno recombinante produzido em condições desnaturantes mostrou-se adequado para a produção em larga escala, pela facilidade de obtenção e purificação. Os resultados de estabilidade obtidos em três lotes-piloto indicaram validade de pelo menos 27 meses sem perda de reatividade. Além disso, o teste apresentou 96,95% de sensibilidade em 197 soros de pacientes com gota espessa positiva para P. vivax e especificidade de 100,00% utilizando soros de 101 indivíduos controles sadios e 99,26% quando considerados também 168 amostras de soro de pacientes com outras doenças. O coeficiente de variação das amostras positivas foi <= 3,8% para a repetitividade e <= 10,6% para a reprodutibilidade. Quanto à reatividade cruzada, obtiveram-se falsos resultados positivos com amostras de doença de Chagas (5,88%) e fator reumatoide (6,67%). Após a validação, avaliou-se a prevalência de anticorpos IgG anti-MSP119 de P. vivax entre doadores de sangue do Sudeste do Brasil, considerados aptos à doação, ensaiando 1.974 amostras de plasma de bancos de sangue, sendo 1.309 do Estado São Paulo (SP) e 665 do Estado do Rio de Janeiro (RJ). A positividade entre as amostras de SP foi 1,15% (N = 15) e entre as do RJ foi 1,65% (N = 11). O índice de reatividade (IR) das amostras positivas variou entre 8,98-1,16 (SP) e 13,03-1,08 (RJ). Em SP e RJ, maior positividade foi encontrada nos municípios que têm contato com o bioma Mata Atlântica e no RJ, também no bairro da Tijuca, onde se encontra a Floresta da Tijuca. A presença de anticorpos IgG anti-P. vivax não é necessariamente um marcador de parasitemia ou doença, porém aponta para o risco de MTT, mesmo em áreas de baixa endemicidade, pois doadores assintomáticos podem ser aceitos com base em triagem clínica. Estes achados constituem-se em alerta que nos impele a rever os critérios adotados para a seleção dos doadores, com o objetivo de reduzir o risco de MTT nessas áreas sem perder doações. / In non-endemic and low endemic areas, transfusion-transmitted malaria (TTM) is a rarely reported event, representing a major challenge, essentially due to the occurrence of asymptomatic infections and to the possibility of Plasmodium survival up to three weeks in stored red blood cells at temperatures between 2 and 6ºC. In São Paulo State, four TTM were detected, including one death. Infected donors were identified as asymptomatic carriers that lived or that had displacements to the Atlantic forest biome in the state. In these donors generally the parasite densities are low and undetectable in the thick blood smear or rapid diagnostic tests. The use of platforms including serological tests might point out donors suspected of harboring Plasmodium, minimizing the possibility of TTM. Accordingly, the aim of this study was to standardize the production of P. vivax MSP119 recombinant antigen, which is the most prevalent species in Brazil, and validate ELISA-PvMSP119, aiming at the application in Brazilian haemotherapic services in malaria non-endemic areas. The recombinant antigen produced under denaturing conditions was suitable for large-scale production, due to the ease of obtaining and purification. The results of stability obtained in three pilot batches indicated that it was valid for at least 27 months without loss of reactivity. Furthermore, the test showed 96.95% sensitivity in sera from 197 patients with positive thick-blood smear for P. vivax and 100.00% specificity in sera from 101 healthy controls, and 99.26% when considered also 168 samples from patients with other diseases. The variation coefficient of positive samples was <= 3.8% for repeatability and <=10.6% for reproducibility. For cross-reactivity, false positive results were obtained with Chagas\' disease (5.88%) and rheumatoid factor (6.67%) samples. After validation, we evaluated the prevalence of IgG anti-MSP119 antibodies to P. vivax among blood donors in Southeastern Brazil, considered suitable for donation, rehearsing 1,974 plasma samples from blood banks, being 1,309 from the State of São Paulo (SP) and 665 from the State of Rio de Janeiro (RJ). The positivity among samples from SP was 1.15% (N = 15) and in RJ was 1.65% (N = 11). The reactivity index (RI) of the positive samples ranged from 8.98 to 1.16 (SP) and from 13.03 to 1.08 (RJ). In SP and RJ, highest positivity was seen in Municipalities in contact to the Atlantic Forest biome, and in RJ, also in the Tijuca neighborhood, where there is the Tijuca Forest. The detection of IgG antibodies is not necessarily a marker of parasitemia or disease, however, points out to the risk of TTM, even in areas of low endemicity, since asymptomatic donors could be accepted based on clinical screening. These findings constitute an alert that impel us to review the adopted criteria for screening of the donors aiming to reduce the risk of TTM in these areas without losing donations.

