β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG. / β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis.

No description available.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: Avaliar a acuracia de diferentes testes fenotipicos para a deteccao da producao de MBL entre amostras produtoras de IMP, VIM, SPM, GIM, ou SIM, incluindo Pseudomonas, Acinetobacter spp. e enterobacterias. Metodos: Foram testadas 46 bacterias nao relacionadas geneticamente e produtoras de diferentes tipos de MBL. Dezenove amostras nao produtoras de MBL foram incluidas como controles negativos. Foi avaliada a capacidade do inibidor de MBL (IMBL) em inibir o crescimento bacteriano e em realizar a hidrolise do substrato. Os isolados foram submetidos aos testes de disco aproximacao e disco combinado para adeteccao da producao de MBL, utilizando imipenem e ceftazidima em combinacao com diferentes IMBLs. Resultados: Foi obtido 100 por cento de sensibilidade e especificidade para a deteccao da producao de MBL por disco aproximacao utilizando acido mercaptopropionico como IMBL, em combinacao com ceftazidima e imipenem, para P. aeruginosa e Acinetobacter spp., respectivamente. A tecnica de disco combinado utilizando imipenem e EDT A apresentou os mesmos resultados para detectar enterobacterias produtoras de MBL, considerando-se como ponto de corte o aumento de pelo menos 5,0 mm na zona de inibicao do crescimento bacteriano. Conclusoes: Nossos resultados indicam que ambos os metodos fenotipicos para a deteccao de MBL, disco aproximacao e disco combinado, devem ser escolhidos apos a identificacao da bacteria-teste. Adicionalmente, devem ser considerados a prevalencia local de bacterias que apresentem este determinante de resistencia, assim como a habilidade de tecnicos especializados em interpretar corretamente a inibicao de MBL / The emergence of metallo-β-lactamase (MBL)-producing isolates is a challenge to routine microbiology laboratories, since there are no standardized methods for detecting such isolates. The aim of this study was to evaluate the accuracy of different phenotypic methods to detect MBL production among Pseudomonas, Acinetobacter spp and enterobacterial isolates, including GIM-, IMP-, SIM-, SPM-, and VIM- variants. A total of 46 genetically unrelated P. aeruginosa, P. putida, Acinetobacter spp. and enterobacterial strains producing distinct MBLs were tested. Nineteen strains were included as negative controls. The inhibition of bacterial growth and β-lactam hydrolysis caused by MBL-inhibitors (IMBL) were also evaluated. The isolates were tested for MBL production by both double disk synergy test (DDST) and combined disk (CD) using imipenem and ceftazidime as substrates in combination with distinct IMBL. One hundred percent sensitivity and specificity was achieved by DDST using 2-mercaptopropionic acid in combination with ceftazidime and imipenem for detection of MBL production among P. aeruginosa and Acinetobacter spp. isolates, respectively. CD showed the same results for detecting MBL-producing enterobacteria by combining imipenem and EDTA with a 5.0 mm breakpoint increase in the inhibition zone. Our results indicate that both phenotypic methods to detect MBL-producing isolates should be based on the genera to be tested regardless of the enzyme produced by such isolates as well as the local prevalence of MBL producers and on the ability of specialized technicians to correctly interpret MBL inhibition. / FAPESP: 2006/07197-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No Hospital São Paulo, um hospital terciario de 600 leitos, a presenca de P. aeruginosa produtora de metalo-β-lactamase tem sido encontrada desde 2000 (a primeira, SPM-1, foi isolada em 1997). Durante a periodo entre 2000 e 2001, 25 das 128 amostras avaliadas produziam SPM au IMP (88 por cento e 12 por cento das P. aeruginosa resistentes a imipenem, respectivamente). Durante o ano de 2004, as 10 primeiras amostras consecutivas de P. aeruginosa isoladas par mes foram selecionadas para a producao de MβL. Um total de 120 isolados foram submetidas ao teste de hidro1ise contra imipenem, PCR para a identificacao do gene de MβL seguido de sequenciamento de DNA. Todos as isolados produtores de IMP foram avaliados para a presenca de integrons de c1asse 1. A similaridade genetica dos isolados produtores de MβL foram avaliados pelo PFGE. Entre os 120 isolados de P. aeruginosa, 46 (38,1 por cento) foram capazes de hidrolizar imipenem. 