Objetivo: Avaliar a influência da infecção por Pseudomonas aeruginosa formadora de biofilme na penetração pulmonar da tobramicina através da modelagem populacional dos dados de plasma e microdialisado em animais sadios e infectados. Metodologia: A pneumonia foi desenvolvida através de inoculação de P. aeruginosa (cepa PA14) pela via intratraqueal (109 UFC/mL) a ratos Wistar. Sete dias após a inoculação os animais infectados (n = 5) receberam tobramicina 10 mg/kg i.v. bolus. Animais saudáveis (n = 6) foram utilizados como controle. As concentrações livres pulmonares foram coletadas por microdiálise (sonda CMA/20). As sondas de microdiálise foram calibradas in vitro através de diálise e retrodiálise e in vivo utilizando retrodiálise. A ligação da tobramicina às proteínas plasmáticas foi determinada por microdiálise. As concentrações do fármaco nas amostras foram determinadas por cromatografia líquida em tandem com espectrometria de massas (CLAE-EM/EM) utilizando metodologia validada. Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por abordagem não-compartimental (Phoenix®) e modelagem populacional (popPK) (Monolix®). Resultados e Discussão: A recuperação relativa (RR) das sondas foi independente da concentração de tobramicina e inversamente proporcional ao fluxo de perfusão. A RR determinada in vivo foi de 27,64 % ± 7,70 para animais sadios e 24,47 % ± 1,66 para animais infectados. A ligação às proteínas plasmáticas foi de 11,3 ± 1,9%. A infecção com formação de biofilme não alterou a farmacocinética plasmática da tobramicina, entretanto reduziu em cerca de 70% a penetração pulmonar do fármaco. As concentrações plasmáticas e teciduais foram simultaneamente descritas por um modelo farmacocinético populacional de dois compartimentos, tanto em animais sadios como infectados. A infecção, utilizada como covariável categórica, permitiu descrever as alterações no volume do compartimento periférico e na constante de eliminação do compartimento central devido à infecção. Conclusões: As concentrações plasmáticas da tobramicina, utilizadas para ajuste posológico, superestimam as concentrações ativas no pulmão infectado. O modelo popPK descrito permite a previsão das concentrações livres pulmonares da tobramicina em pulmão infectado, podendo auxiliar na otimização da terapia de pneumonias com P. aeruginosa formadora de biofilme. / Objective: To evaluate the influence of biofilm-forming Pseudomonas aeruginosa infection on tobramycin lung penetration by population pharmacokinetic modeling of plasma and microdialysate data in healthy and infected rats. Methodology: The infection was developed by intratracheal inoculation (109 CFU/mL) of P. aeruginosa (PA14 strain) to Wistar rats. In order to determine plasma and tissue concentrations, seven days after the inoculation the infected animals (n = 5) received tobramycin 10 mg/kg i.v. bolus dose via femoral vein. A healthy group (n = 6) was used as control. Free lung concentrations were determined in microdialysate samples obtained using CMA/20 probes. Microdialysis probes were calibrated in vitro by dialysis and retrodialysis and in vivo by retrodialysis. Tobramycin plasma protein binding was determined by microdialysis. Plasma and tissue concentrations were quantified by a developed and validated liquid chromatography in tandem with mass spectrometry (LC-MS/MS) method. Compartmental and non-compartmental analyses were carried out by Monolix™ and Phoenix™ software, respectively. Results and Discussion: Microdialysis probes relative recovery was independent of the tobramycin concentration and is inversely proportional to the perfusion flow rate investigated. The in vivo probe recovery was 27.64 % ± 7.70 (healthy rats) and 24.47 % ± 1.66 (infected rats). The plasma protein binding was 11.3 ± 1.9%. The biofilm-forming lung infection did not alter tobramycin plasma pharmacokinetics, however, reduced lung penetration in about 70%. The plasma and tissue concentrations-time profiles were simultaneously described by a two compartment popPK model in healthy and infected animals. The infection process, used as categorical covariate allowed describing the changes observed in the volume of the peripheral compartment and in constant rate of elimination from the central compartment. Conclusions: Tobramycin plasma concentrations, used for dosing adjustments, overestimate active concentrations in infected lung. The described popPK model allows predicting free tobramycin lung concentrations in infected lung and could be useful to optimize the treatment of pneumonia caused by biofilm-forming P. aeruginosa with this drug.

