Foram comparadas diferentes doses de eCG e hCG associadas a dispositivos intravaginais de progesterona (DIV), para avaliar o crescimento folicular e a ovulação, bem como a taxa de prenhez após a IATF e a funcionalidade do CL 12 dias após a sincronização em búfalas, durante a estação reprodutiva desfavorável. Para tanto, foram realizados cinco experimentos. Nos experimentos 1, 2 e 4, os grupos foram estabelecidos em função da ciclicidade dos animais, avaliada pelas concentrações plasmáticas de progesterona mediante colheita de sangue por punção da veia jugular no D-10 e no D0. Nos experimentos 3 e 5, os grupos foram estabelecidos em função da condição corporal e da ordem de parto. Em todos os experimentos as búfalas receberam um DIV associado a 2mg de Benzoato de Estradiol (BE) no D0. No D9 o DIV foi retirado, e procedeu-se à administração de 0,150mg de prostaglandina (PGF). No experimento 1, as búfalas do G1 (Controle, n=9) e do G2 (eCG, n=10) receberam 1500UI de hCG no D11; o G2 recebeu também 500UI de eCG no D-9; a IATF foi realizada no D12. Nesse experimento, o diâmetro máximo do folículo dominante (DMFD) foi de 12,6 ± 3,0 e 13,4 ± 1,7mm para o G1 e o G2, respectivamente (P>0,05); o diâmetro do folículo ovulatório (DFO) foi de 14,9 ± 2,9 (G1) e de 14,0 ± 1,6mm (G2; P>0,05); o intervalo entre a retirada do DIV e a ovulação (IROV) foi de 78,0 ± 12 (G1) e 68,0 ± 9,0h (G2; P>0,05); a taxa de ovulação (TO) foi de 44,4 (G1) e 70,0% (G2; P> 0,05). A área do CL (ACL) foi de 31,6 ± 19,9 (G1) e de 29,9 ± 9,7mm2 (G2; P>0,05); a concentração plasmática de P4 (P4) foi de 1,3 ± 1,4 (G1) e 2,0 ± 1,6ng/ml (G2; P>0,05); a taxa de prenhez (TP) foi de 22,2 (G1) e 60% (G2; P=0,11). No experimento 2, as búfalas do G1 (1500 UI de hCG; n=21) e do G2 (1000UI de hCG; n=21) receberam 500UI de eCG no D9; no D11, o G1 recebeu 1500UI de hCG e o G2 1000UI de hCG. Os resultados desse experimento são relatados a seguir: DMFD de 12,4 ± 2,3 (G1) e 12,2 ± 2,5mm (G2; P>0,05); DFO de 12,6 ± 2,3 (G1) e 12,5 ± 2,7mm (G2; P>0,05); IROV de 67,7 ± 18,1 (G1) e 72,8 ± 16,7h (G2; P>0,05); TO de 67,7 (G1) e 67,7% (G2; P>0,05); ACL de 24,8 ± 9,2 (G1) e 28,3 ± 17,2mm2 (G2; P>0,05); P4 de 2,3 ± 1,4 (G1) e 2,4 ± 1,3ng/ml (G2; P>0,05). No experimento 3, os animais foram tratados de forma idêntica àqueles do experimento 2, porém as búfalas do G1 (n=83) e do G2 (n=91) receberam a IATF no D12. Nesse experimento, foi obtida TP de 53 (G1) e de 53,8% (G2; P>0,05). No Experimento 4, as búfalas do G1 (n=10) receberam 500UI e as do G2 (n=11) 400UI de eCG; os dois grupos receberam 1000UI de hCG no D11. Esse experimento teve como resultados: DMFD de 13,2 ± 1,4 (G1) e 13,8 ± 1,8mm (G2; P>0,05); DFO de 13,7 ± 1,1 (G1) e 14,2 ± 1,5mm (G2; P>0,05); IROV de 71,1 ± 11,7 (G1) e 75,0 ± 5,5h (G2; P>0,05); TO de 70,0 (G1) e 72,7% (G2; P>0,05); ACL de 28,4 ± 8,6 (G1) e 31,6 ± 10,3mm2 (G2; P>0,05); P4 de 2,7 ± 1,2 (G1) e 3,3 ± 2,9ng/ml (G2; P>0,05). No experimento 5 (G1/n=54; G2/n=51) foi adotado o mesmo protocolo do experimento 4, porém as búfalas receberam a IATF no D12. Esse experimento resultou em TP de 42,6 (G1) e 43,1% (G2; P>0,05). Assim, foi possível concluir que as concentrações de 400UI de eCG e de 1000UI de hCG, associadas ao DIV, foram suficientes para induzir o crescimento folicular, a ovulação e a prenhez em búfalas durante o período reprodutivo desfavorável. / Different dosage of eCG and hCG were compared in association to progesterone intravaginal device (IVD) in female buffalo during the off breeding season with the purpose of evaluating the follicular growing and ovulation as well as the pregnancy rate after FTAI and functionality of the CL, twelve days after the synchronization. For this, 5 experiments were done. For the establishments of the groups in the experiments 1,2 and 4 blood samples were collected for the analysis of plasmatic concentrations of P4 on D -10 and D0 to verify the cyclicity. In the experiments 3 and 5 the groups were established due body condition score and number of calving. In all the experiments the buffaloes received a IVD associated with 2mg of estradiol benzoate (EB) on D0. On D9 the IVD was extracted and it was followed by the administration of 0,150mg of prostaglandin (PGF). In the exp. 1 the buffaloes of G1 (control, n=9) and G2 (eCG, n=10) received 1500IU of hCG on D11. On G2 was administrated 500IU of eCG on D9. The FTAI was done on D12. The maximun diameter of dominant follicle (MDDF) was 12.6 ± 3.0 and 13.4 ± 1.7mm to the G1 and G2, respectively (P>0,05). The diameter of the ovulatory follicle (DOF) was 14.9 ± 2.9 (G1) and 14.0 ± 1.6mm (G2; P>0,05). The interval between the device withdrawn and ovulation (DWO) was 78.0 ± 12.0 (G1) and 68.0 ± 9.0h (G2; P>0,05). The ovulation rate (OR) was 44.4 (G1) and 70.0% (G2; P>0,05). The CL area (CLA) was 31.6 ± 19.9 (G1) and 29.9 ± 9.7mm2 (G2; P>0,05). The plasmatic concentration of P4 (P4) was 1.3 ± 1.4 (G1) and 2.0 ± 1.6ng/ml (G2; P>0,05). The pregnancy rate (PR) was 22.2 (G1) and 60% (G2; P=0,11). In the exp. 2 the buffalo females of G1 (1500IU of hCG; n=21) and G2 (1000IU of hCG; n=21) received 500IU of eCG on D9. On D11, G1 received 1500IU of hCG and G2 1000IU of hCG. The MDDF was 12.4 ± 2.3 (G1) and 12.2 ± 2.5mm (G2; P>0,05), the DOF was 12.6 ± 2.3 (G1) and 12.5 ± 2.7mm (G2; P>0,05), DWO was 67.7 ± 18.1 (G1) and 72.8 ± 16.7h (G2; P>0,05), the OR was 67.7 (G1) and 67.7% (G2; P>0,05), the CLA was 24.8 ± 9.2 (G1) and 28.3 ± 17.2mm2 (G2; P>0,05) and the P4 was 2.3 ± 1.4 (G1) and 2.4 ± 1.3ng/ml (G2; P>0,05). The exp. 3 was identical to exp.2, although the animals of G1 (n=83) and G2 (n=91) received the FTAI on D12. The PR was 53.0 (G1) and 53,8% (G2; P>0,05). In exp. 4, the animals of G1 (n=10) received 500IU and G2 (n=11) 400IU of eCG. Both groups received 1000IU of hCG on D11. The MDDF was 13.2 ± 1.4 (G1) and 13.8 ± 1.8mm (G2; P>0,05), the DOF was 13.7 ± 1.1 (G1) and 14.2 ± 1.5mm (G2; P>0,05), the DWO was 71.1 ± 11.7 (G1) and 75.0 ± 5.5h (G2; P>0,05), the OR was 70.0 (G1) and 72.7% (G2; P>0,05), the CLA was 28.4 ± 8.6 (G1) and 31.6 ± 10.3mm2 (G2; P>0,05) and the P4 was 2.7 ± 1.2 (G1) and 3.3 ± 2.9ng/ml (G2; P>0,05). In exp. 5 (G1/n=54; G2/n=51) was done the same protocol in the exp. 4, although the animals received the FTAI on D12. The PR was 42.6 (G1) and 43.1% (G2; P>0,05). Dosage of 400IU of eCG and 1000IU of hCG, associated to IVD for FTAI were enough to induce follicular growing, ovulation and pregnancy in buffalo females during the off breeding season.

O bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico) é um dos fatores envolvidos na organogênese placentária. O fator participa da regulação dos processos de angiogênese, de crescimento e desenvolvimento placentário e de proliferação e diferenciação das células placentárias. A homeostase tecidual requer balanço entre proliferação e morte celular. A identificação de células em atividade proliferativa pode ser feita pela detecção do antígeno Ki-67 presente no núcleo das células em proliferação. Objetivou-se estudar a distribuição espaço-temporal do bFGF e dois de seus receptores, FGFR1 e FGFR2, na placenta bubalina correlacionando-a à proliferação celular. Foram utilizadas treze placentas de fêmeas da espécie bubalina em diferentes fases da gestação, divididas em quatro grupos. Grupo 1 (n=4), placentas de 3 meses; grupo 2 (n=4), 5 meses; grupo 3 (n=1), 8 meses e grupo 4 (n=4), 9,5 meses. Para a detecção da proteína do bFGF, FGFR1 e FGFR2 bem como do antígeno Ki-67 foram realizados testes de imuno-histoquímica. Para tal, bloqueou-se a peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio PA a 1% em metanol e as reações inespecíficas com soro eqüino. A incubação com os anticorpos primários anti-Ki-67, anti-bFGF, anti-FGFR1 e anti-FGFR2 foi feita a 4°C por vinte e quatro horas e a incubação com o anticorpo secundário universal por vinte minutos em temperatura ambiente. Foi utilizado um complexo avidina-biotina para amplificar a reação e para revelação utilizou-se Nova Red&reg;. A análise dos resultados foi feita em microscópio óptico em aumento de 400 vezes através do sistema de imagens KS-400. Utilizou-se o programa Graph Prism 4 para análise estatística dos resultados. Foi detectada a expressão da proteína do bFGF e seus receptores no núcleo e citoplasma de células do estroma e epitélio maternos e fetais da placenta bubalina de maneira tempo-dependente ao longo da gestação. A atividade proliferativa apresentou perfil decrescente do início até o final da gestação. A correlação observada entre a expressão do bFGF e do Ki-67 nas células do epitélio materno e fetal e estroma materno foi positiva (r = 0,282, r = 0,313 e r = 0,469, respectivamente; p < 0.05); entre FGFR1 e Ki-67 a correlação foi mais elevada para as células do estroma e epitélio maternos e estroma fetal (r = 0,739, r = 0,511 e r = 0,358; p<0,0001) e negativa para o epitélio fetal (r = -0.211); FGFR2 e Ki-67 a correlação foi negativa para as células epitélio materno (r = -0,027) e positiva para o epitélio e estroma fetal (r = 0,384 e r = 0,268; respectivamente; p < 0.05). Pode-se concluir a partir dos resultados obtidos que existe uma correlação positiva entre a expressão da proteína do bFGF de seus receptores 1 e 2 e o antígeno Ki-67. No entanto, essa correlação é dependente do tipo celular e da fase de gestação analisadas, e aponta para um possível envolvimento do bFGF e seu receptor 2 na proliferação do trofoblasto enquanto o receptor 1 modularia a ação de outro agente proliferativo no epitélio materno e estromas materno e fetal. / The bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) is involved in the placental organogesis as a potent angiogenic molecule and is related to the growing and development of the placenta and proliferation of placental cells. Tissue homeostasis requires a balance between cell proliferation and cell death. The identification of proliferating cells can be made through the detection of Ki-67 nuclear antigen, present in these cells. The aim of this study was to evaluate the space-temporal expression of bFGF and two of its receptors, FGFR1 and FGFR2, in buffalo placenta in correlation to proliferative activity. In this study 13 buffalo placentas in different gestational phases were collected and divided into four groups. Group 1 (n=4), three moth-old placentas; group 2 (n=4), five month-old; group 3 (n=1), eight month-old and group 4 (n=4), 9.5 month-old. For the localization of bFGF, FGFR1, FGFR2 proteins and Ki-67 antigen, immunohistochemical assays were carried out. For that purpose, endogenous peroxidase activity was blocked with 1% Hydrogen Peroxide PA in methanol and non-specific binding with equine serum (1:10). Incubations with primary antibodies anti-Ki-67, anti-bFGF, anti-FGFR1 and anti-FGFR2 were made for 24 hours at 4°C. Incubation with universal secondary antibody (1:200) was made for 20 minutes in moist chamber at room temperature. Avidin/biotinylated horseradish ABC Elite Kit was used to amplify and Nova Red&reg; to develop the immunostaining. Slides were observed under a light microscope at 400 times magnification and photographed with KS-400 image program. Graph Prism 4.0 program was used for statistical analysis. Expression of the bFGF and its receptors proteins was detected in the nucleus and cytoplasm of buffalo placental cells during gestation. Placental proliferative activity was evaluated through the expression of Ki-67 antigen. The correlation observed between bFGF and Ki-67 expression in the maternal and fetal epithelium and maternal stroma cells was positive (r = 0,282, r = 0,313 e r = 0,469, respectively; p < 0.05). Between FGFR1 and Ki-67 the correlation was higher for maternal epithelial and stroma and fetal stroma cells (r = 0,739, r = 0,511 e r = 0,358, respectively; p<0,0001) and negative for fetal epithelium (r = -0.211). FGFR2 and Ki-67 correlation observed was negative for maternal epithelium cells (r = -0,027) and positive for fetal epithelium and stroma cells (r = 0,384 e r = 0,268; respectively; p < 0.05). We conclude that bFGF and its receptors 1 and 2 are positively correlated to the expression of the Ki-67 antigen, depending on cell type and gestational period. The results suggest that bFGF and its receptor 2 may be involved in the modulation of trophoblast proliferation, whereas FGFR1 may modulate proliferation in the maternal epithelium and fetal and maternal stroma, probably through the binding to another growth factor (s).