0 sequenciamento dos amplicons demonstrou que 20 por cento dos 80 por cento dos isolados de P. aeruginosa carreavam blaIMP-1 e blaSPM-1, respectivamente. Todos os isolados produtores de IMP-1 pertenciam ao mesmo clone, enquanto os isolados produtores de SPM-1 apresentaram uma grande diversidade genetica. A analise dos dados c1inicos dos pacientes que apresentaram infeccao por P. aeruginosa mostrou que a urina parece ter um papel importante na aquisicao de P. aeruginosa resistentes a carbapenemicos no Hospital São Paulo e que o uso previa de carbapenemicos e um fator de risco importante na aquisicao de amostras produtoras de MI3L. Os dados sugerem que as medidas de prevencao de disseminacao de P. aeruginosa carreadoras de MβL no Hospital São Paulo no ano de 2004 foram ineficazes / At Hospital São Paulo, a 600-bed tertiary care university hospital, the presence of metallo-β-lactamase producing P. aeruginosa has been detected since 2000 (the first strain, a SPM producer, was isolated in 1997). During the 2000-2001 period, 25 of 183 evaluated strains produced SPM or IMP (88% and 12% of the imipenem-resistant P. aeruginosa, respectively). During 2004, the 10 first consecutive imipenem resistant P. aeruginosa strains isolated monthly were screened for the production of MβL. A total of 120 isolates were submitted to hydrolysis test against imipenem, PCR for described MßL genes, and DNA sequencing. IMP-producing isolates were further evaluated with primers targeting class 1 integrons. The genetic relatedness of MßL-producing isolates was evaluated by PFGE. Among the 120 P. aeruginosa isolates, 46 (38,1%) were able to hydrolyze imipenem. Sequencing of the amplicons showed that 20% and 80% of the P. aeruginosa isolates carried blaIMP-1 and blaSPM-1, respectively. All IMP-1-producingisolates belonged to the same genotype, while the SPM-1-producing isolates showed a great genetic diversity. Analysis of the clinical data of patients with P. aeruginosa infections reveals that the urinary site seems to be important in the acquisition of carbapenem-resistant P. aeruginosa at Hospital São Paulo and that the previous use of carbapenens is an important risk factor for the acquisition of MßL-producing strains. These data show that the nosocomial infection control measures for prevention of dissemination of P. aeruginosa carring MßL in patients hospitalized at Hospital São Paulo in 2004 were not effective. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

VALENTE, Livia Gurgel do Amaral. Identificação de melanina em cepas clínicas e ambientes de Burkholderia pseudomallei e atividade in vitro do farnesol como inibidor de ß-lactamases. 2012. 81 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-08-12T16:03:59Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-08-12T16:04:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-12T16:04:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_lgavalente.pdf: 2099115 bytes, checksum: 202d0f130cefb452d49f8b0f3f7f0594 (MD5) Previous issue date: 2012 / Burkholderia pseudomallei é um bacilo Gram-negativo causador da melioidose uma doença infecciosa severa e geralmente fatal, a qual pode ser adquirida através da inoculação, inalação e ingestão do microrganismo que se encontra distribuído no ambiente. No Brasil a melioidose é considerada uma doença emergente descrita pela primeira vez em 2003 no Nordeste brasileiro O presente estudo consistiu em identificar o gene hppD que codifica a produção de um precursor importante na síntese de melanina e avaliar fenotipicamente a produção do pigmento em cepas de B pseudomallei através de meios contendo substratos fenólicos. Aliado ao estudo foi realizada a comparação do perfil de sensibilidade e curva de morte entre cepas melanizadas e não melanizada ante ao imipenem além da avaliação da possível ação do sesquiterpeno farnesol como um inibidor de β-lactamases Os isolados utilizados no estudo pertencem ao Laboratório de Patógenos Reemergentes e Emergentes-LAPERE UFC Para o cumprimento da metodologia as cepas foram recuperadas do estoque realizado a extração de DNA e a identificação do gene hppD através de reação de PCR A expressão fenotípica de melanina foi avaliada através de subcultivos em meio Brain Heart infusion (BHI) acrescido de ácido caféico. O teste de sensibilidade com cepas melanizadas e não melanizadas foi realizado utilizando-se o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo CLSI segundo documento M07-A8 A curva de morte foi realizada a partir da incubação do inóculo com imipenem no intervalo de 0,125 µg/ mL a 0,5 µg/ mL por 1 e 2 horas, seguida da contagem das colônias A avaliação do farnesol como um possível inibidor de β-lactamases foi realizada através da combinação in vitro do farnesol com antibióticos β-lactâmicos (amoxicilina ampicilina oxacilina imipenem amoxicilina-ácido clavulânico utilizando-se o teste de microdiluição em caldo. O gene hppD foi detectado em todas as cepas