Especies reativas de oxigenio/nitrogenio (ERO/ERN) produzidas por neutrofilos atraves do complexo NADPH oxidase (Nox2) estao diretamente associadas as acoes deleterias surgidas quando a inflamacao escapa do controle da homeostase. A ativacao da NADPH oxidase de neutrofilos requer o acoplamento das subunidades citosolicas aos componentes de granulos e translocacao do complexo a membrana do fagossoma. A PDI (Proteina Dissulfeto Isomerase, EC 5.3.4.1) e uma chaperona envolvida no trafego proteico celular, sendo encontrada na superficie de diversas celulas procarioticas e eucarioticas. Trabalhos previos sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsaveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o transito das subunidades ate a membrana do fagossoma. Neste trabalho foi testada a atividade de Nox2 de neutrofilos inflamatorios correlacionada a atividade redutase de PDI de membrana e o efeito do nitroxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil (Tempol) sobre esses processos. Neutrofilos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e nao foi detectado consumo de oxigenio associado ao sistema Nox2, conforme ensaios realizados com uso de um pseudo-substrato para PDI e monitoramento com eletrodo de Clark, respectivamente. Sob estimulo de forbol (PMA), os fagocitos consumiram quantidade significativa de oxigenio (6.5„b0.58 nmol.min-1) e apresentaram alta atividade de PDI, cerca de quatro vezes maior que as celulas dormentes. Quando os fagocitos foram previamente tratados com Tempol houve decrescimo dose-dependente da atividade de Nox2 (ED50: 45 ƒÝg/106 neutrofilos), em correlacao direta com o decrescimo da atividade de PDI. Testes com inibidores padroes de PDI (bacitracina e acido ditionitrobenzoico- DTNB) confirmaram que a inibicao de PDI determina decrescimo da atividade de Nox2, resultados obtidos atraves de ensaios espectrofotometricos (reducao de citocromo c, 550 nm) e quimioluminescentes (sistema luminol-peroxidase). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente a atividade de Nox2 em neutrofilos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona esta diretamente associada a ativacao e/ou manutencao da atividade da oxidase fagocitaria. Adicionalmente, esse trabalho mostrou que o nitroxido Tempol e capaz de modular negativamente a atividade de Nox2, cujo efeito, ao menos em parte, e decorrente da inibicao de PDI, sugerindo um novo mecanismo anti-inflamatorio dos nitroxidos. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). This study examines whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) inhibits the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory neutrophils. Phorbol-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in neutrophils, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Both events were significantly inhibited in a concentration-dependent manner when neutrophils were pre-treated with Tempol, which has an ED50 of 45 M. To substantiate that Tempol’s action on PDI activity is related to Nox2 downregulation, assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the neutrophil respiratory burst. This study shows that Tempol’s inhibition of Nox2 activity is correlated with decreased PDI reductase activity at the neutrophil cellular membrane, suggesting a close association between the enzymes of activated phagocytes and pointing to a novel anti-inflammatory mechanism for Tempol. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

As espécies reativas de oxigênio/nitrogênio são produzidas por fagócitos, inicialmente, pela formação do ânion superóxido do qual se derivam outros potentes microbicidas. Em resposta ao estresse oxidativo/nitrosativo, todas as células apresentam capacidade de defesa antioxidante endógena. Fungos são capazes de modular sua defesa antioxidante aumentando sua patogenicidade frente às defesas do organismo hospedeiro. Vários dados experimentais levantam a hipótese que de que Candida albicans são fungos que aumentam sua defesa antioxidante para formação de biofilmes. Os nitróxidos são antioxidantes sintéticos que modulam a atividade do complexo NADPH oxidase (Nox2) de fagócitos, reduzindo a produção de ânions superóxido. Esse efeito dos nitróxidos diminui as ações deletérias de oxidantes durante um processo inflamatório, mas poderia comprometer a capacidade microbicida dos fagócitos. O objetivo deste trabalho foi o estudo da interação entre neutrófilos humanos e C. albicans na forma planctônica e biofilme, enfocando a defesa