La notion de robustesse peut se définir par le maintien des performances et de la santé quelles que soient les conditions d’environnement. Le sevrage constitue la phase où la plus grande quantité d’antibiotiques est utilisée car il est source de perturbations multiples pour le porcelet. L’identification de porcs robustes permettrait d’envisager des soins spécifiques et/ou une sélection génétique sur ce caractère. Les objectifs de cette thèse étaient d’identifier certains marqueurs physiologiques associés à la robustesse du porcelet au sevrage et de prédire cette robustesse par des variables physiologiques décrivant ces réponses mesurées avant et après sevrage. Pour répondre à cet objectif, des variables physiologiques ont d’abord été mesurées dans des environnements très divers puis celles associées à la robustesse ont été identifiées. Une première étude a été conduite en installation expérimentale visant à étudier les effets de l’âge, des conditions de sevrage et de la santé sur l’évoPar ailleurs, dans une deuxième étude, des variables physiologiques ont été mesurées dans 16 élevages commerciaux autour du sevrage. Les performances de croissance et le statut sanitaire étaient les 2 facteurs de variations d’élevages contrôlés. L’analyse des données a permis de mettre en évidence une forte influence du statut sanitaire sur les variables physiologiques mesurées autour du sevrage. Des variables descriptives du statut oxydant, du statut métabolique et de l’activation du système immunitaire ont été associées à la robustesse du porcelet au sevrage. Ainsi, les porcelets les plus / The concept of robustness can be defined as the ability to maintain performances and health whatever environmental conditions. Weaning is the step where the biggest part of antibiotics is used because it is the source of multiple perturbations for the piglet. The identification of robust pigs could allow settling specific care and/or genetic selection on this criteria. The objectives of this thesis were to identify physiological parameters associated with the robustness of piglet at weaning and to predict this robustness by biological variables describing those measured responses before and after weaning. To answer to this objective, physiological variables were first measured in very different environments and, then, those ones associated with the robustness were identified. A first experiment was realized in experimental unit, aiming to study the effects of age, weaning conditions and health on the evolution of blood variables describing immune and metabolic status, stress and oxidatGrowth performances and health status were the two controlled factors of variations of farms. The analysis of data allowed us to show a high influence of health status on physiological variables around weaning. Some variables describing oxidative status, metabolic status and the activation of immune system were associated with the robustness of piglet at weaning. Thus, the most robust piglets are those ones who, in favorable or unfavorable environments, have a capacity to limit their oxidative stress, to mobilize less body reserves and to activate quickly their immune system. Those variables

Les TSA représentent un groupe de troubles neurodéveloppementaux défini par des déficits des interactions sociales, de la communication et des comportements restreints et répétitifs. A ce jour le diagnostic de l’autisme se fait uniquement sur la base de symptômes cliniques. Il n’existe aucun biomarqueur des TSA. Ce travail s’inscrit donc (1) dans la recherche de biomarqueurs prédictifs dans les TSA et (2) dans la mise en évidence des dysfonctions métaboliques cérébrales dans un modèle de rat (rat valproate, VPA). Pour mettre en évidence des biomarqueurs urinaires prédictifs nous avons analysé simultanément les données issues de plusieurs technologies analytiques afin d’améliorer la robustesse et la capacité prédictive des modèles statistiques. L’autre partie de la thèse consistait à caractériser et à comparer au cours du développement l’évolution du métabolome du rat VPA. Nous avons mis en évidence des perturbations des voies de la neurotransmission, énergétique, du stress oxydatif etc. Même si on ne peut pas transposer les résultats obtenus chez le rat, à l’homme, le modèle VPA permet néanmoins de mieux comprendre les perturbations physiologiques cérébrales induites par ce médicament. / ASDs are a group of neurodevelopmental disorders defined by deficits in social interaction, communication and restricted and repetitive behaviors. To date, the diagnosis of autism is made only on the basis of clinical symptoms. There is no biomarker of ASD. The aim of this work is (1) the search of predictive biomarkers in ASD and (2) the better understanding of brain metabolic dysfunctions in a rat model (valproate rat, VPA). To highlight urinary predictive biomarkers we analyzed together data from different analytical technologies in order to improve the robustness and predictive power of statistical models. The second part of the thesis was to characterize and compare the cerebral metabolome of VPA rat during development. We showed disturbances of neurotransmission, energy, oxidative stress pathways. Even if results obtained in rats cannot be transposed to humans, the VPA model still allows a better understanding the brain physiological disturbances induced by the drug.