A apoptose é um processo fisiológico que desempenha papel crucial no desenvolvimento, remodelagem e senescência teciduais, inclusive placentários. A placenta, enquanto órgão temporário, atravessa todas estas fases em aproximadamente 10 meses, na espécie bubalina. O crescimento da placenta e a nutrição fetal requerem altas taxas de renovação e diferenciação celulares, e a maturação placentária está relacionada à redução das células epiteliais das criptas carunculares maternas. As modificações morfológicas celulares decorrentes do processo de apoptose são fruto de eventos bioquímicos complexos promovidos por uma família de cisteína-proteases, as caspases, especialmente as caspases executoras, dentre as quais se destaca a caspase-3, capaz de degradar várias proteínas citoplasmáticas e nucleares. Durante a apoptose, ocorre a clivagem caspase-mediada da citoqueratina 18, proteína dos filamentos intermediários do citoesqueleto, e com isso a formação de um neoepítopo específico. Por meio de métodos imunoistoquímicos pode-se detectar a presença tanto deste neoepítopo, quanto da forma ativa da caspase-3, o que demonstra que a célula entrou em estágio irreversível de morte celular. Morfologicamente, algumas das principais alterações celulares observadas são condensação da cromatina, a degradação e fragmentação do DNA, a formação de ?blebs? (pregas/bolhas) na membrana plasmática, além da fragmentação celular em corpúsculos apoptóticos, os quais podem ser identificados em cortes corados pelo método de rotina hematoxilina e eosina, utilizando-se microscópio de imunofluorescência, devido à eosinofluorescência das células em apoptose. Assim como a apoptose, a proliferação celular participa no equilíbrio homeostático tissular. Neste estudo, pretende-se avaliar a ocorrência de apoptose e proliferação celular em 42 placentônios de diferentes animais em diversas fases gestacionais (2-10 meses de gestação), em tecidos fixados em 4% paraformoldeído, incluídos em paraplast e submetidos à imunoistoquímica (anticorpo monoclonal M30 CytoDeath; Caspase-3 Clivada; PCNA - antígeno de marcação nuclear), sendo também avaliada a presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes nas amostras. Utilizando-se M30 e caspase-3 clivada pudemos constatar a ocorrência de apoptose nos epitélios uterino e trofoblástico, em células gigantes placentárias e, ocasionalmente, em células mesenquimais fetais, do estroma uterino e endoteliais. Não houve diferenças significativas (p<0.05) entre os métodos adotados, mas sim entre os estágios gestacionais. Para o M30, houve um aumento significante da apoptose do primeiro grupo (2-4.5 meses) em relação ao quarto grupo (9-10 meses); no caso da Caspase-3 Clivada houve um aumento estatísticamente significante (p<0.05) entre os três primeiros grupos (2-4.5; 5-6.5; e 7-8.5 meses de gestação, respectivamente) de animais em relação ao quarto grupo. Para o PCNA, ocorreu uma diminuição no número de células em proliferação dos dois primeiros grupos de animais em relação ao quarto grupo (p<0.05). A presença de corpúsculos apoptóticos eosinofluorescentes pôde ser observada em todas as amostras. Nossos resultados sugerem haver uma relação entre a ocorrência de apoptose e a maturação, senescência e liberação placentárias em ruminantes. / Apoptosis is a physiological process that plays a crucial role in the development, remodeling and aging of the placenta. The placenta is a temporary organ that undergoes growth and development, followed by senescence and death in 10 months in the buffalo species. Placental growth and fetal nutrition require high rates of cellular turnover and differentiation, and placental maturation is correlated to the reduction of the number of epithelial cells of the maternal crypts. The morphological changes of the apoptotic cells are product of complex variety of biochemical events promoted by a family of cystein-proteases, the caspases, mainly the effectors caspases, and among them the caspase-3, which is able to degrade cytoplasmic and nuclear proteins. During apoptosis, the caspase-mediated cleavage of cytokeratin 18, which is one of the first intermediate filament proteins of the cytoskeleton, leads to the formation of a specific neo-epitope. It is possible to detect the presence of this neo-epitope by immunohistochemistry, as well as the active form of caspase-3, showing that the cell has entered an irreversible stage of cell death. Morphologically, some of the main observed cellular alterations are condensation of the chromatin, degradation and spalling of the DNA, blebbing of the cell membrane and the formation of apoptotic bodies. These bodies can be identified in slides stained by hematoxilin and eosin with a fluorescent microscope, due to the eosinofluorescent property of the apoptotic cells. Like apoptosis, cellular proliferation also contributes to the tissue homeostasis. In the present study, we intend to evaluate the occurrence of apoptosis and cellular proliferation in 42 placentomes, collected from different animals in several gestacional phases (2-10 months of gestation), fixed in 4% paraformaldehyde, processed for embedding in paraplast and cut in sections, through immunohistochemistry (monoclonal antibody M30 CytoDeath; Cleaved Caspase-3; PCNA - antigen of nuclear proliferation). The presence of eosinofluorescent apoptotic bodies were also studied in the samples. M30 and Cleaved Caspase-3 allowed to show the occurrence of apoptosis in the uterine and trophoblastic ephitelium, in placental giant cells and, occasionally, in the fetal mesenquimal cells, in the uterine stroma and endothelium cells. There were no significant differences (p<0.05) between the adopted methods, although there were differences between the gestational phases studied. For M30, there was an increase of the number of apoptotic cells (p<0.05) from the first group (2-4.5 months) in relation to the fourth group of animals (9-10 months); for the Cleaved Caspase-3 there was a statistical significant increase (p<0.05) between the first three groups of animals (2-4.5; 5-6.5; and 7-8.5 months of gestation, respectively) and the last one. In relation to the PCNA, a decrease in the number of proliferative cells occurred from the first two groups of animals to the fourth group (p<0.05). The occurrence of eosinofluorescent apoptotic bodies was observed in all the samples studied . Our data suggest a relationship between apoptosis and the maturation, senescence and release of the ruminant placenta.