antioxidante enzimática como mecanismo de patogenicidade do fungo. O efeito de adição do nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol) foi testado, com o intuito de verificar se este composto altera a resistência destes microrganismos ao ataque de oxidantes produzidos por fagócitos. Foi realizado o doseamento das enzimas antioxidantes superóxido dismutases (SOD) e catalase (CAT) das leveduras e dos neutrófilos na presença e ausência do Tempol. O monitoramento do burst respiratório foi utilizado para determinar os efeitos do nitróxido sobre a atividade de Nox2 dos neutrófilos. O ensaio de killing de C. albicans por neutrófilos foi realizado cultivando-se a levedura na presença de neutrófilos previamente tratados com Tempol ou apenas com o veículo e avaliado através de contagem de unidades formadoras de colônias. Os resultados revelaram uma alta atividade das enzimas SOD e CAT no fungo, sendo maior quando em biofilme. Além disso, a levedura diminuiu a atividade enzimática antioxidante dos neutrófilos humanos, quando os mesmos foram expostos. O Tempol foi capaz de reduzir essa atividade tanto na levedura quanto nos neutrófilos. A levedura em suas formas estudadas estimulou alta atividade de Nox2 dos neutrófilos e o Tempol inibiu a mesma. Através do ensaio de killing foi detectado um crescimento menor do fungo quando na presença dos neutrófilos e um maior crescimento microbiano quando adicionado o Tempol, sugerindo um comprometimento da ação fungicida dos neutrófilos. Os resultados mostraram que, na forma de biofilme, C. albicans tem uma maior defesa frente ao sistema imune do hospedeiro, decorrente, ao menos em parte, da alta atividade das enzimas SOD e CAT, o que exige uma demanda mais elevada de espécies oxidantes para controlar o foco infeccioso. A presença de um antioxidante sintético provocou diminuição da concentração destas espécies oxidantes, o que pode ser deletério no controle da infecção. / The early reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) produced by phagocytes are superoxide anions, from which are derived other oxidant compounds that are potent microbicides. In response to oxidative/nitrosative stress, all cells present endogenous antioxidant defense capacity. Some fungi are able to modulate their antioxidant defense, increasing their pathogenicity forward to the oxidant host organism attack. Attention has been given to the ability of Candida albicans biofilms modulate their antioxidant defense, associated to the increase of morbidity and mortality of infected patients. Nitroxides are synthetic antioxidants that modulate the activity of Nox2 in phagocytes, reducing the production of superoxide anions. This effect of nitroxides decreases the harmful effects of ROS/RNS during an inflammatory process, but could compromise the microbicidal capacity of phagocytes. The aim of this work was to study the interaction between human phagocytes and C. albicans in both, planktonic and biofilm, forms. Also, the effect of nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (Tempol) was tested in order to verify the hypothesis of interference of this antioxidant in the host immune defense. The antioxidant enzymes catalase (CAT) and superoxide dismutases (SOD) were evaluated in yeasts and neutrophils, either in presence or absence of Tempol. Neutrophil respiratory burst was monitored to determine the effects of the nitroxide on superoxide anion production. Killing assay of C. albicans was performed by cultivating yeast in the presence of human neutrophils with or without Tempol addition, followed by colony forming units counting. The results showed a high activity of SOD and CAT in the fungus, which was stronger when biofilm form was established than that planktonic one. In addition, the exposure to yeast caused a decrease on antioxidant enzymes activities of human neutrophils. Tempol addition caused a significant impairment on both antioxidant enzymatic activities, as in neutrophil suspensions as in cultured fungi. Exposure to C. albicans biofilms stimulated a larger neutrophil superoxide anion formation than correspondent planktonic form, an event that was inhibited by Tempol. Nitroxide addition partially deleted neutrophil fungicide capability, suggesting a deleterious action on phagocytic fulfillment on host defence. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-05T14:11:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) MARCIA ROSULA POETINI SILVA.pdf: 1891478 bytes, checksum: e4874e22f3dbc89ee3033d4701e4a8a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-05T14:11:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) MARCIA ROSULA POETINI SILVA.pdf: 1891478 bytes, checksum: e4874e22f3dbc89ee3033d4701e4a8a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:11:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) MARCIA ROSULA POETINI SILVA.pdf: 1891478 bytes, checksum: e4874e22f3dbc89ee3033d4701e4a8a2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Os flavonoides são compostos naturais presentes em diversos tipos de plantas, são quimicamente classificados como polifenóis e geralmente encontrados em sua forma livre ou glicosilada. A Hesperidina (Hsd) é um flavonoide cítrico, encontrado principalmente em frutas cítricas como a laranja e o limão, classificado como flavanona glicosídica e possui propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas, antivirais, hipolipidêmica, entre outras. O ferro (Fe) é um nutriente fundamental para todas as células vivas, mas em excesso pode ser tóxico, por causar danos oxidativos através da formação de radicais livres, como a reação de fenton, os quais resultam em fenômenos de estresse oxidativo. Uma desregulação no metabolismo do Fe está associado com dano celular e também a doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e Alzheimer. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito neuroprotetor da hesperidina na exposição aguda ao ferro na forma de sulfato ferroso em Drosophila melanogaster adultas macho. As moscas foram divididas em quatro grupos: 1) controle, 2) hesperidina (10 μM), 3) Fe (20 mM) na forma de sulfato ferroso, 4) hesperidina (10 μM) + Fe (20 mM). As moscas foram concomitantemente expostas ao Fe e Hsd na dieta em papel filtro (dissolvidos em sacarose 1 %) por 48 horas, de acordo com seus respectivos grupos. Para as análises in vivo foram avalizadas a sobrevivência e os comportamentos (testes como geotaxia negativa, campo aberto e base/topo) e ex vivo a atividade da acetilcolinesterase (AChE) na cabeça e no corpo, viabilidade celular e mitocondrial e determinação dos níveis de dopamina na cabeça das moscas. A atividade da catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa S-transferase (GST), os níveis de peroxidação lipídica (TBARS), níveis de espécies reativas (ER), o teor de tióis não protéicos (NPSH), os tióis totais e os níveis de ferro na cabeça e no corpo de Drosophila melanogaster também foram avaliados. A exposição ao Fe aumentou significativamente a mortalidade das moscas, enquanto que as sobreviventes apresentaram déficit locomotor significativo com atividade aumentada de AChE. No entanto, a suplementação dietética com Hsd causou uma diminuição significativa na mortalidade, melhora da atividade locomotora e restauração da atividade da AChE em moscas expostas ao Fe. O metal também causou decréscimo nos níveis de tióis totais e não proteicos e na atividade das enzimas SOD, CAT e GST, acompanhadas com aumento significativo na geração de ER e TBARS, assim como aumento nos níveis de Fe na cabeça e no corpo e redução nos níveis de dopamina na cabeça das moscas expostas ao elemento. Efeitos esses prevenidos pela hesperidina. A hesperidina apresentou o potencial antioxidante e amenizou o efeito causado pela exposição aguda ao Fe em Drosophila melanogaster. / Flavonoids are natural compounds present in many plant types, are chemically classified as polyphenols and are generally found in their free or glycosylated form. Hesperidin (Hsd) is a citrus flavonoid, found mainly in citrus fruits such as orange and lemon, classified as flavanone glycosidic and has antioxidant, anti-inflammatory, anticancer, antiviral, hypolipidemic properties, among others. Iron (Fe) is a fundamental nutrient for all living cells, but in excess it can be toxic because it causes oxidative damage through the formation of free radicals, such as fenton reaction, which result in phenomena of oxidative stress. Deregulation in the metabolism of Fe is associated with cellular damage and also neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's. The objective of this study was to evaluate the neuroprotective effect of hesperidin on acute exposure to iron in the form of ferrous sulfate in adult male Drosophila melanogaster. The flies were divided into four groups: 1) control, 2) hesperidin (10 μM), 3) Fe (20 mM) as ferrous sulfate, 4) hesperidin (10 μM) + Fe (20 mM). Flies were concomitantly exposed to Fe and Hsd in the diet on filter paper (dissolved in 