A celulose é o biopolímero de maior abundância no mundo e tem potencial para se tornar fonte de energia renovável através de sua transformação em açúcares fermentáveis, que por sua vez serão transformados em etanol. A recalcitrância da celulose, principal dificuldade encontrada no processo, pode ser superada com o auxílio de enzimas (celulases). Ao menos três enzimas celulolíticas são necessárias para a degradação total da celulose, incluindo as celobioidrolases, que hidrolisam as ligações glicosídicas das extremidades redutoras e não redutoras da cadeia, as endoglucanases, que clivam a cadeia de celulose amorfa randomicamente, e as beta-glicosidases, que produzem glicose através dos celo-oligômeros. Mas para que esse processo se torne financeiramente viável é necessário conhecer o funcionamento, otimizar a atividade e aumentar a produção dessas celulases. Com o intuito de avançar na compreensão da função e estrutura dessas enzimas, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de beta-glicosidases da família GH1 e endoglucanases da família GH5. Na primeira parte do trabalho, a expressão da endoglucanase II de Trichoderma reesei não foi alcançada, mesmo utilizando diferentes organismos e condições de expressão. Porém, na segunda etapa, foi obtida a expressão, purificação e os primeiros ensaios de cristalização de 11 beta-glicosidases bacterianas da família GH1 e 8 endoglucanases bacterianas da família GH5. Dentre elas, três beta-glicosidases e uma endoglucanase de Bacillus licheniformis foram cristalizadas e tiveram sua estrutura resolvida. As beta-glicosidases, apesar de possuírem o enovelamente similar, apresentaram variações no tamanho e posição das alças formadoras da fenda catalítica e divergem em relação a um dos aminoácidos importantes para a estabilização do substrato. Essas diferenças podem ajudar a explicar o mecanismo dessas enzimas para reconhecer substratos distintos. A endoglucanase da família GH5, possuindo dois módulos acessórios, foi cristalizada tanto na forma apo quanto complexada ao substrato celotetraose. O segundo módulo acessório possivelmente é um domínio de ligação à celulose (CBM) e seus resíduos aromáticos, que são responsáveis pela interação com o substrato, parecem complementar o sítio catalítico, sendo assim um novo mecanismo de auxílio enzimático de um CBM. O primeiro módulo acessório não possui um aparente sítio de interação com carboidratos e provavelmente funciona como um conector entre domínio catalítico e o CBM. O posicionamento do substrato no sítio de ligação é parecido com outras estruturas já determinadas, porém, suscita algumas dúvidas sobre a função dos resíduos catalíticos que é conservada na família. O carbono anomérico do substrato possui uma densidade eletrônica contínua com o glutamato da fita β4 (que deveria ser o ácido/base) e está mais próximo dele que do glutamato da fita β7 (que deveria ser o nucleófilo). / Cellulose is the most abundant biopolymer in the world and can become a renewable energy source through its transformation in fermentable sugars, which will be converted in bioethanol. The cellulose recalcitrance, main difficulty in the process, can be overcome with the aid of enzymes (cellulases). At least three cellulolytic enzymes are required for complete hydrolysis of cellulose, including cellobiohydrolases for hydrolyzing the glycosidic linkages from the reducing and non-reducing chain ends, endoglucanases for randomly cleaving cellulose chains in the amorphous regions, and beta-glucosidases for producing glucose from the solubilized cello-oligomers. But, to become a financially viable process it is necessary to know the mechanism, optimize the activity and improve the production of these cellulases. In order to advance the understanding of the structure and function of these enzymes, the present work intended to study the structure of beta-glucosidases from family GH1 and endoglucanases from family GH5. In the first part of the work, the expression of endoglucanase II from Trichoderma reesei was not achieved, even using different organisms and expression conditions. However, in the second part, the expression, purification and the crystallization first trials of eleven bacterial beta-glucosidases and eight bacterial endoglucanases were achieved. Among them, three beta-glucosidases and one endoglucanase from Bacillus licheniformis were crystallized and had their structures solved. Beta-glucosidases, although having a similar folding, showed variations in the length and position of the loops that form the catalytic cleft and diverge in relation to one of the amino acids that are important in substrate stabilization. These differences may help explain the mechanism of these enzymes to recognize distinct substrates. The endoglucanase, which has two accessory modules, was crystallized in the apo form and complexed with the substrate celotetraose. The second accessory module probably is a cellulose binding domain (CBM) and its aromatic residues, which are responsible for the substrate interaction, seem to complement the catalytic site. Therefore it can be a new mechanism of CBM assistance in the enzymatic activity. The first accessory module has no apparent interaction site with carbohydrates and probably works as a connector between the catalytic domain and CBM. The positioning of the substrate in the binding site is similar to other structures already solved but raises some questions about the role of the catalytic residues, that are conserved in the family. The anomeric carbon of the substrate has a continuous electron density with glutamate from sheet-β4 (which should be the acid/base) and is closer to it than to glutamate from sheet-β7 (which should be the nucleophile).

