Atualmente, há uma considerável quantidade de informações relativas a aspectos químicos e biológicos da própolis, porém sua aplicação terapêutica ainda pode ser considerada incipiente. Isto se deve, principalmente, a grande variabilidade da composição química deste produto em função de sua origem geográfica/botânica, já que em diferentes ecossistemas as abelhas recorrem a distintas espécies vegetais como fontes de matérias-primas para sua elaboração. Desta forma, para se chegar a uma futura padronização, os conhecimentos da(s) fonte(s) botânica(s) e da origem geográfica da amostra são fundamentais e devem acompanhar qualquer estudo biológico, no sentido de se estabelecer quais atividades biológicas correspondem a um tipo específico de própolis. O presente trabalho objetiva contribuir para os conhecimentos da composição de própolis do estado de São Paulo (coletado na Serra do Japi) e de sua fonte botânica, bem como para a discussão dos possíveis mecanismos envolvidos em processos de cicatrização, influenciados pela aplicação tópica de própolis (um de seus usos mais difundidos mundialmente é como \"cicatrizante\"). Para tanto, traz análises físico-químicas, preconizadas pelo Ministério da Agricultura (teores de cinzas, cera, sólidos solúveis, flavonóides e fenóis totais, perda por dessecação a 105 ºC e massa mecânica), estudos de composição química pela técnica CLAE, análises cromatográficas comparativas entre o extrato metanólico de própolis e de sua suposta fonte botânica, quantifica a complexação de substâncias fenólicas da própolis ao pó de pele e traz estudos, in vitro, da influência deste produto sobre proliferação de fibroblastos de camundongos (células NIH 3T3). Excetuando-se a perda por dessecação a 105 ºC, todos os demais parâmetros estiveram dentro dos limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, para a fixação de identidade e qualidade da própolis. Identifica os flavonóides canferol, canferida e isossacuranetina e os ácidos para-cumárico, ferúlico, clorogênico, cafeico, trans-cinâmico e Artepillin C, na própolis, e comprova ser a Baccharis dracunculifolia DC. (vassourinha) a sua fonte botânica. Mostra que a própolis foi tóxica aos fibroblastos nas concentrações de 125,00; 62,50 e 31,25 µg/mL e levemente proliferativa entre as concentrações 7,812 e 0,732 µg/mL, mas sem diferenças estatisticamente significativas em relação a seus controles. Indica que 68,12% das substâncias fenólicas presentes no extrato etanólico de própolis complexaram com pó de pele. Conclui, dentre outras coisas, que a própolis estudada apresenta grande variedade de substâncias fenólicas, adsorve fortemente a pele humana, não possui efeito proliferativo estatisticamente significativo sobre os fibroblastos de camundongo (células NIH 3T3) e, provavelmente, atua auxiliando o processo de cicatrização indiretamente, facilitando o estabelecimento das condições ideais para que a cicatrização ocorra. / Nowadays a great amount of information relating chemical and biological aspects of propolis is available in the literature, but only a few data on its therapeutic uses are found. The major reason of this fact is due to the enormous variability of chemical composition of propolis regarding the geographiclbotanic source of the material, because bees prepare propolis using different vegetable species as raw materiais from different e cosystems in the environment. In order to increase the therapeutic use of propolis, it is important to establish which biological activity corresponds to a specific type of propolis (regarding its origin and chemical composition). Therefore, the botanical and geographic origin of propolis knowledge should follow any biological investigations with this material. This paper offers a contribution to the chemical composition knowledge of propolis from São Paulo state (Serra do Japi - Brazil) and its botanical vegetable source, as well as the discussion of possible mechanisms involved in wound healing process related to this material. For this reason, presents commended Ministry of Agricultural analysis (loss on drying at 105 ºC, determinations of extractable and non-extractable matter and determinations of ash, wax, flavonoids and total phenolic contents), chemical composition studies by HPLC, comparative chromatographic analysis between propolis and its expected vegetal source, adsorption determination of phenolic substances in skin powder and fibroblast proliferation assay (NIH 3T3 cells). Excepting the drying loss test at 105 ºC, all the parameters have been according the limits established by the Ministry of Agricultural to guarantee the identity and quality of propolis. Identification of kaempferol, kaempferide, isosakuranetin, Artepillin C, p-coumaric acid, ferulic acid, chlorogenic acid, caffeic acid and t-cinnamic acid in propolis was possible. The specie Baccharis dracunculifolia DC was identified as the vegetable source of the propolis. About 68% of phenolic substances present in the original extract adsorbed to the skin powder. Propolis was toxic to the fibroblasts at 125,0, 62,5, and 31,25 µg/mL and slightly proliferative between concentrations of 7,812 and 0,732 µg/mL but with no significant statistic differences relating the controls. It is conclusive that the propolis under study presents a great variety of phenolic substances, adheres strongly to the human skin, presents no proliferative effect to the mouse fibroblasts (NIH 3T3 cells) and probably helps to esta blish good conditions to the wound healing process.

