Orientador : Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-01T15:00:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Minussi_RosanaCristina_D.pdf: 23875463 bytes, checksum: 675667e791d5bb4f80aa0ae309919523 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As condições ótimas de cultivo em meio semi-sólido e líquido de Trametes versieolor, Trametes villosa, Lentinus edodes e Botrytis einerea para produção de lacase foram estudadas. A maior atividade de 1acasefoi obtida em meio líquido com o fungo T. versicolor na presença de 2,5- xilidina e cobre como indutores. A atividade de lacase presente no extrato bruto foi então purificada e caracterizada. Foram encontradas duas fonnas de lacases (LI e L2) com a mesma massa molecular de 66 kDa. As lacases purificadas apresentaram propriedades catalíticas e fisicoquímicas similares as lacases de outros fungos basidiomicetos. A aplicação de lacase de T. versieolor em efluentes provenientes da indústria papeleira e da produção de óleo de oliva mostrou o alto potencial biotecnólogico desta enzima em presença e ausência de mediadores. A presença do mediador entendeu os substratos oxidados pela enzima. Fungos foram selecionados com base na sua habilidade em descolorir efluente têxtil e corantes comerciais em meio sólido. Atividade de lacase foi observada em placas descoradas por Trametes versieolor e Trametes villosa de corante Azul Reativo 19. Lentinus edodes mostrou a maior habilidade em termos de extensão e rapidez de descoloração nos diferentes corantes. Os resultados obtidos indicam uma possível relação entre a produção de sideróforos e a descoloração de corantes utilizados na indústria têxtil. Uma grande correlação entre potencial antioxidante total e teor de fenóis totais em vinhos comerciais foi observada. Ácido gálico foi o mais abundante dos ácidos fenólicos em vinhos tintos, seguido de (+)-catequina e (-)~icatequina. Estes compostos também foram correlacionados com o potencial total de antioxidantes dos vinhos. A detenninação do potencial total de antioxidantes pela descoloração de radicais cátions do ácido 2,2' -azino-bis(3-etilbenztiazoline-6-sulfonico) (ABTS), usando acido gálico como padrão, mostrou-se eficiente na determinação de características de diferentes vinhos. A utilização de lacase de Trametes versicolor na remoção de fenóis em mosto visando estabilização de vinhos indicou que o tratamento com o mosto tinto afeta principalmente os compostos fenólicos responsáveis pelas propriedades antioxidantes. Entretanto, o tratamento de mostos brancos com lacase mostrou maior redução em fenóis totais que no potencial antioxidante. A degradação de fenóis foi mais rápida para catequinas, seguida pelos estilbenos (eis e trans resveratrol) e derivados de ácidos cinâmicos (ferúlico e cafeico) e benzóicos (siringico, vanilico e gálico) / Abstract: The optimum cultivation conditions in semi-solid and liquid medium of Trametes versieolor, Trametes vil/osa, Lentinus edodes and Botrytis einerea for laccase production were studied. A high laccase activity was obtained in a liquid cu1tureof T. versieolor in the presence of 2,5-xylidine and copper as inducers. The laccase activity present in the crude extract was then purified and characterized. Two forms of laccases (LI and L2) with the same molecu1armass of 66 kDa were found. The purified laccases physicochemical and catalytic properties were similar to the analogous enzymes of other basidiomycetes. The application of this laccase in EI (pulp and paper) and olive oil wastewaters showed high biotechnology potential in the presence and absence of mediators. The mediator presence extended the oxidized compounds by laccases in these wastewaters. Four selected fungi were screened for their ability to decolorize a textile efl1uent and commercial reactive dyes in a solid medium. Laccase activity was observed in Reactive Blue 19 decolorized plates by Trametes versieolor and Trametes vil/osa. Lentinus edodes presented the greatest decolorization ability both in terms of extent and rapidity of decolorization. The results showed a possible relation between siderophores production and decolorization oftextile dyes. A high relationship between the total antioxidant potential and the phenolic content of commercial wines was found. In red wines, gallic acid was the major of the phenolic acids and (+)- catechin and (-)-epicatechin were the next most abundant phenolics. Also, these compounds are strictly correlated with the total antioxidant potential of wines. Total antioxidant potential by bleaching of 2,2' zino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical cations, using gallic acid as standard, could be a successful tool for evaluating the characteristics of different wines. Laccase utilization in must aiming wine stabilization indicated that the treatment of a red must with laccase affect mainly the phenolic compounds responsible for the must antioxidant properties. Although, the treatment of white musts with laccase showed a greater reduction in total phenol than in total antioxidant potential. Phenol degradation was very rapid for catechins, and less rapid for stilbenes (eis and trans resveratrol) and derivatives of cinnamic (ferulic and caffeic) and benzoic (syringic, vanillic, and gallic) acid / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Benedito Carlos Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agricola / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:48:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antoniolli_LucimaraRogeria_D.pdf: 2606407 bytes, checksum: 8fc34ece34c72c032981ec90141e3a83 (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Orientador: Rui Curi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T11:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_Benedito_D.pdf: 2811562 bytes, checksum: 6c865f6a7c5878a7e2af001ba77f1f56 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O efeito da insulina, hormônios tiroidianos, glicocorticóides (dexametasona) e catecolaminas na atividade de enzimas antioxidantes (CuZn- e Mn- superoxido dismutase SOD, catalase e glutatione peroxidase - GPX) em macrófagos intraperitoneais residentes de ratos e órgãos linfóides (linfonodo mesentérico - LNM, timo e baço) foi investigado. Para tanto, ratos adultos foram submetidos à várias disfunções hormonais: diabetes, hiper e hipotiroidismo, tratamento com dexametasone e adrenodesmedulação. O efeito dos hormônios em macrófagos cultivados também foi avaliado. Além dos estudos sobre atividade de enzimas antioxidantes, a produção de peróxido de hidrogênio (H202) por macrófagos foi determinada in vivo e in vitro. Em macrófagos: 1) a insulina aumentou a atividade da CuZn-SOD, catalase e GPX mas reduziu a da Mn-SOD, 2) os hormônios tiroidianos elevaram a atividade da CuZn- e Mn-SOD mas diminuiu a da GPX, enquanto que a dexametasona reduziu a da Mn-SOD e GPX, 3) a remoção da medula adrenal promoveu diminuição da atividade da Mn-SOD e GPX, 4) a produção de H202 foi aumentada pela insulina mas reduzida pelos hormônios tiroidianos e dexametasona. A indução do diabetes causou as seguintes mudanças de atividade das enzimas antioxidantes em órgãos linfóides: redução (exceto para GPX) no baço, aumento (exceto para a Mn-SOD) no timo, queda da Mn-SOD e catalase mas aumento da GPX no LNM; todas essas alterações foram revertidas pelo tratamento com insulina e permaneceu inalterada pela normoglicemia. O hipertiroidismo provocou elevação das atividades da CuZn- e Mn-SOD e diminuição da atividade da catalase nos órgãos linfóides. O tratamento com dexametasona causou: 1) queda da atividade da CuZn-SOD em todos os órgãos linfóides e da Mn-SOD no LNM, 2) redução da atividade da catalase no LNM e timo e aumento no baço, 3) aumento da atividade da GPX no LNM, timo e baço. A adrenodesmedulação elevou a atividade da CuZn-SOD em todos os órgãos linfóides, diminuiu a atividade da Mn-SOD no LNM e baço mas elevou no timo, enquanto que a atividade da catalase foi reduzida no LNM e timo e a atividade da GPX tornou-se indetectável nestas condições. Esses dados indicam que a atividade das enzimas antioxidantes é alterada pela insulina, hormônios tiroidianos, glicocorticóides e adrenalina. Essas alterações enzimáticas e metabólicas são tecidoespecíficas e podem desempenhar papel importante nas modificações da funcionalidade imunitária que geralmente acompanham as disfunções endócrinas envolvendo esses hormônios / Abstract: The effect of insulin, thyroid hormones, glucocorticoids (dexamethasone) and catecholamines on the activity of antioxidant enzymes (CuZn- and Mn-superoxide dismutase - SOD, catalase, and glutathione peroxidase - GPX) in rat resident intraperitoneal macrophages and lymphoid organs (mesenteric lymph nodes - MLN, thymus, and spleen) was investigated. For this purpose, aduIt rats were submitted to various hormonal disfunctions such as diabetes, hyper and hypothyroidism, dexamethasone treatment and adrenodemedullation. The effect of the hormones on macrophage cuItures was also examined. In addition to the antioxidant enzyme assays, the production of hydrogen peroxide (H202) by macrophages was determined both in vivo and in vitro. In macrophages: 1) Insulin raised the activity of CuZn-SOD, catalase and GPX but reduced that of Mn-SOD, 2) Thyroid hormones increased the activity of CuZn- and Mn-SOD but decreased that of GPX, whereas dexamethasone diminished both Mn-SOD and GPX activities, 3) The removal of adrenal medulla caused a marked decrease of Mn-SOD and GPX activities, 4) H202 production was increased by insulin but reduced by thyroid hormone and dexamethasone treatment. The induction of diabetes caused the following changes in antioxidant enzyme activities of the lymphoid organs: Reduction (except for GPX) in the spleen, increase (except for Mn-SOD) in the thymus, decrease of Mn-SOD and catalase but increase of GPX in the MLN; all these changes were reversed by insulin treatment and remained unchanged under normoglycemia. The hyperthyroidism provoked an elevation of CuZn- and Mn-SOD activities and decrease of catalase in all lymphoid organs. Dexamethasone treatment caused: 1) A decrease of CuZn-SOD activity in all lymphoid organs and of Mn-SOD in the MLN, 2) A reduction of catalase activity in the MLN and thymus and an increase in the spleen, 3) An augmentation of GPX activity in the MLN, thymus and spleen. Adrenodemedullation raised CuZn-SOD activity in all lymphoid organs, decreased the activity of Mn-SOD in the MLN and spleen but increased the latter activity in the thymus, whereas catalase activity was reduced in the MLN