Cette thèse porte sur la sélection d’anticorps humains et la découverte de nouveaux biomarqueurs en vue d’un diagnostic et d’une thérapie de l’athérosclérose. Le premier volet concerne, dans un premier temps, la sélection d’anticorps humains dans un contexte physiopathologique chez un modèle animal de l’athérosclérose. La sélection in vivo a permis de sélectionner des anticorps sur large pannel de cibles dans leur conformation native et sous l’influence de leur microenvironnement. Suite à cela, afin d’accéder à la spécificité des clones, une méthode innovante de criblage a été développée, la cytométrie de flux à moyen débit. Cette technique, contrairement à l’ELISA couramment utilisé pour la caractérisation d’anticorps ou de peptides, ne nécessite pas de connaitre l’antigène et permet également de travailler à des concentrations de protéines moindres. Ainsi, deux cents anticorps ont pu être sélectionnés. Les tests d’affinité et de caractérisation de ces anticorps ont, par la suite, mené à l’identification d’une nouvelle cible de la plaque d’athérome, la galectine 3, protéine impliquée dans l’activation des macrophages ainsi que la rétention des LDL oxydées par ces dernières. Le deuxième volet concerne une seconde approche de criblage in silico des anticorps issus de la sélection in vivo, notamment grâce à l’utilisation de techniques de séquençage haut débit (Pacific Biosciences). Les résultats de cette étude pilote ont permis demettre en exergue plusieurs points : (1) la possibilité d’obtenir des séquences >1000bpcorrespondant à des scFv après analyse par IMGT/HighV-QUEST (database des immunoglobulines internationales) et (2) la possibilité d’identifier des séquences de clones préférentiellement enrichies après une sélection in vivo. En conclusion et perspectives, ces deux méthodes de criblage complémentaires nous donnent accès à de nouvelles voies d’obtention d’anticorps humains pour (1) le couplage à des nanoparticules pour le diagnostic par IRM de la plaque d’athérome ainsi que (2) apporter une thérapie in situ au site inflammatoire. / This thesis is based on the selection of human antibodies and identification of newbiomarkers to develop a diagnosis and a therapy of atherosclerosis. The part one treats, first,the selection of human antibodies in a pathophysiological context in an animal model ofatherosclerosis. To access not only to a large panel of targets but also proteins in their nativeconformation and influenced by their microenvironment, an in vivo selection was performed.In a second time, an innovative high throughput flow cytometry screening was implemented.Contrary to the use of ELISA screening which needs to have an identified target, the flowcytometry doesn’t have this limitation and uses a lower quantity of proteins than ELISAassays. By this screening, two thousand clones were selected. Characterization and specificitytests of these antibodies have yielded to the discovery of galectin 3 has a new biomarker. Thisprotein is implicated in macrophage activation, binding of oxLDL by macrophages to formfoam cells. The second part is about a second screening approach of the antibodies issuingfrom the in vivo selection by using Next Generation Sequencing methods (PacificBiosciences). The results of this primary study allowed for highlighingt two points: (1) thefeasibility to obtain long reads >1000bp identified as scFv after analysis by IMGT/HighVQUEST(international database of immunglobulins) and (2) the feasibility to identify hits ofclones preferentially enriched during the in vivo selection. In conclusion and perspectives,these two complementary methods give the opportunity to obtain human antibodies for (1) thecoupling to nanoparticles for diagnosis by MRI of atheroma plaque and (2) serve as ligandsfor in situ delivery of drugs.