1% sucrose) for 48 hours, according to their respective groups. Survival and behaviors (tests such as negative geotag, open field and base / top) and ex vivo acetylcholinesterase (AChE) activity in head and body, cell and mitochondrial viability and determination of dopamine on the head of flies. The activity of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione Stransferase (GST), levels of lipid peroxidation (TBARS), reactive species levels (RS), nonprotein thiol content (NPSH), total thiols and iron levels in the head and body of Drosophila melanogaster were also evaluated. Exposure to Fe significantly increased fly mortality, while survivors had significant locomotor deficits with increased AChE activity. However, dietary supplementation with Hsd caused a significant decrease in mortality, improvement of locomotor activity and restoration of AChE activity in Fe-exposed flies. The metal also caused a decrease in the levels of total and non-protein thiols and in the activity of SOD enzymes , CAT and GST, accompanied with a significant increase in RS and TBARS generation, as well as increase in Fe levels in the head and body and reduction in dopamine levels in the head of the flies exposed to the element. These effects prevented by hesperidin. Hesperidin presented the antioxidant potential and attenuated the effect caused by the acute exposure to Fe in Drosophila melanogaster.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-05T14:30:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) NEICI CACERES SILVA.pdf: 1202377 bytes, checksum: 5bb6385a1361f9c1260f1e75c6bb7a30 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2017-06-05T14:30:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) NEICI CACERES SILVA.pdf: 1202377 bytes, checksum: 5bb6385a1361f9c1260f1e75c6bb7a30 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) NEICI CACERES SILVA.pdf: 1202377 bytes, checksum: 5bb6385a1361f9c1260f1e75c6bb7a30 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / As doenças cardiovasculares (DCV) representam um problema de saúde pública, e as dislipidemias constituem importantes fatores de risco para seu desencadeamento. A alteração de lipídeos circulantes constitui o maior fator de impacto no desenvolvimento da doença aterosclerótica. Segundo pesquisas fitoquímicas, sabe-se que a planta nativa erva-de-passarinho (EP) da espécie Tripodanthus acutifolius (TA) possui atividade antioxidante promissora, sendo utilizada em alguns estudos como hipoglicemiante, antibacteriano, antiinflamatório e diurético. Estudos evidenciam que o estresse oxidativo (EO) está diretamente relacionado com a dislipidemia, ocupando um local de destaque no processo inflamatório e na progressão da aterosclerose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do extrato hidroalcoólico das folhas de Tripodanthus acutifolius em ratos Wistar hipercolesterolêmicos. Os animais foram divididos em 5 grupos: CN (Controle Normocalórico); CH (Controle Hipercalórico); Suspensão oral de Sinvastatina 10 mg/Kg (SIM 10 mg/Kg); Extrato de TA 50 mg/Kg (TA 50 mg/Kg) e Extrato TA 100 mg/Kg (TA 100 mg/Kg). Somente o CN recebeu apenas ração, os demais grupos receberam uma dieta hipercolesterolêmica por 30 dias, após a confirmação da hipercolesterolemia, as formulações foram administradas por gavage uma vez ao dia. Após este período, os ratos foram eutanasiados e o sangue venoso e órgãos coletados para análises posteriores. Foi realizada a análise fitoquímica do pó liofilizado das folhas de TA através da HPLC-DAD. O composto majoritário encontrado nas folhas de TA foi a isoquercitrina, seguido pela catequina e a luteolina. Foram realizados ensaios in vitro para determinação da atividade antioxidante. Os resultados encontrados neste trabalho indicam que o extrato de TA (0,5 mg/mL) obteve uma porcentagem de inibição de 95,3 % frente ao DPPH e 92,40 % ao radical ABTS. A quantidade de polifenóis totais mostrou comportamento dose-dependente. Na concentração de 1,0 mg/mL a concentração de fenólicos totais foi de 45,80 mg de ácido gálico/mL. Nos ensaios realizados vii in vivo os resultados demonstram que todos os grupos suplementados com TA, mostraram uma redução significativa (p <0.05) na contagem total de plaquetas em relação aos grupos controle. Além disso, os grupos CH e SIM apresentaram elevada contagem de monócitos quando comparados aos grupos suplementados com TA. Na suplementação com TA observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos níveis de colesterol