A função da eritrofagocitose observada após o extravasamento de sangue na interface materno-fetal é indefinida em várias espécies, incluindo o búfalo. Na ovelha, este processo foi muito estudado, e ocorre na zona arcada do placentônio (topos dos septos maternos e base dos vilos fetais), região onde o processo é realizado pelo trofoblasto. É possível que o ferro seja transferido para o feto mediante a eritrofagocitose trofoblástica nesta área hemófaga da placenta e nas glândulas endometriais. Para este estudo foram utilizadas placentas de búfalas entre 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 e 10 meses de prenhez, fixadas por perfusão com solução aquosa de formaldeído a 10% e paraformaldeído a 4%, para microscopia de luz, e glutaraldeído a 2,5%, para microscopia eletrônica de transmissão, processadas e coradas para microscopia de luz (HE, azul de Toluidina, tricromo de Gomori, Hematoxilina-floxina, Azul de metileno - fucsina básica), histoquímica (reação de Perls, PAS e fosfatase ácida) além de microscopia eletrônica de transmissão. A metodologia utilizada permitiu-nos observar que as áreas hemófagas estavam presentes em determinadas regiões do placentônio, nas quais se identificavam áreas hemorrágicas entre o epitélio uterino e o trofoblástico, nas placentas de 4 a 10 meses de prenhez. Eritrócitos foram encontrados nas células trofoblásticas, elucidando, deste modo, a eritrofagocitose. A reação de PAS foi positiva, marcando substância mucóide, principalmente na base dos vilos fetais, células trofoblásticas binucleadas e nas glândulas endometriais da região interplacentomal. A reação de Perls foi negativa nos placentônios e positiva nas glândulas endometriais. A reação de fosfatase ácida foi positiva tanto nos placentônios, quanto na região interplacentomal. A ultraestrutura da região das áreas hemófagas revelou eritrócitos ingeridos dentro das células trofoblásticas epiteliais em diferentes fases de digestão e eletrondensidades, várias vesículas endocíticas, cavéola, muitas gotículas lipídicas, retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvido e a presença de grande quantidade de mitocôndrias. O epitélio das glândulas endometriais da região interplacentomal é do tipo colunar com a presença de microvilos em seu ápice, e núcleos basais. / The function of erytrophagocytosis observed after blood extravasation in the maternal-fetal interface is indefinite various species, including the water buffalo. In ewe, this process had been hardly studied and it occurs in the placentome arcade zone (top of maternal septa), region where the process is performed by the trophoblast. It is possible that iron is being transferred to the fetus through the trophoblastic erytrophagocytosis in the hemophagous areas of the placenta and in the endometrial glands. In our research we have been using placentomes of buffaloes between 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 and 10 months of pregnancy, fixed by perfusion with 10% formaldehyde aqueous solution, 4% paraformoldehyde for light microscopy and 2,5% glutaraldehyde for transmission electron microscopy, processed and stained for light microscopy (HE, Toluidine blue, Gomori trichrome, hematoxilin - floxin, methilen blue ? basic fucsin), histochemistry (Perls, PAS and acid phosfatase reaction) and transmission electron microscopy. The methodology used allowed us to observe that the haemophagous areas were present in determined regions of the placentome, in which there were showing haemorragic areas between the trophoblastic and uterine epithelium, in 4-10 months pregnant placentae. Erythrocytes had been found inside trophoblastic cells, thus contributing to explain the erytrophagocytosis. The PAS reaction was positive, staining mucoid substance, mainly in the basis of the fetal villi, trophoblastic binucleate cells and in an endometrial glands in the interplacentomal region. The Perls reaction was negative in the placenton as well as in the endometrial glands. The acid phosphatase reaction was positive in placenton as well as in the interplacentomal region. The ultrastructure of the haemophagous areas revealed ingested erythrocytes inside the epithelial cells of trophoblast in different phases of digestion and electrondensities, various endocitic vesicles, caveolae, many lipid droplets, well-developed rough endoplasmic reticulum and large number of mitochondrias. The endometrial glands epithelium of interplacentomal region is columnar type with microvilli and basal nuclei.