La dengue est une maladie virale endémique dans les pays tropicaux. Bénigne dans sa forme classique (FC), elle peut être redoutable lors de complications associées à sa forme sévère (FS). Actuellement, l’établissement du pronostic d’évolution vers une dengue sévère est peu fiable. Afin d’identifier des marqueurs précoces d’évolution vers une forme sévère, une étude de caractérisation différentielle de plasmas FC et FS prélevés précocement, a été effectuée par différentes approches de protéomique. La protéine non-structurale NS1 est une des protéines virale associée à la pathogénicité. Une méthode de profilage des plasma utilisant la technologie SELDI-TOF/MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry) couplée à un anticorps monoclonal anti-NS1 a été utilisée afin d’identifier les ligands de cette protéine. La protéine NS1 a été détectée spécifiquement dans des plasmas de patients dengue. Aucun partenaire de la NS1 n’a pu être identifié. La méthode peut néanmoins être utilisée pour sérotyper les échantillons.Une analyse différentielle en ICPL (Isotope Coded Protein Labelling) des protéines plasmatiques de patients FC ou FS a permis d’identifier trois marqueurs potentiellement liés la sévérité de la maladie qui ont été validés en ELISA. La synthèse du virus mettant en jeu des partenaires cellulaires, le viroprotéome associé à chaque pathologie a été caractérisé par LC-MS/MS. Une méthode de purification du virus de la dengue a préalablement été mise au point sur un modèle in vitro. Cette méthode a ensuite été appliquée sur des pools de plasmas de patients prélevés en phase virémique. Des protéines virales ainsi que des protéines de l’hôte potentiellement associées aux virus ont été identifiées. Après analyse, une « empreinte » mettant en jeux des voies canoniques spécifiques a pu être déterminée pour les FS. Des ELISA ont été réalisés afin de valider le différentiel d’expression sur un choix de protéines.Au-delà de l’identification d’outils susceptibles d’aider les praticiens à poser un pronostic, ces études s’inscrivent dans la compréhension des mécanismes complexes qui sous-tendent le passage d’une FC à une FS. / Dengue is a endemic viral disease in tropical countries. If its classical form (CF) is benign, its severe form (SF) leads however to serious complications. Currently, the prognosis of severe dengue is unreliable. Differential proteomic studies on acute CF and FS plasma specimens were performed in order to identify early markers of progression to severe forms.The non-structural protein 1 (NS1) is a viral protein associated with pathogenicity. A method using SELDI-TOF/MS (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry) coupled to anti-NS1 monoclonal antibodies was developed in order to profile the proteins interacting with NS1 in plasma. Whereas NS1 protein was specifically detected in acute dengue plasma specimens, no NS1 ligand was identified. This method however allowed for sample serotyping.Plasma proteins of SF and CF patients were analyzed differentially using ICPL (Isotope Coded Protein Labeling). Three markers potentially related to disease severity were identified and validated by ELISA.As cellular partners are involved in virus biosynthesis, the viroproteome associated to each disease was characterized by LC-MS/MS. A method of dengue virus purification was first developed on an in vitro model. This method was then applied to pools of acute plasma of either CF or SF patients. We identified viral proteins as well as host proteins potentially associated with the viral particles. A footprint involving specific canonical pathways were subsequently identified in SF patients. Finally, a set of proteins found differentially expressed was validate by ELISA.Beyond identification of tools allowing assessment of dengue severity prognosis, these results give clues on the complex mechanisms underlying the transition from the CF to the SF.

Les encéphalopathies spongiformes subaigües transmissibles (ESST) sont des maladies neurodégénératives affectant l'Homme et les animaux, l'issue est toujours fatale. La détection dans le sang de l'agent pathogène responsable de l'infection (protéine prion pathologique)reste difficile à ce jour et l'identification de nouveaux biomarqueurs impliqués dans la physiopathologie des ESST constitue un projet ambitieux et risqué. Dans ce contexte, notre objectif est d'établir un profil protéique corrélé aux ESST. L'utilisation d'un modèle animalbien caractérisé : la tremblante naturelle du mouton, d'une technologie adaptée à l'analyse de profils protéiques : SELDI-TOF MS et d'un fluide biologique : le sérum, a constitué la base de nos travaux de recherche. Dans un premier temps, les protocoles expérimentaux ont été mis en place et optimisés. Puis, ils ont été évalués pour leur pertinence dans la discrimination de moutons pathologiques en phases précoce et tardive de la maladie versus des moutons contrôles par analyse des sérums fractionnés ou non. Des biomarqueurs potentiels de faibles poids moléculaires ont