and thymus and GPX activity became undetectable under these conditions. These findings support the proposition that the antioxidant enzyme activities are aItered by insulin, thyroid hormones, glucocorticoids and adrenalin. These metabolic changes are tissue-specific and might play a role in the impairment of the immune function under endocrine disfunctions involving these hormones / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T00:40:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carmona_AndreaFerreiraMendes_M.pdf: 3922990 bytes, checksum: f993bbf2203082f1aa0eb3becb41c539 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Portadores de Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) sofrem necessariamente adaptação à hipóxia, por apresentar saturação de oxigênio (SatOz) na hemoglobina mais baixa em relação a indivíduos normais. Aliado à doença, o hábito de fumar pode induzir aumento na produção de radicais livres, o que torna necessário adaptações bioquímicas nesses indivíduos. Nesse estudo, avaliamos biomarcadores de estresse oxidativo e outros, que podem estar relacionados com a caracterização de alterações específicas induzidas pela doença e pelo tabagismo. Participaram do estudo, voluntários do sexo masculino com idades entre 40 a 80 anos. O grupo foi dividido entre pacientes portadores de DPOC, fumantes e não fumantes. Os biomarcadores sangüíneos utilizados foram: atividades das enzimas catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) para o sistema de defesa antioxidante, e da creatina quinase (CK) para lesão muscular, concentração de proteínas carboniladas (PC), de grupamentos sulfidrila livres (SH), de ácido úrico (AV) e de substâncias reativas ao ácido tiubarbitúrico (TBARs) para o ataque oxidativo, além das concentrações de hemoglobina e lactato. Os resuItados apresentados neste trabalho, sugerem que os parâmetros de saturação de oxigênio, lactato, concentração de hemoglobina, creatina quinase, catalase e grupamento sulfidrila livres possam ser usados para caracterizar alterações específicas observadas nos três grupos / Abstract: Patients suffering from Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) are likely to be adapted to hypoxic situation, as they present lower levels of oxygen saturated hemoglobin compared to normal individuais. This disease, as well as smoking habit potentially induce an increase on free radical generation what causes some biochemical adaptations. In the present work we have analysed some biomarkers for oxidative stress as well as other biochemical parameters which could be used to characterize specific adaptations induced by COPD or smoking. The study group comprized 40 to 80 years old male voluntiers, divided in COPD patients, smoking and non smoking individuais. The evaluated blood biomarkers were: the enzymatic activities of catalase (CAT) and glutathione reductase (GR) for the antioxidant defense system and creatine kinase (CK) for muscle injury; the concentrations of carbonyl proteins (PC), total sulphydryl groups (SH), uric acid (AV) and thiubarbituric acid reactive substances (TBARs) as indicators of oxidative attack, as well as hemoglobin and lactate concentrations. Our results show that the parameters saturation of oxygen, lactate, hemoglobin, creatine kinase, catalase and total sulphydryl groups can be used to characterize specific alterations observed in the three distinct groups / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Alba Regina Monteiro Souza Brito / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_LeoniaMaria_D.pdf: 440409 bytes, checksum: d51ae28cd556e603a8eb4586b27e646c (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Syngonanthus bisulcatus e Syngonanthus arthrotrichus, espécies pertencentes à família Eriocaulaceae, são encontradas em regiões tropicais na América do Sul e no Brasil, principalmente nos estados da Bahia e Minas Gerais. Este gênero é conhecido popularmente como ¿sempre vivas¿. S. bisulcatus e S. arthrotrichus foram investigadas porque os dados quimiotaxonômicos e filogenéticos da família apontavam a presença de flavonóides, que possuem atividades biológicas relevantes. Os extratos etanólicos dessas espécies, nas doses de 50, 100 e 250 mg/kg, e as frações ricas (FRF) e deficientes (FDF) em flavonóides, na dose de 100 mg/kg via oral, foram estudadas em modelos de úlceras induzidas agudamente (HCl/etanol, etanol, estresse, indometacina/betanecol e isquemia e reperfusão) e subcronicamente (ácido acético 30%), em camundongos e ratos. A via intraduodenal foi empregada somente para frações no modelo de ligadura do piloro. Tanto extratos, quanto frações, inibiram significativamente as lesões ulcerativas induzidas pelos diferentes agentes. Também foram observadas alterações significantes nos parâmetros bioquímicos da secreção ácida gástrica com redução na concentração total de H+ no suco gástrico com conseqüente elevação do pH. Estes resultados sugeriram atividades anti-secretória e citoprotetora para extratos e frações. O pré-tratamento com as frações FRF de ambas as espécies produziu, no modelo de úlcera por ácido acético, redução na área da lesão por estimulação do processo de cicatrização. Adicionalmente, verificou-se que a atividade antiulcerogênica das frações não está relacionada ao aumento da