Submitted by ANA PAULA PERES LOPES ROMARIZ (anapaulaperlopes@hotmail.com) on 2018-11-08T20:05:10Z No. of bitstreams: 1 ANA PAULA ROMARIZ Dissertação corrigida 06.05.18 E 04.11.pdf: 2116840 bytes, checksum: b2108011ea2c9d6d8f71c8bf663ffd36 (MD5) / Approved for entry into archive by Cristina Alexandra de Godoy null (cristina@adm.feis.unesp.br) on 2018-11-09T11:06:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 romariz_appl_me_ilha.pdf: 2116840 bytes, checksum: b2108011ea2c9d6d8f71c8bf663ffd36 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-09T11:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 romariz_appl_me_ilha.pdf: 2116840 bytes, checksum: b2108011ea2c9d6d8f71c8bf663ffd36 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Tripanosomatídeos são protozoários parasitas flagelados que em ruminantes no Brasil incluem os pertencentes à família Trypanosomatidae, com os gêneros Trypanosoma e Leishmania. Com relação aos búfalos domésticos (Bubalus bubalis), pouco ou nada se conhece sobre estes parasitas. Este estudo teve como objetivo avaliar por meio de métodos parasitológicos (exame direto do parasita no microscópio), sorológicos (RIFI – reação de imunofluorescência indireta) e moleculares (PCR – reação em cadeia pela polimerase e sequenciamento) a presença de tripanosomatídeos em búfalos. Amostras de sangue e suabe conjuntival foram coletadas de 100 búfalos da Fazenda São Francisco, Andradina, SP e de 10 búfalos de Selvíria, MS. Dos 110 búfalos, 60,9% (67/110) apresentaram hemoflagelares tripanossomatídeos nos esfregaços sanguíneos e 90% (99/110) deles apresentaram anticorpos anti-Leishmania pela RIFI. O DNA destes parasitas foi detectado em 29,09% (32/110) dos búfalos pela técnica de PCR, sendo, 26,36% (29/110) na PCR do sangue e 3,6% (4/110) na PCR do suabe conjuntival. Das amostras positivas para PCR, sete foram enviadas para o sequenciamento gênico, e uma delas foi identificada como Leishmania infantum e três como Trypanosoma theileri, ambas as amostras apresentaram 100% de similaridade com as respectivas espécies após comparação pelo GenBank. Este estudo relata o primeiro registro de infecção por L. infantum em B. bubalis na região de Andradina, SP, e a presença de búfalos infectados por espécies de T. theileri, evidenciando a necessidade de mais estudos sobre tripanosomatídeos em búfalos. / Trypanosomatides are flagellate protozoan parasites that in ruminants include those belonging to the family Trypanosomatidae, with the genera Trypanosoma and Leishmania, but with little or nothing information about these parasite infections in domestic water buffalo (Bubalus bubalis). Tthis study was assessed through the parasitological (direct examination of the parasite under microscope), serological (IFAT – immunofluorescence antibody test), and molecular tests (PCR from blood and conjunctival swab and genic sequencing) to detect possible trypanosomatides in buffalo herds from Andradina, SP and Selvíria, MS. Thus, 60.9% (67/110) buffaloes presented trypanosomatid parasites in the blood smears, 90% (99/110) had anti-Leishmania antibodies by IFAT. The DNA of these parasites was detected in 29.09% (32/110) of buffaloes by the PCR technique; 26.36% (29/110) in blood and 3.6% (4/110) in conjunctival swab. Positive PCR samples from seven animals were sent for DNA sequencing, and one of them was identified as Leishmania infantum and three as Trypanosoma theileri, both samples showed 100% of similarity with the respective species after comparison by BenBank. This study reports for the first time the presence of parasite L. infantum in B. bubalis from Andradina, SP, and highlights the presence of buffaloes infected with T. theileri, and indicates the need for more studies on trypanosomatid parasites in buffaloes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-18Bitstream added on 2014-06-13T20:33:40Z : No. of bitstreams: 1 ramirezdiaz_j_me_jabo.pdf: 299917 bytes, checksum: 05bd7ca3c91cc621d21a5b0a924a0ad7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Foram analisadas 1842 informações de produção de leite e constituintes – gordura, proteína e sólidos totais- de búfalas leiteiras de diferentes grupos genéticos (GG) com o objetivo de avaliar o efeito do grupo na produção total de leite (Pltotal) e a produção total de gordura, proteína e sólidos totais em quilogramas. Utilizando a metodologia dos modelos mistos com medidas repetidas no tempo, três diferentes modelos foram analisados. A composição racial (CR) foi formada levando-se em conta a porcentagem de Murrah das búfalas, sendo apresentados como desvio dessa raça. O Modelo um (M1) considerou como efeito fixo a CR, enquanto que o modelo dos (M2), considerou, alem da CR, as informações de heterozigose como co-variável, e o modelo três (M3) desconsiderou a CR e utilizou as informações de heterozigose. O efeito do grupo de contemporâneos (GC) definidos por rebanho- ano e estação de parto foi considerado como fixo e a duração da lactação (DL) – efeito linear- e idade da vaca ao parto (IVP) -efeitos linear e quadrático- foram consideradas como co-variáveis nos três modelos. Efeito significativo (P<0.05) do GC, IVP e DL foram observados para todas as características analisadas, enquanto que o efeito da CR não foi significativo em nenhuma das características, independentemente do modelo utilizado. Também foram calculadas as estimativas de herdabilidade (h2) para Pltotal (kg), e para a produção de proteína (Prot), gordura (Gord) e sólidos totais (ST) das primeiras lactações das búfalas sob analises uni-característica utilizando o método de máxima verossimilhança restrita pelo programa MTDFREML (BOLDMAN et al., 1995) considerando o M1 incluindo os efeitos aleatórios de animal, de ambiente permanente e residual. Os coeficientes de herdabilidade estimados para a Pltotal, Gord/kg, Prot/kg e ST/kg foram 0,14 ± 0,05; 0,37±0,07; 0,5±0,14; e 0,46... / We analyzed information on 1842 milk production and constituents -fat, protein and total solids- of water dairy buffalo from different breed in order to evaluate the effect of breed composition (CR) in total milk production (Pltotal) and production in kilograms of fat, protein and total solids. Using the methodology of mixed models with repeated measure, three models were studied. The breed composition was conformed taking into account the percentage of Murrah, as deviation from this breed. Model one (M1) included as fixed effect the CR, whereas the model two (M2), included the information of the CR and heterozygosity as a covariate. The model three (M3) included the information heterozygosity. The effect of contemporary group (CG) conformed by year and season of birth was considered as fixed effect and the duration of lactation (DL) - a linear- and age at calving (IVP)-linear and quadratic effects - were considered as covariates in the three models. We also estimated genetic parameters for Pltotal (kg), and for the production of protein Prot (kg), fat (Gord) and total solids TS (kg) of first lactation of buffaloes. Uni-trait analyses under the method of restricted maximum likelihood method were used for the estimation of variance components and heritability for PLtotal, Gord, Prot and ST. The fixed effects as contemporary group consisting of herd, year and season of calving, and genetic group (GG), linear and quadratic covariate of age at calving (IVP) and the random effects of animal, permanent environment and residual. Estimates of coefficients of heritability estimates for Pltotal, Gord / kg, Prot / kg and ST / kg were 0,14±0,05; 0,37±0,07; 0,5±0,14; e 0,46±0,06 respectively