Orientador: Fernando Antonio Cabral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piantino_CarlaRoberta_M.pdf: 1329816 bytes, checksum: a1ff2a32e69a174c17fb18c61821b0db (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Extratos de folhas de Baccharis dracunculifolia foram obtidos usando como solventes, o dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2), o etanol e o metano. Coletou-se também em alguns ensaios de SC-CO2, a fração + voláteis do óleo essencial pela captura em armadilha com adsorvente Porapak-Q. Os ensaios com SC-CO2 foram realizados em triplicata nas pressões de 200, 300 e 400 bar e nas temperaturas de 40, 50 e 60°C. Mediram-se o rendime nto global de extração (Xo), a atividade antioxidante por seqüestro do radical DPPH e a atividade antimicrobiana pelo método de difusão em disco. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) foi utilizada para determinação de quatro compostos fenólicos: ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, também conhecido como Artepillin C), ácido 3-prenil-4-hidroxicinâmico (PHCA), ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-cumárico); 4¿-metoxi-3,5,7-triidroxiflavona (canferide). A composição dos óleos essenciais foi obtida por análise de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM). Os rendimentos globais de extração (Xo) obtidos pelos métodos convencionais com etanol e metanol foram respectivamente 6,11 e 10,94%, sendo maiores que os valores entre 2,40 e 4,71% obtidos por SC-CO2. Observou-se que a concentração dos componentes fenólicos analisados nos extratos supercríticos obtidos a 60oC e 400 bar foi maior que nos extratos alcoólicos, exceto para o ácido p-cumárico e os rendimentos de extração de canferide, Artepillin C e PHCA foram 156%, 98% e 64%, respectivamente, maiores nos ensaios com SC-CO2 que nos extratos alcoólicos. O rendimento médio dos voláteis foi de 0,17% e esses voláteis apresentaram teores de monoterpenos entre 16,5 e 26,5%, teores de hidrocarbonetos sesquiterpênicos de 60,8 a 74,3% e teores de álcoois sesquiterpênicos de 5,1 a 10,7%. Os melhores resultados de atividade antioxidante foram encontrados no extrato etanólico (ED50 = 26,68 µg/mL) e no extrato supercrítico obtido a 50ºC e 300 bar com 5% de etanol na matriz (ED50 = 23,88 µg/mL). Todos os extratos, exceto o metanólico, apresentaram atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus / Abstract: Extracts from Baccharis dracunculifolia leaves were obtained using the following solvents: supercritical carbon dioxide (SC-CO2), ethanol and methanol. The most fraction + volatiles of essential oil of some SC-CO2 trials was obtained by trapping it on adsorbent Porapak-Q. Supercritical extraction was carried out in triplicate at temperatures of 40, 50 and 60ºC and pressures of 200, 300 and 400 bar. The global extraction yields (X0), the antioxidant activity using DPPH radical scavenging and the antimicrobial activity using the disk diffusion method were determined. Four phenolic compounds were analyzed in the extracts by reversed phase highperformance liquid chromatography (RP-HPLC): 3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid (DHCA or Artepillin C); 3-prenyl-4-hydroxycinnamic acid (PHCA); 4- hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid) and 4¿-methoxy-3,5,7-trihydroxyflavone (kaempferide). The essential oils' composition was evaluated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The global extraction yields (X0) obtained by the conventional methods with ethanol and methanol were 6.11 and 10.94%, respectively. These results were higher than the ones obtained by SC-CO2 (between 2.40 and 4.71%). In the supercritical extracts obtained at 60ºC and 400 bar, the concentration of analysed phenolic compounds were higher than in the alcoholic extracts (except to p-coumaric acid), and the extraction yields of kaempferide, artepillin C and PHCA, were 156%, 98% and 64% higher, respectively, than in the alcoholic extracts. The average yield of volatiles obtained from supercritical extration was 0.17%. These volatiles presented monoterpenes contents between 16.5% and 26.5%, sesquiterpene hydrocarbons contents 60.8% and 74.3%, and sesquiterpene alcohols between 5.1% and 10.7%. The ethanolic extract (ED50 = 26.68 µg/mL) and the supercritical extract obtained at 50ºC and 300 bar with 5% of ethanol in the matrix (ED50 = 23.88 µg/mL) were shown to have the higher antioxidant activities among all the studied extracts. All extracts, except the methanolic one, presented antimicrobial activity against Staphylococcus aureus / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Atualmente, há uma considerável quantidade de informações relativas a aspectos químicos e biológicos da própolis, porém sua aplicação terapêutica ainda pode ser considerada incipiente. Isto se deve, principalmente, a grande variabilidade da composição química deste produto em função de sua origem geográfica/botânica, já que em diferentes ecossistemas as abelhas recorrem a distintas espécies vegetais como fontes de matérias-primas para sua elaboração. Desta forma, para se chegar a uma futura padronização, os conhecimentos da(s) fonte(s) botânica(s) e da origem geográfica da amostra são fundamentais e devem acompanhar qualquer estudo biológico, no sentido de se estabelecer quais atividades biológicas correspondem a um tipo específico de própolis. O presente trabalho objetiva contribuir para os conhecimentos da composição de própolis do estado de São Paulo (coletado na Serra do Japi) e de sua fonte botânica, bem como para a discussão dos possíveis mecanismos envolvidos em processos de cicatrização, influenciados pela aplicação tópica de própolis (um de seus usos mais difundidos mundialmente é como \"cicatrizante\"). Para tanto, traz análises físico-químicas, preconizadas pelo Ministério da Agricultura (teores de cinzas, cera, sólidos solúveis, flavonóides e fenóis totais, perda por dessecação a 105 ºC e massa mecânica), estudos de composição química pela técnica CLAE, análises cromatográficas comparativas entre o extrato metanólico de