total em todos os grupos suplementados em relação ao CH, apresentando níveis menores que o próprio grupo CN. Também observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos níveis de triglicerídeos, colesterol-LDL, em todos os grupos tratados, assim como o aumento dos níveis do colesterol-HDL, em comparação com o grupo CH. No tratamento com TA observou-se uma redução significativa (p <0.05) nos marcadores de função hepática, renal e cardíaca. Durante a análise dos marcadores inflamatórios, notou-se um aumento significativo (p <0.05) de Adiponectina nos grupos suplementados com TA e uma redução nos níveis de PCRus em relação ao grupo CH. Os grupos que receberam TA apresentaram uma redução significativa (p <0.05) em relação ao CH na peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e frequência de micronúcleos induzidos pela hipercolesterolemia. Os grupos suplementados com TA demonstraram também aumento significativo (p <0.05) na atividade das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx. Observou-se ainda aumento dos níveis de Polifenóis, Vit C e GSH. Na análise histológica, o tratamento foi capaz de diminuir o espassamento da aorta, mostrando um efeito protetor contra a aterosclerose. Assim, pode-se sugerir que extrato de TA é promissor no tratamento da dislipidemia. / Cardiovascular diseases (CVD) represent a public health problem, and dyslipidemias are important risk factors for their onset. Changes in the levels of circulating lipids constitute the major impact factor in the development of atherosclerotic disease. According to phytochemical research, it is known that Tripodanthus acutifolius (TA) shows promising antioxidant activity, and has been applied as a hypoglycemic, antibacterial, anti-inflammatory and diuretic compound. Studies indicate that oxidative stress (OE) is directly related to dyslipidemia, playing a prominent role in inflammatory processes and in the progression of atherosclerosis. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effects of hydroalcoholic Tripodanthus acutifolius leaf extracts on hypercholesterolemic Wistar rats. The animals were divided into 5 groups: NC (Normocaloric Control); HC (Hypercaloric Control); Oral Simvastatin Suspension 10 mg/kg (SIM 10 mg/kg); TA Extract 50 mg/kg (TA 50 mg/kg) and TA Extract 100 mg/kg (TA 100 mg/kg). The NC group was the only one to receive only feed, while the others received a hypercholesterolemic diet for 30 days. After hypercholesterolemia confirmation, the formulations were administered by gavage once a day. Rats were then euthanized and venous blood and organs were collected for further analyses. The phytochemical analysis of the lyophilized TA powder leaves was performed by HPLC-DAD. The major compound found in the TA leaves was isoquercitrin, followed by catechin and luteolin. In vitro assays were performed to determine antioxidant activity. The TA extract (0.5 mg/mL) resulted in 95.3% DPPH inhibition and 92.40% ABTS inhibition. Total polyphenols showed a dose-dependent behavior. At 1.0 mg/mL, total phenolic concentrations showed 45.80 mg gallic acid mL-1. In vivo assays demonstrated that all TA-supplemented groups showed a significant (p <0.05) decrease in total platelet counts relative to the control groups. In addition, the HC and SIM groups showed high monocyte counts when compared to the TA-supplemented groups. A significant (p <0.05) decrease in total ix cholesterol levels was observed in all TA-supplemented groups compared to HC, with lower levels than even the NC group. A significant (p <0.05) decrease in triglycerides and LDL-cholesterol levels in all TA-treated groups was also observed, as well as increases in HDL cholesterol levels compared to the HC group. Significant decreases (p <0.05) in liver, renal and cardiac function markers were observed after TA treatment. The analysis of inflammatory markers revealed a significant increase (p <0.05) in adiponectin and decrease in PCRus levels in the TA-supplemented groups in relation to the HC group. The TA-supplemented groups also showed a significant decrease (p <0.05) in relation to HC in lipid peroxidation, protein carbonylation and micronucleus frequency induced by hypercholesterolemia, as well as a significant increase (p <0.05) in the activity of the antioxidant enzymes CAT, SOD and GPx and an increase in Polyphenols, Vit C and GSH. The histological analysis demonstrated that the treatment was able to reduce aortic spasm, exhibiting a protective effect against atherosclerosis. Thus, it may be suggested that TA extract is promising in the treatment of dyslipidemia.