A proposta do nosso estudo foi comparar o número de células apresentadoras de antígenos (CAAs) presentes em biópsias de gengivite (G) e de hiperplasia gengival induzida por ciclosporina (HGIC). Vinte e oito biópsias de pacientes com G e 14 biópsias de HGIC foram analisadas no epitélio de revestimento bucal (ERB), epitélio sulcular (ES) e no tecido conjuntivo (TC). O número de macrófagos (CD68+), de células de Langerhans (CD1a+) e de células dendríticas intersticiais (CDIs) (FXIIIA+) foi investigado por técnica imunoistoquímica. Células CD1a+/mm2 foram significantemente aumentadas na G quando comparada com HGIC, no TC, no ES e no ERB (p<0,05). Em contrapartida, o número de células CD68+ no TC e no ERB, e o número de células FXIIIA+/mm2 no TC foram aumentadas no grupo de HGIC (p<0,05). Ciclosporina A está relacionada com a diminuição de células de Langerhans. Podemos sugerir que este fato aumenta as infecções oportunistas, conseqüentemente, um maior número de macrófagos é necessário para combater os microorganismos. / The aim of this study was to compare the number of antigen-presenting cells (APCs) observed in biopsies of gingivitis (G), and in cyclosporine-induced gingival overgrowth (CIGO). Twenty eight biopsies from patients with G, and 14 with CIGO were analyzed in oral epithelium (OE), sulcular/junctional epithelium (SJE), and connective tissue (CT). The number of macrophages (CD68+), Langerhans’cells (CD1a+), and interstitial dendritic cells (FXIIIA+) was investigated by immunohistochemistry. CD1a+ cells/mm2 were significantly increased in G when compared with CIGO, in CT, in SJE, and in OE (p<0.05). In contrast, the number of CD68+ in CT, and in OE, and FXIIIA+ cells/mm2 in CT were increased in CIGO group (p<0.05). Cyclosporine is related with the diminution of Langerhans’ cells. We can suggest that this fact increase opportunistic infections, consequently, a greater number of macrophages is necessary in order to combat the microorganisms.

INTRODUÇÃO: O desenvolvimento das glândulas salivares envolve um processo coordenado de interações moleculares complexas, nas quais as integrinas têm papel fundamental. As integrinas são uma família de receptores transmembrânicos, heterodímeros, compostos por duas subunidades: alfa e beta que estão ligadas de forma não covalente e dependentes de cations bivalentes. Estes heterodímeros medeiam sinais intra e extracelulares envolvidos na organização das células em tecidos e órgãos durante seu desenvolvimento. Em particular a integrina beta1 está envolvida na proliferação e diferenciação de células no desenvolvimento dos tecidos epiteliais. OBJETIVOS: Para compreender o papel da integrina beta1 no desenvolvimento das glândulas salivares humanas, estudamos a sua expressão por meio da hibridização in situ em tecido fetal humano em desenvolvimento. MATERIAL E MÉTODOS: A hibridização in situ com o método chromogenic in situ hibridization (CISH) foi utilizada para investigar a expressão genética da integrina beta1 em espécimes de glândulas salivares em desenvolvimento derivados de 30 fetos humanos em vários estágios gestacionais (de 825 semanas de vida intrauterina). Os resultados obtidos com a hibridização in situ foram relacionados com os aspectos morfológicos das glândulas salivares em desenvolvimento em cada fase da evolução da morfogênese glandular, por meio de análise qualitativa. RESULTADOS: Expressão da integrina beta1 foi detectada em raras células na fase prebotão. A expressão dessa molécula foi detectada