été sélectionnés à l'aide de la méthode statistique SAM et une signature protéique permettant un diagnostic précoce a été établie (87% de sensibilité et 90%de spécificité). Un des biomarqueurs a été identifié comme étant un fragment de la transthyrétine, puis son potentiel discriminant a été évalué en SELDI-TOF MS dans une étude cinétique de hamsters Syriens infectés par la scrapie, en western blot et par dosage ELISA.Finalement, une cohorte de validation constituée de moutons appelés « scrapie-free » a permis de valider les biomarqueurs les plus pertinents. / Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative diseasesoccurring in animals and humans for which no ante-mortem diagnostic test in biological fluidsis available. In such pathologies, detection of the pathological form of the prion protein (i.e.,the causative factor) in blood is difficult. Identification of new biomarkers implicated in thepathway of prion infection is relevant. In this context, our objective was to find a proteicprofile correlated to TSEs. We used a well-known TSE model: scrapie in sheep breeding, amass spectrometry technology easy-to-use for proteic profiling: SELDI-TOF MS and abiological fluid: serum. First, experimental tools have been developed and optimized. Thesetools were evaluated for their discriminating potential of control sheep and animals with earlyor late phase scrapie using a large number of serum samples (fractionated or not). Then, usingthe SAM statistical method, potential low molecular weight biomarkers were selected. Amongthese biomarkers, a protein signature pattern was identified; it can discriminate between earlyphase scrapie and control sera (sensitivity of 87% and specificity of 90%). One of theseproteins was identified as a fragment of transthyretin and evaluated as a biomarker using aSELDI-TOF MS kinetic study of sera from scrapie infected Syrian hamsters. This biomarkerwas also confirmed by western blot analysis and ELISA quantitation. Finally, a cohort of freescrapiesheep permits to validate the diagnostic potential of the candidate biomarkers.

Les estuaires ont été soumis à une forte pression humaine qui a entraîné la présence de polluants dans leurs eaux et sédiments, par exemple les métaux traces. Les estuaires du Golfe de Gascogne n’en sont pas une exception et les estuaires d’Ibaizabal et de la Gironde sont bien connus pour avoir des concentrations élevées de métaux. Dans ce contexte, les programmes de surveillance de l’environnement se sont appuyés sur l’utilisation des moules et des huîtres comme espèces sentinelles, car les analyses chimiques et biologiques de leurs tissus permettent d’évaluer l’état général de santé de leur environnement. Dans le but d’acquérir une meilleure compréhension des interactions entre la bioaccumulation et des effets toxiques du cuivre (Cu) et de l’argent (Ag) dans les huîtres Crassostrea gigas, ainsi que l’influence de facteurs environnementaux, le présent travail présente une étude de terrain et trois expériences de laboratoire. Parmi les résultats obtenus, on peut souligner que : (I) même si les huîtres et les moules peuvent indiquer correctement l’état de santé des estuaires du Golfe de Gascogne, une accumulation clairement plus élevée de métaux se produit dans les huîtres que dans les moules, (II) la voie d’exposition (directe ou alimentaire)induit des réponses de différentes intensités dans les huîtres, (iii) la toxicité de l’Ag est renforcée par la présence accrue de Cu dans les huîtres et (IV) la salinité a un faible effet sur la toxicité des métaux dans les huîtres. / Estuaries have been subjected to a high human pressure which has led to the presence of pollutants in their waters and sediments including trace metals. The estuaries in the Bay of Biscay do not constitute an exception of this situation and the Ibaizabal and Gironde Estuaries are both very well known for having high metal concentrations in different compartments. In this context, environmental health monitoring programmes have relied on the use of mussels and oysters as sentinel organisms because chemical and biological analyses of their tissues allow assessing the general health status of their surrounding environment. The present work aims at acquiring a deeper understanding of the interactions between bioaccumulation and the toxic effects of copper (Cu) and silver (Ag) in oysters Crassostrea gigas, as well as the effects that environmental factors may have on them, For this, one field study and three laboratory experiments have been carried out. Among the most relevant results obtained it can be highlighted that: (I) both oysters and mussels are useful to properly indicate the health status of estuaries of the Bay of Biscay, yet higher accumulation of metals occurs in oysters than in mussels, (II) the intake pathway (watercolumn and/or food) induces different response intensities in oysters (III) the toxicity of Ag is enhanced in the presence of Cu in oysters and (IV) salinity has a low effect on the toxicity of both metals in oysters.