O surgimento de cepas bacterianas resistentes a múltiplos fármacos impulsiona a busca por agentes antimicrobianos que possuem novos mecanismos de ação, incluindo compostos antivirulência. Apesar da ampla variedade de moléculas derivadas de química combinatória produzidas pela indústria farmacêutica, produtos naturais continuam a desempenhar um papel chave no desenvolvimento de fármacos. A seleção de plantas como fonte de compostos antimicrobianos é adequada do ponto de vista ecológico, uma vez que elas naturalmente produzem uma grande variedade de metabólitos secundários que atuam como defesa química contra micro-organismos no ambiente. Neste estudo, nós relatamos que miricetina (Myr), um flavonoide comum derivado de vegetais, frutas, nozes, frutas e chá, pode diminuir a produção de vários fatores de virulência de Staphylococcus aureus utilizando diferentes ensaios fenotípicos. Para explorar o mecanismo pelo qual Myr inibe a virulência de S. aureus, enquanto a sua forma glicosilada não, verificamos os níveis de expressão de genes relacionados à virulência e empregamos simulações de dinâmica molecular com enzimas cruciais no processo de patogênese. Além disso, Myr conferiu um grau significativo de proteção contra a infecção estafilocócica em modelo in vivo de Galleria mellonella. Outro foco deste estudo e com base em dados anteriores, o extrato de Harpochilus neesianus foi selecionado para o fracionamento bioguiado, uma vez que não há estudos fitoquímicos e de atividade biológica relatados na literatura para esta espécie. Utilizando o ensaio de proteinase e análises por MALDI-TOF, peptídeos foram identificados como os compostos bioativos, sendo então isolados por cromatografia em Sephadex G-50 e RPC18. Este estudo revela compostos derivados de plantas com um elevado potencial como protótipos antivirulência contra agentes bacterianos patogênicos e uma possível aplicação destes agentes na concepção de superfícies biomédicas anti-infectivas. / The emergence of drug-resistant bacterial strains drives the search for antimicrobials possessing new modes of action, including antivirulence compounds. Despite the wide variety of molecules derived from combinatorial chemistry by the pharmaceutical industry, natural products still play a key role in the development of pharmaceuticals. The selection of plants as source of antimicrobial compounds is appropriate from the ecological standpoint, since they naturally produce a wide range of secondary metabolites that act as a chemical defense against microorganisms in the environment. In this study, we report that myricetin (Myr), a common flavonol derived from vegetables, fruits, nuts, berries and tea, can remarkably decrease the production of several Staphylococcus aureus virulence factors using different phenotypic assays. To explore the mechanism by which Myr inhibits S. aureus virulence, while its glycosylated form does not, we verified the relative expression levels of virulence related genes and employed molecular dynamics simulations with pivotal enzymes in pathogenesis process. Furthermore, Myr conferred a significant degree of protection against staphylococcal infection in Galleria mellonella in vivo model. In addition to this study and based on previous data, Harpochilus neesianus extract was selected for the bioguided fractionation, since no phytochemical studies and biological activity is reported in the literature for this species. By using proteinase assay and MALDI-TOF analyses, peptides were identified as bioactive compounds which were isolated by Sephadex G-50 and RP-C18. This study reveals plant-derived compounds with high potential as antivirulence prototypes against bacterial pathogens and a possible application of these agents in the design of anti-infective biomedical surfaces.

Submitted by Isabela Amendola (isabelaamendola@hotmail.com) on 2019-02-01T11:22:14Z No. of bitstreams: 1 Tese-Isabela-Amêndola.pdf: 2013510 bytes, checksum: 69df8d92f153155f71d6e8a4b37d5eb6 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2019-02-01T17:50:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 amendola_i_dr_sjc.pdf: 2013510 bytes, checksum: 69df8d92f153155f71d6e8a4b37d5eb6 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-01T17:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amendola_i_dr_sjc.pdf: 2013510 bytes, checksum: 69df8d92f153155f71d6e8a4b37d5eb6 (MD5) Previous issue date: 2018-12-03 / A resistência microbiana aos antibióticos disponíveis é preocupação constante, devido à dificuldade no tratamento de infecções causadas por cepas resistentes, em decorrência do uso indiscriminado de antimicrobianos. Assim, a busca por terapias antimicrobianas alternativas tem sido crescente e necessária, sendo a fitoterapia umas das opções de escolha. O objetivo do presente estudo foi analisar a atividade antibacteriana de extratos glicólicos de Achyrocline satureioides (macela), Cynara scolymus (alcachofra), Hamamelis virginiana (hamamelis) e Persea americana (abacateiro), pelos períodos de 5 min e 24 h de exposição sobre bactérias