A integração de fatores contemporâneos locais e procesos biogeográficos fornece uma visão ampla e promissora a respeito da diversidade de espécies e seus padrões de diversidade. Utilizando ferramentas recentes para análises espaciais, eu integro fatores históricos e contemporâneos para analisar a distribuição e beta diversidade espécies de anuros do Cerrado. Forneço informações atualizadas a respeito da composição e distribuição das espécies de anuros no Cerrado, com base em um extensivo levantamento em coleções zoológicas e estudos de campo. Analiso a distribuição e beta diversidade em um contexto histórico, enfocando as relações do Cerrado com seus domínios vizinhos, e suas condições ambientais. Registrei 204 espécies de anuros no Cerrado, das quais 50% são endêmicas. Espécies que ocorrem no Cerrado e mais um domínio apresentam alta estruturação espacial, na qual espécies amazônicas estão restritas à porção noroeste e as espécies atlânticas estão restritas à porção sudeste do Cerrado. Registrei espécies endêmicas em quase todas as localidades e em todas as regiões, enquanto espécies de distribuição restrita ocorrem apenas em regiões montanhosas no centro, sudeste e sudoeste do Cerrado. Gêneros originado na Mata Atlântica e Amazonia estão distribuídos em um padrão de \"tabuleiro de xadrez\" dentro do Cerrado, e co-ocorrem menos do que seria esperado ao acaso. Essa estruturação espacial no Cerrado é influenciada pela ação combinada das condições ambientais e restrições históricas: gêneros atlânticos estão predominantemente distribuídos em áreas de montanha, com baixa precipitação e próximas ao limite com a Mata Atlântica, enquanto gêneros amazônicos estão distribuídos em vales mais próximos ao limite com a amazônia. Da mesma forma, os padrões de beta diversidade no Cerrado parece estar fortemente influenciados pelos gradientes ambientais, uma vez que metade da dissimilaridade na composição de espécies entre taxocenoses foi explicada por estes preditores. Espécies endêmica responderam às condições ambientais regionais de forma mais intensa que todas as espécies em conjunto. A resposta das espécies endêmicas parece estar relacionada na similaridade do ambiente em que ocorrem em relação aos domínios vizinhos, uma vez que suas espécies-irmãs estão principalmente distribuídas por estas regiões. Meus resultados reforçam a importância de se considerar a história biogeográfica das linhagens nas análises dos padrões regionais de disversidade. Demonstro também que a heterogeneidade na distribuição das espécies de anuros pode ter uma base histórica, que interage com restrições atuais, como o clima, disponibilidade de habitat e interações ecológicas na montagem de comunidades. / Integrating local contemporary factors and biogeographic processes allows a promising and broad view on species diversity and distribution patterns. Building on the development of new tools for spatial analysis, I integrate historical and contemporary factors that may explain species distribution and beta diversity patterns of anuran amphibians in Brazilian Cerrado. Especifically, I update information about species composition and distribution of anurans in the Cerrado, based on an extensive search in zoological collections and fieldwork. I analyze distribution and beta diversity in a historical framework, focusing on the relationship of the Cerrado with its adjoining domains, and its environmental conditions. I found 204 anuran species occurring within the Cerrado, from which 50% are endemics. Species occurring in the Cerrado and one more domain present a highly structured spatial pattern, in which Amazonian species are restricted to the northwestern part of the Cerrado and Atlantic species are restricted to the southeastern part. I found Cerrado endemics in most of the localities, in all regions, whereas narrow endemics are restricted to mountain ranges in central, southeastern, and southwestern Cerrado. Cerrado anuran genera originated in Atlantic Forest and Amazon are distributed in a checkerboard pattern, and co-occur less than it would be expected by chance. This spatial structure within the Cerrado is influenced by the interplay of environmental conditions and historical constrains: Atlantic genera are mostly distributed in mountainous and upland areas, with low precipitation and closer to the boundaries of Atlantic Forest, whereas Amazonian genera are distributed in valleys closer to the boundaries of the Amazon. Similarly, patterns of beta diversity in the Brazilian Cerrado appear to be strongly influenced by the environmental gradients, since half of the dissimilarity in species composition was explained by these predictors. Endemic species responded to regional environmental conditions stronger than all species. Endemics may be responding to environment based on how similar they are to the conditions of adjoining phytogeographical domains, since their sister-species are mostly distributed in these regions. My results reinforce the importance of taking biogeographical history into account when analyzing spatial patterns of species diversity at a regional scale. I also show that the heterogeneity in anuran distribution in the Cerrado may have a historical basis, which interacts with present-day constraints, such as climate, habitat availability and ecological interactions, to shape local and regional assemblages.