própolis e de sua suposta fonte botânica, quantifica a complexação de substâncias fenólicas da própolis ao pó de pele e traz estudos, in vitro, da influência deste produto sobre proliferação de fibroblastos de camundongos (células NIH 3T3). Excetuando-se a perda por dessecação a 105 ºC, todos os demais parâmetros estiveram dentro dos limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, para a fixação de identidade e qualidade da própolis. Identifica os flavonóides canferol, canferida e isossacuranetina e os ácidos para-cumárico, ferúlico, clorogênico, cafeico, trans-cinâmico e Artepillin C, na própolis, e comprova ser a Baccharis dracunculifolia DC. (vassourinha) a sua fonte botânica. Mostra que a própolis foi tóxica aos fibroblastos nas concentrações de 125,00; 62,50 e 31,25 µg/mL e levemente proliferativa entre as concentrações 7,812 e 0,732 µg/mL, mas sem diferenças estatisticamente significativas em relação a seus controles. Indica que 68,12% das substâncias fenólicas presentes no extrato etanólico de própolis complexaram com pó de pele. Conclui, dentre outras coisas, que a própolis estudada apresenta grande variedade de substâncias fenólicas, adsorve fortemente a pele humana, não possui efeito proliferativo estatisticamente significativo sobre os fibroblastos de camundongo (células NIH 3T3) e, provavelmente, atua auxiliando o processo de cicatrização indiretamente, facilitando o estabelecimento das condições ideais para que a cicatrização ocorra. / Nowadays a great amount of information relating chemical and biological aspects of propolis is available in the literature, but only a few data on its therapeutic uses are found. The major reason of this fact is due to the enormous variability of chemical composition of propolis regarding the geographiclbotanic source of the material, because bees prepare propolis using different vegetable species as raw materiais from different e cosystems in the environment. In order to increase the therapeutic use of propolis, it is important to establish which biological activity corresponds to a specific type of propolis (regarding its origin and chemical composition). Therefore, the botanical and geographic origin of propolis knowledge should follow any biological investigations with this material. This paper offers a contribution to the chemical composition knowledge of propolis from São Paulo state (Serra do Japi - Brazil) and its botanical vegetable source, as well as the discussion of possible mechanisms involved in wound healing process related to this material. For this reason, presents commended Ministry of Agricultural analysis (loss on drying at 105 ºC, determinations of extractable and non-extractable matter and determinations of ash, wax, flavonoids and total phenolic contents), chemical composition studies by HPLC, comparative chromatographic analysis between propolis and its expected vegetal source, adsorption determination of phenolic substances in skin powder and fibroblast proliferation assay (NIH 3T3 cells). Excepting the drying loss test at 105 ºC, all the parameters have been according the limits established by the Ministry of Agricultural to guarantee the identity and quality of propolis. Identification of kaempferol, kaempferide, isosakuranetin, Artepillin C, p-coumaric acid, ferulic acid, chlorogenic acid, caffeic acid and t-cinnamic acid in propolis was possible. The specie Baccharis dracunculifolia DC was identified as the vegetable source of the propolis. About 68% of phenolic substances present in the original extract adsorbed to the skin powder. Propolis was toxic to the fibroblasts at 125,0, 62,5, and 31,25 µg/mL and slightly proliferative between concentrations of 7,812 and 0,732 µg/mL but with no significant statistic differences relating the controls. It is conclusive that the propolis under study presents a great variety of phenolic substances, adheres strongly to the human skin, presents no proliferative effect to the mouse fibroblasts (NIH 3T3 cells) and probably helps to esta blish good conditions to the wound healing process.

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Maria Cristina Marcucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-11T16:33:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diehl_LosianeCristinaPaviani_D.pdf: 2190860 bytes, checksum: 14ff7d870d5d338ac4dd225c63db07b9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi investigar a influência da temperatura, pressão e porcentagem de etanol como co-solvente no processo de extração e fracionamento com dióxido de carbono supercrítico de princípios ativos presentes no extrato etanólico de própolis (EEPS) e da própolis bruta. Os experimentos foram realizados nas temperaturas de 20 °C, 35 °C e 50 °C, pressões de 150, 200 e 250 bar e adição de etanol como co-solvente nas proporções de 0 %, 5 % 10 % e 15 %. A identificação dos compostos presentes nos extratos foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) frente a quatro marcadores (compostos fenólicos): ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, também conhecido como Artepillin C), ácido 3-prenil-4-hidrocinâmico (PHCA), ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-cumárico) e 4¿-metoxi-3,5,7-tridroxiflavona (canferide). A atividade antioxidante dos extratos foi baseada no sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) pelos extratos de própolis analisados e o resultado é expresso em ED50. A atividade antimicrobiana in vitro foi avaliada pelo método de difusão em disco contra três microorganismos patogênicos: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 10231) e Escherichia coli (ATCC 25922). O extrato etanólico de própolis teve um rendimento médio de 39,45 % e uma alta atividade antioxidante, ou seja, um ED50 de 7,58 µg/mL. O experimento de extração supercrítica a partir do EEPS realizado na condição de 20 °C e pressão de 250 bar apresentou uma alta atividade antioxidante, cerca de 7,91 mg/mL, muito próximo com o valor obtido para o EEPS. A extração supercrítica a partir do extrato etanólico de própolis com adição de 5, 10 e 15 % não apresentou resultados satisfatórios. Os maiores rendimentos globais para a extração supercrítica da própolis bruta, foi obtido quando adicionou-se 15 % de etanol como co-solvente. O extrato etanólico de própolis seco (EEPS) apresentou um halo de inibição de 10 mm frente ao S. aureus. O extrato etanólico de própolis e os extratos obtidos via supercrítica não apresentaram atividade antimicrobiana contra Candida albicans e Escherichia coli / Resumo: O objetivo deste trabalho foi investigar a influência da temperatura, pressão e porcentagem de etanol como co-solvente no processo de extração e fracionamento com dióxido de carbono supercrítico de princípios ativos presentes no extrato etanólico de própolis (EEPS) e da própolis bruta. Os experimentos foram realizados nas temperaturas de 20 °C, 35 °C e 50 °C, pressões de 150, 200 e 250 bar e adição de etanol como co-solvente nas proporções de 0 %, 5 % 10 % e 15 %. A identificação dos compostos presentes nos extratos foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) frente a quatro marcadores (compostos fenólicos): ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, também conhecido como Artepillin C), ácido 3-prenil-4-hidrocinâmico (PHCA), ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-cumárico) e 4¿-metoxi-3,5,7-tridroxiflavona (canferide). A atividade antioxidante dos extratos foi baseada no sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) pelos extratos de própolis analisados e o resultado é expresso em ED50. A atividade antimicrobiana in vitro foi avaliada pelo método de difusão em disco contra três microorganismos patogênicos: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 10231) e Escherichia coli (ATCC 25922). O extrato etanólico de própolis teve um rendimento médio de 39,45 % e uma alta atividade antioxidante, ou seja, um ED50 de 7,58 µg/mL. O experimento de extração supercrítica a partir do EEPS realizado na condição de 20 °C e pressão de 250 bar apresentou uma alta atividade antioxidante, cerca de 7,91 mg/mL, muito próximo com o valor obtido para o EEPS. A extração supercrítica a partir do extrato etanólico de própolis com adição de 5, 10 e 15 % não apresentou resultados satisfatórios. Os maiores rendimentos globais para a extração supercrítica da própolis bruta, foi obtido quando adicionou-se 15 % de etanol como co-solvente. O extrato etanólico de própolis seco (EEPS) apresentou um halo de inibição de 10 mm frente ao S. aureus. O extrato etanólico de própolis e os extratos obtidos via supercrítica não apresentaram atividade antimicrobiana contra Candida albicans e Escherichia coli / Abstract: The objective of this work is to investigate the influence of temperature, pressure and percentage of ethanol as a co-solvent in the process of extraction and fractionation with supercritical carbon dioxide of active ingredients present in dry ethanolic extract of propolis (EEP) and crude propolis. The experiments were conducted under temperature conditions of 20 °C, 35 °C and 50 °C, pressure on the conditions of 150, 200 and 250 bar and the addition of ethanol as co-solvent in the proportions of 0 %, 5 %, 10 % and 15 %. The identification of compounds present in the extracts was measured by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) against four markers (phenolic compounds): 3,5-diprenyl- 4-hydroxycinnamic acid (DHCA, also known as Artepillin C), 3-prenyl-4- hydroxycinnamic acid (PHCA), 4-hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid) and 4'- methoxy-3 ,5,7-tridroxyflavone (Kaempferide). The antioxidant activity for all extracts were evaluated by the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical scavenging method, the results was expressed in ED50. The antimicrobial activity using disk diffusion were determined against three pathogenic microorganisms: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 10231) and Escherichia coli (ATCC 25922). The global yield of the extraction of ethanolic extract of propolis was 39.45% and had a high antioxidant activity, ED50 of 7.58 µg /mL. The experiment of supercritical extraction of the EEP conducted on the condition of 20 °C and pressure of 250 bar resulted in an extract with about 7.91 mg/mL, very close to the value obtained for the EEP. The supercritical extraction from ethanol extract of propolis with the addition of 5, 10 and 15% of what did not present satisfactory results. The global yield of supercritical extraction of crude propolis, was obtained when added 15% of ethanol as a co-solvent. The ethanolic extract of propolis (EEP) presented an inhibition halo of 10 mm for S. aureus. The ethanolic extract of propolis and the extracts obtained by supercritical technology did not show antimicrobial activity against Candida albicans and Escherichia coli / Abstract: The objective of this work is to investigate the influence of temperature, pressure and percentage of ethanol as a co-solvent in the process of extraction and fractionation with supercritical carbon dioxide of active ingredients present in dry ethanolic extract of propolis (EEP) and crude propolis. The experiments were conducted under temperature conditions of 20 °C, 35 °C and 50 °C, pressure on the conditions of 150, 200 and 250 bar and the addition of ethanol as co-solvent in the proportions of 0 %, 5 %, 10 % and 15 %. The identification of compounds present in the extracts was measured by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) against four markers (phenolic compounds): 3,5-diprenyl- 4-hydroxycinnamic acid (DHCA, also known as Artepillin C), 3-prenyl-4- hydroxycinnamic acid (PHCA), 4-hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid) and 4'- methoxy-3 ,5,7-tridroxyflavone (Kaempferide). The antioxidant activity for all extracts were evaluated by the DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical scavenging method, the results was expressed in ED50. The antimicrobial activity using disk diffusion were determined against three pathogenic microorganisms: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 10231) and Escherichia coli (ATCC 