Orientador: André Mendes Jorge / Resumo: Objetivou-se com este estudo avaliar a associação de medidas de eficiência, desempenho e digestibilidade de nutrientes de três grupos genéticos de bubalinos. Foram utilizados 75 machos não-castrados (25 de cada raça: Jafarabadi, Mediterrânea e Murrah), com peso e idade média de 314 ± 117 kg e 390 ± 58 dias, respectivamente. Os animais foram confinados em baias coletivas e alimentados de forma ad libitum utilizando sistema automático para determinação do consumo de alimento e água durante 112 dias (28 dias de adaptação e 84 dias de coleta de dados). No início e ao término do experimento foram realizadas avaliações de ultrassonografia (AOL, EGS e EGG) e a cada 28 dias pesagens e determinação da altura da garupa (AG). Foram avaliadas: conversão alimentar (CA), eficiência alimentar (EA), consumo alimentar residual (CAR), ganho residual (GR) e consumo ganho residual (CGR). Amostras de fezes foram coletadas para o cálculo da excreção fecal a partir do marcador interno de fibra em detergente neutro indigestível (FDNi) e posterior determinação da digestibilidade aparente dos nutrientes da dieta. Os dados foram analisados pelos procedimentos MIXED e CORR (SAS Inst. Inc., Cary, NC). O grupo Jafarabadi obteve valor superiores para PVF (P = 0,03), GMD (P < 0,01) e AG (P < 0,01), enquanto que os grupos Mediterrâneo e Murrah não diferiram. Não houve efeito do grupo genético para as variáveis relacionadas ao consumo de alimentos (CMS; CMS kg/d; CMS %PV; CMS g/kg0,75; P > 0,28) e água (P = 0... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O presente trabalho teve como objetivo a análise microbiológica das amostras de leite de fêmeas bubalinas, a avaliação da quantidade de UFC/mL dos microrganismos isolados e a contagem de células somáticas/mL. Os quartos mamários foram submetidos ao teste de tamis e CMT e foram colhidas 262 amostras de leite de fêmeas bubalinas primíparas e pluríparas; para análise microbiológica, quantificação das UFC/mL e contagem de células somáticas/mL. A contagem das células somáticas foi realizada através da leitura em microscopia ótica dos esfregaços de leite. A leitura foi realizada utilizando-se a totalidade dos campos existentes no esfregaço de 1cm2. No teste do tamis, 99,6% das amostras apresentaram resultado negativo. No CMT, observamos resultado negativo em 88,2% das amostras; traços (8%), positivo 1+ (1,5%); positivo 2+ (1,15%); positivo 3+ (1,15%). A análise microbiológica apresentou amostras sem crescimento de microrganismos (75,6%); isolamento de Staphylococcus spp. (11,8%); Corynebacterium spp. (7,3%); Streptococcus spp, (3,1%) e crescimento de microrganismos associados (1,2%). A contagem total de células somáticas das amostras avaliadas apresentou mediana de 2300 células/mL de leite; a mediana da contagem de PMN e MN foi, respectivamente, 700 células/mL e 1500 células/ml de leite, com diferença estatisticamente significante (P<0,0001). As quantidades totais de células somáticas/mL e as quantidades de células polimorfonucleares e mononucleares nas amostras negativas ao exame microbiológico foram estatisticamente menores do que nas amostras que apresentaram isolamento de microrganismos. A mediana relativa às quantidade de UFC/mL foi de 550 UFC/mL para as amostras com isolamento de Corynebacterium spp.; 500 UFC/mL para as amostras com isolamento de Staphylococcus spp e 1100 UFC/mL para Streptococcus spp. ,sendo que não houve diferença estatisticamente significativa entre eles. Concluiu-se que a espécie bubalina, apresenta baixos índices de mastite; nas amostras com isolamento de microrganismos, o número de UFC/mL é pequeno.Existe um número de animais que apresenta resultado positivo no exame microbiológico do leite, sem contudo apresentar sinais de processo inflamatório. / The aim of the present study was the microbiological analysis of milk samples from female buffaloes, the amount evaluation of CFU/mL of the isolated microorganisms and the somatic cells counting/mL. The mammary quarters were submitted to strip cup test and CMT and 262 milk samples were colletected from buffalo cows to microbiological analysis, CFU/mL quantification and somatic cells counting. The somatic cells countings were obtained through optical microscopy reading of the milk smears, where all fields of the 1 cm2 smears area were considered. In the strip cup test, 99,6% of the samples had negative results. In the CMT, the negative results were observed in 88,2% of the samples; traces (8%), 1+ positive (1,5%), 2+ positive (1,15%) and 3+ positive (1,15%). The microbiological analysis resulted in samples with no microorganism growth (75,6%); Staphylococcus spp (11,8%); Corynebacterium spp (7,3%) and Streptococcus spp (3,1%) and associated microorganisms growth (1,15%). The total counting of somatic cells in the evaluated milk samples showed median of 2300 cells/mL; while PMN and MN counting median were 700 cells/mL and 1500 cells/mL respectivelly, with a significant statisticall difference (P< 0,0001). The total somatic cells counting/mL and the amount of PMN and MN cells in the microbiological negative samples were statistically smaller than the findings in the samples that showed microorganism isolation. Concerning the amount of CFU/mL, the median obtained for samples with Corynebacterium spp was 550CFU/mL; 500 CFU/mL for Staphylococcus spp samples and 1100 CFU/mL for Streptococcus spp results, with no statiscally significant difference between them. It follows that he buffalo species has a low rate of mastitis; the number of CFU/mL is small in the microbiological positive samples. There are a number of animals that despite presenting milk microbiological exam with positive results, showed no signs of inflamatory process.

