Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 3 uppsatser.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2099736 bytes, checksum: 3154bc6417163042770bdea529771577 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The cancer is a disease of the genetic material of our cells and the experimental cancerology has a huge value for the studies of several aspects related to the neoplastic processes. Many drugs used nowadays in chemotherapy were extracted from plants or derived from a natural prototype. However, medicinal plants have aggressive substances and, so, their toxicity must be evaluated. Rollinia leptopetala R.E. Fries, popularly known as angry pine , is a tree or bush endemic in Brasil and is utilized by popular medicine as digestive and against tumors and inflammations. It s barely addressed in the literature, both from the point of view of phytochemist studies as their biological activities. Because of this, this work has the objective of evaluate the antitumor activity and the toxicity of the Brute Hydroalcoholic Extract (BHYE) of the leaves from R. leptopetala, through the assays in vitro and in vivo. The value of CI50 obtained from the assays of the exclusion of the trypan blue was 512,3 μg/mL. Already in the bioassay with A. salina the value obtained from CL50 was 78,49 μg/mL. The BHYE of the leaves from R. leptopetala didn t show significant hemolytic activity in erythrocytes in mice, producing only 10 % of hemolysis in concentrations above 1250 g/mL. In the evaluation of antitumor activity in vivo in sarcoma 180 the rates of inhibition of tumor growth were 8.05, 38.72 and 49.73% after treatment with 50, 100 and 150 mg/kg of the extract, respectively. The toxicological analysis of the animals showed that there was no change in the index of spleen and thymus after the treatments, these alterations that occur with chemotherapy drugs used in clinical practice, nor the kidneys, liver and heart. In the study of the subchronic toxicity, it was observed that the continuous use of the extract at a dose of 90mg/kg, possibly has a diuretic action, which can cause megaloblastic anemia and can affect the Central Nervous System, in addition to increasing the quantity of platelets. Therefore, it is possible to infer that the BHYE from the leaves of R. leptopetala has antitumor activity, but that its continuous usage can cause toxicological damage. / O câncer é uma doença do material genético de nossas células e a cancerologia experimental é de grande valia para se estudar os diversos aspectos relacionados aos processos neoplásicos. Muitas drogas usadas atualmente na quimioterapia foram isoladas de espécies de plantas ou derivadas de um protótipo natural. Porém, plantas medicinais possuem substâncias agressivas e, assim, sua toxicidade deve ser avaliada. Rollinia leptopetala R.E. Fries, conhecida popularmente como pinha brava , é uma árvore ou arbusto, endêmica do Brasil e utilizada pela medicina popular como digestivo e contra tumores e inflamações. É pouco relatada na literatura, tanto do ponto de vista dos estudos fitoquímicos como de suas atividades biológicas. Diante disto, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antitumoral e toxicidade do Extrato Hidroalcoólico Bruto (EHAB) das folhas de R. leptopetala, através de ensaios in vitro e in vivo. O valor de CI50 obtido através dos ensaios de exclusão do azul de tripan foi 512,3 μg/mL. Já no bioensaio com A. salina, o valor de CL50 obtido foi 78,49 μg/mL. O EHAB das folhas de R. leptopetala não mostrou atividade hemolítica significativa em eritrócitos de camundongos, produzindo apenas 10 % de hemólise em concentrações acima de 1250 g/mL. Na avaliação da atividade antitumoral in vivo frente sarcoma 180 as taxas de inibição do crescimento tumoral foram 8,05, 38,72 e 49,73 % após tratamento com 50, 100 e 150 mg/kg do extrato, respectivamente. As análises toxicológicas dos animais mostraram que não houve alteração no índice de baço e timo após os tratamentos, alterações estas que ocorrem com quimioterápicos utilizados na prática clínica, nem dos rins, fígado e coração. No estudo da toxicidade subcrônica, observou-se que o uso contínuo do extrato na dose de 90mg/kg, possivelmente tem uma ação diurética, pode causar anemia megaloblástica e pode afetar o Sistema Nervoso Central, além de aumentar a quantidade de plaquetas. Portanto, é possível inferir que o EHAB das folhas de R. leptopetala possui atividade antitumoral, mas que seu uso contínuo pode causar danos toxicológicos.

Lung cancer is the leading cause of cancer mortality worldwide. Understanding biological processes of specific antitumor immune response remains of an eminent interest and represents necessity for designing successful antitumor immunotherapeutic strategies. The theoretical part of the thesis describes components of the immune system that are involved in antitumor response and discusses their role in the hitherto known and used lung cancer immunotherapy. In the practical part of the thesis, two studies studying different aspects of anticancer immune response are described. Both studies were conducted in cooperation with 3rd Surgical Department 1st Faculty of Medicine, Charles University and University Hospital Motol and with the biotechnology company Sotio a.s. The first study is focused on the humoral component of the specific antitumor response and prospectively analyses serum frequency of antitumor antibodies against NY-ESO-1, Her2/neu and MAGE-A4 antigens in 121 patients with NSCLC. Here it was shown for the first time that tobacco smoking significantly increases the frequency of NY- ESO-1 antibodies in sera of smokers in comparison to ex-smokers and non-smokers. The second study is focused on the cellular component of the specific antitumor response investigating the activity of the dendritic...