PGE2; porém, o muco aderido, provavelmente estimulado pelo óxido nítrico, bem como os grupos sulfidrilas protéicos parecem estar envolvidos com a atividade citoprotetora de FRF, de FDF ou de ambas, dependendo do mecanismo de ação investigado. Animais tratados com as FRF das espécies em estudo e submetidos à indução de úlcera por etanol tiveram aumento significativo dos níveis séricos do hormônio somatostatina e redução no de gastrina. As FRF, estudadas em ratos submetidos à isquemia e reperfusão, produziram diminuição do número de lesões, indicando atividade antioxidante verificada através da redução da peroxidação lipídica e aumento dos níveis de grupamentos tióis totais. Por último, experimentos de citotoxicidade demonstraram que as frações da S. bisulcatus foram mais citotóxicas do que as frações da S. arthrotrichus em cultura de células V79. Análises cromatográficas e RMN demonstraram que as FRF contém luteolina e luteolina glicosilada para ambas as espécies, além de lutonarina (5,3¿,4¿-triidroxi-6-C,7-O-di-B-D-glucopiranosilflavona) e 6-hidroxi-7-O-B-D-glucopiranosilluteolina (5,6,3¿,4¿-tetrahidroxi-7-O-B-D-gluco-piranosil) para S. bisulcatus. Para a S. arthrotrichus, foram isoladas ainda apigenina e uteolina-6-C-?-D-glucopiranosideo. O conjunto de dados permite concluir que a atividade antiulcerogênica dos extratos e frações da S. bisulcatus e S. arthrotrichus está relacionada à atividade anti-secretória, citoprotetora e antioxidante dos flavonóides existentes nessas espécies / Abstract: The genus Syngonanthus (family Eriocaulaceae) is found in tropical regions of South America. In Brazil, the species Syngonanthus bisulcatus and Syngonanthus arthrotrichus, popularly known as ¿sempre vivas¿, occur mainly in the states of Bahia and Minas Gerais. Chemiotaxonomic and phylogenetic data have indicated the presence of flavonoids in both of these species. In this work, we investigated the effects of ethanolic extracts (50, 100 and 250 mg/kg, orally) and of flavonoid-rich (FRF) and -deficient (FDF) fractions (100 mg/kg, orally) of these species in models of acute (HCl/ethanol, ethanol, stress, indomethacin/bethanecol) and subchronic (30% acid acetic) ulcers in mice and rats, as well as in a model of pylorus ligature in which the fractions were administered intraduodenally. The extract and fractions significantly prevented ulceration caused by various agents, and also significantly reduced the total H+ concentration in gastric juice, which led to a rise in pH. These results indicated that the extract and fractions had antisecretory and cytoprotective actions. In acetic acid-induced ulcers, treatment with the fractions (FRF) from both species reduced the area of damage by enhancing the healing process. The antiulcerogenic activity of the fractions was not associated with an increase in PGE2 formation. In contrast, the amount of adhered mucus (probably stimulated by nitric oxide), together with the sulphydryl groups of proteins, appeared to be involved in the cytoprotection by FRF and FDF, depending on the mechanism of action. In animals pre-treated with the FRF of either species and then subjected to ulcer induction with ethanol, there was a significant increase in the serum levels of somatostatin and a reduction in those of gastrin. In rats with ischemia and reperfusion, FRF of both species increased the extent of injury, thus indicating an antioxidant activity that was reflected in a reduction in lipid peroxidation and an increase in the levels of total thiols. In cultured Chinese hamster V79 fibroblasts, the fractions of S. bisulcatus were more cytotoxic than those of S. arthrotrichus. Chromatographic analysis and NMR of the fractions of both species showed that the FRF contained luteolin and glycosylated luteolin, as well as previously detected flavonoids such as lutonarin 5'3¿,4¿-trihydroxy-6-C,7-O-di-B-D-glucopyranosylflavone) and 6-hydroxy-7-O-B-D-glucopyranosylluteolin (5,6,3¿,4¿-tetrahydroxy-7-O-B-D-glucopyranosyl), in the case of S. bisulcatus. In addition to luteolin, apigenin and luteolin-6-C-?-D-glucopyranoside were also detected in S. arthrotrichus. These results indicated that the antiulcerogenic activity of extracts and fractions of S. bisulcatus and S. arthrotrichus was related to the antisecretory, cytoprotective and antioxidant actions of flavonoids present in these plants / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340461.pdf: 6740223 bytes, checksum: 45fdef44d0dd589c15b21d92ff281d38 (MD5) / Passiflora tenuifila Killip e Passiflora setacea DC. são espécies endêmicas dos biomas brasileiros Cerrado, Mata Atlântica e Caatinga (P. setacea DC.) e foram selecionadas pelo programa de melhoramento genético da Embrapa Cerrados, visando o desenvolvimento tecnológico para uso funcional das Passifloras silvestres. O objetivo desse trabalho foi determinar a atividade antioxidante e os conteúdos de fenólicos totais e flavonoides de extratos de calos de diferentes idades, originados de diferentes tipos de explantes. Os calos de P. setacea foram produzidos a partir de explantes de segmentos de raiz, hipocótilo, cotilédone, nó cotiledonar e nó foliar de plântulas de 8 semanas de idade, e de segmentos de caule de microplantas cultivados em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% de Phytagel e 2,5 µM de 2,4-D. Os calos de P. tenuifila foram produzidos a partir do cultivo de sementes em desenvolvimento, em meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com 88,5 mM de sacarose, 2,5 µM de 2,4-D, 0,2% de Phytagel, e de segmentos de caules de microplantas cultivados em 88,5 mM de sacarose ou frutose, 2,5 µM de ANA, 0,2% de Phytagel. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2ºC, sob fotoperíodo de 16/8 horas de luz/escuro e umidade relativa de 70%. Uma vez estabelecidos os calos foram submetidos às análises de crescimento, macerados e submetidos à extração por exaustão em etanol 96% por 21 dias. Os extratos foram evaporados, até a secagem e analisados quanto ao rendimento. Os extratos foram analisados colorimetricamente quanto à capacidade sequestradora de radicais livres, pelo método do DPPH e quanto ao poder redutor, com base na redução do ion férrico. Os melhores rendimentos dos extratos ocorreram aos 30 dias, em calos de nó foliar de P. setacea (39,1%) e aos 45 dias, em calos de sementes imaturas (16,5%) de P. tenuifila. As maiores atividades antioxidantes, detectadas pelo método do DPPH, ocorreram em calos de 30 dias de nó cotiledonar de P. setacea (70,58%) e em calos de caule em frutose de 45 e 60 dias de P. tenuifila (59,93% e 60,88%). Os maiores valores de poder redutor foram observados em calos de nó cotiledonar de 45 dias de P. setacea (361,39 mg Eq AA/g extrato seco) e em calos de caule em sacarose de 45 dias de P. tenuifila (287,45 mg Eq AA/g extrato seco). Os maiores conteúdos de fenólicos totais ocorreram em calos de 30 dias de nó cotiledonar (43,73 mg Eq AG/g extrato seco) e em calos de caule em frutose, de 45 e 60 dias e em calos de sementes imaturas de 60 dias (25,80 mg Eq AG/g extrato seco). Os maiores níveis de flavonoides totais foram detectados em calos de 30 dias de nó foliar de P. setacea (5,49 mg Eq Q/g de extrato seco), apesar de não diferir dos demais tipos de calos, e em calos de sementes imaturas de 45 dias de P. tenuifila (4,77 mg Eq Q/g de extrato seco). Calos de nó cotiledonar de P. setacea e de caules em frutose de P. tenuifila apresentaram os máximos valores de atividade antioxidante e de teores de fenólicos totais. As análises indicaram que os níveis de fenólicos totais, flavonoides, atividade antioxidante variaram com a espécie, com o tipo de explante e com a idade dos calos. Esses resultados permitiram definir, para cada espécie e tipo de calo, a idade da cultura de calos ideal para otimizar a biossíntese de fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante, confirmando o potencial de utilização das culturas celulares em futuras aplicações de abordagens biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários. <br> / Abstract : Passiflora tenuifila Killip e Passiflora setacea DC are endemic of the Brazilian biomas Cerrado, Atlantic Forest and Caatinga (P. setacea DC.) and were selected by the Embrapa Cerrados genetic improvement program aiming the tecnological development for the functional utilization of the native Passifloras. The aim of this work was the determination of antioxidant activity and total phenolic and flavonoid contents of extracts from in vitro calluses at different age, originated from different explant types. Calluses of P. setacea were produced from root, hypocotyl, cotyledon, cotyledonary and leaf nodal segments from 8-week-old seedlings and from stem segments of in vitro microplants cultured on Murashige & Skoog basal medium supplemented with 88.5 mM sucrose, 0.2% Phytagel and 2.5 µM de 2,4-D. The P. tenuifila calluses were produced from developing seeds and microplant stem segments cultured on Murashige & Skoog basal medium supplemented with either 88.5 mM sucrose or fructose, 2% Phytagel and 2.5 µM NAA. Cultures were kept at 25 ± 2ºC, under a 16/8 light/dark photoperiod and 70% relative umidity. Once established calluses were submitted to growth analysis, macerated and extracted with 96% ethanol for 21 days. The extracts were evaporated to dryness and analyzed for yield. The extracts were analyzed collorimetrically for their free radical scavenging capacity, using the DPPH assay and the reducing power, based in the reduction of the ferric ion. The best extract yielding occurred in 30 day old leaf node calluses of P. setacea (39.1%) and in 45 day old calluses derived from immature seeds (16.5%) of P. tenuifila. The highest antoxidant activity detected by the DPPH assay occurred in 30 day old cotyledonary node calluses of P. setacea (70.58%) and in 45 and 60 day old stem derived callus of P. tenuifila grown in fructose (59.93% e 60.88%). The highest reducing power was observed in 45 day old cotyledonary node calluses of P. setacea (361.39 mg Eq AA/g) dry extract) and in 45 day old stem derived calluses of P. tenuifila (287.45 mg Eq AA/g dry extract) grown in sucrose. Higher total phenolic content occurred in 30 day old cotyledonar node calluses of P. setacea (43.73 mg Eq AG/g dry extract) and in 45 e 60 day old stem derived calluses grown in fructose and in 60 day old calluses derived from immature seeds of P. tenuifila (25.80 mg Eq AG/g dry extract). The highest flavonoid levels were detected in 30 day old leaf node callus of P. setacea (5.49 mg Eq Q/g dry extract), although it did not differ from the other callus type, and in 45 day old callus derived from immature seed of P. tenuifila (4.77 mg Eq Q/g dry extract). Cotyledonary node calluses of P. setacea and stem derived calluses of P. tenuifila grown in frutose showed the highest antioxidant activity and total phenolics at the same culture time. The analysis carried out have shown the levels of phenolics, flavonoids and antioxidant activity varied according to species, with the explant type and the calluses culture age. These results allowed the establishment, for each species and for each callus type, the ideal callus culture age to optimize the biosynthesis of phenolics, flavonoids and antioxidant activity, confirming the potential use of cell cultures as tools for further application of biotechnological approaches for secondary metabolite production.