O presente estudo objetivou estabelecer o padrão de referência dos constituintes físico-químicos e celulares do leite e identificar relações entre os valores desses elementos constituintes da secreção láctea de búfalas, criadas em São Paulo/BR. Para tanto foram utilizadas 98 búfalas adultas e lactantes, da raça Murrah, distribuídas em vários grupos experimentais, segundo os seguintes fatores de variabilidade: idade; fase da lactação; momento da ordenha e tipo de ordenha utilizada. Dessas búfalas foram colhidas 1.176 amostras de leite (de glândulas mamárias que não apresentavam sinais de processo inflamatório ou tivessem sido submetidas a tratamento intramamário). As amostras de leite foram submetidas aos seguintes exames: testes da caneca de fundo escuro e do CMT; determinação da concentração hidrogeniônica e da eletrocondutividade; bem como, determinaram-se os teores de cloreto; lactose; proteína; gordura e sólidos totais. Também, foram realizadas contagens de células somáticas, bem como, o isolamento e identificação de cepas bacterianas e, nos casos positivos realizaram-se o antibiograma. Os valores considerados como padrão de referência para o leite de búfalas, segundo as fases de lactação (inicial, intermediária e final) foram respectivamente: para o pH - 6,89; 6,85 e 6,9; para a eletrocondutividade - 3,82; 4,02 e 4,49 mS/cm; para os teores de cloreto - 18,21; 20,13 e 26,49 mg/dl; para os teores de gordura - 4,25; 3,70 e 3,56 g/dl; para os teores de proteína - 3,97; 4,03 e 4,5 g/dl; para os teores de lactose - 5,11; 5,08 e 4,81 g/dl; para os teores de sólidos totais - 14,55; 13,88 e 13,93 g/dl e para o número de células somáticas - 29.000; 29.000 e 16.000 cel/ml. Os resultados comprovaram que a fase de lactação influía sobre os valores do pH, eletrocondutividade, teores de cloreto, gordura, proteína, lactose, sólidos totais e número de células somáticas e que, os teores de gordura, proteína, lactose, sólidos totais e número de células somáticas sofreram influência do momento da ordenha (amostra colhidas antes e depois da ordenha), respectivamente, com os seguintes valores: 3,90 e 8,9 g/dl; 4,12 e 3,67 g/dl; 5,02 e 4,64 g/dl; 14,18 e 18,31 g/dl e; 29.000 e 56.000 cel/ml. A análise dos resultados permitiu constatar, que o tipo de ordenha influiu na eletrocondutividade, no número de células somáticas e nos teores de gordura e proteína do leite, sendo os resultados nas amostras das búfalas submetidas à ordenha manual ou mecânica, respectivamente, para: eletrocondutividade - 3,89 e 4,14 mS/cm; número de células somáticas - 22.000 e 32.000 CS/ml; teores de gordura - 4,47 e 3,62 g/dl e; para proteína - 3,77 e 4,29 g/dl. Ao se considerar a idade das búfalas verificou-se que, com o progredir da idade a eletrocondutividade e os teores de cloreto aumentavam, mas, em contra posição os teores de lactose diminuíram; não se observou alteração significativa nos valores de gordura, sólidos totais, proteína e pH lácteos. Os escores do CMT (negativo, traços, 1+ e 2+), aumentavam, gradativamente, com o evoluir da fase da lactação e, a eletrocondutividade, o teor de cloreto e o número de células somáticas aumentaram de forma, diretamente, proporcional ao aumento do escore do CMT; porém, ao contrário, o teor de lactose diminuía. A variação do escore do CMT não foi acompanhada de modificações significativas dos teores lácteos de gordura, proteína e de sólidos totais. As bactérias isoladas com maior freqüência foram as dos gêneros: Corynebacterium sp (28,5%); Staphylococcus sp (24,7%); Streptococcus sp (15,8%) e; Actinomyces sp (11,4%). O número de isolamentos bacterianos aumentou, significativamente, com o evoluir da lactação. Entretanto, o momento da ordenha não influiu no número de isolamentos e evidenciou-se maior freqüência de isolamentos nas glândulas posteriores do úbere. No antibiograma das cepas de bactérias isoladas foram utilizados os seguintes antibióticos e quimioterápicos: cefalotina; cefoperazone; cloranfenicol; cotrimoxazol; enrofloxacina; estreptomicina; gentamicina; neomicina; nitrofurantoína; oxacilina; penicilina e tetraciclina. Entre os Corynebacterium sp, 47 cepas (61,03%) foram resistentes à nitrofurantoína; 10 (12,9%) à oxacilina; 8 (10,38%) à estreptomicina e; 7 (9,09%) à tetraciclina; sendo sensíveis aos demais antimicrobianos testados. Os Staphylococcus sp demonstraram, em 12 (26,66%) dos casos, resistência a nitrofurantoína; em 2 (4,44%) à tetraciclina e; foram sensíveis aos demais antimicrobianos; os Streptococcus sp, com exceção de 7 (25%), resistentes à ação da nitrofurantoína, foram sensíveis aos demais antimicrobianos utilizados. / The objective of the present study was to establish reference values for physical-chemical and cellular contents of the milk of buffaloes bred in the state of São Paulo, Brazil, and to draw relationships between these values and elements present in this kind of milk. Ninety-eight adult Murrah buffalo females were distributed into different experimental groups, according to the following variability factors: age, phase of lactation, time of milking and milking procedure. From these animals, 1,176 samples of milk were collected (from udders that did not present any signs of inflammatory process or that have been subject to intramammary treatment). Milk samples were submitted to the following tests: strip cup test and CMT; determination of pH and electroconductivity, chloride, lactose, protein, fat and total solid contents. Milk samples were also submitted to somatic cell counts, as well as isolation and identification of bacterial strains, which were also submitted to antibiograms. Reference values for buffalo milk, according to the phase of lactation (beginning, middle and end of lactation) were, respectively: pH, 6.89; 6.85 and 6.9; electroconductivity, 3.82; 4.02 and 4.49 mS/cm; chloride content, 18.21; 20.13 and 26.49 mg/dl; fat content 4.25; 3.70 and 3.56 g/dl; protein content, 3.97; 4.03 and 4.5 g/dl; lactose content, 