?rea de concentra??o: Ci?ncias farmac?uticas. / Incluir como ag?ncias financiadoras: Grupo Coimbra das Universidades Brasileiras (GCUB) e Organiza??o dos Estados Americanos (OEA). / Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2018-01-03T17:55:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-19T16:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) maria_angelica_mera_cordoba.pdf: 4879022 bytes, checksum: 13557ebc3d06581da850d1f24cc11a52 (MD5) Previous issue date: 2017 / O Cerrado mineiro possui muitas esp?cies vegetais utilizadas na medicina popular, dentre elas est?o a Pseudobrickellia brasilensis , a Miconia ferruginata e Ageratum fastigiatum, plantas popularmente usadas como analg?sico, cicatrizante e anti-inflamat?rio. Estudos realizados no Laborat?rio de Imunologia da UFVJM indicaram que extratos destas plantas possuem efeito inibit?rio sobre a ativa??o de linf?citos humanos in vitro. Em virtude disso, e com base em relatos populares sobre uma poss?vel a??o antitumoral, o objetivo principal deste trabalho foi pesquisar se estes extratos apresentariam ou n?o efeito citot?xico sobre a linhagem tumoral Jurkat, utilizando-se concentra??es n?o t?xicas, j? avaliadas sobre c?lulas mononucleares do sangue perif?rico humano (PBMC). Uma vez que os extratos vegetais foram dilu?dos no solvente Dimetilsulf?xido (DMSO), inicialmente investigou-se a concentra??o m?xima de DMSO que n?o alteraria a viabilidade das c?lulas Jurkat ap?s 24, 48 e 72 horas de cultura. O efeito citot?xico dos extratos foi avaliado sobre linf?citos tumorais (Jurkat) e sobre linf?citos humanos de volunt?rios h?gidos pelo m?todo de exclus?o com azul de tripan, com exce??o das culturas tratadas com P.brasilensis, onde a viabilidade foi avaliada por citometria de fluxo. Tamb?m foram calculados os ?ndices de seletividade e percentuais de efic?cia dos extratos com rela??o ao f?rmaco antineopl?sico Paclitaxel. Foi avaliada tamb?m a interfer?ncia desses extratos sobre as fases do ciclo celular das c?lulas Jurkat, bem como os mecanismos de morte envolvidos na a??o citot?xica dos extratos. De acordo com os resultados obtidos, o DMSO n?o apresentou efeito t?xico sobre as c?lulas Jurkat na concentra??o de 1%v/v nos tr?s tempos de incuba??o, sendo esta a concentra??o de solvente utilizada em todos os ensaios realizados. Extratos etan?licos das folhas da P. brasilensis (PBf) a 200?g/mL, das partes a?reas da A. fastigiatum (Afpa) a 50?g/mL e extratos etan?licos e aquosos da M. ferruginata (Mfet, Mfaq) a 125?g/mL mostraram maior toxicidade sobre as c?lulas Jurkat principalmente ap?s 72h de tratamento. O tratamento, por 24h, com extrato Afpa 50 ?g/mL mostrou ser o mais seletivo e eficaz com rela??o aos outros extratos. Foi evidenciado em todos os extratos, que nas maiores concentra??es, ap?s de 24 horas de tratamento, houve uma inibi??o na progress?o da fase G2M do ciclo celular. O extrato das partes a?reas de Ageratum fastigiatum tamb?m produziu uma reten??o dessas c?lulas na fase G0-G1. Todos os extratos induziram a apoptose as c?lulas Jurkat, onde o n?mero de c?lulas em apoptose tardio foi predominante em rela??o aos processos necr?ticos. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / The Cerrado Mineiro has many vegetable species used in folk medicine. Plants like Pseudobrickellia Brasilensis, Miconia ferruginata and Ageratum fastigiatum are widely used as analgesic, healing or anti-inflammatory. Studies carried on the Immunology Laboratory (UFVJM) shown that extracts from these plants has inhibitory effects in the activation of in-vitro-cultured human lymphocytes. In this way, and based on folk stories related with their anti-tumor action, the main objective of this work was research about the cytotoxic effect of this plants on Jurkat tumor line-cell cultures, using as first experiment non-toxic extract concentrations previously proved on peripheral blood mononuclear cells (PBCM). Once the vegetable extracts were diluted in dimetilsulfoxide (DMSO), previously, the maximum DMSO concentration not-altering cell viability was determined after 24, 48 and 72 hours. Cytotoxic effect was studied using the exclusion method with tripam blue on tumor lymphocytes (Jukart) and human lymphocytes, donated by healthy volunteers, except for P.brasilensis treated line cells, for which cell viability was studied by flux cytometer. The selectivity index and extracts efficiency percentage were calculated and related with the antineoplastic Paclitaxel drug. The extracts interference on the Jukart cell cycle phases and the cell death mechanisms related with the cytotoxic activity were evaluated. According to the obtained results, DMSO does not show cytotoxic effects on Jukart cells in 1% (v/v) concentration at the three incubation times, being this the solvent concentration used in all the experiments. Ethanol extracts of P. brasilensis leaves (PBf) at 200?g / mL, aerial parts of A. fastigiatum (Afpa) at 50?g / mL and M. ferruginata aqueous and ethanolic extracts (Mfet, Mfaq) at 125?g / mL showed higher Toxicity on Jurkat cells mainly after 72h of treatment. The 24 h treatment with Afpa at 50 ?g/mL was the most selective and effective in comparison with the other tested extracts. It was evidenced in all extracts, that at the highest concentrations, after 24 hours of treatment, there was an inhibition in the progression of the G2M phase of the cell cycle. The extract of Ageratum fastigiatum aerial parts also produced the G0-G1 phase retention. All extracts induced Jukart cell apoptosis, and cell number on late apoptotic phase predominated on the necrotic ones.