25922). The global yield of the extraction of ethanolic extract of propolis was 39.45% and had a high antioxidant activity, ED50 of 7.58 µg /mL. The experiment of supercritical extraction of the EEP conducted on the condition of 20 °C and pressure of 250 bar resulted in an extract with about 7.91 mg/mL, very close to the value obtained for the EEP. The supercritical extraction from ethanol extract of propolis with the addition of 5, 10 and 15% of what did not present satisfactory results. The global yield of supercritical extraction of crude propolis, was obtained when added 15% of ethanol as a co-solvent. The ethanolic extract of propolis (EEP) presented an inhibition halo of 10 mm for S. aureus. The ethanolic extract of propolis and the extracts obtained by supercritical technology did not show antimicrobial activity against Candida albicans and Escherichia coli / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

O aumento da resistência microbiana devido a fatores como uso excessivo e ineficiente de antibióticos convencionais acarreta a necessidade da busca por novos compostos bioativos que atuem por mecanismos de ação diferentes aos fármacos já conhecidos. Na agricultura, o uso intensivo de pesticidas para o combate de microrganismos que comprometem principalmente a parte alimentícia também traz diversos problemas relacionados à resistência antimicrobiana e a riscos ambientais, oriundos do acúmulo dessas substâncias no solo. Dentro deste aspecto, o pseudofungo Pythium aphanidermatum, da classe dos oomicetos, destaca-se por ser uma espécie agressiva e altamente resistente a fungicidas comuns, apodrecendo raízes e frutos de cultivos de tomate, beterraba, pepino, pimentão, etc. A própolis verde, constituída em sua grande parte por material resinoso coletado e processado pela abelha da espécie Apis mellifera tem sido utilizada na medicina tradicional devido ao seu amplo espectro de ações preventivas e tratamentos de doenças, possuindo propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, anticancerígenas e antioxidantes, tornando-se um produto de grande interesse na busca de novos compostos bioativos. Dentro destes aspectos apresentados, neste trabalho investigamos a ação da própolis verde contra o fitopatógeno P. aphanidermatum e identificamos através da técnica de cromatografia e bioensaios que a Artepillin C (3,5-diprenil-4-ácido-hidroxicinâmico), majoritária na própolis verde, foi o principal composto nesta ação. Os efeitos terapêuticos desta molécula tem sido foco de muitos estudos, porém ainda não há evidência em sua interação com agregados anfifílicos que mimetizam membranas celulares. O caráter anfifílico do composto, elevado pela presença dos grupos prenilados ligados ao ácido cinâmico, favoreceram a sua inserção nas membranas modelo, principalmente em seu estado agregado. Estas conclusões puderam ser inferidas devido às alterações nas propriedades das bicamadas lipídicas na presença da Artepillin C, podendo causar, especificamente para o caso de fitopatógenos como o P. aphanidermatum, perdas funcionais das proteínas de membranas, liberação de eletrólitos intracelulares e desintegração citoplasmática dos micélios e esporos. Ainda, as diferentes composições lipídicas nas vesículas influenciam no modo de interação do composto e consequentes alterações em suas estruturas, principalmente na presença do colesterol, que auxilia na manutenção da permeabilidade da bicamada lipídica, que pode contribuir para a integridade do conteúdo citoplasmático da célula. / The increase in the microbial resistance due to the excessive and inefficient use of conventional antibiotics brings the necessity to search new bioactive compounds which play their mechanism of action differently from the known drugs. In the agriculture, the intensive use of pesticide for the combat of microorganisms which undermine mainly the food portion also brings several issues related to the antimicrobial resistance and environment risks, originated from the high amount of these substances on the soil. In this aspect, the fungus-like Pythium aphanidermatum microorganism, from class Oomycete, stands out for being an aggressive species and highly resistant to common fungicides, rotting roots and fruits of tomato, beet, cucumber, pepper, etc. Green propolis, constituted by resinous material collected and processed by bees of the species Apis mellifera, has been used in the traditional medicine due its wide spectrum of preventive actions and diseases treatments, promoting anti-inflammatory, antimicrobial, anticancer and antioxidant properties, becoming a product of interest for investigation in the research of new bioactive compounds. Under all the aspects showed so far, in this work we investigated the action of the green propolis against the phytopathogen P. aphanidermatum and identified through chromatography and bioassays that Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid), majority in the green propolis, was the main compound in this action. The therapeutic effects of this molecule have been the focus of several studies, but, so far there is no evidence for its interaction with amphiphilic aggregates that mimic cell membranes. The amphiphilic character of the compound, enhanced by the presence of two prenylated groups bounded to the cinnamic acid, favors the insertion of the compound in the model membranes mainly in its aggregation state. These conclusions could be inferred due the alterations in the properties of the lipid bilayer in the presence of Artepillin C, that may cause, specifically in the case of phytopathogens like P. aphanidermatum, functional losses of membrane proteins, releasing of intracellular electrolytes and cytoplasmatic disintegration of mycelium and spores. Moreover, the difference of the lipid composition in the vesicles influence in the action of the compound and consequent alteration in their structures, mainly in the presence of cholesterol, that provides the maintenance of permeability of the lipid bilayer, contributing to the integrity of the cytoplasmic material of the cell.