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Maqui (Aristotelia chilensis), murtilla (Ugni molinae) y arándano (Vaccinium corymbosum) son berries originarios de Chile, Sudamérica y Norteamérica, respectivamente. Han sido utilizados en alimentos funcionales y fitofármacos por su reconocido poder antioxidante, además de tener propiedades antiinflamatorias y antibacterianas. Para medir la actividad antioxidante de extractos vegetales, principalmente se utilizan compuestos sintéticos. Estos compuestos son xenobióticos para la celula animal, y por lo tanto sus potenciales redox no son comparables con los de los antioxidantes biológicos. Es por esto que en este trabajo se estudió la capacidad antioxidante de estos berries utilizando microsomas hepáticos de rata como sistema biológico y como sistema prooxidante, Fe3+/ascorbato. Inicialmente, se midió la cantidad de polifenoles de los tres extractos para ser usada como parámetro comparativo entre ellos. Los tres extractos previnieron la lipoperoxidación de los microsomas, y revirtieron y previnieron la oxidación de los tioles microsómicos con distinta potencia, todas reacciones inducidas por el sistema pro oxidante Fe3+/ascorbato. Todos los extractos además, fueron capaces de quelar el ion Cu2+. El extracto de maqui mostró la mayor actividad antioxidante, y el extractoto de arándano, la menor. La calidad y cantidad de los antioxidantes presentes en los diferentes extractos podría explicar esta diferencia. Cabe destacar que extractos polivalentes como los ensayados ejercen su poder antioxidante por diversos mecanismos actuando de manera sinérgica. Esta característica representa una gran ventaja al formular fitofármacos orientados al tratamiento de patologías asociadas a estrés oxidativo / Maqui (Aristotelia chilensis), murtilla (Ugni molinae) y Arándano (Vaccinium corymbosum) are berries from Chile, Southamerica and Northamerica, respectively. They have been used in functional foods and herbal medicine because of their recognized antioxidant power and anti-inflammatory and antibacterial properties. Antioxidant activities of herbal extracts are determined using principally synthetic compounds. These compounds are xenobiotic for the animal cell, thus theirs redox potentials are not comparable with those of biological antioxidants. This is the reason why the antioxidant capacity from these berries was studied. Rat liver microsomes were used as a biological system and Fe3+/ascorbate, as prooxidant system. Initially, the amount of polyphenols in the three extracts was measured in order to be used as a comparative parameter among them. Our request involved that the three extracts prevented microsomal lipoperoxidation and reverted and prevented the oxidations of microsomal thiols with different potency, all reactions induced by Fe3+/ascorbate). They were also able to chelate ion Cu+2. Maqui extract showed the highest antioxidant capacity and the lowest corresponding to the arandano extract. The quality and quantity of the antioxidants present in each one of the three extracts could explain this difference. These polyvalent extracts should exert its antioxidant power by diverse mechanisms acting in a synergic way. This characteristic represent a great benefit for therapies related with pathologies specially associated to oxidative stress

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / "La Astaxantina protege a las neuronas de cultivo primario de hipocampo de los efectos dañinos de los oligómeros del peptido β-amiloide " Introducción: El incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno y la aparición de estrés oxidativo contribuyen en forma importante para el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs) son considerados como entidades moleculares centrales en la patogénesis de la EA. A concentraciones sub-letales, los AβOs producen señales aberrantes de Ca2+ y disminuyen la expresión de la isoforma 2 del receptor de ryanodina (RyR2), una proteína importante para los procesos de plasticidad y memoria asociados al hipocampo. En este trabajo, investigamos si el pre-tratamiento con el antioxidante astaxantina (ATX) protege a las neuronas de los efectos deletéreos inducidos por los AβOs, como el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de la isoforma c4 del factor nuclear de células T activadas (NFATc4), y la disminución del RNAm de RyR2 en un modelo de cultivo primario de células de hipocampo de rata. Metodología: Para estudiar los efectos de ATX sobre la viabilidad celular, se realizó una curva dosis respuesta con ATX y se determinó la viabilidad utilizando el kit Live/Dead®. Para determinar los niveles de producción de H2O2 mitocondrial y la activación de NFATc4, las neuronas se transfectadas con plasmidios codificantes para la proteína sensora de H2O2, para HyperMito o para la proteína de fusión entre NFATc4 y la proteína fluorescente verde (GFP), (NFATc4-eGFP), respectivamente. Los niveles de RNAm de RyR2 se determinaron por qPCR. Los cultivos primarios de células hipocampales se pre-trataron con 0,1 μM de ATX, 90 minutos antes de ser tratados con 0,5 μM AβOs. Resultados y Conclusiones: El tratamiento con ATX (≤10 μM) por ≤ 24 horas no evidenció cambios en la viabilidad del cultivo. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial inducido por los AβOs. El tratamiento con AβOs por 6 horas indujo la translocación nuclear de NFATc4-eGFP y la disminución de los niveles de expresión del RNAm de RyR2. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno ambos efectos. Estos resultados indican que la ATX protege a las neuronas del incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de NFATc4, y la disminución del RNAm de RyR2, inducidos por los AβOs / "Astaxanthin protects primary hippocampal neurons against noxious effects of Aβ-Oligomers" Introduction: Increased reactive oxygen species (ROS) generation and the ensuing oxidative stress contribute to Alzheimer´s disease pathology. We reported previously that amyloid-β peptide oligomers (AβOs) produce aberrant Ca2+ signals at sub-lethal concentrations and decrease the expression of type-2 ryanodine receptors (RyR2), which are crucial for hippocampal synaptic plasticity and memory. Here, we investigated whether the antioxidant agent astaxanthin (ATX) protects neurons from AβOs-induced excessive mitochondrial ROS generation, NFATc4 activation and RyR2 RNAm down-regulation. Methodology: To study the effects of ATX on cell viability, we performed a dose response curve and quantified cells survival using the Live/Dead® kit. To determine mitochondrial H2O2 production or NFATc4 nuclear translocation, neurons were transfected with plasmids coding for HyperMito or NFATc4-eGFP, respectively, qPCR was employed to determine RyR2 RNAm expression levels. Primary hippocampal cultures were incubated with 0.1 μM ATX for 1.5 h prior to 0.5 μM AβOs addition. Results and Conclusion: We found that incubation with ATX (≤10 μM) for ≤ 24 h was non-toxic to neurons. Pre-incubation with 0.1 μM ATX also prevented the neuronal mitochondrial H2O2 generation induced within minutes of AβOs addition. Longer exposures to AβOs (6 h) promoted NFATc4-eGFP nuclear translocation and decreased RyR2 RNAm levels, evaluated by detection of the eGFP tagged fluorescent plasmid and qPCR, respectively. Pre-incubation with 0.1 μM ATX prevented both effects. These results indicate that ATX protects neurons from the noxious effects of AβOs on mitochondrial ROS production, NFATc4 activation and RyR2 gene expression down-regulation

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Doctora en Farmacología / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2016 / La importancia mundial que hoy tienen las plantas medicinales ha fomentado el desarrollo de fitofármacos por las compañías farmacéuticas. A diferencia de los fármacos sintéticos, las etapas para el desarrollo de fitofármacos (formulaciones que contienen extractos de hierbas polivalentes), no están claramente definidos, estandarizados y normalizados. Estas preparaciones a base de hierbas son muy diversas y los estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos de ellos son escasos. De ahí la importancia de la normalización de los procesos que intervienen en la obtención de extractos herbales y fitofármacos, así como la determinación de la dosis, la seguridad y la eficacia de fitofármacos. El estudio de los parámetros farmacocinéticos requiere datos experimentales, que se resumen en las curvas de dosis-respuesta. En estas curvas se representa la concentración plasmática del fármaco en función del tiempo después de su administración. La concentración individual de principios activos en los extractos de hierbas es muy baja, por lo que es difícil su cuantificación plasmática utilizando los métodos de HPLC clásicos. Asimismo, se ha observado que existe una correlación directa entre la concentración plasmática de los principios activos presentes en un fármaco con los efectos farmacológicos observados. Si se acepta esta correlación, la cuantificación del principio activo podría ser reemplazada por cualquier efecto medible en plasma. Las hojas de las plantas en general, poseen un alto contenido de antioxidantes, siendo mayoritarios los compuestos polifenólicos. Existen diversas publicaciones que indican que estos compuestos ejercen diferentes efectos farmacológicos relacionados con su actividad antioxidante. Así, preparados de ellos se han asociado a la terapia clásica de patologías tales como enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas (16, 62, 64). Considerando los antecedentes expuestos, en este trabajo se utilizaron extractos hidro-alcohólicos de hojas de Buddleja globosa Hope (matico) y Plantago major L. (Llantén). Extractos hidro-alcohólicos de matico y llantén, previamente caracterizados