de B pseudomallei testadas além da produção de pigmento em meios contendo substratos fenólicos Em relação ao perfil de sensibilidade as cepas não melanizadas e melanizadas apresentaram o mesmo valor de CIM porém as cepas melanizadas demonstraram maior capacidade de sobrevivência quando em contato com a droga do que as cepas não melanizadas. Em relação ao farnesol todas as cepas testadas foram inibidas por este composto com CIM variando de 75 a 150µM Dentre as combinações dos β-lactâmicos testadas com farnesol, todas as drogas apresentaram redução estatisticamente significativa: amoxicilina (p=0,0001) amoxicilina-ácido clavulânico (p=0,0005), ampicilina (p=0,0026), oxacilina (p=0,0001) e imipenem (p=0,0105). Por fim as combinações com amicacina e gentamicina não apresentaram redução estatisticamente significativa pois os aminoglicosídeos praticamente repetiram seus valores quando combinados com farnesol Esse estudo abre perspectivas acerca de um novo fator de virulência melanina ainda não descrita para B pseudomallei, além do sesquiterpeno farnesol como um possível inibidor de β-latamases nessa espécie.

MARTINS, Michelle Freitas. Caracterização clínica, hematológica e molecular dos adultos com β talassemia no Ceará. 2010. 84 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-22T15:45:29Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_mfmartins.pdf: 2051486 bytes, checksum: 4814e2ffcebed41f58aba297f0cf6f41 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T14:22:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_mfmartins.pdf: 2051486 bytes, checksum: 4814e2ffcebed41f58aba297f0cf6f41 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T14:22:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_mfmartins.pdf: 2051486 bytes, checksum: 4814e2ffcebed41f58aba297f0cf6f41 (MD5) Previous issue date: 2010 / Background: Beta thalassemia is a group of disorders, each resulting from a genetic defect in the rate of synthesis of one or more globin chains of hemoglobin (Hb). The imbalance in the production of globin chains can result in ineffective erythropoiesis, insufficient production of hemoglobin, hemolysis and anemia of varying degree. Beta thalassemia is more common in countries bordering the Mediterranean Sea, reflecting the participation of these peoples in the formation of the Brazilian population. The predominant mutations in Brazil are the IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 and CD 39, which are associated with different clinical conditions and are mostly regionally specific. Objective: To characterize the clinical, hematological and molecular adults with beta thalassemia of the University Hospital Cantídeo Walter and followed at a referral center for Hematology of the state of Ceará (Hemoce). Methods: We analyzed 22 individuals with beta thalassemia, 7 intermediate and 15 minor, in both sexes, from February 2008 to September 2009. Clinical data and laboratory tests: blood count, levels of Hb A2 and Hb F, serum iron, total capacity and latent iron binding (CTLFe, CLLFe), ferritin and transferrin saturation index (IST) were obtained from medical records, diagnosis. About 5 mL of venous blood was collected in tubes containing EDTA anticoagulant for molecular study. The analysis of mutations was performed using the technique of chain reaction mediated by allele specific polymerase (PCR-AE), where we analyzed the following mutations: IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 and CD 39. Statistical analysis was carried out in software R (version 2.7.0) and the level of significance was 5%. Results: Of 22 patients studied, 15 were patients with β thalassemia minor and seven intermediate. The age ranged 18-68 years with a mean of 44.7 years. 18.2% male and 81.8% female. The mutations were characterized in 68.2% of cases, which had the most frequent IVS-I-6, followed by the codon 39. The mutation IVS-I-1 was found in one patient and IVS-I-110 was not found. There was no significant clinical differences between the hematological and biochemical parameters. There was a discrepancy between phenotype and genotype in some patients, but no significant difference between mutations and clinical manifestations. Conclusions: The results of this study reinforce the dominance of the mutation IVS-I-6 in northeastern Brazil. Are recommended further studies to investigate the co-inheritance with α-thalassemia in these patients to justify the discrepancy between genotypes and phenotypes. / Introdução: A beta talassemia é um grupo de distúrbios, cada um resultando de um defeito genético, na velocidade de síntese de uma ou mais cadeias globínicas da hemoglobina (Hb). A desproporção na produção das cadeias globínicas