em mais estruturas com a evolução do desenvolvimento morfogenético das glândulas salivares. CONCLUSÕES: A expressão a integrina beta1 parece ser regulada de forma temporoespacial e é associada ao estabelecimento do fenótipo maduro das glândulas salivares / INTRODUCTION: Salivary gland development entails coordinated processes involving complex molecular interactions in which integrins have a fundamental role. The integrins are a family of heterodimeric transmembrane receptors comprising alpha and beta subunits that mediate intercellular and extracellular signals involved in the organisation of cells in tissues and organs during development. The beta1 integrin in particular have been implicated in proliferation and differentiation of cells involved in the development of epithelial tissues. OBJECTIVE: To understand the role of beta1 integrin in salivary gland development we have studied its expression in human foetal tissues. MATERIAL AND METHODS: In situ hybridisation CISH technique was used to compare the expression and localisation of integrin beta1 with differentiation markers in developing human salivary glands obtained from foetuses of 825 gestational weeks. RESULTS: Integrin beta1 first appeared during bud stage in a few cells and its distribution increased as salivary gland morphogenesis progressed. CONCLUSIONS: The developmentally regulated expression of integrin beta1 in association with the establishment of a mature phenotype of salivary glands is suggestive of its role in salivary gland morphogenesis

A proposta do nosso estudo foi comparar o número de células apresentadoras de antígenos (CAAs) presentes em biópsias de gengivite (G) e de hiperplasia gengival induzida por ciclosporina (HGIC). Vinte e oito biópsias de pacientes com G e 14 biópsias de HGIC foram analisadas no epitélio de revestimento bucal (ERB), epitélio sulcular (ES) e no tecido conjuntivo (TC). O número de macrófagos (CD68+), de células de Langerhans (CD1a+) e de células dendríticas intersticiais (CDIs) (FXIIIA+) foi investigado por técnica imunoistoquímica. Células CD1a+/mm2 foram significantemente aumentadas na G quando comparada com HGIC, no TC, no ES e no ERB (p<0,05). Em contrapartida, o número de células CD68+ no TC e no ERB, e o número de células FXIIIA+/mm2 no TC foram aumentadas no grupo de HGIC (p<0,05). Ciclosporina A está relacionada com a diminuição de células de Langerhans. Podemos sugerir que este fato aumenta as infecções oportunistas, conseqüentemente, um maior número de macrófagos é necessário para combater os microorganismos. / The aim of this study was to compare the number of antigen-presenting cells (APCs) observed in biopsies of gingivitis (G), and in cyclosporine-induced gingival overgrowth (CIGO). Twenty eight biopsies from patients with G, and 14 with CIGO were analyzed in oral epithelium (OE), sulcular/junctional epithelium (SJE), and connective tissue (CT). The number of macrophages (CD68+), Langerhans’cells (CD1a+), and interstitial dendritic cells (FXIIIA+) was investigated by immunohistochemistry. CD1a+ cells/mm2 were significantly increased in G when compared with CIGO, in CT, in SJE, and in OE (p<0.05). In contrast, the number of CD68+ in CT, and in OE, and FXIIIA+ cells/mm2 in CT were increased in CIGO group (p<0.05). Cyclosporine is related with the diminution of Langerhans’ cells. We can suggest that this fact increase opportunistic infections, consequently, a greater number of macrophages is necessary in order to combat the microorganisms.