por su actividad antioxidante in vitro, fueron administrados oralmente a ratas Sprague-Dawley. El análisis de la capacidad antioxidante plasmática a través del tiempo, mostró un aumento de la capacidad de reducir hierro y una disminución de la concentración plasmática de malondialdehído, producto de la oxidación de los lípidos celulares. Por otra parte, el análisis cromatográfico (HPLC) del plasma de las ratas, no mostró los picos correspondientes a los marcadores polifenólicos seleccionados para cada planta (estándares de polifenoles). Como una forma de detectar la presencia de los marcadores seleccionados en los extractos, muestras de los extractos fueron analizadas por LC-masa. Los cromatogramas obtenidos por este método mostraron la presencia en los extractos de los marcadores seleccionados; por lo tanto, la no aparición de ellos en los cromatogramas HPLC confirma la falta de sensibilidad del método HPLC implementado para cuantificar tan pequeñas cantidades de principios activos. El aumento de la capacidad antioxidante plasmática sin embargo, demuestra que hubo absorción de los antioxidantes presentes en las dosis orales de los extractos herbales administrados a las ratas. Estos resultados nos permiten postular que para determinar los parámetros farmacocinéticos de fitofármacos, la determinación del efecto farmacológico, en este caso el efecto antioxidante, podría reemplazar a la concentración plasmática. Cabe destacar que este trabajo representa el primer intento para determinar parámetros farmacocinéticos de fitofármacos, preparados herbales polivalentes. Sin embargo, se necesitan nuevos experimentos que permitan estandarizar las condiciones experimentales implementadas de tal forma que esta metodología pueda que esta metodología pueda ser utilizada en el estudio farmacocinético de fitofármacos / The global importance now given to medicinal plants has encouraged the development of phytodrugs by pharmaceutical companies. Different to synthetic drugs, the stages for the development of phytodrugs (formulations containing polyvalent herbal extracts), are not clearly defined, standarized and normalized. These herbal preparations are very diverse and the pharmacokinetics and pharmadynamics studies of them are scarce. Hence the importance of standardizing the processes involved in obtaining herbal extracts and phytodrugs, as well as, the, the dosage, safety and efficacy of phytodrugs. The study of pharmacokinetic parameters requires experimental data, which are summarized in dose-response curves. These curves plot the plasmatic drug concentration versus time after administration. The individual concentration of active ingredients in herbal extracts are very low, so their plasmatic quantification is difficult using the classis HPLC methods. It has been observed that there is a direct correlation between plasma concentrations of the active ingredients present in a drug with the pharmacological effects observed. If this correlation is accepted, the quantification of the active ingredient could be replaced by any measurable effect on plasma. In general, the leaves of plants have a high content of antioxidants, being polyphenolic compounds the major constituents. There are different publications indicating that these compounds have many pharmacological effects related to its antioxidant activity. This is the reason why the use of herbal preparations has been associated with conventional theraphy of diseases such as cardiovascular and neurodegenerative (16, 62, 64). Considering the above, this study used hydro-alcoholic extracts of leaves of Buddleja globosa Hope (matico) and Plantago major L. (Llantén). Hydro-alcoholic extracts of matico and llantén, previously characterized for their in vitro antioxidant activity, were orally administered to Sprague-Dawley rats. Analysis of plasma antioxidant capacity over time showed an increase in the ability to reduce iron and a decreased in the concentration of plasmatic malondialdehyde, product of celular lipid oxidation. Moreover, chromatographic analysis (HPLC) of rat’s plasma showed no peak corresponding to the polyphenolic markers selected for each plant (polyphenols standards). As a way to detect the presence of polyphenols markers, extract samples were analyzed by LC-mass chromatography. The chromatograms Obtained by this method showed the presence of the selected markers in the extracts; therefore, the non-appearance of them in the HPLC chromatograms confirms the lack of sensitivity of the HPLC method implemented to quantify such small amounts of active principles. The increase in plasma antioxidant capacity however, shows absorption of antioxidant compounds present in the oral doses of herbal extracts given to rats. These results allow us to postulate that to determine the pharmacokinetic parameters of phytodrugs, determination of pharmacological effect, in this case antioxidante effect, could replace the determination of plasmatic concentration levels. It is worthy to note that this work represents the first attempt to determine pharmacokinetic parameters of phytodrugs (polyvalent herbal preparations). However, further experiments to standardize experimental conditions implemented so that this methodology can be used in pharmacokinetic studies of phytodrugs, are needed / Conicyt