pode resultar em eritropoese ineficaz, produção insuficiente de Hb, hemólise e anemia de grau variado. A beta talassemia é mais frequente nos países banhados pelo mar Mediterrâneo, refletindo a participação desses povos na formação da população brasileira. As mutações predominantes no Brasil são a IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 e o CD 39, as quais estão associadas a diversos quadros clínicos e são, em sua maioria, regionalmente específicas. Objetivo: Caracterizar o perfil clínico, hematológico e molecular dos indivíduos adultos com beta talassemia do Hospital Universitário Walter Cantídeo, em acompanhamento no centro de referência de Hematologia e Hemoterapia do estado do Ceará (HEMOCE). Metodologia: Foram analisados 22 indivíduos portadores de beta talassemia, sendo 7 intermediária e 15 menor, de ambos os sexos, no período de fevereiro de 2008 a setembro de 2009. Os dados clínicos e laboratoriais: hemograma, níveis de Hb A2 e de Hb F; ferro sérico; capacidade total e latente de ligação do ferro (CTLFe, CLLFe), ferritina e índice de saturação da transferrina (IST), foram obtidos dos prontuários, ao diagnóstico. Cerca de 5 mL de sangue venoso foi coletado em tubo contendo o anticoagulante EDTA para o estudo molecular. A análise das mutações foi realizada por meio da técnica da reação em cadeia mediada pela polimerase alelo específico (PCR-AE), onde foram analisadas as seguintes mutações: IVS-I-1, IVS-I-6, IVS-I-110 e o CD 39. As análises estatísticas foram desenvolvidas no software livre R (versão 2.7.0) e o nível de significância estabelecido foi 5%. Resultados: Dos 22 pacientes estudados, 15 eram portadores de β talassemia menor e sete intermediária. A idade variou de 18 a 68 anos, com média de 44,7 anos. 18,2 % do sexo masculino e 81,8% do sexo feminino. As mutações foram caracterizadas em 68,2% dos casos, que teve como mais frequente a IVS-I-6, seguida do códon 39. A mutação IVS-I-I foi caracterizada em um paciente e a IVS-I-110 não foi encontrada. Não houve diferença clínica significante entre os parâmetros hematológicos e bioquímicos. Houve discrepância entre o fenótipo e o genótipo em alguns pacientes, porém não houve diferença significativa entre as mutações e as manifestações clínicas. Conclusões: Os resultados do presente estudo reforçam o predomínio da mutação IVS-I-6 no nordeste do Brasil. Recomendam-se estudos posteriores para investigação da co-herança com a α talassemia nesses pacientes para justificar a discrepância entre genótipos e fenótipos.

Neste trabalho foi desenvolvido um novo bioprocesso para a síntese de lactosacarose, um candidato a prebiótico. A lactosacarose foi produzida por transgalactosilação, catalisada pela β-galactosidase de Bacillus circulans imobilizada em macroesfera de quitosana, utilizando a lactose e a sacarose como substratos. No processo de imobilização, os resultados indicam que a melhor razão entre a concentração de enzima e de suporte foi de 200 mg.g-1. A estabilidade térmica da enzima imobilizada foi determinada e comparada com a estabilidade térmica da enzima livre em temperaturas de 50, 60 e 70 °C e para esta última foi verificada a estabilidade na presença e ausência de substrato. A imobilização aumentou de 10 a 260 vezes a estabilidade térmica da enzima, sendo este efeito inversamente relacionado com a temperatura. A otimização das condições de produção indica, para a β-galactosidase imobilizada e livre, que a melhor condição de produção de lactosacarose e de oligossacarídeos totais, ocorre na temperatura de 30 °C e pH 7,0. Nesta condição, após 24 h, foi alcançada a produção de 79 g.L-1 de lactosacarose, 35 g.L-1 de galacto-oligossacarídeos (GOS) e 260 g.L-1 de oligossacarídeos totais. O processo de imobilização possibilitou a reutilização da enzima imobilizada por 30 ciclos, mantendo aproximadamente 95% da concentração inicial de lactosacarose, GOS e oligossacarídeos totais produzidos inicialmente. Portanto, o bioprocesso de imobilização de β-galactosidase de Bacillus circulans em macroesfera de quitosana pode ser considerado um potencial catalisador para produção industrial de lactosacarose. / This work developed a new process for the synthesis of lactosucrose, a candidate for prebiotic. The lactosucrose was produced by transgalactosylation that was catalyzed by a Bacillus circulans β-galactosidase immobilized on macrospheres of chitosan using lactose and sucrose as substrates. In the process of immobilization, the results indicate that the best ratio of the concentration of enzyme and carrier was 200 mg.g-1. The thermal stability of the immobilized enzyme was determined and compared with the thermal stability of the free enzyme at temperatures of 50, 