L’œil et le système nerveux central (SNC) ont une origine embryologique commune et les structures rétiniennes, facilement observables, pourraient refléter les atteintes cérébrales. L’objectif général de cette thèse était d'analyser les relations entre atteintes rétiniennes et manifestations cliniques (déclin cognitif, démence) et paracliniques (imagerie cérébrale) du vieillissement cérébral. Deux "biomarqueurs" rétiniens ont été analysés : les fibres nerveuses de la rétine (RNFL) et les structures vasculaires. Les données utilisées proviennent de la cohorte populationnelle 3 Cités-Alienor. Nous avons montré que les sujets ayant une épaisseur réduite de la RNFL (mesurée par tomographie par cohérence optique spectral-domain, SD-OCT) présentaient des performances diminuées en mémoire épisodique (principale fonction cognitive affectée dans la maladie d’Alzheimer, MA) après 2 ans de suivi ; sur une période aussi courte, aucune association n'a été trouvée avec le risque de démence. Une épaisseur réduite de la RNFL était aussi associée à des paramètres altérés en IRM au niveau des voies visuelles et des régions du système limbique, régions particulièrement vulnérables dans la MA. Enfin nous avons montré qu'une épaisseur réduite de la couche vasculaire choroïde était associée à un volume d’hypersignaux de la substance blanche plus important. Des processus pathologiques vasculaires et neurodégénératifs sont associés dans le vieillissement cérébral. Ainsi, la rétine pourrait refléter les altérations du SNC dans la MA et le vieillissement cérébral. D'autres recherches doivent encore être menées avant de considérer la rétine comme un biomarqueur potentiel du vieillissement cérébral. / The eye and central nervous system (CNS) have a common embryological origin, and easily observable retinal structures may reflect brain damage. The primary objective of this thesis was to analyze the relationship between retinal disorders and clinical (cognitive decline, dementia) and para-clinical (brain imaging) brain aging manifestations. Two types of retinal "biomarkers" were analyzed: the retinal nerve fiber layer (RNFL) and vascular structures. The data used come from the population-based cohort 3-Cities Alienor. We have shown that subjects with reduced RNFL thickness (measured by spectral-domain optical coherence tomography, SD-OCT) showed a reduced episodic memory score (cognitive function that is principally affected in Alzheimer's disease, AD) after 2 years of follow-up; over this short period of time no association with dementia risk was found. A reduced RNFL thickness was also associated with altered MRI parameters in visual pathways and in limbic system regions, which are particularly vulnerable in AD. Finally we have shown that reduced vascular choroid layer thickness was associated with larger white matter hyperintensities volumes. Vascular and neurodegenerative disease processes are associated with brain aging. Thus, alterations in the CNS by AD and brain aging could be reflected in the retina. Other research is still needed before considering the retina as a potential biomarker of brain aging.

La stratification du risque des patients atteints d'insuffisance cardiaque (IC) systolique chronique est essentielle afin d'identifier ceux qui pourront bénéficier de stratégies invasives telle que la transplantation cardiaque. En dépit des avancées récentes, cette stratification nécessite d'être encore améliorée. En effet, certains patients caractérisés à faible risque vont décéder précocement ; et inversement, d'autres identifiés à haut risque auront une survie prolongée.Objectif - Notre objectif était d'investiguer la place d'une analyse protéomique du plasma dans la stratification du risque des patients IC et de découvrir des biomarqueurs circulants associés à la mortalité cardiovasculaire précoce de ces patients.Méthodes et résultats - Pour ce faire, nous avons d'abord désigné 2 populations : une population test et une de validation. Ces 2 populations étaient issues de la population INsuffisance CArdiaque (INCA) constituée de l'ensemble des patients référés à notre centre pour une évaluation pronostique extensive d'une IC systolique chronique (FEVG <45%) entre novembre 1998 et mai 2010. Pour la phase test (population cas/témoins), nous avons sélectionné 198 patients entre novembre 1998 et décembre 2005: 99 patients décédés de cause cardiovasculaire dans les 3 ans suivant l'inclusion (cas) ont été comparés à 99 survivants à 3 ans appariés sur l'âge, le sexe et la cause de l'IC (témoins). Pour la phase de validation, nous avons évalué une cohorte de 344 patients consécutifs inclus entre janvier 2006 et mai 2010. Les populations ont été parfaitement caractérisées. La mortalité cardiovasculaire était définie comme un décès de cause cardiovasculaire, une transplantation en urgence (critère United Network for Organ Sharing status 1) ou une assistance cardiaque en urgence.Une analyse protéomique utilisant la technique SELDI-TOF-MS a ensuite été réalisée dans la population test sur des échantillons de plasma prélevés à l'inclusion. Les échantillons ont été déplétés des protéines majoritaires et analysés après randomisation en duplicate en utilisant des puces CM10 (échangeur de cations) et H50 (hydrophobie). Au total, 42 pics m/z étaient différentiellement abondants entre les cas et les témoins et ont été utilisés pour développer des scores protéomiques prédicteurs de la mortalité cardiovasculaire à l'aide de 3 méthodes statistiques de régression : machine à vecteur