Objetivo: AC04 é um derivado acridínico com elevada atividade contra tumores sólidos em camundongos. O objetivo deste trabalho foi investigar a farmacocinética no plasma e a distribuição tecidual em ratos Wistar após administração i.v. bolus bem como o metabolismo in vitro e in vivo do AC04. Metodologia: AC04 foi submetido à oxidação in vitro com catalisador de Jacobsen, modelo que biomimetiza o CYP450. O produto obtido na reação foi caracterizado por 1H RMN e analisado por CLAE-EM/EM. O AC04 também foi incubado em meio microssomal de ratos para confirmar a formação do produto observado in vitro com catalisador. Para a avaliação farmacocinética, uma dose única de 1,5 mg/kg foi administrada a ratos Wistar por i.v. bolus (n = 7) e amostras de sangue foram coletadas da veia lateral da cauda até 120 h após administração. AC04 e o 1-oxo-AC04 foram separados do plasma por desproteinização com acetonitrila e analisados por método de CLAE-EM/EM previamente validado. A fração ligada a proteínas foi determinada por ultrafiltração e a distribuição tecidual foi avaliada após administração de 1,5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animais/tempo). Resultados: A oxidação do AC04 pelo catalisador de Jacobsen resultou na formação de um metabólito, 1-oxo-AC04, o mesmo formado pela incubação da fração microssomal e in vivo após administração da droga a roedores. O modelo aberto de dois compartimentos descreveu adequadamente o perfil de concentração plasmática do AC04, possibilitando a determinação de CL de 3,4 ± 3,4 L/h/kg, Vdss de 137,9 ± 91,4 L/kg, t1/2 de 45,5 ± 31,5 h e ASC0-∞ de 788 ± 483 ng·h/mL. A ligação a proteínas plasmáticas foi de 98,1 ± 1,6%. A penetração no pulmão, fígado e baço foi de 1077, 410 e 355 respectivamente, enquanto no cérebro foi de 0,54. O AC04 se acumula no tecido adiposo com um fator de penetração de 30. O t1/2 do 1-oxo-AC04 foi de 23,2 ± 10,4 h. Conclusões: O conjunto de resultados sugere que, apesar da pequena fração livre no plasma livre, AC04 é capaz de se acumular em diferentes tecidos, o que pode ser um componente importante para sua ação em tumores sólidos, além de ter uma meia-vida longa. A reação de oxidação de Jacobsen e o metabolismo in vitro com fração microssomal possibilitaram a identificação do mesmo metabólito obtido in vivo. / Purpose: AC04 is an acridine derivative with high activity against solid tumors in mice. The goal of this work was to investigate the plasma pharmacokinetics and tissue distribution of the drug in Wistar rats after bolus i.v. administration as well as the its in vitro and in vivo metabolism. Methodology: AC04 was submitted in vitro oxidation by Jacobsen catalyst, a biomimetic CYP450 model. The product obtained in the reaction was characterized by (1H NMR) and analyzed by LC-MS/MS. AC04 was also incubated with rats microsomal fraction to confirm the formation of the product observed in vitro with the catalyst. A single 1.5 mg/kg i.v. bolus dose of AC04 was given to Wistar rats (n = 7) and blood samples were harvested from the lateral tail vein up to 120 h after dosing. AC04 and 1-oxo-AC04 were separated from plasma by deproteinization with acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS with a previously validated method. Protein binding fraction was performed by ultrafiltration and AC04 tissue disposition was evaluated after 1.5 mg/kg i.v. bolus (n = 3 animals/point) Results: The Jacobsen-catalyzed oxidation of AC04 resulted in the formation of one metabolite, 1-oxo-AC04. The same metabolite was observed with microsomal incubation and in vivo, after AC04 dosing to Wistar rats. A two-compartment open model adequately fitted the individuals plasma profiles of AC04 resulting in a CL of 3.4 ± 3.4 L/h/kg, a Vdss of 137.9 ± 91.4 L/kg, a t1/2 of 45.5 ± 31.5 h and a ASC0-∞ of 788 ± 483 ng·h/mL. AC04 plasma protein binding was 98.1 ± 1.6%. Lung, liver and spleen showed a penetration of 1077, 410 e 355 respectively, while brain penetration was of 0.54. The AC04 accumulates in the adipose tissue with a penetration factor of 30. The 1-oxo-AC04 metabolite showed a t1/2 of 23.2 ± 10.4 h. Conclusions: The Jacobsen oxidation reaction and the in vitro metabolism by microsomes allowed the identification of the same metabolite observed in vivo. The results suggest that despite the small free plasma fraction, AC04 is capable to accumulate in different tissues, which may contribute to its activity in solid tumor, besides its long half-life.