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T05:00:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bezerra_MarcosAndreCavalcanti_M.pdf: 1651250 bytes, checksum: efe8b98a0acb6f960292cb82199b3ee2 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A talassemia ß é uma doença hereditária freqüente da Hb e tem sido encontrada em praticamente todas as populações estudadas. A ocorrência dessas síndromes no Brasil tem sido estudada ao longo do tempo, entretanto, por causa das limitações nas metodologias utilizadas em muitas pesquisas, os dados de prevalência e diversidade são incompletos. Além disso, como conseqüência da composição étnica do nosso país, miscigenada por elementos de origens européia, africana, asiática e indígena, e desigualmente distribuída, a incidência da talassemia pode variar de região para região. Este estudo tem como objetivo mostrar caracteríticas clínicas, bioquímicas e moleculares das síndromes talassêmicas em população do estado de Pernambuco. Foram estudados 117 pacientes não relacionados, sendo 11 diagnosticados com talassemia ß maior, 36 talassemia ß intermediária e 70 com a interação S/ß talassemia, acompanhados na Fundação HEMOPE. A caracterização molecular foi feita por técnicas de PCR e seqüenciamento. A caracterização dos alelos ß talassêmicos revelou 15 diferentes mutações, sendo que 4 delas correspondem a 84,3% dos alelos ß talassêmicos, nas seguintes proporções: 54,9% IVS-I-6 (T-»C), 15,2% IVS-I-5 (G-»C), 7,9% códon 39 (C-»T) e 6,1% IVS-I-1 (G-»A). Foram encontradas outras mutações raras, pela primeira vez descritas no Brasil: IVS-II-849 (A-»G), poli-A (T-»C), - 29 (A-»G), Códon 30 (A-»C), IVS-I-2 (T-»C), IVS-II-837 (T-»G), Códons 106/107 (+G), além das mutações IVS-I-5 (G-»A) e -88 (C-»T). Uma nova mutação foi descrita: códon 12 (-C). Foram encontrados 30 pacientes homozigotos IVS-I-6 (T-»C) e tal mutação mostrou uma forte associação com o haplótipo VI. A mutação IVS-I-5 (G-»C) esteve relacionada ao haplótipo I, diferentemente do encontrado em outras populações (haplótipo VII) em que esta mutação é prevalente, podendo sugerir uma origem diferente para esta mutação no Brasil. A deleção -a3.7 kb esteve presente em 4,2% dos pacientes homozigotos para talassemia ß e em 15,7% dos S/ß tal, enquanto a aaaanti 3.7kb foi encontrada em 5,7% dos S/ß tal. O polimorfismo XmnI esteve presente em 6,1% dos pacientes com ß tal homozigota e em apenas 1,4% dos S/ß tal. Com relação ao alelo UGT1A1, foi visto que pacientes com genótipos (TA)7 / (TA)7 e (TA)7 / (TA)8 apresentaram maiores níveis de bilirrubina não conjugada e parecem ter maior probabilidade de desenvolver colelitíase. No Brasil, embora a composição étnica da população seja heterogênea, as mutações mais comuns são de origem Mediterrânea; Pernambuco pode ser considerado uma exceção já que cerca de 16,0% da população talassêmica possui mutações de origem Asiática e 10,8% são de origem africana. A diversidade de mutações e suas respectivas freqüências diferem do encontrado em outras populações brasileiras já estudadas, como a do Sudeste, onde 4 mutações também respondem pela maioria (97%) dos casos, porém a mutação predominante é a ß039 (C-»T) / Abstract: ß Thalassemia is a frequent inherited disease of the Hb molecule found in the majority of populations and distributed worldwide. The prevalence of this syndrome in Brazil has been studied for a long time, but due to limitations in the methodology of some research, data on prevalence and clinical diversity are not fully complete. Furthermore, as a consequence of our ethnic composition, mixed with an uneven distribuition of European, African, Asian and Indian native populations, the incidence of thalassemia may vary greatly from one region to another. This study aims to show clinical features, and also biochemical and molecular data of our thalassemia syndromes in a population setting of thalassemia patients in the State of Pernambuco. We studied 117 non-related patients, 11 of them with ß thalassemia major, 36 ß with thalassemia intermedia and 70 with the S/ß thalassemia interaction, followed regularly at the Fundação HEMOPE ¿ Recife - Brazil. Molecular characterization was performed by PCR techniques and DNA sequencing. Characterization of ß thalassemia alleles showed 15 different mutations, 4 of which corresponded to 84.3% of the ß thalassemia alleles, in the following proportions: 54.9% IVS-I-6 (T-»C), 15.2% IVS-I-5 (G-»C), 7.9% codon 39 (C-»T) and 6.1% IVS-I-1 (G»A). Other rare mutations were found and for the first time in Brazil, such as: IVS-II-849 (A-»G), poly-A (T?C), -29 (A?G), codon 30 (A-»C), IVS-I-2 (T-»C), IVS-II-837 (T-»G), codons 106/107 (+G), as well as IVS-I-5 (G-»A) and -88 (C-»T) mutations. A new mutation is also described: codon 12 (-C). We found 30 homozygous patients for the IVS-I-6 (T-»C) mutation, which showed a strong association with the ß gene haplotype VI. The IVS-I-5 (G-»C) mutation was related to the ß gene haplotype I, differently from that found in other populations studied (ß haplotype VII) where it is more prevalent, suggesting a different origin for this mutation in Brazil. The -a3.7 kb deletion was present in 4.2% of ß thalassemia homozygous patients and in 15.7% of the S/ß thalassemia patients, whereas the aaaanti3.7kb was found in 5.7% of them. The XmnI polymorphism was present in 6.1% of the homozygous ß thalassemia patients and in only 1.4% of the S/ß thalassemia individuals. In relation to the UGT1A1 allele, we found that patients with genotypes (TA) 7 / (TA) 7 and (TA) 7 / (TA) 8 showed higher levels of non-conjugated bilirrubin and seem to be more prone to developing gall stones. In Brazil, although the ethnic composition is markedly heterogeneous, the most common mutations are of Mediterranean origin; Pernambuco may be a curious exception to this, since around 16.0% of the thalassemia population have mutations of Asian origin and 10.8% of African origin. In conclusion, the diversity of the mutations found and their frequencies greatly differ from those found in other Brazilian populations studied previously, for example in the Southeast where only four thalassemia mutations are responsible for the majority (97%) of the thalassemia cases, although the commonest mutation is the ß039 (C-»T) / Mestrado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Jose Augusto Rosario Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milagre_CintiaDuartedeFreitas_D.pdf: 13975648 bytes, checksum: c19e1f34ffddd6515caebefac654ec04 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As nikkomicinas são um grupo de antibióticos nucleosídeos dipeptídeos isoladas como metabólitos secundários de culturas de Streptomyces sp. Estes compostos são potentes inibidores da quitina sintetase, a enzima que atua na