de support, régression des moindres carrés partiels et régression logistique de Lasso. Les scores protéomiques ont ensuite été testés dans la population de validation et étaient significativement plus élevés chez les patients qui vont décéder dans les 3 ans avec les 3 méthodes. Ces scores protéomiques persistaient associés à la mortalité cardiovasculaire après ajustement sur les facteurs confondants. De plus, l'utilisation de ces scores permettait une amélioration significative de la discrimination des patients IC par rapport à une évaluation pronostique classique selon les index suivants : "integrated discrimination improvement" et "net reclassification improvement".L'étape suivante a été de procéder à la purification et à l'identification des protéines correspondant aux pics m/z différentiellement abondants dans les 2 populations (n=13). Actuellement, nous avons pu identifier plusieurs apolipoprotéines : 14511 CM10-BM (ApoA1), 29024 CM10-BM (ApoA1), 3267 H50-BM (ApoC1), 6416 H50-BM (ApoC1), 6616 H50-BM (ApoC1), 6825 H50-BM (ApoC1), 8764 H50-BM (ApoC3), 9421 H50-BM (ApoC3). ceci a conduit à la quantification de ces apolipoprotéines dans la population INCA par une technique de "mass reaction monitoring".Conclusion - Une analyse protéomique des protéines du plasma semble améliorer la stratification du risque de mortalité précoce chez les patients atteints d’une IC chronique.Perspectives - Des investigations complémentaires sont en cours afin de déterminer l'impact des apoplipoprotéines dans la stratification du risque de ces patients. / Risk stratification of patients with systolic chronic heart failure (HF) is critical to better identify those who may benefit the most from invasive therapeutic strategies such as cardiac transplantation. In spite of recent advances, risk stratification of HF patients needs to be further improved. Indeed, there remains variability in the prognosis with some patients who are categorized at low risk but experience early mortality; and conversely, patients categorized as severe but have an unexpectedly prolonged survival. Proteomics has been used to provide prognostic information in various diseases.Aim – Our aim was to investigate the potential value of plasma proteomic profiling for risk stratification in HF and to find new circulating biomarkers that are associated with early cardiovascular mortality of chronic HF patients.Methods and results – For that purpose, we first designed 2 populations: a discovery and a validation population. Both populations issued from the INsuffisance CArdiaque (INCA) cohort, which is constituted of all consecutive patients referred in our institution for extensive prognostic evaluation of systolic chronic HF (LVEF <45%) between November 1998 and May 2010. For the discovery phase (case/control population), we selected 198 patients included between November 1998 and December 2005: 99 patients who died from cardiovascular cause within 3 years after the initial evaluation (cases) were individually matched for age, sex, and HF etiology with 99 patients who were still alive at 3 years (controls). For the validation phase, we evaluated a cohort of 344 consecutive patients included between January 2006 and May 2010. Study populations were carefully phenotyped. Cardiovascular death included cardiovascular-related death, urgent transplantations defined as United Network for Organ Sharing status 1 and urgent assist device implantation. A proteomic profiling using surface enhanced laser desorption ionization - time of flight - mass spectrometry was then performed in the case/control discovery population on plasma samples collected at inclusion. Plasma samples were depleted for major proteins and randomly analyzed in duplicate using CM10 (Weak Cation Exchanger) and H50 (Reverse Phase) proteinchip arrays. Forty two ion m/z peaks were found differentially abundant between cases and controls in the discovery population and were used to develop proteomic scores predicting cardiovascular death using 3 statistical regression methods: support vector machine, sparse partial least square discriminant analysis and lasso logistic regression. The proteomic scores were then tested in the validation population and score levels were significantly higher in patients who subsequently died within 3 years with the 3 methods. Proteomic scores remained significantly associated with cardiovascular mortality after adjustment on confounders. Furthermore, use of the proteomic scores allowed a significant improvement in discrimination of HF patients as determined by integrated discrimination improvement and net reclassification improvement indexes on top of “classic” prognostic evaluation. The next step was the purification and identification of the proteins related to the different m/z peaks (n=13) that were found significantly differentially abundant in both populations. We have currently identified several peaks as apolipoproteins: 14511 CM10-BM (ApoA1), 29024 CM10-BM (ApoA1), 3267 H50-BM (ApoC1), 6416 H50-BM (ApoC1), 6616 H50-BM (ApoC1), 6825 H50-BM (ApoC1), 8764 H50-BM (ApoC3), 9421 H50-BM (ApoC3). This has led to the quantification of these apolipoproteins in the INCA population using mass reaction monitoring technique.Conclusion – Proteomic analysis of plasma proteins may help to improve risk prediction of early mortality in HF patients.Perspectives – Further investigations are ongoing in order to determine the impact of the different apolipoproteins tested in risk stratification of chronic HF patients.