Objetivo: Contribuir para o desenvolvimento do candidato a antitumoral (LaSOM 65) através da avaliação farmacocinética pré-clínica em roedores de diferentes doses pelas vias i.v., p.o e i.p. e avaliação da toxicidade aguda do composto. Metodologia: LaSOM 65 foi administrado a ratos Wistar nas doses de 1 mg/kg i.v. bolus (n = 8), 10 e 30 mg/kg p.o. e 30 e 90 mg/kg i.p. (n = 6/grupo). As concentrações plasmáticas foram quantificadas por CL-UV em método desenvolvido e validado. A ligação às proteínas foi determinada por ultrafiltração e a distribuição tecidual foi avaliada por homogeneizado de tecido após administração i.v. de 1 mg/kg (n = 3 animais/ponto de coleta). Para o ensaio de toxicidade aguda, dose única de 1, 2,5 e 5 mg/kg i.v. e 50, 100 e 150 mg/kg p.o. de LaSOM 65 foi administrada aos animais. Ganho de peso, massa relativa dos tecidos, determinação de parâmetros bioquímicos e hematológicos e uma observação clínica detalhada foram realizados para a avaliação de possíveis efeitos tóxicos. Resultados e Discussão: LaSOM 65 apresentou farmacocinética linear na faixa de dose de 1 a 30 mg/kg (i.v., p.o. e i.p.). Após dose i.v. apresentou um CL = 0,85 ± 0,18 L/h/kg, t1/2 = 1,8 ± 0,7 h e Vd = 1,76 ± 0,24 L/kg. Para a dose de 90 mg/kg i.p. um aumento no Vd (3,2 ± 0,8L/Kg) e t1/2 (2,9 ± 0,9 h) foi observado. O composto apresentou boa biodisponibilidade para as administrações extravasculares (58 e 50% p.o. e 73 e 61% i.p.). A ligação às proteínas foi de 84,7 ± 1,6%. O composto distribuiu-se nos tecidos investigados tendo no pulmão a maior taxa de penetração (ASCtecido/plasma = 2,7) e o cérebro a menor (ASCtecido/plasma = 0,4). Piloereção, diarréia, letargia e dispneia foram os sinais clínicos observados imediatamente após administrações i.v., os quais regrediram após 3 h. Para a via oral nenhuma alteração foi observada. Nenhum outro parâmetro avaliado demonstrou efeitos tociológicos para o LaSOM 65. Conclusões: LaSOM 65 demonstrou uma rápida distribuição tecidual e uma rápida eliminação após administração i.v. Sua boa biodisponibilidade e uma possível ausência de toxicidade apresentada por esta via permitem seu uso oral. A baixa penetração cerebral sugere que desenvolvimento no âmbito farmacotécnico será necessário visando seu uso para o tratamento de gliomas. / Purpose: To contribute with the development of a new anticancer candidate (LaSOM 65) by investigating its pre-clinical pharmacokinetics in rodents after administration of different doses by three routes (i.v., p.o. and i.p.) and acute toxicological evaluation of the compound. Methodology: LaSOM 65 was administrated to Wistar rats in the 1 mg/kg i.v. bolus (n = 8), 10 and 30 mg/kg p.o. and 30 and 90 mg/kg i.p. dose (n = 6/group). Plasma concentrations were determined by a development and validated LC-UV method. Protein binding was determined by ultrafiltration and tissue penetration was investigated in tissue homogenates after i.v. administration of 1 mg/kg (n = 3 animals/time point). For the acute toxicological assay, single administration of LaSOM 65 at the doses of 1, 2.5 and 5 mg/kg i.v. and 50, 100 and 150 mg/kg p.o. were given to the rats. Weight gain, organ relative mass, biochemical and hematological parameters and a detailed clinical observation were evaluated to determine LaSOM 65 toxicity. Results and Discussion: LaSOM 65 showed linear pharmacokinetic between 1 and 30 mg/kg (i.v., p.o and i.p.) with CL = 0.85 ± 0.18 L/h/kg, t1/2 = 1,8 ± 0,7 h and Vd = 1.76 ± 0.24 L/kg after i.v. dosing. After 90 mg/kg i.p. dosing an increase in Vd (3.2 ± 0.8 L/kg) and t1/2 (2.9 ± 0.9 h) were observed. The compound showed good bioavailability after p.o. (58 and 50%) and i.p. (73 and 61%) dosing. The protein biding was 84.7 ± 1.6%. LaSOM 65 distributed into the tissues investigated with a higher penetration ratio into lung (AUCtissue/plasma = 2.7) than into brain (AUCtissue/plasma = 0.4). Piloerection, diarrhea, lethargy and dyspnea were the clinical signs observed immediately after the i.v. administrations and they regressed 3 h post-dosing. No alterations were observed after p.o. dosing. Conclusions: LaSOM 65 showed a rapid tissue distribution and elimination after i.v. administration. Its good bioavailability together with the probably absence of toxicity for the oral route allowed its use by this route. The low brain penetration suggests that a pharmaceutical development will be necessary if LaSOM 65 is intended for the treatment of glioma.