60 and 70 °C and for the latter was verified stability in the presence and absence of substrate. The immobilization increased (10-260 times) the thermal stability of the enzyme, which is inversely related to the temperature. The results of the experiment optimization of lactosucrose production conditions indicate point out that, for free and immobilized β-galactosidase, the best condition lactosucrose production and total oligosaccharides occurs at a temperature of 30 °C and pH 7.0. In this condition, after 24 h, producing 79 g.L-1 lactosucrose was reached, 35 g.L-1 galactooligosaccharides (GOS) and 260 g.L-1 of total oligosaccharides. The immobilization process enabled the reuse of immobilized enzyme for 30 cycles, maintaining approximately 95% of the initial concentration of lactosucrose, GOS and total oligosaccharides produced initially. Therefore, the bioprocess of β-galactosidase from Bacillus circulans immobilization on macrospheres of chitosan can be considered a potential catalyst for industrial.

A resistência das bactérias aos antibióticos é um problema recorrente que dificulta o tratamento de infecções causadas por bactérias. Alguns membros da família Enterobacteriaceae são responsáveis por carrear e disseminar diferentes mecanismos de resistência, entre estes está a capacidade de algumas bactérias em produzir enzimas como as β-lactamases. Tendo em vista esta problemática o objetivo do presente estudo foi detectar/identificar através de análises fenotípicas e genotípicas quais os genes de resistência presentes em amostras ambientais. Para tanto os primeiros ensaios realizados foram os fenotípicos: teste de Hodge Modificado (MHT), testes com inibidores como ácido fenilborônico (APB), EDTA e cloxacilina, e o teste confirmatório para Extended-Spectrum β-lactamase (ESBL). Foram isoladas 131 amostras as quais passaram por uma triagem inicial através do antibiograma, utilizando os antimicrobianos: cefotaxima (30μg), cefpodoxima (10μg), ceftazidima (30μg), ertapenem (10μg), meropenem (10μg), aztreonam ( 30μg). Destas, 62 amostras foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano as quais foram submetidas aos demais testes fenotípicos. Os resultados mostram que 40 amostras apresentaram perfil positivo para pelo menos um dos testes fenotípicos. Estas 40 amostras foram submetidas a PCR Multiplex para detecção e caracterização dos principais genes de resistência à β-lactamases: β-lactamase de espectro extendido (ESBL), Carbapenemase e β-lactamase AmpC. Uma vez detectado os genes, foi realizado o sequenciamento dos amplicons para confirmação da presença dos mesmos A relação clonal foi estabelecida utilizando XbaI através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE). Os resultados mostraram que em 85% dos isolados foi detectada a presença de genes de resistência, dentre os quais observamos as seguintes espécies: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae. A prevalência foi para os genes de β-lactamases com 77,5% (TEM, SHV e CTX-M) seguido por Carbapenemase (KPC e GES) com 45% e AmpC (ACT/MIR) com 2,5%. Este foi o primeiro relato desses genes de resistência em isolados ambientais no município de Porto Alegre/RS. Oito amostras apresentaram três genes de resistência, quatorze amostras dois e 12 com um gene cada. A análise da eletroforese em campo pulsado mostrou uma relação clonal entre alguns isolados de K. pneumoniae que foram separados em três grupos diferentes (K1, K2, K3). Entre os isolados de Enterobacter sp. não foi possível estabelecer uma relação clonal. Fica claro com o trabalho a ocorrência e a capacidade de disseminação desses genes de resistência em amostras ambientais e o potencial risco à saúde da comunidade em geral, tornando-se um problema de saúde pública. / Bacteria resistant to antibiotics are a recurring problem which makes difficult the treatment of bacterial infections. Some members of the Enterobacteriaceae family are responsible for carrying and disseminating different mechanisms of resistance. Among them are strains which produce enzymes such as β-lactamases. In view of this problem the objective of this study was to detect / identify through phenotypic and genotypic analysis which resistance genes present in environmental isolates. For this the first trials were the phenotypic assys: Hodge test Modified (MHT), tests with inhibitors such as phenylboronic acid (APB), EDTA and cloxacillin, and confirmatory test for Extended-Spectrum β-lactamase (ESBL). In the first screening 131 isolates were submitted to antibiogram using following antimicrobials: cefotaxime (30μg), cefpodoxime (10mg), ceftazidime (30μg), ertapenem (10mg), meropenem (10mg), aztreonam (30μg). Out of 62 isolates were