O aumento da resistência microbiana devido a fatores como uso excessivo e ineficiente de antibióticos convencionais acarreta a necessidade da busca por novos compostos bioativos que atuem por mecanismos de ação diferentes aos fármacos já conhecidos. Na agricultura, o uso intensivo de pesticidas para o combate de microrganismos que comprometem principalmente a parte alimentícia também traz diversos problemas relacionados à resistência antimicrobiana e a riscos ambientais, oriundos do acúmulo dessas substâncias no solo. Dentro deste aspecto, o pseudofungo Pythium aphanidermatum, da classe dos oomicetos, destaca-se por ser uma espécie agressiva e altamente resistente a fungicidas comuns, apodrecendo raízes e frutos de cultivos de tomate, beterraba, pepino, pimentão, etc. A própolis verde, constituída em sua grande parte por material resinoso coletado e processado pela abelha da espécie Apis mellifera tem sido utilizada na medicina tradicional devido ao seu amplo espectro de ações preventivas e tratamentos de doenças, possuindo propriedades anti-inflamatórias, antimicrobianas, anticancerígenas e antioxidantes, tornando-se um produto de grande interesse na busca de novos compostos bioativos. Dentro destes aspectos apresentados, neste trabalho investigamos a ação da própolis verde contra o fitopatógeno P. aphanidermatum e identificamos através da técnica de cromatografia e bioensaios que a Artepillin C (3,5-diprenil-4-ácido-hidroxicinâmico), majoritária na própolis verde, foi o principal composto nesta ação. Os efeitos terapêuticos desta molécula tem sido foco de muitos estudos, porém ainda não há evidência em sua interação com agregados anfifílicos que mimetizam membranas celulares. O caráter anfifílico do composto, elevado pela presença dos grupos prenilados ligados ao ácido cinâmico, favoreceram a sua inserção nas membranas modelo, principalmente em seu estado agregado. Estas conclusões puderam ser inferidas devido às alterações nas propriedades das bicamadas lipídicas na presença da Artepillin C, podendo causar, especificamente para o caso de fitopatógenos como o P. aphanidermatum, perdas funcionais das proteínas de membranas, liberação de eletrólitos intracelulares e desintegração citoplasmática dos micélios e esporos. Ainda, as diferentes composições lipídicas nas vesículas influenciam no modo de interação do composto e consequentes alterações em suas estruturas, principalmente na presença do colesterol, que auxilia na manutenção da permeabilidade da bicamada lipídica, que pode contribuir para a integridade do conteúdo citoplasmático da célula. / The increase in the microbial resistance due to the excessive and inefficient use of conventional antibiotics brings the necessity to search new bioactive compounds which play their mechanism of action differently from the known drugs. In the agriculture, the intensive use of pesticide for the combat of microorganisms which undermine mainly the food portion also brings several issues related to the antimicrobial resistance and environment risks, originated from the high amount of these substances on the soil. In this aspect, the fungus-like Pythium aphanidermatum microorganism, from class Oomycete, stands out for being an aggressive species and highly resistant to common fungicides, rotting roots and fruits of tomato, beet, cucumber, pepper, etc. Green propolis, constituted by resinous material collected and processed by bees of the species Apis mellifera, has been used in the traditional medicine due its wide spectrum of preventive actions and diseases treatments, promoting anti-inflammatory, antimicrobial, anticancer and antioxidant properties, becoming a product of interest for investigation in the research of new bioactive compounds. Under all the aspects showed so far, in this work we investigated the action of the green propolis against the phytopathogen P. aphanidermatum and identified through chromatography and bioassays that Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid), majority in the green propolis, was the main compound in this action. The therapeutic effects of this molecule have been the focus of several studies, but, so far there is no evidence for its interaction with amphiphilic aggregates that mimic cell membranes. The amphiphilic character of the compound, enhanced by the presence of two prenylated groups bounded to the cinnamic acid, favors the insertion of the compound in the model membranes mainly in its aggregation state. These conclusions could be inferred due the alterations in the properties of the lipid bilayer in the presence of Artepillin C, that may cause, specifically in the case of phytopathogens like P. aphanidermatum, functional losses of membrane proteins, releasing of intracellular electrolytes and cytoplasmatic disintegration of mycelium and spores. Moreover, the difference of the lipid composition in the vesicles influence in the action of the compound and consequent alteration in their structures, mainly in the presence of cholesterol, that provides the maintenance of permeability of the lipid bilayer, contributing to the integrity of the cytoplasmic material of the cell.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos de própolis verde por meio de analises físico-químicas, químicas e sensoriais, visando seu uso em alimentos. Foi avaliada a influência da sazonalidade sobre os compostos antioxidantes presentes em amostras de própolis verde. Amostras foram coletadas ao longo de um ano e, com o auxílio da Metodologia de Superfície de Resposta, foram produzidos extratos hidroalcoólicos sob condições otimizadas. As variáveis testadas na otimização foram o grau de hidratação do solvente, temperatura e tempo de extração. As respostas foram o teor de Fenólicos Totais e a atividade antioxidante in vitro pelos métodos ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), ABTS (2,2\'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) e FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). A identificação e quantificação dos compostos fenólicos presentes nas amostras foi realizada por meio de técnicas de cromatografia liquida e gasosa (UPLCDAD e GC-MS), com padrões antioxidantes. Os