biossíntese da quitina e, exibem atividades fungicidas, inseticidas e acaricidas. Neste trabalho realizamos a síntese enantio- e diastereosseletiva do esqueleto de um análogo do resíduo N-terminal da nikkomicina B que contém três centros assimétricos contíguos através de duas rotas lineares distintas. As etapas chave em ambas as rotas consistiram na redução de compostos carbonílicos mediada por microorganismos e na otimização de reações de a-metilenação direta tipo Mannich para a obtenção de compostos carbonílicos a,b-insaturados. Enquanto a rota A gerou exclusivamente o esqueleto com configuração 3R,4R,5S (98% ee, 11,5% de rendimento global em 7 etapas), pela rota B obtivemos o esqueleto com configuração 3R,4R,5S e 3R,4S,5R (razão diastereoisomérica 1:12, 98% ee, 20% de rendimento global em 6 etapas) / Abstract: Nikkomycins are a group of nucleoside dipeptide antibiotics which have been isolated from Spretpomyces sp cultures as a secondary metabolites. These compounds are potent chitin synthetase inhibitors and they exhibit fungicidal, insecticidal and acaricidal activities. Herein we developed an enantio- and diastereoselective synthesis of a Nikkomycin B analogue skeletal, which contains three stereogenic centers, through two linear and distinct routes. The key steps in both routes consisted in carbonyl compounds reduction mediated by microorganisms and optimizations of direct Mannich-type a-methylenation reactions in order to obtain a,b-unsaturated carbonyl compounds. While the route A gave exclusively the skeletal with 3R,4R,5S configuration (99% ee and 11.5% global yield under 7 steps) the route B gave the skeletal with 3R,4R,5S and 3R,4S,5R configurations (d.r. 1:12, 98% ee and 20% global yield under 5 steps) / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

A utilização de bioativos naturais como ingredientes está em constante expansão na indústria alimentícia, devido ao aumento das exigências pelos consumidores por alimentos mais saudáveis. Por isso, há uma busca constante de tecnologias que possibilitem a incorporação de tais substâncias em alimentos. O β-caroteno é uma substância hidrofóbica, cujos benefícios estão relacionados principalmente à sua ação antioxidante. Devido à sua característica hidrofóbica, a utilização deste pigmento implica em desafios tecnológicos para ser incorporado em formulações alimentícias de base aquosa. Por este motivo, a encapsulação em lipossomas pode ser uma ótima alternativa, devido à capacidade de englobar tais substâncias em sua bicamada lipídica. Além da proteção, essas matrizes encapsulantes podem proporcionar a liberação controlada dos ingredientes encapsulados, bem como aumento de sua biodisponibilidade. O objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar dispersões de lipossomas encapsulando β-caroteno estabilizadas com a adição de hidrocolóides(goma xantana ou mistura de goma xantana e goma guar). O diâmetro médio hidrodinâmico, a distribuição de tamanho das partículas e a morfologia foram avaliadas. Os lipossomas produzidos foram vesículas multilamelares (MLV), as distribuições de tamanho dos lipossomas apresentaram-se heterogêneas e as micrografias revelaram a forma esférica dos lipossomas dispersos no meio aquoso, assim como a integridade da sua bicamada lipídica. Foram realizadas análises de quantificação do β-caroteno e colorimetria instrumental, sendo que todas as dispersões mostraram-se eficientes na preservação do β-caroteno ao longo do período de armazenamento. Os hidrocolóides adicionados foram eficazes no aumento da viscosidade da fase contínua, evitando a agregação das vesículas ao longo do tempo, exceto para dispersão estabilizada com a mistura de goma xantana e goma guar, com 0,15% de goma total. Em relação à adição das dispersões de lipossomas em iogurte, as formulações mostraram-se homogêneas, com ausência de grumos ou qualquer tipo de separação de fases, e também foram aprovados por uma parcela de painelistas na análise sensorial. / The use of natural bioactives as ingredients is in constant expansion in the food industry, due to increasing consumer demands for healthier foods. Therefore, there is a constant search for technologies capable of incorporating such substances in food. β-carotene is a hydrophobic substance, whose benefits are mainly related to its antioxidant action. Because of its hydrophobic characteristics, the use of this pigment implies technical challenges to be incorporated into aqueous-based food formulations. For this reason, encapsulation in liposomes may be a good alternative, because of their ability to incorporate such substances in their lipid bilayer. Besides the protection, these encapsulants matrix can provide controlled release of the encapsulated ingredients, as well as increasing its bioavailability. The objective of this study was to produce and characterize dispersions of liposomes encapsulating β-carotene, which were stabilized with the addition of hydrocolloids: xanthan gum or a mixture of xanthan gum and guar gum. The mean hydrodynamic diameter, distribution of particle size and its morphology were studied. The obtained dispersions were multilamellar vesicles (MLV), the liposomes size distributions were heterogeneous and the micrographs revealed the liposomes spherical shape dispersed in aqueous medium, as well as the integrity of their lipid bilayer. The quantification of β-carotene and instrumental colorimetry analyses indicated the liposomes were efficient in the preservation of β-carotene during the storage period. The hydrocolloids added in the dispersions were highly efficient to increase the viscosity of the continuous phase. Therefore, the hydrocolloids were responsible for the prevention of aggregation of the vesicles during the storage period, except for stabilized dispersion with the mixture of xanthan gum and guar gum, with 0.15% gum total. Regarding the dispersions of liposomes added in yoghurt, the formulations were homogeneous, with absence of lumps or any phase separation, and also have been approved by a significant number of the panelists.