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A cisticercose suína é uma doença causada pela larva de Taenia solium, Linneaus, 1758, denominada Cysticercus cellulosae (cisticerco). A doença está amplamente distribuída pelo mundo, sendo mais freqüente nos países onde o consumo de carne suína é elevado e as condições sanitárias são deficientes, como em grande parte dos países em desenvolvimento. A cisticercose causa prejuízo em criações de suínos, pois, a carne infectada torna-se imprópria para o consumo humano. Para o diagnóstico da cisticercose suína são realizados o exame da língua in vivo e o exame post-mortem (necropsia). O exame da língua é pouco sensível apesar da elevada especificidade, uma vez que a localização do parasita pode não ser disseminada. A análise post-mortem é baseada em sítios de predileção dos cisticercos. Por isso, são analisados em rotina de inspeção sanitária, o coração, a língua, o diafragma e músculos mastigadores (masseteres e pterigóide). No entanto, infecções brandas, com reduzido número de cisticercos instalados nos tecidos, podem não ser diagnosticadas na necrópsia, evidenciando uma sensibilidade baixa. Recentemente, tem sido sugerida a implementação de testes imunológicos, dentre eles o ELISA (Enzyme Linked Immunossorbent Assay), que tem por princípio a pesquisa de anticorpos no soro. Assim, o presente trabalho objetiva a avaliação de antígenos no método de ELISA para o imunodiagnóstico da cisticercose suína. Dessa forma, 7 suínos, desmamados, provenientes de criação tecnificada foram infectados com 200.000 ovos de T. solium. Foram coletadas amostras sangüíneas antes da infecção e a cada 7 dias até o 140º dia pós-infecção e os soros obtidos foram congelados a 20ºC negativos. Os soros foram avaliados através do ELISA utilizando antígeno total (T-Tso) e de escólex (Es-Tso) de C. cellulosae e de líquido vesicular de C. longicollis (LV-Tcra). O exame da língua in vivo apresentou sensibilidade baixa pois, não foi detectada a presença de cisticercos nos 7 animais durante o período da infecção. Mediante o exame post-mortem, constatou-se a cisticercose em todos os animais. Por outro lado, a quantidade de cisticercos por animal foi baixa tendo em vista a alta dose de ovos inoculados. Foram detectados ao todo 238 cisticercos, sendo todos viáveis. Quanto à distribuição, foi observado que a musculatura do membro anterior e do membro posterior apresentaram as maiores quantidades de parasitas com 24,38% (58) e 28,57% (68) respectivamente. Apenas 18,67% (43) dos cisticercos foram encontrados em tecidos indicados para inspeção da carne. Quanto ao ELISA, obteve-se a padronização do teste para os 3 antígenos, que detectou aumento significativo de anticorpos à partir do 21º dia p.i., para os 7 suínos. O maior índice de reatividade foi encontrado para o antígeno LV-Tcra. O teste com antígenos Es-Tso e LV-Tcra apresentaram os melhores resultados, detectando níveis de anticorpos acima do cut-off nos soros dos animais. Na análise dos soros dos animais suspeitos através do ELISA com Es-Tso, 64,3% (9) das amostras apresentaram absorbâncias acima do cut-off, sendo os animais considerados prováveis portadores de cisticercose. Ficou demonstrada a boa sensibilidade do ELISA com os 3 antígenos, sobretudo quando utilizados o Es-Tso, detectando a doença em animais com infecção leve. Ademais, o ELISA com o antígeno Es-Tso apresenta-se como uma importante ferramenta na pesquisa epidemiológica da cisticercose. / Swine cysticercosis is a disease caused by the Taenia solium’s metacestodes, called Cysticercys cellulosae (Cisticerci). This disease is largely spread around the world and is more frequent in countries where swine meat consumption is high and sanitary conditions are poor, as in developing countries. Cysticercosis is harmful to the raising of the swine because infected meat is not proper for human consumption. To diagnose swine cysticercosis one clinically examines the tonge in vivo and also examines post-mortem (necropsy). The tonge exam has little sensitivity in spite of its high specificity as the parasite location cannot be determined. Post-mortem analysis is based on metacestodes’s favorite sites. Therefore, the heart, the tonge, the diaphragm, and the chewing muscles (masseteres and pterigoidis) in the tissue are analyzed in the regular sanitary inspection. However, mild infections, with a minor number of metacestodes in the tissues may not be diagnosed