ensaios de otimização permitiram a produção de extratos de própolis verde com alta atividade antioxidante, confirmada pela presença de compostos antioxidantes, com uso de etanol 70% (etanol: agua, v/v), a 45°C por 20 minutos. Os teores de ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido p-cumárico, kaempferide, pinostrobina e artepelin C foram identificados nas amostras coletadas ao longo do ano, apresentando maior concentração na amostra coletada do inverno. Ensaios para avaliação da influência da moagem da amostra bruta sobre teor de fenólicos e atividades antioxidante e antifúngica dos extratos, assim como a determinação da atividade antibacteriana dos mesmos foram desenvolvidos. As bactérias testadas foram Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli e os fungos foram Botrytis cinerea e o Rhyzopus stolonifer. Os resultados evidenciaram o efeito inibitório sobre as bactérias e fungos testados. Na avaliação em sistema modelo para determinação da atividade antioxidante, foram utilizadas como matéria-prima oxidável emulsões preparadas com óleo de linhaça e água, adicionadas de diferentes doses de extrato de própolis (50, 100, 150 e 200 mg/kg) e submetidas a teste de oxidação acelerada. Para fins de comparação, os antioxidantes sintéticos permitidos pela legislação brasileira (TBHQ, BHA e BHT) também tiveram sua atividade testada. O teor de hidroperóxidos e absorbância específica no UV foram monitorados durante 120 horas. A concentração que apresentou a maior proteção antioxidante foi avaliada sensorialmente. Os resultados da análise sensorial demonstraram que 100 mg/kg do extrato de própolis foi efetiva, retardando a oxidação lipídica nas emulsões. A análise sensorial indicou que o aroma do extrato de própolis mascarou o odor de ranço, sendo o mais preferido dentre as amostras testadas. Produtos a base de própolis verde apresentaram-se como promissores, dada a presença de compostos bioativos com benefícios reais para aplicação como aditivo em alimentos. / The present study aimed to evaluate antioxidant and biological activities of Brazilian green propolis in order to elucidate its potential use as a food additive. The influence of seasonality over antioxidants compounds in green propolis was evaluated. Samples were collected during a year and, trough Response Surface Methodology (RSM), hydroalcoholic extracts were produced under optimize conditions. The variables evaluated on RSM were: degree of solvent hydration, temperature and extraction time. The responses observed were Total Phenolic Content and antioxidant activity determined by in vitro tests such as ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), ABTS (2,2\'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) and FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). The phenolic compounds identification and quantification were performed by chromatography techniques (UPLC-DAD e GC-MS), with antioxidants standards. The optimized essays made possible the production of green propolis extracts with higher antioxidant activities when prepared with 70% of solvent (ethanol: water, v/v), at 45oC for 20 minutes. Chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, kaempferide, pinostrobin and artepillin C were identified in all samples, the greater amount was observed in winters \'sample. The influence of grinding over antioxidant and antifungal activities well as the antibacterial power were evaluated. Doses of green propolis extract were tested over Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Botrytis cinerea and Rhyzopus stolonifer. The results showed the inhibitory effect of green propolis extract on microorganisms tested. On model system evaluation in order to determine the antioxidant activity were used as raw material, emulsions prepared with flaxseed oil and water, added with different doses of green propolis extract (50, 100, 150 and 200 mg/kg) and submitted to accelerated oxidation test. To compare the results, synthetic antioxidants allowed by Brazilian legislation were also tested (TBHQ, BHA e BHT). The amount of hydroperoxides and specific absorbance on UV were monitored for 120 hours. The dose which presented higher protective effect was sensorially tested. The results of sensory analysis demonstrate that 100 mg/kg of extract was effective to retard the emulsions oxidation. According to sensory analysis\'s results, the green propolis aroma masked the rancid odor. Due to the presence of bioactive compounds, the use of green propolis based products as food additive is promising.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Propolis is a resinous material collected by bees from sprouts and barks of different vegetable source and the propolis has pharmacological and biological properties attributed to the presence of different classes of phenolic compounds. The supercritical fluid extraction (SFE) is an operation that explores the solvation power of fluids at temperature and pressure above its critical values, to extracting or separating components of a sample. This technology has been effective for obtaining extracts from natural matrices. The aim of the study was to define the best process conditions for obtaining Brazilian green propolis extracts (from Paraná) using the SFE. For that definition, the influence of different parameters was evaluated, such as S/F (solvent mass – CO2 – relative to solute mass – propolis), percentage of co-solvent (1 and 2% ethanol), temperature (40 to 50°C) and pressure (250, 350 and 400bar) using supercritical carbon dioxide (CO2). The Global Yield Isotherms (GYIs) were obtained through the evaluation of the yield, and the chemical composition of the extracts was also obtained in relation to the total phenolic compounds, flavonoids, antioxidant activity and 3,5-diprenil-4-hidroxicinamic (Artepillin C) and Acid 4-hidroxicinmic (p-coumaric acid). Furthermore, considering that the variations in the chemical composition, and consequently in the biological activity of propolis are associated with the type and geographical origin, samples of eight different propolis were evaluated, obtained by supercritical fluid extraction (SCO2 - 