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Anderson Ferreira da Cunha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brugnerotto_AnaFlavia_M.pdf: 5508751 bytes, checksum: b177c8643fd6a6d948194049324253a1 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As síndromes talassêmicas compreendem um grupo heterogêneo de doenças hereditárias em que existe uma redução no ritmo de síntese de uma ou mais cadeias polipeptídicas da hemoglobina. Nas talassemias ß ocorre a supressão total ou parcial da produção de cadeias ß. O estado homozigótico da maioria das variantes genéticas da talassemia ß produz o quadro clínico da talassemia maior. Esses pacientes apresentam acentuada anemia e necessitam de transfusões sanguíneas regulares para sobreviverem. Os indivíduos heterozigotos para a talassemia ß apresentam, com raras exceções, apenas discreta anemia. Existem ainda alguns quadros clínicos não tão graves quanto à forma homozigótica clássica, geralmente não dependem de transfusões, que são denominados de talassemia intermediária. Os genes responsáveis pela síntese das cadeias da ß globina estão organizados em um cluster localizado no braço curto do cromossomo 11. Quase 200 alelos de talassemia ß já foram caracaterizados. Destes, 125 representam mutações pontuais em regiões funcionalmente importantes do gene, uma de particular interesse ao nosso estudo, é a mutação Cd 39 (C--T). Este trabalho teve como objetivo analisar o perfil global de expressão gênica de células CD 34+ de pacientes com talassemia ß, portadores da mesma mutação genética (Cd 39), mas com evoluções clínicas distintas, maior e intermediária, pelo método de SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Foram gerados 2718 trancritos únicos para o perfil de talassemia ß intermediária e 3052 para o perfil de talassemia ß maior, os quais foram classificados como genes identifcados, no matches, ESTs e outras sequências preditas e anotadas. As expressões de 14 genes foram quantificadas pela reação em cadeia da polimerase em tempo real nas amostras de células CD34+ dos pacientes talassêmicos intermediário e maior, com intuito de validar os resultados obtidos pelo SAGE. As expressões foram concordantes em 57,14% dos genes (ABCB10, APEX1, APOC1, EYA3, HMBS, OAZ1, SRGN, TAGLN2) e discordantes nos demais 42,85% (EIF5a, GRIN2C, HMGB1, NAE1, PCBP2, RAD23B). Quando ambos os perfis foram comparados entre si, 42 transcritos foram ditos como diferencialmente expresso (p<0,05). A análise funcional comparativa dos 42 transcritos diferencialmente expressos foi realizada de acordo com o Gene Ontology Consortium afim de obtermos a classificação funcional destes transcritos. Em conjunto, os resultados podem colaborar na identificação de transcritos importantes, que possam auxiliar na melhor compreensão da fisiopatologia desta doença e desempenhar papéis moduladores no fenótipo em talassemia ß / Abstract: Thalassemia syndromes are a heterogeneous group of hereditary diseases in which there is a reduction in the synthesis of one or more hemoglobin chains. In ß-thalassemia there is a reduction or total suppression of the expression of ß globin genes. The homozygous state of most ß-thalassemia genetic variants produces the clinical evolution of thalassemia major. These patients present severe anemia and require regular blood transfusions in order to survive. Heterozygous individuals present, with exceptions, discret anemia. There are some clinical evolutions that are not as severe as the classic homozygous form, which are often blood transfusion independent, named ß-thalassemia intemedia. The gene responsible for the synthesis of ß the globin chain is arranged in a cluster located on the short arm of cromossome 11. Nearly 200 ß-thalassemia alleles have been characterized. Of these, 125 represent mutations in functionally-important regions of the gene. A nonsense mutation, ie base substitution, which introduces a premature stop codon, destroying the normal reading and interfering in mRNA translation, is of particular interest to our study, especially the Cd 39 mutations (C--T). The aim of this study was to evaluate the global gene expression pattern of CD34+ culture cells from patients with ß-thalassemia, carrying the same genetic mutation (Cd 39) but with different phenotypes (major and intermedia), using Serial Analysis of Gene Expression (SAGE). Two SAGE profiles were gerated: INT and MAIOR. Comparison of the 2718 an 3052 distinct tags from the INT and MAIOR profiles, represented by identified trnacripts and novel tags, 42 tags demonstrated with a differential expression at a statistically significant level (p<0,05) and corresponded to known genes, ESTs or no matches. The expression of 14 genes was further investigated by the real-time polymerase chain reaction in cells cultured from patients with ß-thalassemia intermedia and major, with the purpose of to validating the results obtained by the SAGE method. Similar expressions were seen in 57.14% (ABCB10, APEX1, APOC1, EYA3, HMBS, OAZ1, SRGN, TAGLN2) and discordant expressions were seen in 42.85% (EIF5a, GRIN2C, HMGB1, NAE1, PCBP2, RAD23B). The functional classification was performed according to the Gene Ontology Consortium and a total of a 42 transcripts were submitted to functional classification. Together, our results may contribute to identify important transcripts that may play roles in modulating phenotype in ß-thalassemia and to better understand the pathophysiology of this disease / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientadores: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Rogerio