anaeróbias Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis e Porphyromonas gingivalis, em culturas planctônica e biofilmes. As bactérias armazenadas a -80ºC foram ativadas em caldo Brucella enriquecido (hemina 1%, menadiona 1% e sangue de carneiro desfibrinado 5%) e incubadas em câmara de anaerobiose por 48 h a 37ºC por sete dias. A partir de culturas puras, o teste de microdiluição em caldo foi conduzido em microplacas por meio de suspensões bacterianas padronizadas em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) e diluições dos extratos em caldo, sendo as placas incubadas por 48 h a 37ºC em anaerobiose. Alíquotas de cada poço foram semeadas em ágar Brucella enriquecido. Após incubação, a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) foram determinadas. As concentrações efetivas de cada extrato foram aplicadas sobre os biofilmes de cada espécie, formados em microplacas a partir de suspensões bacterianas puras padronizadas na escala 0,5 de McFarland. As microplacas foram incubadas por sete dias a 37ºC para formação dos biofilmes, sendo o meio trocado a cada 48 h. Os biofilmes foram tratados por 5 min e 24 h. Em seguida, foram lavados e desprendidos por homogeneizador ultrassônico. As suspensões diluídas foram adicionadas em ágar Brucella enriquecido. Após 48 h, as Unidades Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/mL) foram determinadas. Os resultados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey ou por Kruskal-Wallis e teste Dunns, ambos com nível de significância de 5% (p≤0,05). Sobre as culturas planctônicas, a CIM e CBM dos extratos foi determinada apenas para F. nucleatum. A CBM dos extratos de A. satureioides, C. scolymus e P. americana foi obtida sobre P. micra. Não foi obtida atividade bactericida para P. endodontalis e P. gingivalis. Sobre biofilmes, todas as espécies apresentaram reduções significativas quando expostas aos extratos em ambos os tempos. Pode-se concluir que os extratos testados apresentaram efeito bacteriostático sobre F. nucleatum. Atividade bactericida dos extratos foi observada sobre F. nucleatum, bem como sobre P. micra, exceto para H. virginiana. Os extratos avaliados também apresentaram efeito antibiofilme sobre F. nucleatum, P. micra, P. endodontalis e P. gingivalis por 5 min e 24 h de exposição. / Microbial resistance to antibiotics available is constant concern, due to the difficulty in treating infections caused by resistant strains as a result of the indiscriminate use of antimicrobials. Thus, the search for antimicrobial alternative therapies has been growing and necessary, being one option the herbal medicine. The objective of the present study was to analyze the antibacterial activity to Achyrocline satureioides glycolic extracts (macela), Cynara scolymus (artichoke), Hamamelis virginiana (Witch-Hazel) and Persea americana (avocado), for periods of 5 min and 24 h from exhibition on anaerobic bacteria Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Parvimonas micra, Porphyromonas gingivalis and Porphyromonas endodontalis in planktonic communities and biofilms. Bacteria stored at -80°C have been activated in Brucella broth enriched (hemin 1%, menadione 1% and defibrinated sheep blood 5%) and incubated in anaerobiose chamber for 48 h at 37° C for seven days. From pure cultures, the microdiluição test in broth was conducted in microplates through standardized bacterial suspensions in sterile saline solution (NaCl 0.9%) and dilution of the extracts in broth, being incubated plates for 48 h at 37° C in anaerobiosis. Aliquots of each well were sown in Brucella agar enriched. After incubation, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) were determined. Effective concentrations of each extract were applied on the biofilms of each species, formed in microplates from pure bacterial suspensions in 0.5 McFarland scale standard. The microplates were incubated for 7 days at 37°C for the formation of biofilms, being the culture medium replaced every 48 h. Biofilms were treated for 5 min and 24 h have been washed and given off by ultrasonic homogenizer. Dilute suspensions were added in Brucella agar enriched. After 48 h, the Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) were determined. The results were analyzed by ANOVA and Tukey test, or Kruskal-Wallis test and Dunns, both with a significance level of 5% (p ≤ 0.05). On the planktonic cultures, CIM and CBM of extracts was determined only to F. nucleatum. The CBM of the extracts of A. satureioides, C. scolymus and P. americana was obtained on P. micra. Bactericidal activity was not obtained for P. endodontalis and P. gingivalis. About biofilms, all species exhibited significant reductions when exposed to the extracts in both times. It can be concluded that the extracts tested showed bacteriostatic effect on F. nucleatum. Bactericidal activity of extracts was observed on F. nucleatum and P. micra, except for H. virginiana. The extracts evaluated also presented antibiofilme effect on F. nucleatum, P. micra, P. endodontalis and P. gingivalis for 5 min and 24 h.

Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis são dois patógenos causadores mastite bovina que podem apresentar capacidade de produção de biofilme, o que pode resultar em infecções intramamárias crônicas, menor resposta à terapia, redução de produção de leite e maior risco de descarte das vacas infectadas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a: 1) capacidade de formação de biofilme de S. aureus e S. uberis isolados de vacas com mastite clínica (MC) e subclínica (MSC); 2) sensibilidade in vitro e a multirresistência destes agentes a antimicrobianos selecionados (n=12); 3) associação entre a capacidade de formação de biofilme e resistência aos antimicrobianos de S. aureus e S. uberis. Um total de 197 cepas S. aureus e 128 S. uberis foram isoladas a partir de amostras de leite de vacas com MSC e MC, oriundas de 24 rebanhos. Os isolados de S. aureus e S. uberis foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme pelo método??? e a sensibilidade in vitro aos antimicrobianos foi determinada pela técnica de disco difusão em ágar. A capacidade de formação de biofilme foi classificada em 4 categorias: forte, moderado, fraco e não formador de biofilme. Do total de cepas avaliadas, S. aureus (54,8%) e S. uberis (52,9%) apresentaram capacidade de formação de biofilme (forte, moderado ou fraco). Entre os isolados de S. aureus formadores de biofilme, a frequência de distribuição dos isolados foi de 19,3% na categoria forte, 18,8% moderado, e 16,7% na categoria fraco. Para os isolados de S. uberis, a frequência de distribuição entre as categorias de formação de biofilme foi 17,6% forte, 25,2% moderado, 17,6% fraco. Dentre as cepas de S. aureus isoladas de casos de MC, 55,8% foram classificados como forte formador de biofilme, enquanto 7,6% das cepas isoladas de MSC apresentaram capacidade de formação de biofilme. Todos os isolados de S. uberis (n=30; 100%) provenientes de MC apresentaram capacidade de formação de biofilme na categoria moderado. Quanto à sensibilidade aos antimicrobianos, os isolados de S. aureus apresentaram resistência à penicilina (92,9%), ampicilina (50,8%) e tetraciclina (18,3%); e os isolados de S. uberis apresentaram resistência à penicilina (86,5%), oxacilina (85,5%), tetraciclina (37,5%). Os isolados de S. aureus apresentaram maior chance de resistência aos antimicrobianos ampicilina, tetraciclina e ceftiofur que S. uberis. Em conclusão, S. aureus e S. uberis apresentam elevada capacidade de produção de biofilme, mas não houve interação entre a característica de multirresistência e formação de biofilme. Isolados de S. aureus e S. uberis foram altamente resistentes aos antimicrobianos das classes de beta-lactâmicos e tetraciclinas. / Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis are both mastitis causing pathogens that can present ability to produce biofilm, which can result in chronic intramammary infection, reduced response to the therapy, reduction of milk yield, and greater risk of cows\' culling. The objectives of this study were to evaluate the: 1) biofilm-forming capacity of S. aureus and S. uberis isolated from clinical (CM) and subclinical mastitis (SCM); in vitro sensibility and multi-resistance of these agents to the antimicrobials; 3) association between the biofilm-forming capacity and antimicrobial resistance. A total of 197 S. aureus and 128 S. uberis were isolated from milk samples collected from cows with SCM and CM from 24 dairy herds. The biofilm-forming ability were classified in 4 categories: strong, moderate, weak, and non-biofilm producers. Of all isolates evaluated, S. aureus (54.8%) and S. uberis (52.9%) presented biofilm-forming ability (strong, moderate or weak). Among the biofilm-forming isolates, the frequency of distribution of S. aureus was 19.3% for the strong, 18.8% for the moderate, and 16.7% for the weak categories. For the S. uberis isolates, the frequency of distribution among the biofilm-forming categories was 17.6% strong, 25.2% moderate, and 17.6% weak. In relation to the mastitis presentation form, the strong biofilm-forming category had 55.8% of S. aureus isolates from CM cases; and among all biofilm-forming categories, the strong category was the one with the higher number of isolates of S. aureus (n=43; 19,2%). All S. uberis isolates (n=30; 100%) from CM presented moderate biofilm-forming ability. In relation to the antimicrobial susceptibility, the isolates of S. aureus were resistant to penicillin (92.9%), ampicillin (50.8%) and tetracycline (18.3%); and the isolates of S. uberis presented resistance to penicillin (86.5%), oxacillin (85.5%) and tetracycline (37.5%). The isolates of S. aureus and S. uberis, S. aureus had higher odds to be resistant to ampicillin, tetracycline and ceftiofur than S. uberis. In conclusion, S. aureus and S. uberis presented high ability of production of biofilm, but there was no interaction between multi-resistance and biofilm production ability. Isolates of S. aureus and S. uberis were highly resistant to antimicrobials of the class of beta lactams and tetracycline.