5.11; 5.08 and 4.81 g/dl; total solid content, 14.55; 13.88 and 13.93 g/dl, and somatic cell counts, 29,000; 29,000 and 16,000 cells/ml. Results support that the phase of lactation influence pH, electroconductivity, chloride, fat, protein, lactose and total solid contents, as well as somatic cell counts. Somatic cell counts and fat, protein, lactose and total solid contents were influenced by the moment of sample collection (before or after milking), respectively, with the following values: 3.90 and 8.9 g/dl; 4.12 and 3.67 g/dl; 5.02 and 4.64 g/dl; 14.18 and 18.31 g/dl, and 29,000 and 56,000 cells/ml. Results showed that the kind of milking procedure used influenced electroconductivity, somatic cell counts, fat and protein contents. Results for buffaloes submitted to manual or mechanical milking were, respectively: electroconductivity, 3.89 and 4.14 mS/cm; somatic cell counts, 22,000 and 32,000 cells/ml; fat content 4.47 and 3.62 g/dl, and protein content 3.77 and 4.29 g/dl. When the age of the animals was considered, it was observed that the older the animal, the greater the electroconductivity and chloride contents, and the lower the lactose contents. No significant changes were observed in pH, fat, total solid and protein contents. CMT scores (negative, trace, 1+ and 2+) gradually increased with the phase of lactation. Increases in electroconductivity, chloride content and somatic cell counts were directly proportional to the increase in CMT scores, whereas lactose content decreased. Variation of CMT scores was not followed by significant changes in fat, protein and total solid contents. Bacterial genera more frequently isolated were Corynebacterium sp (28.5%); Staphylococcus sp (24.7%); Streptococcus sp (15.8%) and Actinomyces sp (11.4%). The frequency of bacterial isolation increased significantly with lactation. However, the moment of milking did not influence isolation. Posterior quarters presented the greatest frequency of isolation in the udders analyzed. The following antibiotic and chemotherapic agents were used in the antibiogram: cefalotin; cefoperazone; chloranfenicol; cotrimoxazol; enrofloxacine; streptomycin; gentamycin; neomycin; nitrofurantoin; oxacylin; penicillin and tetracycline. Among Corynebacterium sp, 47 strains (61.03%) were resistant to nitrofurantoin and 10 (12.9%) to oxacylin, 8 (10.38%) streptomycin and 7 (9.09%) to tetracycline. These strains were sensitive to the other antibiotic agents tested. From Staphylococcus sp strains, 12 (26.66%) were resistant to nitrofurantoin and 2 (4.44%) were resistant to tetracycline. They were sensitive to the other antibiotics tested. Among Streptococcus sp strains they were all sensitive to the the antibiotic agents, except for 7 (25%) of them that were resistant to nitrofurantoin.

Com o objetivo de estudar o uso de inóculo de fezes em substituição do conteúdo ruminal de bubalinos na técnica in vitro de produção de gases, este presente trabalho comparou as avaliações realizadas em três ensaios. Foram utilizados três bubalinos da raça Mediterrâneo, machos, adultos, castrados, fistulados no rúmen com média de peso vivo de 450 (± 18,7) kg. Estes animais receberam uma dieta basal, composta de silagem de milho (70%) e concentrado (30%). Estes animais foram os doadores dos 2 tipos de inóculos, que foram conteúdo ruminal (CR) e fezes. O primeiro ensaio realizado foi com alimentos concentrados: grão de milho, farelo de soja, farelo de trigo e farelo de algodão; o segundo ensaio foi com leguminosas forrageiras: alfafa (Medicago sativa L. ), estilosantes pioneiro (Stylosanthes macrocephala cv. Pioneiro), soja perene (Neonotonia wightii) e leucena (Leucaena leucocephala); e o terceiro e último ensaio foi realizado com gramíneas forrageiras: capim braquiarão (Brachiaria brizantha cv. Marandu), capim buffel (Cenchrus ciliaris L. cv. Biloela), estrela africana (Cynodon plectostachyus) e capim mombaça (Panicum maximum Jacq. cv. Mombaça). Os valores médios obtidos de produção potencial de gases em cada ensaio foram menores (P&lt;0,05) para as amostras fermentadas com inóculos de fezes que com conteúdo ruminal, sendo respectivamente, para concentrados (140,23 e 194,08 mL.g-1MS), gramíneas (161,99 e 230,25 mL.g-1MS) e leguminosas (141,78 e 170,70 mL.gm-1MS). Conclui-se que inóculos de fezes não apresentam condições satisfatórias para substituição do inóculum com conteúdo ruminal para uso na técnica de produção in vitro de gases. / In order to study the use of faeces as inoculum as alternative for buffalo rumen contents in the in vitro gas production technique, the present work evaluations of three tests. We used three Mediterranean buffalos, male, adult, neutered, fistulated in the rumen, with an average live weight of 450 (± 18.7) kg. These animals received a basal diet composed of corn silage (70%) and concentrated (30%). These buffalo were the donors of the two types of inocula, rumen content (CR) and faeces. The first test was carried out with concentrate foods: corn grain, soybean meal, wheat bran and cottonseed meal, the second test was with legumes: alfalfa (Medicago sativa L. ), Pioneiro estilo (Stylosanthes macrocephala cv. Pioneiro) , perennial soybean (Neonotonia wightii) and leucaena (Leucaena leucocephala) and the third and last test was carried out with grasses: Marandu grass (Brachiaria brizantha cv. Marandu), buffel grass (Cenchrus ciliaris L. cv. Biloela), African Star grass (Cynodon plectostachyus) and Mombasa grass (Panicum maximum Jacq. cv. Mombasa). The average values of potential production of gas in each test were lower (P&lt;0.05) for samples fermented with an inoculum of faeces with rumen contents, being respectively, for concentrates (140.23 and 194.08 mL.g-1MS), grasses (161.99 and 230.25 mL.g-1MS) and legumes (141.78 and 170.70 mL.g-1MS). It follows that fecal inoculum unsatisfactory condition for replacing the inoculum with rumen technique for use in the in vitro production of gases technique.