de Castilho Jacinto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:24:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montagner_Francisco_M.pdf: 40440080 bytes, checksum: 91c7e1c3b65d68cb2d0c5c34049c40ea (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os objetivos do presente estudo foram analisar a microbiota endodôntica em dentes que se apresentavam com necrose pulpar e abscesso periapical; investigar a presença de enterococos, fungos e enterobactérias na saliva e nos canais radiculares; e, determinar in vitro a suscetibilidade antimicrobiana de bactérias anaeróbias estritas isoladas com método de E-test e produção de _-Lactamases. Coletas microbiológicas de 30 canais radiculares e 30 amostras de saliva dos mesmos pacientes foram processadas e identificadas empregando-se métodos de cultura microbiana e testes bioquímicos. Análise estatística foi realizada através dos testes Qui-quadrado de Pearson ou de Fisher. Dos 159 microrganismos isolados nos canais radiculares, predominaram anaeróbios estritos e bactérias Gram-positivas, sendo Peptostreptococcus micros a espécie mais freqüentemente isolada. Fungos, enterobactérias e enterococos foram pouco isolados dos canais radiculares, sendo mais freqüentemente observados em amostras de saliva. Associações de espécies e sinais e sintomas de origem endodôntica foram encontrados. Penicilina G, amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico, metronidazol foram bastante efetivos frente aos microrganismos testados. Todas as cepas de P. buccae, P. intermedia/nigrescens, P. disiens, P. micros e P. propionicum foram sensíveis à amoxicilina e ao metronidazol. F. nucleatum demonstrou ser bastante resistente aos antibióticos lactâmicos. Observou-se proporção variável de cepas capazes de produzir lactamases. Os resultados sugerem que a infecção endodôntica primária associada a casos sintomáticos é mista, com predomínio de anaeróbios estritos. A presença de fungos, enterococos e enterobactérias não foi significativa tanto nos canais radiculares quanto nas amostras de saliva. Os antibióticos testados mostraram-se efetivos, no entanto resistência microbiana foi detectada em taxas variáveis de acordo com a espécie estudada. / Abstract: The aim of the present study was to analyze the endodontic microbiota of teeth with pulp necrosis and spontaneous pain; detect the presence of enterococci, fungi and enteric bacteria in saliva and root canals; and, to determine, in vitro the antimicrobial sensitivity of anaerobic isolates by E-test and _-lactamasis production. Thirty samples were collected from both root canals and saliva, and processed using strict microbiological techniques. Statistical analysis was performed with Persons X2 test or Fisher's Exact Test, as appropriated. A hundred and fifty nine strains were isolated from the root canals, with a predominance of strict anaerobes and gram-positive bacteria, and Peptostreptococcus micros was the most frequently isolated species. Fungi, enterobacteria and enterococci were seldom found in root canals. There were no Enterobacteria in both places. Positive associations between specific species and signs and symptoms of endodontic origin were present. Penicillin G, amoxicillin, amoxicilin + clavulanate, and metronidazole were effective against the tested microorganisms. All strains of P. buccae, P. intermedia/nigrescens, P. disiens, P. micros e P. propionicum were susceptible to amoxicillin and metronidazole. About 12% to 33% of the isolates were able to produce beta-lactamasis. The present results suggested that the primary endodontic infection in symptomatic teeth was mixed, and was predominantly formed by strict anaerobic strains. Fungi, enterococci and enterobacteria were not significantly found in root canals and saliva. The tested antibiotics were effective, however resistance was detected in several clinical isolates. / Mestrado / Endodontia / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Antonio Gonçalves de Oliveira Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricio_FlaviaRezendePereira_M.pdf: 2174141 bytes, checksum: 0011ea137b3f271896d984e54bb4f4d6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Tumores do córtex da supra-renal (TCSR) em crianças são raros e correspondem a 0,2% dos tumores da infância. Estes tumores são endocrinologicamente ativos, causando na maioria das vezes, virilização do paciente associada, ou não, a um aumento de cortisol. O tratamento dos TCSR é principalmente cirúrgico, sendo a cirurgia com o procedimento de ressecção completa do tumor e sem ruptura a principal modalidade terapêutica. No entanto, a distinção entre tumores benignos e malignos, baseada exclusivamente na histologia, pode ser difícil de ser realizada. Os fatores prognósticos são baseados quase exclusivamente no estadiamento da doença, o qual leva em conta o peso e volume tumoral e a disseminação metastática do tumor. Estudos clínicos e experimentais sugerem que a propagação metastática em alguns tumores está relacionada aos níveis de E-caderina e ?-catenina, que são moléculas presentes no tecido epitelial normal, estando envolvidas diretamente na adesão intercelular. A análise da expressão destas moléculas pode fornecer dados que permite identificar grupos de pacientes mais propensos à evolução tumoral desfavorável, proporcionando, assim, um tratamento mais adequado e individualizado a estes pacientes. Com o objetivo de analisar a expressão da E-caderina e ?