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Aguinaldo Silva Garcez Segundo / Banca: Luciane Dias de Oliveira / Resumo: O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus (GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultrasônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08% para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e 38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S. mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94% para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais. / Abstract: The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial effect of photodynamic therapy (PDT) in biofilms formed by C. albicans (GI), S. aureus (GII) and S. mutans (GIII), alone and in associations (GIVGVII). The biofilms were grown in acrylic resin discs immersed in sterile brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound material. The effects of the methylene blue (MB) photosensitizers at a concentration of 0,1 mg/mL for 5 min and AsGaAl laser (660 nm) for 98 s, alone and conjugated were evaluated. The dics were placed into tubes with sterile saline solution and sonicated for 30 s in order to disperse the biofilms. Ten-fold serial dilutions were carried out and aliquots plated in selective agar which were then incubated for 48 h. Then the numbers CFU/mL (log10) were counted and analyzed statistically (ANOVA, Tukey's test, p< 0,05) Scanning electron microscopy (SEM) on discs with PDT and control biofilms groups were performed. Significant decreases in the viability of all microorganisms were observed when biofilms were exposed to both MB and laser. Reductions (log10) in single-species biofilms were greater than associated biofilms with: 40.22% for C. albicans (GI), 55.91% for S. aureus (GII) and 47.35% for S. mutans (GIII). In associated biofilms the reductions (Log10) were: 35.08% for C. albicans and 43.9% for S. aureus (GIV); 31.54% for C. albicans and 38.7% for S. mutans (GV); 40.12% for S. aureus and 37.14% for S. mutans (GVI); 19.56% for C. albicans, 28.41% for S. aureus and 24.94% for S. mutans (GVII). Scanning electron microscopy micrographs suggested that lethal photosensitization occurred predominantly in the outermost layers of the biofilms. It was concluded that PDT using MB photosensitizer and laser may be a useful approach in the control of oral biofilms. / Mestre

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-08-18T12:03:39Z No. of bitstreams: 1 PDF - Naiana Braga da Silva.pdf: 1358228 bytes, checksum: eda1094c4ae917bdaeef4fb89fb0ec22 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T12:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Naiana Braga da Silva.pdf: 1358228 bytes, checksum: eda1094c4ae917bdaeef4fb89fb0ec22 (MD5) Previous issue date: 2016-05-06 / The dental biofilm is responsible for promoting infectious oral diseases, but it can control both mechanically and chemically. Phytotherapy comes up as an alternative, and the essential oil of lemon grass shows promising as an auxiliary method on chemical biofilm control. In this context, the aim of the study was to perform the chemical analysis of essential oil of Cymbopogon citratus, obtained in a company that is reference on essence and essential oil distribution, as well as to investigate the in vitro antimicrobial and antibiofilm effects of the oil, and its toxicity on human cells. For the chemical analysis, gas chromatography-mass spectrometry was used, and to identify the antimmicrobial effect, we determinate the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) on standard strains of Streptococcus mutans UA159 and Candida albicans ATCC90029,by the microdilution method on well technic. The obtained MIC served as a reference for the antibiofilm test. To determinate the antibiofilm activity, we developed a multispecies biofilm, with Streptococcus mutans and Candida albicans, verifying the inhibitory actions of biofilm formation and the mature biofilm removal, with spectrophotometry evaluation, through a plate reader at a wavelength of 525 nm. To identify the hemolytic activity, we used blood samples from five healthy donors, subjecting the erythrocytes preparation tho the serial concentrations of the essential oil on test, with later spectrophotometry reading, at 560nm. The data was tabulated, statistically analyzed and presented as tables and charts. The main compound of the essential oil was the citral. It was evidenced the antimicrobial activity of the product at bacterial MIC of 1000 µg/mL and fungal MIC at 125µg/mL, as well as the inhibitory effect on biofilm formation on every evaluated concentrations (p<0,05). However, the essential oil was not able to remove mature biofilm. Observed that the essential oil showed protective effect over human erythrocytes on concentrations less than 500µg/mL. Based on the used methodology, checks that the Cymbopogon citratus essential oil has antibiofilm potential, not being toxic to the human erythrocyte membrane. / O biofilme dentário é responsável por promover doenças bucais de caráter infeccioso, podendo ser controlado mecânica e quimicamente. A fitoterapia surge como uma alternativa e o óleo essencial de capim-santo se mostra promissor como método auxiliar no controle químico do biofilme. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi realizar análise química do óleo essencial de Cymbopogon citratus, obtido em empresa de referência na distribuição de essências e óleos essenciais, bem como investigar os efeitos antimicrobiano e antibiofilme do óleo essencial de in vitro, além da toxicidade sobre células humanas. Para análise química, foi utilizada a cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas e, para identificação do efeito antimicrobiano, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM) sobre cepas padrão de Streptococcus mutans UA 159 e de Candida albicans ATCC 90029, pelo método da microdiluição na técnica de poços. A CIM encontrada serviu de referência para o teste antibiofilme. Para determinação da atividade antibiofilme, foi desenvolvido biofilme multiespécie com os microrganismos Streptococcus mutans e Candida albicans, verificando-se ações de inibição da formação de biofilme e remoção de biofilme maduro, com avaliação em espectrofotometria, por meio de um leitor de placas, em comprimento de onda de 525 nm. Para identificação da atividade hemolítica, foram utilizadas amostras sanguíneas de cinco doadores saudáveis, submetendo o preparado de eritrócitos às concentrações seriadas do óleo essencial em teste, com posterior leitura em espectrofotometria, a 560 nm. Os dados foram tabulados, analisados estatisticamente e apresentados na forma de tabelas e quadros. O principal composto do óleo essencial foi o citral. Foi evidenciada atividade antimicrobiana do produto, com CIM bacteriana de 1000 µg/mL e CIM fúngica de 125 µg/mL, bem como forte efeito inibidor da formação de biofilme em todas as concentrações avaliadas (p<0,05). Entretanto, o óleo essencial não foi capaz de remover biofilme maduro. Também foi observado que o fitoterápico apresentou efeito protetor sobre eritrócitos humanos em concentrações inferiores a 500µg/mL. Com base na metodologia adotada, verifica-se que o óleo essencial de Cymbopogon citratus possui potencial antibiofilme, não sendo tóxico à membrana de eritrócitos humanos.