resistant to at least one antimicrobial were submitted to other phenotypic tests. The results show that 40 isolates show a positive profile for at least one phenotypic test. These 40 isolates were submitted to Multiplex PCR for detection and characterization of the major resistance genes for β- lactamases: β-lactamase extended spectrum (ESBL), carbapenemase and β- lactamase AmpC. Once detected the genes, the sequencing of amplicons were performed in order to confirm the presence of the genes. The clonal relationship was established using XbaI endonuclease using Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The results showed that in 85% of the isolates the presence of resistance genes was detected, among which we observed the following species: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae The prevalence was for the β-lactamase gene with 77.5% (TEM, SHV and CTX-M) followed by carbapenemase (KPC and GES) with 45%, and AmpC (ACT / MIR) with 2.5%. This was the first report where these resistance genes were detected in environmental isolates in the city of Porto Alegre/RS. Eight isolates had three resistance genes, fourteen isolates two genes and 12 with one gene. The analysis of pulsed field gel electrophoresis showed a clonal profile among some K. pneumoniae strains which were separated into three groups (K1, K2, K3). Among Enterobacter sp. strains it was not possible to establish a clonal profile. It is clear from the work the occurrence and the ability of disseminate these resistance genes among environmental isolates and the potential health risk to the community and so becoming a public health problem.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-25T13:17:10Z No. of bitstreams: 1 2015_CleberNunesKraus.pdf: 1128389 bytes, checksum: 051f55661eecbb72c783643adbafa38b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-26T14:48:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CleberNunesKraus.pdf: 1128389 bytes, checksum: 051f55661eecbb72c783643adbafa38b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T14:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CleberNunesKraus.pdf: 1128389 bytes, checksum: 051f55661eecbb72c783643adbafa38b (MD5) / O pulso de inundação é a principal força estruturadora ambiental e biológica das planícies alagáveis, mas nem sempre é capaz de homogeneizar os ambientes ao longo de um gradiente espacial e/ou ambiental de conexão. Os regimes hidrológicos controlam o funcionamento dos ecossistemas aquáticos, gerando fases distintas com características distintas, porém, o ciclo de enchente e seca sazonal, não gera sempre uma homogeneização das características ambientais e biológicas da comunidade fitoplanctônica como sugerido por outros autores. Essa heterogeneidade leva a um alto índice de diversidade beta. A diversidade beta é uma das medidas mais importantes para a compreensão do funcionamento dos ecossistemas. Uma das formas mais simples de mensurá-la é uma medida de dissimilaridade biológica entre locais. Existem diferentes métodos para se avaliar essa dissimilaridade, mas todos se concentram em separar a dissimilaridade causada por turnover da dissimilaridade causada pelo aninhamento. Como estes fenômenos levam em conta fatores espaciais e ambientais, eles também podem ajudar na avaliação da estrutura de metacomunidades. Neste trabalho, avaliamos a influência do pulso de inundação na homogeneização das características físicas e químicas da planície e avaliamos a diversidade beta da comunidade fitoplanctônica em dois ambientes lacustres desta planície. Avaliamos também, a importância dos fatores ambientais e espaciais na estruturação da comunidade fitoplanctônica. Nosso trabalho mostra, de forma surpreendente, que períodos de águas baixas e vazante são igualmente heterogêneos, ou seja, não há uma homogeneização das características, embora elas sejam diferentes para os períodos. Mostraram que fatores ambientais e espaciais são importantes na estruturação da diversidade beta, mas que a resposta que eles podem dar depende da escala adotada para o estudo. Por fim, foi evidenciado que diferentes escalas revelaram diferentes padrões na estruturação das metacomunidades. Esses resultados destacam a importância de compreender melhor os processos que afetam a dinâmica hidrológica da planície amazônica e as interações que ocorrem entre as várzeas que compõe esta região, com a biota local e os eventos climáticos extremos. / The flood pulse is not a force that always cause the homogenization of characteristics in floodplain environments. The hydrological regimes control the functioning of aquatic ecosystems, generating distinct phases with different characteristics, however, the flood