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_RaquelLopesCosta.pdf: 18200395 bytes, checksum: 43feaef8d856d7407f2c1362a1e32956 (MD5) Previous issue date: 2010-06-01 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / Viruses evolve at a fast rate, allowing them to accumulate genetic variation in a range of time accessible to epidemyological studies. Among RNA viruses, the dengue virus Flavivirus is the agent of the most widespread viral disease transmited by a insect borne vector of the Aedes genus and affects tropical and subtropical zones. The MCMC Bayesian inference was used in this study assessed the patterns of the viral distribution and molecular evolution of four serotypes of dengue virus (DENV-I, II, III and IV). In total, 603 samples of the envelope from 71 countries that have been isolated for 64 years (1944-2008) were evaluated. Our results show similarities for the average rate of evolution of each serotype (about 7.5 x 10^-4 subst/site/year), with a considerable 95% superposition of HPD. When samples are taken together, the analysis coalescence suggests that the first divergence among serotypes happened at about 330 AD. Extinctions, expansions and the emergence of new lineages are responsible by the intra-serotypical diversity currently observed. Analysis of population show high rate of epidemic increase related to the introduction of new serotypes in Central and South America. Geographic distribution pattern show strong spatial and temporal subdivision, mainly in America and South Asia. / Os vírus, possuem uma rápida taxa evolutiva, acumulando variação genética em um intervalo de tempo acessível aos estudos epidemiológicos. Entre os vírus de RNA, o vírus da dengue Flavivirus é o agente da mais ampla doença viral transmitida por um inseto vetor do gênero Aedes que afeta países das regiões tropicais e subtropicais. Através de técnicas de inferência bayesianas por cadeia de Markov Monte Carlo, este estudo avaliou padrões de distribuição viral e evolução molecular dos quatro sorotipos de vírus da Dengue (DENV-I, II, III e IV) em 603 amostras da região do envelope distribuídas em 71 países e isolados por um período de 64 anos (1944 a 2008). Os resultados mostraram semelhanças nas taxas médias de evolução dos sorotipos (em torno de 7.5 x 10^-4 substituições/por sítio/por ano) com uma considerável sobreposição de 95% de probabilidade posterior. A coalescência das amostras conjuntas sugere que a primeira divergência entre os sorotipos aconteceu por volta de 330 d.C com processos de extinção, aparecimento e expansão de novas linhagens responsáveis pela diversidade intrasorotípica atualmente observada. As análises populacionais revelaram altas taxas de crescimento epidêmico relacionadas com introduções de sorotipos ocorridos principalmente nas Américas Central e do Sul. Padrões de distribuição geográfica mostraram forte estrutura espaço-temporal, principalmente no sudeste asiático e nas Américas.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_aline.pdf: 3429789 bytes, checksum: 82cf452f7244c55bd99e241aadcec89f (MD5) Previous issue date: 2007-05-07 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / The extracelullar matrix (ECM) is formed by an assembly of proteins and glycoproteins which surrounds the cells, in various tissues. The laminin is a glycoprotein localized in the ECM that consists of three polypeptidic chains cross- shaped. It functions by anchoring epithelial cells to basal lamin, through associations with integrins, collagen, elastin and fibronectin. Integrins are adhesion receptors localized on cellular surface, that mediate interactions between cells and ECM. The interactions between proteins of ECM and cellular proteins are crucial for many normal biological processes such as cell differentiation, signal transduction, immune responses, wound healing and metastasis formation. The nature of interactions between laminin and integrin has not been fully identified yet. The present work aims to analyze, in an molecular scale, the interaction between human α6β1 integrin and laminin 111. In this work we conducted many studies, including: i) structural and sequential alignments of β-propeller and βA regions in lacking I-domain integrins; ii) model building of β-propeller e βA regions of α6β1 integrin complexed with small ECD or RGD peptide antagonists; iii) sequential alignment of various laminin LG