Este trabalho apresenta uma análise comparativa da atividade biológica das células imobilizadas em um reator anaeróbio, tratando esgoto sanitário. Os materiais utilizados como suporte para o desenvolvimento do biofilme foram: um polimérico poroso (espuma de poliuretano), um polímero menos poroso (PVC), uma cerâmica porosa (cerâmica especial, desenvolvida pelo DEMA-UFSCar) e uma cerâmica menos porosa (tijolo refratário). A concepção do reator anaeróbio possibilitou o desenvolvimento do biofilme de forma igual, assim como a retirada desse suporte mantendo íntegra a biomassa aderida. Alguns suportes e o lodo retirados do reator anaeróbio foram colocados em reatores diferenciais para determinação dos parâmetros cinéticos. Esses parâmetros foram utilizados para avaliar a atividade biológica, tanto do biofilme aderido aos suportes quanto do lodo. As células imobilizadas nos materiais poliméricos apresentaram maior atividade biológica. Não foi verificada nenhuma diferença significativa na remoção dos constituintes da matéria orgânica (proteínas, carboidratos e lipídeos) entre as células imobilizadas. As análises microscópicas não constataram diferenças na predominância de algum gênero nos suportes ou lodo. O reator foi operado durante 183 dias, com remoção média de DQO de 50,5%, a taxa de carregamento orgânico média foi de 0,193 kg DQO.m3.dia-1. / This work presents a comparative analysis of the biological activity of immobilized biomass in a fixed-bed anaerobic reactor treating domestic sewage. The matrices used for biofilm growth were a porous polymer (polyurethane foam), a polymer with low porosity (PVC), a porous ceramic (special ceramic) and a ceramic with low porosity (refractory brick). The conception of the fixed-bed anaerobic reactor warranty the structure and integrity of the biofilm when samples of support material must be taken. Moreover, the conditions for biofilm growth were similar for all the materials used. After start-up period, some supports were taken from the fixed-bed reactor and transferred to differential reactors, where kinetic studies were carried out. Kinetic parameters were estimated for the different supports and for granulated sludge and used to evaluate the biological activity in a comparative way. The cells adhered to the polymeric supports presented higher activities and the highest activity was obtained when polyurethane foam was used. No differences were verified for organic matter consumption (as proteins, carbohydrates and lipids) when different matrices were used for cell immobilization. Microscopic analysis indicated that the morphological types in the biofilms were similar in ali support materiais. The fixed-bed reactor was operated for 183 days with mean COD removal efficiency of 50.5%, subjected to a organic loading rate of 0.193 Kg COD.m3.dia-1.

Os endoscópios são equipamentos aprovados para serem reutilizados, apesar de apresentarem estrutura interna complexa, composta por canais longos com lúmens estreitos, o que permite a aderência de matéria orgânica e microrganismos, favorecendo assim a formação de biofilmes. Estes dificultam o processamento eficaz, representando um desafio no reuso desses equipamentos. A formação do biofilme é inevitável ao longo do processamento dos endoscópios e há grande dificuldade em removê-lo completamente. Em razão disso, pesquisas atuais apontam-no como possível responsável pela transmissão de infecções exógenas e efeitos adversos que se manifestam em pacientes submetidos a endoscopias gastrointestinais. Essa realidade tem trazido à tona a preocupação em erradicá-lo. Assim, este estudo teve como objetivos avaliar a ação da desinfecção de alto nível na remoção de biofilme após limpeza prévia com escovação em corpos amostrais, simulando os canais de endoscópios flexíveis e comparar os produtos comercialmente disponíveis no mercado nacional para a remoção do biofilme dos endoscópios. Trata-se de uma pesquisa experimental, laboratorial e comparativa. Foram utilizados tubos de revestimento interno de politetrafluoretileno (Teflon®) e a Pseudomonas aeruginosa como microrganismo teste, formadora de biofilme. Foi montado um modelo validado para o desenvolvimento do biofilme. Os corpos amostrais contaminados foram submetidos inicialmente ao processo manual de limpeza com detergente enzimático e escovação. Em seguida, os corpos amostrais foram submetidos a cinco métodos de desinfecção de alto nível, quais sejam: o ácido peracético com concentração de 0,09% a 0,15%, o sistema Steris®, o glutaraldeído a 2%, e a água eletrolítica ácida. Foram extraídos três segmentos, de aproximadamente três milímetros representando o início, meio e fim de cada corpo amostral e analisados com o auxílio da microscopia eletrônica de varredura quanto a presença de biofilme. Conclui-se que nenhum método testado removeu 100% dos biofilmes e que essa remoção depende da interação entre o método de limpeza e a desinfecção posterior. Verificou-se que o método que mais removeu fisicamente o biofilme foi o glutaraldeído a 2% em reprocessadora automática, provavelmente justificado pelo double brushing, uma vez que o equipamento tem uma fase de limpeza no início de seu ciclo. O método que se mostrou mais eficaz na remoção de biofilme e outros resíduos constituídos de bactérias isoladas e da matriz de exopolissacarídeos, foi sistema Steris®. O método que se mostrou menos eficaz na remoção do biofilme e outros resíduos foi a água eletrolítica ácida. Considerando que a água é uma fonte de biofilme, sugeri-se utilizar filtros para a água do enxágüe e a rinsagem final dos canais com álcool. A despeito