xix, 111 p. : ill. (some col.) / Since discovery of its biological effects in the late 1960's, cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum( II)) has become one of the most broadly-prescribed cancer drugs in use today. A majority of efforts to understand the metallobiochemistry of this drug have focused on describing the interactions of cisplatin-derived Pt(II) complexes with DNA. Drug binding to this "high value" cellular target is believed to trigger the apoptotic pathways that underlie cisplatin's cytotoxic effects. Although RNA is chemically similar to DNA and responsible for accurately transferring, regulating, and transforming the same genetic information that is stored within the DNA genome, surprisingly little is known about platinum(II) drug binding to RNA. Accordingly, the first three chapters of this dissertation describe efforts to address questions regarding cisplatin coordination to RNA on the molecular scale. Chapter I reviews fundamental aspects of how metal complexes interact with nucleic acids, highlighting the bioinorganic chemistry of platinum(II) antitumor drugs. This chapter also introduces the idea that drug binding to RNA may form an important part of how these complexes work in the cell. Chapter II describes cisplatin crosslinking between RNA nucleobases located on opposite sides of the internal loop of an RNA subdomain derived from the catalytic core of the spliceosome. Chapter III describes how platinum adducts disrupt the activity of RNA processing enzymes similar to those that are necessary for maturation, maintenance and recycling of the transcriptome. Chapter III also describes the reversal of RNA platination using thiourea. The chemistry of platinum(II) is also characterized by preferential coordination to sulfur ligands, or thiophilicity. Incorporating this property into RNA chemistry, Chapters IV and V describe the reaction of platinum(II) complexes with phosphorothioate-substituted RNAs. Chapter IV describes engineering platinum(II) crosslinks in the Hammerhead ribozyme through the targeting of a platinum(II) complex to a specific phosphorothioate substitution installed in the active site of this catalytic RNA. Chapter V outlines efforts to characterize the cleavage and isomerization reactions promoted by platinum(II) coordination to phosphorothioate-substituted RNAs. Finally, Chapter VI summarizes the insights gained throughout the course of our studies and provides an outlook on the future of platinum-RNA chemistry. This dissertation includes co-authored material and previously published results. / Committee in charge: Michael M. Haley, Chair; Victoria J. DeRose, Advisor; David R. Tyler; Andrew J. Berglund; Eric A. Johnson

Submitted by Rone Aparecido De Grandis null (degrandis.rone@fcfar.unesp.br) on 2016-04-11T18:47:41Z No. of bitstreams: 1 DE GRANDIS, R.A..pdf: 22143869 bytes, checksum: 13d11731ce58a5803f5a3babafd43e87 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-12T18:45:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 degrandis_ra_me_arafc.pdf: 22143869 bytes, checksum: 13d11731ce58a5803f5a3babafd43e87 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T18:45:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 degrandis_ra_me_arafc.pdf: 22143869 bytes, checksum: 13d11731ce58a5803f5a3babafd43e87 (MD5) Previous issue date: 2016-03-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os ensaios de toxicologia genética são utilizados como base no desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que podem identificar rapidamente agentes que causam danos ao material genético. Agências regulatórias preconizam a utilização de ensaios que identificam danos genotóxicos, de forma que possam servir como triagem de processos que levam à carcinogênese. Na busca por novos fármacos, a química inorgânica medicinal representa um campo de grande promessa, com potencial de expansão devido a diversidade química e reatividade dos metais. Especialmente, os complexos de rutênio, têm recebido destaque no tratamento de doenças como o câncer e a tuberculose multi-droga resistente (TB-MDR). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo, avaliar os efeitos toxicogenéticos e antitumorais de três complexos de rutênio(II), com promissora atividade anti-TB-MDR, denominados de SCAR 4, SCAR 5 e SCAR 6 e, diante da importância do conhecimento farmacocinético de novos fármacos, outro objetivo foi avaliar a permeabilidade in vitro desses complexos. A avaliação toxicogenética foi realizada por meio dos ensaios de mutação gênica reversa com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) e pelo ensaio do micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese (CBMN-cit) em ausência e em presença do sistema de metabolização. Ensaios de sobrevivência clonogênica foram utilizados para avaliar a viabilidade das células CHO-K1 e HepG2, utilizadas no ensaio do CBMN-cit. A avaliação da atividade antitumoral foi investigada por meio de ensaios de citotoxicidade frente às linhagens tumorais humanas Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 e MDA-MB-231, pela capacidade de inibição da topoisomerase I humana (Top IB) e por ensaios físico-químicos de