-catenina em crianças com TCSR e sua correlação com a evolução da doença, foi realizada uma revisão retrospectiva dos prontuários de 33 crianças com diagnóstico de TCSR tratadas no Centro Infantil Boldrini (Janeiro de 1998 a Janeiro de 2005). Foram coletados e analisados dados referentes ao sexo, idade, manifestações clínicas, estadiamento, tratamento e evolução dos pacientes. Para a análise imunoistoquímica, foi empregada a técnica de multitissue array com anticorpos específicos para E-caderina e ?-catenina em 30 tumores de crianças com TCSR e uma adrenal normal. Houve predominância do sexo feminino na amostra e a apresentação clínica mais freqüente foi a virilização. Nesta série, observou-se que crianças com idade inferior a dois anos apresentaram melhor prognóstico e, também que a ruptura e recidiva tumoral apresentaram influência negativa na sobrevida dos pacientes. A análise imunoistoquímica mostrou expressão da E-caderina em 73,3% e ?-catenina em 83,3% das crianças que apresentavam TCSR. Além disso, não foi verificada sua expressão na glândula adrenal normal. Quando avaliada a relação da expressão da E-caderina e ?-catenina com os estádios evolutivos da doença, não foi verificada associação significativa entre as variáveis. A positividade da E-caderina e ?-catenina na membrana celular, citoplasma ou núcleo, verificou-se que a expressão na membrana celular mostrou associação significativa com mau prognóstico / Abstract: Adrenal cortical tumor (ACT) in children are rare and they correspond to 0,2% of the tumors of the childhood. They are usually active, causing mainly virilization of patient associate or not with increased levels of corticoids. The treatment of the TCSR is mainly surgical, being the surgery with complete resection of the tumor without spillage the therapeutic mainstay. The distinction between benign and malignant tumors based exclusively on the histology can be difficult and very often uncertain. The prognostic factors are based almost exclusively on the staging of the disease, who takes into account the weight and volume tumoral and the metastatic dissemination. Clinical and experimental studies suggest that metastatic dissemination in some tumors is related with the levels of E-cadherin and ?-catenin. These molecules are found in the normal epithelial tissues and are strongly related with intercellular adhesion. The analysis of the expression of these molecules maybe can allow identifying groups of patients with higher risk of presenting unfavorable outcomes and ensuing appropriate and individualized treatment. With the objective of analyzing the expression of E-cadherin and ?-catenin in children with ACT and its correlation with the evolution of the disease, a retrospective chart review of 33 children with diagnosis of ACT treated at Centro Infantil Boldrini (January of 1998 through January of 2005). Data regarding sex, age, clinical presentation, staging, treatment and outcome were collected and analyzed. Multitissue array technique using specific antibodies for E-cadherin and ?-catenin was done in 30 tumors from children with ACT and 1 normal adrenal tissue. There was predominance of the feminine sex and the most frequent clinical presentation was virilization. In these series children with age bellow two years had a better outcome and tumoral spillage and relapse have had negative influence in the survival of the patients. Immunohistochemical analysis showed expression of E-cadherin in 73,3 % and ?-catenin in 83,3 % of the children who had ACT but showed no expression in the normal adrenal tissue. When the relationship between the expression of E-cadherin and ?-catenin with the stages of the disease was analyzed, no significant association was found. When analyzed the expression of E-cadherin and ?-catenin in the cellular membrane, cytoplasm or nucleus, its presence in the membrane of the cell was found as associated with poor outcome. As far we know, this is the first study to evaluate the expression of E-cadherin and ?-catenin in children with ACT and, although with small number of patients due to the rarity of the disease, it apparently shows some relationship with prognosis. When the relationship between the expression of E-cadherin and ?-catenin with the stages of the disease was analyzed, no significant association was found. When analyzed the expression of E-cadherin and ?-catenin in the cellular membrane, cytoplasm or nucleus, its presence in the membrane of the cell was found as associated with poor outcome. As far we know, this is the first study to evaluate the expression of E-cadherin and ?-catenin in children with ACT and, although with small number of patients due to the rarity of the disease, it apparently shows some relationship with prognosis / Mestrado / Cirurgia / Mestre em Cirurgia

Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de &#946;-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação &#946;-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2&#170; molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, &#946;-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sf&#946;glu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tm&#946;glu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sf&#946;gly) e 56 kDa (Tm&#946;gly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sf&#946;gly) e 171% (Tm&#946;gly) e a concentração protéica de 0,134 &#181;g/&#181;L (Sf&#946;gly) e 0,217 &#181;g/&#181;L (Tm&#946;gly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNP&#946;-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MU&#946;-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tm&#946;gly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +&#8734; (vH&#62;&#62;vT) a 1,5 para pNP&#946;-gluco