de tecnologias atualmente disponíveis para o processamento de canais dos endoscópios, nenhum dos métodos testados na presente investigação foi completamente eficaz para remover os biofilmes frente ao desafio imposto. Resta, portanto, recomendar que práticas baseadas em protocolos das sociedades sejam rigorosamente seguidas, apesar do tempo requerido para as boas práticas e optar, preferencialmente pelo processo automatizado, a fim de diminuir o erro humano / Endoscope is equipment approved to be reused in spite of its complex internal structure, consisting of long channels with narrowed lumens, allowing adherence of organic material and microorganisms, favoring formation of biofilm, making difficult an effective procedure, which is a challenge in the reuse of this equipment. The biofilm formation during endoscopic procedures is inevitable and it is very difficult to entirely remove it. Consequently, recent researches report it as the probable factor responsible by transmissions of exogenous infections and for the side effects found in patients submitted to gastrointestinal endoscopy procedures. This picture brought the concern to eradicate it. Thus, the objectives of this study were to evaluate the action of high level disinfection to remove biofilm after prior cleaning and brushing in body samples, simulating flexible endoscopic channels and to compare products commercially available in the national market to remove the biofilm from endoscopes. This is an experimental, laboratory and comparative research. Tubes of internal politetrafluorethylen (Teflon) and the Pseudomonas aeruginosa as a test microorganism to form the biofilm. A validated model was designed to develop the biofilm. The contaminated body samples were initially submitted to manual cleaning process with enzymatic cleansing and brushing. Next, these bodies were submitted to five high-level disinfection methods, as follows: peracetic acid at 0.09% and 0.15% of concentration, Steris System, 2% glutaraldehyde and acid electrolytic water. Three segments were removed, measuring approximately three millimeters, representing the beginning, the middle and the end of each body sample. These segments were analyzed by means of screening electronic microscopy in relation to biofilm presence. It was concluded that no tested method removed 100% of biofilm and that this removal depends on the interaction between the cleaning method and later disinfection. It was observed that the most effective procedure to physically remove the biofilm was the 2% glutaraldehyde, in automatic reprocessing method, probably due to double brushing since the equipment had a cleaning phase at the beginning of the cycle. The most effective method to remove the biofilm and other residues of isolated bacteria and of exopolysaccaride matrix was the SterisSystem method. The less effective method to remove biofilm and other residues was the acid electrolic water. Considering that water is the biofilm source, it was suggested to use filters for the water when cleansing and to rinse the channels with alcohol at the end. Regarding new technologies available for processing endoscope channels, none of the tested methods in the present investigation was totally effective to remove biofilm in face of the challenge presented. So, we may suggest that the good practices recommended by the several existing societies be strictly followed, in spite of the time needed for this process. Automated process is suggested as the best option to decrease human error

O presente trabalho objetivou: 1) comparar a efetividade da técnica de escovação anteroposterior com escovas de design modificado e cerdas multinível com a técnica de escovação transversal com escova infantil convencional de cerdas retas com, quanto à remoção de biofilme em superfícies oclusais de molares permanentes em erupção, em curto e longo prazo; 2) comparar diferentes métodos de avaliação de biofilme para superfícies oclusais e 3) verificar fatores clínicos associados com a redução de biofilme nas superfícies oclusais de dentes em erupção. Foram determinados diferentes desfechos: presença de placa visível, presença de placa madura, área de placa corada e fluorescência da placa medida pelo aparelho de fluorescência induzida por luz (QLF). Dois examinadores, calibrados e cegos quanto ao grupo de tratamento que as crianças seriam alocadas, realizaram os exames com os índices e o exame com o QLF foi realizado apenas por um examinador. Um terceiro avaliador externo ficou encarregado de orientar e avaliar as técnicas e o grau de deteriorização das escovas. Foram selecionadas 33 crianças (92 dentes), que compareceram a triagem da disciplina de Odontopediatria da FOUSP, com idade entre 5-7 anos (Média±DP=6,23±0,56), com pelo menos um molar permanente em erupção presente na cavidade bucal. Essas crianças foram alocadas aleatoriamente em dois grupos de acordo com a técnica de escovação a ser empregada. Os dentes foram avaliados pelos métodos acima citados no início do estudo e após 15 dias, 1 mês e 3 meses. Alguns parâmetros clínicos foram analisados quanto à associação com redução de biofilme. Análises multinível foram realizadas buscando verificar qual a técnica mais efetiva na remoção de biofilme em superfícies oclusais de molares permanentes em erupção e as possíveis associações entre parâmetros clínicos e redução de biofilme. Foram também verificadas a reprodutibilidade e a correlação entre os métodos usados para avaliação do biofilme. Até os 15 dias de seguimento, não houve diferença entre os grupos. Após 1 mês de seguimento das crianças houve maior