interação com o calf thymus DNA (ct-DNA). A permeabilidade foi analisada por meio do ensaio in vitro de permeação em monocamadas de células Caco-2 na presença e ausência de albumina do soro bovino (BSA). A interação dos complexos com albumina foi analisada por meio da medida da supressão da fluorescência dos resíduos de triptofano da BSA. Os resultados mostraram que apenas o complexo SCAR 6 apresentou efeito mutagênico, observado no Teste de Ames e no CBMN-cit e, em ambos os modelos, o efeito foi apresentado apenas quando o complexo fora submetido a sistemas metabolizadores. Na avaliação da citotoxicidade frente às linhagens tumorais, todos os complexos se mostraram seletivos contra as linhagens de câncer de próstata e mama, com destaque para o complexo SCAR 6, que se apresentou seletivo em quatro diferentes linhagens celulares tumorais. Por outro lado, o complexo SCAR 5 foi altamente ativo na inibição da Top IB, seguido do complexo SCAR 4. Ensaios físico-químicos apontaram os efeitos de interação dos complexos com o ct-DNA, confirmando a capacidade do complexo SCAR 6 se ligar ao DNA de forma covalente, enquanto SCAR 4 e 5 apresentaram um perfil de interação eletrostática com o ácido nucleico. SCAR 4 e 5 também apresentaram alta permeabilidade aparente (Papp) in vitro. O complexo SCAR 6 apresentou baixa Papp, sobretudo com a adição de BSA no tampão de permeabilidade, provavelmente devido a alta afinidade pela albumina apresentada nos ensaios de interação com a BSA, onde, os complexos SCAR 4 e 5, apresentaram constante de ligação moderada. Nossos estudos mostraram que os complexos SCAR 4, 5 e 6 apresentam uma afinidade relevante por biomoléculas como DNA, Top IB e albumina. A interação, mesmo que ainda pouco elucidada por esses alvos biológicos, pode sugerir a aplicação terapêutica desses complexos de rutênio, seja interrompendo vias bioquímicas, causando danos no DNA ou, inclusive, interagindo de forma sinérgica, promovendo terapias mais seguras e eficazes. / The genetic toxicology assays are used as the basis in the development of new drugs since it’s may rapidly identify agents that cause damage to the genetic material. Regulatory agencies have recommend the use of assays that identify genotoxic effcts, thus they may serve as a screening processes that lead to carcinogenesis. In the search of new molecules for therapeutic purposes, medicinal inorganic chemistry is a major promise of the field, with potential expansion due to chemical diversity and reactivity of metals. Especially, ruthenium complexes, have been highlighted in the treatment of growing diseases such as cancer and multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB). In this context, this study aimed to evaluate the toxicogenetic effects of three ruthenium(II) complex, that showed promising anti-MDR-TB activity, called SCAR 4, SCAR 5 and SCAR 6. In addition to this safety profile, and cosidering the traditionally antitumor activity of ruthenium complexes, this study also aimed to evaluate the antitumor activity of these complexes. In front of the importance of pharmacokinetic knowledge of new drugs, another aim of this study was to evaluate the in vitro permeability of these complexes. The toxicogenetics evaluation was performed by reverse gene mutation assays with Salmonella typhimurium (Ames test) and by Cytokinesis-block micronucleus cytome assay (CBMN-cyt). In both assays, we used models to assess the effect of complexes’s metabolization. The clonogenic survival assays were used to assess the viability of HepG2 and CHO-K1 cells, that it has been used in CBMN-cyt assay. The evaluation of the antitumor activity was investigated by means of cytotoxicity assays with the human tumor cell lines Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 and MDA-MB-231, by the ability to inhibit human topoisomerase I (Top IB) and physico-chemical assays of interaction with the thymus calf DNA (ct-DNA). The permeability was examined by means of in vitro permeation assay with Caco-2 cell monolayers in presence and absence of Bovine Serum Albumin (BSA). The interaction of the complex with albumin was analyzed by measuring the suppression of the fluorescence of tryptophan residues from BSA. In genotoxicity evaluation, only SCAR 6 complex showed mutagenic effect. This effect was observed in the Ames test and the CBMN-cyt and, in both models, the effects were observed only when the complex was subjected to metabolizers systems. In cytotoxicity evaluation, all the complexes showed selective index against prostate and breast cancer cell lines, especially SCAR 6, which was selective in four different tumor cell lines. Moreover, the SCAR 5 complex was highly active in inhibiting Top IB, followed by SCAR 4. Physico-chemical assays showed the effects of interaction of the complexes with ct-DNA, confirming the capacity of SCAR 6 to bind covalently to DNA, while SCAR 4 and 5 showed an electrostatic interaction profile with DNA. SCAR 4 and 5 also showed high apparent permeability (Papp) in vitro. The SCAR 6 complex showed low Papp, especially with the addition of BSA in the permeability buffer, probably due to the high affinity for albumin presented in