50°C, 350bar, 1% co-solvent and S/F 110) and ethanoic extraction (EtOH - 80% at 70°C). The evaluated samples were: red (Alagoas and Sergipe), green (Minas Gerais and Paraná) and brown (Paraná, Santa Catarina and Rio Grande do Sul). The samples were characterized referring to protein, lipids, ash, minerals (sodium, potassium, calcium and lithium), fiber, water activity and analyzed by scanning electron microscopy (SEM). The extracts were analyzed for their content of phenolic compounds, flavonoids, in vitro antioxidant activity (DPPH and ABTS), quantification of Artepillin C and p-coumaric acid by high-performance liquid chromatography (HPLC) and antimicrobial activity. The EtOH extracts were evaluated as the anti-proliferative activity against B16F10 cell lines (murine) as well. For the SFE application as an extraction method to obtain propolis extract (green propolis from Paraná), the best results were found at 350bar, 50°C, presence of 1% ethanol (co- solvent) and 110 S/F. Under these conditions, a content of 8.93±0.01 and 0.40±0.05g/100g Artepillin C and p-coumaric acid were identified, respectively, showing efficiency of the extraction process. Regarding to the comparative analysis of EtOH and SCO2 extracts of different samples, the red propolis from northeastern Brazil (Sergipe and Alagoas) showed the highest biological potential and the highest content of antioxidant compounds. The best results were presented for the extracts obtained from the conventional extraction (EtOH). It was found that despite the low yield of the process, the extracts obtained by SFE showed elevated levels of compounds of interest, as well as proving to be a viable process to obtain propolis extracts. The best results of antioxidant activity were presented by red and green propolis, thus demonstrating the biological potential of these samples. Finally, there is the composition and biological activity of Brazilian propolis varies significantly depending on the sample type, geographic region gathering and extraction conditions. / A própolis é caracterizada como um material resinoso produzido pelas abelhas a partir da coleta de materiais de diferentes fontes vegetais e exibe propriedades farmacológicas e biológicas atribuídas à presença de diferentes classes de compostos fenólicos. A extração com fluido supercrítico (SFE) é uma operação que explora o poder de solvatação dos fluidos à temperatura e pressão acima de seus valores críticos para extrair ou separar componentes de uma amostra. Esta tecnologia tem se mostrado eficaz para obtenção de extratos a partir de matrizes naturais. O objetivo do estudo foi o de determinar as melhores condições de processo para a obtenção de extratos de própolis verde brasileira (Paraná) utilizando a SFE. Para isso, foi avaliada a influência de diferentes parâmetros, como S/F (massa de solvente – CO2 – em relação à massa de soluto – própolis), percentual de co-solvente (1 e 2% de etanol), temperatura (40 e 50°C) e pressão (250, 350 e 400bar) utilizando dióxido de carbono (CO2) supercrítico. Foi estudado o rendimento e obtidas as Isotermas de Rendimento Global (GYIs) e composição química dos extratos em relação ao teor de compostos fenólicos totais, flavonoides, atividade antioxidante e 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (Artepillin C) e Ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-cumárico). Além disso, tendo em vista que as variações na composição química, e, consequentemente na atividade biológica da própolis estão associadas ao tipo e a sua origem geográfica, neste estudo, foram também avaliados extratos de própolis obtidos por extração supercrítica (SCO2 – 50°C, 350bar, 1% de co-solvente e S/F de 110) e extração etanólica (EtOH – 80% a 70°C) de oito amostras de própolis de diferentes tipos, vermelha (Alagoas e Sergipe), verde (Minas Gerais e Paraná) e marrom (Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul), coletas em diferentes regiões geográficas do Brasil. As amostras foram caracterizadas em relação ao teor de proteínas, lipídeos, cinzas, minerais (sódio, potássio, cálcio e lítio), fibras, atividade de água e analisadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os extratos foram analisados quanto ao teor de compostos fenólicos totais, flavonoides, atividade antioxidante in vitro (DPPH e ABTS), quantificação de Artepillin C e ácido p-cumárico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e atividade antimicrobiana. Os extratos EtOH foram avaliados também quanto a atividade antiprolifefativa frente a linhagens de células B16F10 (murino). Em relação ao emprego da SFE como método de obtenção de extratos de própolis (verde do Paraná) os melhores resultados foram identificados em 50°C e 350bar na presença de 1% de etanol (co-solvente) e S/F de 110. Nessas condições, foi identificado um teor de 8,93±0,01 e 0,40±0,05g/100g de Artepillin C e ácido p-cumárico, respectivamente, evidenciando a eficiência do processo de extração. Em relação à análise comparativa dos extratos EtOH e SCO2 das diferentes amostras, as própolis vermelhas do nordeste brasileiro (Sergipe e Alagoas) apresentaram o maior potencial biológico, bem como, o maior conteúdo de compostos antioxidantes. Os melhores resultados foram apresentados para os extratos obtidos a partir da extração convencional (EtOH). Entretanto, foram identificadas as maiores concentrações de Artepillin C e ácido p-cumárico nos extratos SCO2 (própolis verde e marrom), indicando assim uma maior seletividade do processo para extração destes compostos. Constatou-se que apesar do baixo rendimento do processo, os extratos obtidos por SFE apresentaram elevados teores de compostos de interesse, mostrando-se assim como um processo viável para obtenção de extratos de própolis verde. Os melhores resultados de atividade antioxidante foram apresentados pelas própolis vermelha e verde, evidenciando assim o potencial biológico dessas amostras. Por fim, destaca-se que a composição e atividade biológica da própolis brasileira variam significativamente a depender do tipo de amostra, da região geográfica de coleta e das condições de extração.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.