redução no biofilme visível e no biofilme maduro quando utilizada a escova modificada de cerdas multinível. Nenhuma alteração foi notada quando avaliado os desfechos de fluorescência da placa e área de placa corada. Os índices visuais mostraram fraca correlação entre si e a fluorescência da placa não mostrou correlação com os demais métodos. Diferentes fatores são associados com a redução de biofilme maduro e biofilme visível pelas técnicas de escovação. Conclui-se que, em longo prazo, a escova de cerdas multinível consegue desorganizar melhor o biofilme maduro e o biofilme visível e que os métodos de avaliação do biofilme avaliam o biofilme de forma diferente. A redução de placa madura e placa visível foram associadas a diferentes fatores clínicos testados, sugerindo que esses desfechos avaliam aspectos discretamente diferentes do biofilme acumulado em superfícies oclusais de dentes em erupção. / The present study aimed 1) to evaluate the effectiveness of anteroposterior toothbrushing using a children`s toothbrush with multilevel filaments vs. cross-toothbrushing technique using straight bristles in short and long-term analysis; 2) to compare different methods assessing dental plaque in occlusal surfaces and 3) to verify the association between clinical parameters and the removal of biofilm on the occlusal surfaces of erupting permanent molars. Different outcomes concerning dental plaque were chosen: presence of visible plaque, presence of mature plaque, area of disclosed plaque and plaque fluorescence measured by a quantitative light fluorescence device (QLF). Two calibrated and blinded examiners performed the examinations using indices and only one assessed the biofilm using the QLF. Another examiner was responsible for explaining the techniques and evaluating the degree of deterioration of the toothbrushes. Thirty-three children aged 5-7 years (mean=6.23, SD=0.56), who attended the screening of the discipline of Pediatric Dentistry FOUSP, were select. In those children 92 erupting molars are included. These children were randomly assigned into two groups according to the toothbrushing technique Teeth were evaluated by the methods at baseline and after 15 days, 1 month and 3 month. Some clinical parameters were also analyzed regarding their association with plaque reduction. Multilevel analysis were performed to determine which technique is the most effective in removing plaque on occlusal surfaces of erupting permanent molars. Reproducibility and correlation of methods for plaque measuring were also tested. After 15 days, no difference was observed between groups. However, after 1 month of following-up, higher reduction in mature and visible plaque were found using the toothbrushes with multilevel filaments. Visual indexes for plaque evaluation presented poor correlation between themselves and the plaque fluorescence measured by QLF did not show correlation with visual them. Different clinical parameters were associated with biofilm removal by toothbrusing techniques. In conclusion, in a long-term analysis, the toothbrishing with multilevel filaments is able to disorganize the plaque on occlusal surfasse of erupting molares more efficiently and the methods for plaque assessement evaluate different parameters related to plaque. Finally, the reduction in mature plaque and in visible plaque are differently associated with clinical parameters, suggesting they measure slight different aspects related to de dental plaque on occlusal surface of erupting teeth.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen that is now the leading cause of morbidity and mortality in immunocompromised individuals. Those suffering with the genetic disease cystic fibrosis (CF) commonly encounter P. aeruginosa infections. P. aeruginosa infection can present itself as an acute infection, which is characterised by highly virulent, "free-swimming" bacteria, or as a chronic infection associated with the formation of surface-adhered bacterial communities known as biofilms. The labyrinth of interconnecting signalling networks has meant that the regulatory mechanisms behind biofilm formation and virulence are largely undefined. In this dissertation, a single nucleotide polymorphism was identified within the gene, fusA1, encoding elongation factor G (EF-G). The mutation introduced minor structural changes to the protein which were likely to have functional repercussions in its involvement in protein synthesis. Phenotypic analysis revealed that the mutation conferred changes in both resistance and sensitivity to various antibiotics, as well as changes in motility, exoenzyme production, quorum sensing, metabolism, synthesis of biofilm-associated proteins and exopolysaccharide production. Most notably was the up-regulation of a major virulence determinant, the type three secretion system, typically characteristic of cells comprising an acute infection. Proteomic and transcriptomic profiling of the mutant strain provided an insight into the genetic basis behind these phenotypes, identifying the up-regulation of multidrug efflux systems and modulations to the chemotactic systems. This study also found links between several biological processes that were modulated in the mutant strain, such as crosstalk between sulfur metabolism, iron uptake and the oxidative stress response. In summary, the work presented in this dissertation highlights the susceptibility of fusA1 to spontaneous mutation and identifies a novel role for EF-G in bacterial virulence and antibiotic sensitivity, both of which have worrying implications for infection within the CF lung.