interaction assays with BSA, where the complexes SCAR 4 and 5 have showed moderate binding. Our studies showed that SCAR 4, 5 and 6 have presented a relevant affinity for biomolecules such as DNA, Top IB and albumin. The interaction, even middling elucidated, by these biological targets, may suggest the therapeutic application of these ruthenium complexes, such as disrupting biochemical pathways, causing DNA damage, or even interacting synergistically, promoting more safer and effective therapies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-30Bitstream added on 2014-06-13T20:17:46Z : No. of bitstreams: 1 passoni_mh_me_arafcf.pdf: 404173 bytes, checksum: 0602419a359e80c6739ffbcafd458c33 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A teicoplanina é um antibiótico glicopeptídico, cujo mecanismo de ação é inibir a síntese da parede celular bacteriana. Esse antibiótico vem sendo bastante utilizado no Brasil no combate a bactérias Gram-positivas multiresistente a fármacos. Em razão deste fármaco ser relativamente novo no mercado, não há metodologia de análise descrita em compêndios oficias. Este trabalho apresenta procedimentos para quantificação de teicoplanina em pó para solução injetável. O método espectrofotometrico na região ultravioleta a 279 nm, na faixa de concentração de 60,0 a 110,0 μg/mL (r2 = 0,999), apresentou linearidade, precisão e exatidão, com teor médio no pó para solução injetável de 97,45%. A cromatografia líquida de alta eficiência utilizou coluna C18 (4,6 x 250 mm, 5 mm) e a fase móvel constituída de metanol : acetonitrila (50:50, V/V), na faixa de concentração de 70,0 a 120,0 mg/mL (r2 = 0,999) e apresentou linearidade, precisão e exatidão, com teor médio no pó para solução injetável de 99,12%. Os dados foram calculados pela análise de variância (ANOVA), permitindo assim aplicação destes métodos no controle de qualidade. / Teicoplanin is a glycopeptide antibiotic, which inhibits the bacteria cellular membrane synthesis. This antibiotic is quite new and has been used in Brazil to combat Gram-positive bacteria that are multi-drug resistant. There is not described analytical methodology in official literature. This work reports procedures for the quantification of teicoplanin in pharmaceutical forms. In the UV-spectrophotometry at 279 nm, the Lambert-Beer law was obeyed in the concentration range from 60.0 to 110.0 μg/mL (r2 = 0,999), whose analysis presented linearity, precision and accuracy, with average in powder for injection of 97.45. In the second method, HPLC methods, the samples were injected into a Waters Symmetry C18 column (4.6 x 250 mm, 5 mm). The mobile phase was consisted of acetonitrile and methanol (50:50, V/V). UV detection was performed at 279 nm, and the samples and reference solutions were prepared in the mobile phase; the calibration curve for teicoplanin was linear from 70.0 to the 120.0 mg/mL range (r2 = 0.999). The procedure presented linearity, precision, accuracy, with average in powder for injection of 99.12%. The statistical data were calculated by analysis of variance (ANOVA), that it allows the application of the analytical methods in the quality control of pharmaceutical preparations.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-06T12:21:20Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1977225 bytes, checksum: 4fbd41473c4fb59dd997d5983d38f034 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T12:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1977225 bytes, checksum: 4fbd41473c4fb59dd997d5983d38f034 (MD5) Previous issue date: 2015-07-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Lectins are proteins with the ability to interact specifically and reversibly with carbohydrates. They are present in all forms of life, performing vital functions for the maintenance of these beings. The legume lectins have numerous biological activities that can be used for therapy. The aim of this study was to isolate a lectin of Phaseolus lunatus seeds var. cascavel (PLUN), as well as to characterize it and check anti-hemolytic, antioxidant, antitumor and gastroprotective activities. The presence of lectins and an indication of their carbohydrate inhibitor was determined using the hemagglutination activity against human type ABO red blood cells. Protein concentration was determined by Bradford method using bovine serum albumin as standard. The isolation of PLUN was performed by size exclusion chromatography on Sephadex G-100. The weight and the purity of lectin was estimated by EGPA (polyacrylamide gel electrophoresis) under reducing and non-reducing conditions. The characterization was performed PLUN checking their resistance to pH and temperature variations, the presence front integrity of urea, DTT (dithiothreitol), beta-mercaptoethanol, EDTA (ethylenediaminetetra acetic acid), as well as the action of the trypsin and chymotrypsin enzymes . The characterization of glycoproteins was carried out by electrophoretic and staining for determination of total carbohydrates. The anti-hemolytic activity was performed using human ABO red blood cells, the antioxidant activity was determined by the molybdenum reduction methods (total antioxidant) and