in the necropsy, showing that evidently there is an low sensitivity. Recently there has been suggestions of immunological tests, including the ELISA (Enzyme Linked Immunossorbent Assay) which has as a principle the antibodies research in swine’s serum. Thus, this study’s aim is to evaluate the antigens in the ELISA method for immunodiagnosis of the swine cysticercosis. The experiment used 7 weaned swine for technological rising were orally infected with 200.000 T. solium eggs. At every 7 days, up to the 140º day of infection, 10 mL of blood was collected and the serum was frozen at minus 20ºC. The serum were analyzed through the ELISA and the analyses used 3 antigens: total (T-Tso) and scolex (Es-Tso) of C. cellulosae and C. longicollis’s vesicular fluid (LV-Tcra). The in vivo tongue exam showed low sensitivity because at no time during in the infection the presence of metacestodes could be detected. Through the post-mortem exam one could notice the cysticercosis in all animals. However, the amount of metacestodes per animal was very low, considering the high number of inoculated eggs. As a total 238 metacestodes were detected and all were viable. As for distribution, one observed that the muscles of front and hindquarters showed more parasites with 24,38 % (58) and 28,57% (68), respectively. Only 18,67% (43) of metacestodes were found in tissue appointed for meat inspection. As for the ELISA, the standardization was obtained for 3 antigens, that detected a significant rise of antibodies from the 21th day of infection. It was also observed that the test using the 3 antigens could detected antibodies anti-Cysticercus from the 21th day post-infection. The highest rate of reactivity was found for the antigen LV-Tcra. The immunoenzimatic tests with the Es-Tso and LV-Tcra showed best results, detecting antibodies level over the cut-off in the animals. In the analysis of the suspected animals with ELISA using Es-Tso, 64,3% (9) samples showed high absorbance to the cut-off and the animals considered probably cysticercosis carriers. In conclusion, it was proved that there is good sensitivity in the ELISA, particularly when the antigen Es-Tso is used, detecting cysticercosis in animals with mild infection. Moreover, the ELISA with the Es-Tso show as an important tool for the cysticercosis epidemiological research.

INTRODUÇÃO: O objetivo deste estudo foi avaliar prospectivamente os anticorpos anti-HLA após o transplante renal e associar estes achados com episódios de rejeição aguda, marcação por C4d e sobrevida do enxerto. MÉTODOS: Foram avaliados 926 soros de 111 pacientes no primeiro ano pós-transplante ou até a perda do enxerto. Os anticorpos foram analisados por PRA-ELISA (Panel Reactive Antibodies by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Anticorpos anti-HLA doador-específicos foram detectados por provas-cruzadas e caracterizados pelo método de microesferas marcadas com antígenos HLA. Episódios de rejeição aguda foram classificados conforme os Critérios de Banff 97, atualizados em 2003. RESULTADOS: Conforme o PRA-ELISA pós-transplante os pacientes foram classificados em 5 Grupos: Grupo A (n=80): sem evidência de anticorpos pré e pós-transplante; Grupo B (n=8): pacientes com anticorpos de novo; Grupo C (n=5): pacientes sensibilizados que permaneceram com mesmo nível de PRA-ELISA; Grupo D (n=4): pacientes sensibilizados que elevaram o nível de PRA-ELISA e Grupo E (n=14): pacientes sensibilizados que diminuíram o nível de PRA-ELISA durante o primeiro ano pós-transplante. A incidência de rejeição aguda foi de 23,4%. Pacientes dos Grupos B, C e D apresentaram mais episódios de rejeição aguda (respectivamente, 57%; 60% e 100%) que os dos Grupos A (18%) e E (7%), (p<0,001). Rejeições ocorridas no Grupo A foram histologicamente menos severas do que as dos outros Grupos (p=0,03) e com menor incidência de C4d+ (p<0,001). Entre os pacientes com rejeição aguda, 44% deles apresentaram anticorpos no momento da rejeição, sendo que em 90% dos casos esses anticorpos foram doadorespecíficos. Rejeição mediada por células, ou seja, sem anticorpos e com C4d-, ocorreu em 56% dos casos. A incidência global de rejeição mediada por anticorpos (RMA) foi de 11%. A sobrevida do enxerto censurada para óbito foi menor em pacientes com rejeição aguda (p<0,001), especialmente naqueles com anticorpos anti-HLA doador-específicos (p<0,001), com C4d+ (p=0,003) e nos casos de RMA (p<0,003). CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que a monitorização dos anticorpos anti-HLA após o transplante renal pode ser útil no diagnóstico das respostas mediadas por anticorpos e tem implicações em termos de sobrevida do enxerto. / INTRODUCTION: The aim was to follow prospectively anti-HLA antibodies (Abs) after kidney transplantation and to evaluate their association with acute rejection episodes, C4d staining and graft survival. METHODS: We analyzed 926 sera from 111 transplanted patients until graft lost or during 1 year posttransplant. The antibodies were analyzed using Panel Reactive Antibodies by Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (PRA-ELISA). Donor-specific antibodies (DSA) were detected by crossmatch tests and characterized by single antigen beads. Acute rejections (AR) were classified by Banff 97 criteria, updated in 2003. RESULTS: According to post-transplant PRAELISA the patients were classified in 5 groups: Group A (n=80): no evidence of Abs pre and post-transplant; Group B (n=8): patients with Abs de novo; Group C (n=5): sensitized patients who sustained the same PRA-ELISA levels; Group D (n=4): sensitized patients who increased PRA-ELISA levels and Group E (n=14): sensitized patients who decreased PRA-ELISA levels during the first year. The overall incidence of acute rejection was 23,4%. Patients from Groups B, C and D had more AR (respectively, 57%; 60% and 100%) than patients from Groups A (18%) and E (7%), (p<0.001). Patients from Group A had lower Banff scores than other groups (p=0.03) and lower rates of C4d positivity on AR biopsies (p<0.001). Among patients with AR, 44% of them had antibodies which appeared/increased during the AR episodes, and 90% were DSA. AR were pure cell-mediated (C4d-/Abs-) in 56% of the cases. The overall incidence of antibody-mediated rejection (AMR) was 11%. One-year censored graft survival was lower in patients with AR (p<0.001), specially in those with DSA (p<0.001), C4d+ (p=0.003), and AMR (p<0.003). CONCLUSION: Our data suggest that monitoring of anti- HLA antibodies post-transplantation is an useful tool for the diagnosis of antibody-mediated responses, and has prognostic implications in terms of graft survival.

A Paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, endêmico na América Latina, especialmente Brasil. Para melhor avaliarmos a resposta imune celular frente a diferentes componentes do fungo, como gp43, considerada o antígeno imunodominante de P. brasiliensis, filtrado de cultura livre de gp43 (Filtrado), e gp43 tratada com metaperiodato (meta), utilizamos os ensaios de linfoproliferação e ELISA para detecção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. Os resultados com relação à gp43 corroboram dados da literatura e de nosso laboratório demonstrando que gp43 é o antígeno imunodominante do fungo e pode estar envolvido no mecanismo de anergia dos linfócitos T de pacientes com a micose ativa. Com o Filtrado observamos respostas linfoproliferativas positivas, porém menores que com gp43, também evidenciando a anergia de linfócitos T de pacientes, e a indução de IL-10 em células de controles curados, podendo representar assim um mecanismo de imunossupressão. Com relação à meta, esta não induziu resposta linfoproliferativa nem a síntese de citocinas, sugerindo não ser um antígeno apropriado para esse tipo de avaliação. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, endemic in latin América, specially Brazil. To better understand the cellular immune responses to different components of the yeast, such as gp43, considered the immunodominant antigen, a culture filtrate free of gp43 (CF), and gp43 treated with metaperiodate, we used lymphoproliferative assays and ELISA to detect the cytokines IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. The results with gp43 were consistent with the literature and previous with data from our Laboratory showing that gp43 is the immunodominant antigen of P. brasiliensis and is likely involved with the anergy of T-cells from patients. With CF we observed positive, but weaker, proliferative responses. It also evidenced the T-cell anergy of patients and the preferential induction of IL-10 in cells from cured controls. The latter can represent a mechanism of anergy induction. With meta, we observed that neither induce proliferative responses nor cytokine secretion, being apparently an inappropriate antigen for use in cellular immunoassays.