Bien que le mélanome malin cutané (MMC) ne représente que 10% des cancers cutanés, il en est la forme la plus agressive et est responsable de 90% des décès dus aux cancers de la peau. Son incidence ne cesse d'augmenter ces dernières années et atteint 10.8 cas pour 100 000 habitants chez les hommes et 11 chez les femmes. La survie médiane des patients atteint de mélanome à un stade avancé est de 6.2 mois et seulement 1 patient sur 4 est encore en vie à 1an. Le diagnostic du mélanome est uniquement histopathologique et seul l'examen de la biopsie permet de le poser définitivement. De la même façon, il n'existe pas de marqueurs pronostiques associés au mélanome malin cutané. Seuls des facteurs histologiques tels que l'épaisseur de la tumeur, le degré d'invasion ou encore l'envahissement ganglionnaire ont été validés par l'American Joint Committee on Cancer et servent de facteurs pronostiques. Cependant, bien qu'ils permettent d'évaluer le risque métastatique, leur valeur pronostique est encore très insuffisante. L'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser les protéines associées à la progression tumorale du MMC. Grâce à une approche protéomique quantitative de type iTRAQ par nanoLC MS/MS, j'ai pu identifier et caractériser 2242 protéines dans un modèle cellulaire de progression tumorale du mélanome. La surexpression de huit de ces protéines dans les lignées tumorales par rapport à la lignée normale a été validée par western blot. Deux d'entre elles, TRAP1 et PDIA4 ont ensuite été validées en immunohistochimie comme marqueurs associés à la progression tumorale dans le MMC. Dans un second temps, l'implication de ces deux protéines dans les mécanismes de carcinogénèse du mélanome a été étudiée. L'inhibition de TRAP1 et de PDIA4 induit une diminution de la migration et de la viabilité de la lignée cellulaire métastatique de mélanome 1676. Enfin, la sous-expression dePDIA4 induit une inhibition du complexe Cycline D/CDK4 provoquant un blocage des cellules en phase G0/G1. Ce blocage passerait par la voie PERK liées au stress du réticulum endoplasmique. / Although cutaneous malignant melanoma (CMM) represents only 10% of skin cancers, it is the most aggressive form with 90% of deaths from skin cancer. The Incidence rate is increasing in recent years to 10.8 cases and 11 cases per 100000, in men and women respectively. The prognosis of metastatic melanoma is poor, with a median survival of only 6.2 months. Histopathologic examination remains the gold standard for melanoma diagnosis. There are no prognostic markers associated with CMM. Only histological factors such as tumor thickness, level of invasion, or lymph node involvement have been validated by the American Joint Committee on Cancer and are currently used as prognostic factors. However, although these histological factors are used to assess the risk of metastasis development, their prognostic value is still very low. The aim of my PhD work is to identify and characterize biomarkers associated with tumor progression of CMM. Using a quantitative proteomics approach (iTRAQ and nanoLCMS/MS), I was able to identify and characterize 2242 proteins in a cellular model of melanoma tumor progression. The overexpression of eight proteins in tumor cell lines compared to the normal cell line was validated by immunoblotting. Among these proteins, TRAP1 and PDIA4 were then validated by immunohistochemistry as markers associated with tumor progression in the CMM. Secondly, the involvement of these two proteins in the mechanisms of melanoma carcinogenesis has been studied. The inhibition of TRAP1 and PDIA4 induces a decrease in migration and viability of the metastatic melanoma cell line. Finally, PDIA4 under expression induce an inhibition of cyclin D/Cdk4 complex leading to G0/G1 cell-cycle arrest dependant of endoplasmic reticulum stress by the PERK pathway.