capture of the DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hidrazila), and ABTS (2,2' sulfonic -azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6 acid), antitumor activity was determined by the MTT (3- [4,5-dimethyl-thiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) against cells melanoma A375 and the gastroprotective the protection induced gastropathy ethanol. The hemagglutinating activity indicated the presence of lectins only able to agglutinate erythrocytes of type A. This was inhibited only by lectin-carbohydrate N-acetyl-D-galactosamine at a concentration of 25 mM. The molecular exclusion was enough to isolate the lectin, where the peak I obtained from chromatography was active against type A red blood cells (PLUN). The estimated weight by EGPA indicated that it has about 128 kDa. The final purification yield was 80%, and this purified protein about 28 times. Thermostability and pH indicated variations in resistance to 80°C and pH between 2 and 11. Only the 8 M urea was able to inhibit the lectin. The 250 mM EDTA was inhibitory effect on hemagglutination activity was recovered in the presence of manganese ions. PLUN is a glycoprotein, with approximately 2% of carbohydrates in its composition. The lectin has no anti-hemolytic effect for no human blood type. PLUN has antioxidant action with AAEAA (μMAA/g) of 418.20, 326 and 82.9 for total antioxidant activity, ABTS radical capture and capture of DPPH radical, respectively. The IC50 (mg/ml) stood at 1.22, 0.21 and 4.39 for the tests cited above, respectively. The lectin has antitumor activity against melanoma derived cells at doses of 100 and 50 mg/ml, reducing up to 83% tumor cells, and gastroprotective action in a concentration of 1000 mg / kg, reducing up to 63% of the injured area stomach. / Lectinas são proteínas com a capacidade de interagir de forma específica e reversível com carboidratos. Estão presentes em todas as formas de vida desempenhando funções vitais. As lectinas de leguminosas apresentam inúmeras atividades biológicas que podem ser utilizadas pela terapêutica. O objetivo desse estudo foi isolar uma lectina de sementes de Phaseolus lunatus var. cascavel (PLUN), bem como caracterizá-la e verificar as atividades antihemolítica, antioxidante, antitumoral e gastroprotetora. A presença de lectinas e a indicação do seu carboidrato inibidor foi determinada utilizando a atividade hemaglutinante. A concentração proteica foi determinada pelo método de Bradford utilizando a albumina sérica bovina como padrão. O isolamento de PLUN foi realizado por cromatografia de exclusão em Sephadex G-100. O peso e a pureza da lectina foram estimados por EGPA (eletroforese em gel de poliacrilamida). A caracterização de PLUN foi realizada verificando sua resistência às variações de temperatura e pH, integridade frente à presença de ureia, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, EDTA, tripsina e quimiotripsina. A caracterização para glicoproteínas foi realizada pela coloração eletroforética e pela dosagem de carboidratos totais. A atividade antihemolítica foi realizada utilizando hemácias humanas ABO, a atividade antioxidante foi determinada pelos métodos de redução do molibdênio (antioxidante total) e captura dos radicais DPPH e ABTS, a atividade antitumoral foi determinada pelo ensaio do MTT contra células de melanoma A375 e a gastroprotetora pela proteção a gastropatia induzida por etanol. A atividade hemaglutinante indicou a presença de lectinas capazes de aglutinar apenas hemácias do tipo A. Essa lectina foi inibida apenas pelo carboidrato n-acetil-D-galactosamina em uma concentração de 25 mM. A exclusão molecular foi suficiente para isolar a lectina, onde o pico I obtido da cromatografia foi ativo contra hemácias tipo A (PLUN). A estimativa do peso por EGPA indicou que esta apresenta aproximadamente 128 kDa. O rendimento final da purificação ficou em 80%, sendo essa proteína purificada cerca de 28 vezes. A termoestabilidade e as variações de pH indicaram resistência em até 80ºC e em pH entre 2 e 11. Apenas a ureia 8 M foi capaz de inibir a lectina. O EDTA 250 mM teve efeito inibidor sobre a atividade hemaglutinante que foi recuperada em presença de íons manganês. PLUN é um glicoproteína, apresentando aproximadamente 2% de carboidratos em sua composição. A lectina não apresenta efeito antihemolítico para nenhum tipo sanguíneo humano. PLUN apresenta ação antioxidante com AAEAA (μMAA/g) de 418,20, 326 e 82,9 para a ação antioxidante total, captura do radical ABTS e captura do radical DPPH, respectivamente. As IC50 (mg/mL) ficaram em 1,22, 0,21 e 4,39 para os ensaios acima citados, respectivamente. A lectina apresenta atividade antitumoral contra células oriundas de melanoma em doses de 100 e 50 μg/mL, reduzindo em até 83% as células tumorais, e ação gastroprotetora em uma concentração de 1000 μg/kg, reduzindo em até 63% a área lesada do estômago. Os resultados indicam uma lectina com considerada atividades antioxidante, antitumoral e gastroprotetora. Mais estudos devem ser realizados para verificar possíveis mecanismos moleculares envolvidos nessas observações, bem como a determinação da estrutura tridimensional da proteína.