e +&#8734; a 1 para MU&#946;-gluco. Sf&#946;gly, ao contrário, não transglicosila com substrato MU&#946;-gluco. Além disso, vH/vT para pNP&#946;-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sf&#946;gly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MU&#946;-gluco, mas para pNP&#946;-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +&#8734; (vH&#62;&#62;vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tm&#946;gly e Sf&#946;gly K201F do que em Sf&#946;gly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNP&#946;-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sf&#946;gly e 2 vezes em Tm&#946;gly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sf&#946;gly são maiores do que para Tm&#946;gly e Sf&#946;gly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sf&#946;gly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sf&#946;gly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo. / Glycosides are essential to life and can be synthesized by enzymatic methods with high specificity. The reaction mechanism of GH1 &#946;-glucosidases by double-substitution involves the formation of covalent intermediate (glycosyl-enzyme) which may follow two routes. One of them involves hydrolysis in &#946;-glycosidic bond between aglycone glucone and the substrate, releasing a monosaccharide from the non-reducing end, whereas in the other route, transglycosylation or synthesis by kinetic control, the intermediate is attacked by a glucosyl acceptor (second substrate molecule), generating a new glucoside. BglB has two residues (W and H) that form a \"channel\" through which water attacks the covalent intermediate on the active site. Thus, the residues are potential targets for mutations that alter the balance between routes, increasing the efficiency of transglycosylation. To characterize the molecular basis of the ratio between these two catalytic routes, two &#946;-glycosidases from GH1 family, Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gly; AF052729) and Tenebrio molitor (Tm&#946;gly; AF312017) were produced as recombinant enzymes in Pichia pastoris GS115, concentrated using 90% (w/v) ammonium sulfate and reverse dialysis with PEG 10000, and dialyzed in 100 mM CP buffer pH 6. SDS-PAGE confirmed that Sf&#946;gly (~50 kDa) and Tm&#946;gly (~56 kDa) were pure after that procedure. The activity recovered after purification were 152% (Sf&#946;gly) and 171% (Tm&#946;gly) and protein concentration were 0.134 mg/mL (Sf&#946;gly) and 0.217 mg/mL (Tm&#946;gly). The ratio between the hydrolysis and transglycosylation (vH/vT) was analyzed using pNP&#946;-gluco substrates (0.1 mM to 8 mM) and MU&#946;-gluco (0.1 mM to 40 mM), the rate of formation of pNP or MU and glucose. Tm&#946;gly catalyzes transglycosylation reactions with both substrates, but vH/vT depends on [S] ranging from +&#8734; (vH&#62;&#62;vT) to 1.5 for pNP&#946;-gluco and + &#8734; to 1 for MU&#946;-gluco. In contrast, Sf&#946;gly did not catalyses transglycosilation with MU&#946;-gluco. Moreover, vH/vT for pNP&#946;-gluco-is 2 and is independent of [S]. Sf&#946;gly K201F combines properties of both, because it does not catalyse transglycosylation with MU&#946;-gluco, but for pNP&#946;-gluco the occurrence of transglycosylation is dependent on [S], ranging from + &#8734; (vH&#62;&#62;vT) to 1.25. The kinetic parameters (Vmax e Km) were adjusted in Enzfitter and numerical simulation showing that Km2is higher for Tm&#946;gly and Sf&#946;gly K201F than Sf&#946;gly. We also evaluated the effect of adding alternative acceptors that replace the water in pNP&#946; gluco-4 mM. For the three enzymes the addition of methanol makes vglc less than pNP, indicating the occurrence of transglycosylation. Addition of n-propanol decreases vH/vT about 7 times in Sf&#946;gly and 2 times Tm&#946;gly. The effects on Sf&#946;gly are higher than on Tm&#946;gly and Sf&#946;gly K201F, suggesting easier access to the covalent intermediate in Sf&#946;gly. We observe that vH/vT is not related to affinity for the second substrate molecule and may be modulated by mutation of residue K201 Sf&#946;gly, position related to the access of water or alternative acceptor to the active site.

Diversos estudos compreendem a análise de variáveis definidas no intervalo (0, 1), como porcentagens ou proporções. Os modelos mais adequados são os de regressão baseados nas distribuições beta e simplex. Neste trabalho, apresentamos o modelo de regressão beta proposto por Ferrari & Cribari-Neto (2004) e desenvolvemos o modelo de regressão simplex. Definimos um resíduo para o modelo de regressão simplex, muito útil na análise de diagnóstico, a partir do trabalho de Espinheira, Ferrari & Cribari-Neto (2008). Apresentamos uma forma geral para algumas medidas de diagnóstico, que podem ser aplicadas para os dois modelos. Avaliamos os modelos de regressão beta e simplex por meio de duas aplicações a dados reais, utilizando essas medidas. / Many studies consider the analysis of variables restricted to the interval (0, 1), as percentages and proportions. The most recommended models are based upon the beta and simplex distributions. In this work, we present the beta regression model proposed by Ferrari and Cribari-Neto (2004) and develop the simplex regression model. We propose a residual for the simplex regression model, which is very useful for the diagnostic analysis, based upon the work of Espinheira et al. (2008). We generalize some diagnostic techniques that can be applied to both models. We evaluate the beta and simplex models by two applications to real data, using those techniques.