L’objectif du travail a été d’explorer la valeur pronostique pour les tumeurs de la vessie des polymorphismes de gènes associés à l’inflammation et du microenvironnement tumoral lymphocytaire CD8+. Pour les marqueurs constitutionnels, deux approches ont été conduites concomitamment, l’une explorant de façon globale les gènes associés à l’inflammation, l’autre ciblant un gène inflammatoire d’intérêt, PDL1, impliqué dans des points de contrôles immunologiques. A l’échelle du génome, en utilisant des méthodes statistiques soit classiques soit innovantes (dites multi marqueurs), nous avons démontré que les variants (SNP) dans les gènes TNIP1, CD5 et JAK3 étaient associés au risque de récidive des tumeurs de vessie non invasives du muscle alors que les variants dans les gènes MASP1, AIRE et CD3 étaient associés au risque de progression. Dans un deuxième temps, l’association entre variants dans le gène de PDL1 et pronostic des tumeurs de vessie a été explorée en appliquant une méthode classique « SNP par SNP » et une approche à l’échelle du gène. Nous avons identifié une forte association entre des variants de PDL1 et le pronostic de tumeurs de vessie envahissant le muscle dans une large cohorte prospective, mais sans pouvoir répliquer ce résultat dans une série issue du consortium TCGA.Dans les tumeurs n’envahissant pas le muscle, nous avons développé et évalué une méthode d’évaluation standardisée de l’infiltrat lymphocytaire CD8+, cellules T-cytotoxiques impliquées dans la mort des cellules tumorales. L’analyse morphométrique après double immuno-marquage des cellules tumorales et des lymphocytes CD8+ et numérisation a permis d’estimer de façon séparée le compte des cellules inflammatoires dans la tumeur et le stroma, et d’estimer l’hétérogénéité spatiale intra-tumorale. Nous avons montré que cette hétérogénéité limite les estimations de l’infiltrat CD8+ sur les puces tissulaires (Tissue Micro Array) qui échantillonnent les tumeurs de façon restrictive. Sous cette réserve, nous avons identifié dans les tumeurs n’envahissant pas le muscle une association entre l’infiltrat lymphocytaire CD8+ et le stade tumoral Ta/T1, ainsi qu’avec le risque de récidive des tumeurs T1. A l’avenir, variations génétiques constitutionnelles dans les gènes de l’inflammation et évaluation de l’infiltrat tumoral inflammatoire pourraient être intégrées en vue d’améliorer la prédiction du pronostic des tumeurs vésicales. / The aim of this study was to explore prognostic value for bladder cancer of germline polymorphisms in inflammatory genes and tumor CD8+ lymphocytic microenvironment. For constitutional markers, two approaches were conducted jointly: one genome-based using specific GWAS statistical methods, the other gene-based focusing on PDL1, an inflammatory gene implicated in immune checkpoints. At the genome level, using both standard and innovative statistical methods (multi marker methods Bayesian Lasso and Bayes A) we demonstrated that variants (SNPs) in TNIP1, CD5 and JAK3 were associated with the risk of recurrence of non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) while SNPs in MASP1, AIRE and CD3 were associated with risk of progression. Meanwhile, association between PDL1 and prognosis of NMIBC and muscle invasive BC (MIBC) was explored using classical SNPS by SNP investigations and a gene based approach. We identified a very strong association between PDL1 variants and MIBC prognosis in a large prospective cohort but failed replicating those results in the TCGA consortium series.In non-muscle invasive bladder cancer, we developed and evaluated a standardized counting approach of CD8+ cells, T-cytotoxic lymphocytes implicated in tumor cells death. Morphometric analysis after double immuno-staining of tumor cells and digitalization allowed separate estimation of CD8+ cells in the tumor and stroma compartment and estimation of spatial intra tumoral heterogeneity. We demonstrated that this heterogeneity compromised CD8+ estimation on Tissue Micro Arrays, which sample the tumors in a restrictive manner. Keeping those limitations in mind, we identified an association between CD8+ inflammatory infiltrate and both NMIBC stage and T1 tumours risk of recurrence. In the future, germline variation in inflammatory genes and evaluation of tumor inflammatory infiltrate could be integrated for better prediction of bladder cancer prognosis.