cycle and seasonal drought, not always generates a homogenization of environmental and biological characteristics of the phytoplankton community as suggested by other authors. This heterogeneity leads to a high beta diversity index. The beta diversity is one of the most important measures for understanding the functioning of ecosystems. One of the simplest ways to look at, is as a measure of biological dissimilarity between sites. There are different methods to evaluate this dissimilarity, but all focus on separating the divergence caused by turnover of dissimilarity caused by nestedness. As these phenomena take into account spatial and environmental factors, they can also help us in understand the metacommunity structure. We evaluate the influence of the flood pulse in homogenization the physical and chemical characteristics of flooplain and evaluate the beta diversity of phytoplankton in two lakes in this floodplaine. We evaluate also the importance of environmental and spatial factors in the structuring of phytoplankton community. Our work shows, surprisingly, that the low-water and low tide are also heterogeneous, there is not a homogenization of the features, although they are different for the periods. Showed that environmental and spatial factors are important in structuring the beta diversity, but the answer they can give depends on the scale adopted for the study. Finally, it was evident that different scales revealed different patterns in structuring metacommunities. These results highlight the importance of better understanding the processes that affect the hydrological dynamics of Amazonian floodplain systems and the interactions that occur between the floodplain that make up this region with the local biota and climate extremes.

β-glicosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações β-glicosídicas, e diversas aplicações biotecnológicas são postuladas para β-glicosidases microbianas. Este estudo apresenta a triagem de substratos para a produção de uma β-glicosidase extracelular por Monascus purpureus NRRL1992 em cultivo submerso, bem como a purificação parcial e a caracterização da enzima. A produção da enzima demonstrou ser indutível e controlada por repressão catabólica. A maior produção de β-glicosidase foi observada com a utilização de resíduo de uva e peptona como substratos. A purificação parcial da β-glicosidase envolveu a precipitação com acetona e etapas de cromatografia líquida (gel-filtração e interação hidrofóbica), resultando em fator de purificação de 92 vezes e recuperação de 23% a partir do extrato bruto. A enzima apresentou atividade ótima em amplas faixas de temperaturas e pHs frente ao substrato p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG), sendo selecionadas as condições de 50 °C e pH 5,5. A β-glicosidase demonstrou ser moderadamente termoestável, apresentando atividade residual de 78% após 120 minutos a 60 °C. Os íons Hg2+ e Cr3+ inibiram a atividade β-glicolítica, provavelmente através de modificações estruturais da enzima. β-mercaptoetanol, SDS, entre outros reagentes não afetaram a catálise. Etanol ou metanol em baixas concentrações estimularam a atividade enzimática, possivelmente devido à atuação da enzima como glicosiltransferase; contudo, o aumento na concentração destes álcoois reduziu a atividade enzimática. A hidrólise de pNPβG, celobiose, maltose, salicina e n-octil-β-D-glicopiranosídeo indica a ampla especificidade da enzima frente à diferentes substratos. As constantes cinéticas Km e Vmax foram definidas para pNPβG, celobiose e maltose, sendo observados valores intermediários para β-glicosidases. Glicose e celobiose inibiram competitivamente a hidrólise de pNPβG. / β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis. β-glucosidases are enzymes that catalyse the hydrolysis of β-glycosidic linkages, and various biotechnological applications are proposed for microbial β-glucosidases. This study presents the screening of substrates for extracellular β-glucosidase production by Monascus purpureus NRRL1992 in submerged cultivations, as well as the enzyme partial purification and caracterization. The enzyme production showed to be inducible and controled by catabolic repression. The higher β-glucosidase production was observed with grape residue and peptone as substrates. The β-glucosidase partial purification involved acetone precipitation and liquid chromatography steps (gel-filtration and hydrophobic interaction), resulting in a 92-fold purification factor and a recovery of 23% from the crude extract. The enzyme showed optimal activity in a wide range of temperatures and pH values for p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside (pNPβG) hydrolysis.