domains; iv) model building of laminin 111 LG1 domain; and v) model building of the first described complex between the N-terminal portion of α6β1 integrin and laminin 111 LG1 domain. In order to do this, homology modeling and molecular dynamics techniques were applied, together with alignments between integrins α and β chains, and laminin LG domains. Our initial results show that the loop between blades 3 and 4 of α6 integrin subunit discriminates ligands by electrostatic interactions. Therefore we assumed that α6β1 integrin preferentially interacts with ECDF based peptides. It was demonstrated that the laminin 111 LG1 domain interacts with α6β1 integrin by the contact of this H β strand and α6 β-propeller. Further, by its electrostatic function and proximity to H β strand, LG1 residue Asp82 adheres to Mg+2 containing MIDAS in α6β1 integrin. This interaction appears to be indispensable for α6β1 and laminin 111 binding. / A matriz extracelular (ECM) é definida como um complexo de proteínas e glicoproteínas que envolve as células nos mais diversos tecidos. A laminina é uma glicoproteína que é formada por três cadeias polipeptídicas dispostas em cruz. Sua função é a de ancorar as células epiteliais à ECM, da qual faz parte, através de associações a outras proteínas como as integrinas, o colágeno, a elastina e a fibronectina. As integrinas são receptores de adesão localizadas na superfície celular, que medeiam a interação célula-ECM. Estas interações são cruciais para diversos processos biológicos, tais como a diferenciação celular, a transdução de sinais, a resposta imunológica, a cicatrização de ferimentos e a formação de metástases. Porém a forma estrutural com que a interação entre a integrina e a laminina ocorre ainda não foi esclarecida. Neste contexto este trabalho visa analisar, em escala molecular, a forma com que a integrina α6β1 e a laminina 111 humanas interagem. Assim, foram conduzidos vários estudos, entre eles: i) alinhamentos estruturais e seqüenciais das regiões β-propeller e βA de integrinas não-possuidoras de domínio I; ii) construção do modelo das regiões β-propeller e βA da integrina α6β1 em complexo com pequenos inibidores peptídicos do tipo ECD ou RGD; iii) alinhamento entre os domínios LG de lamininas; iv) construção do modelo do domínio LG1 da laminina 111; e v) construção do primeiro modelo descrito do complexo formado pela porção N- terminal da integrina α6β1 e o domínio LG1 da laminina 111. Para tanto, foram aplicadas as técnicas de modelagem por homologia e dinâmica molecular, além de alinhamentos entre as cadeias α e β de integrinas, e dos domínios LG de lamininas. Inicialmente os resultados mostraram que o loop que corresponde à região entre os subdomínios D2 e D3 da cadeia α6 discrimina ligantes por interações eletrostáticas, e a partir disso, que a integrina α6β1 possui interação preferencialmente com peptídeos do tipo ECDF. Foi mostrado que o domínio LG1 de laminina 111 interage com a integrina α6β1 pelo contato da fita β H com o β-propeller de α6. Além disso, por seu caráter eletrostático e proximidade à fita β H , o resíduo Asp82 de LG1 se adere ao íon Mg+2 do MIDAS da integrina α6β1, e que esta interação é indispensável à ligação entre as duas proteínas.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Corrigida_Final_Gregorio_2011.pdf: 7241946 bytes, checksum: cb82d524114ee5f3199d1239571fb2cd (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / The problem of predicting the native structure of proteins from their amino acid sequence is one of the major challenges of computational biology and implies very high computational cost. Several attempts have been made in the search for efficient algorithms and simplified models for protein structure prediction. In this respect, the inclusion and the correct description of the effects of protein solvent interaction are essential for the success of these methods, considering that the solvent plays a key role in the folding process and structural stability of proteins. Despite recent progress, the modelling of protein-solvent interactions in computer simulations remains a challenge. Implicit solvation models use different strategies to reproduce the effects of the solvent without representing their molecules discretely, doing this with a direct estimate of the solvation free energy. This work aimed to implement and carry out a comparative analysis of implicit solvation models described in the literature, and evaluate the impact of such models in the predictive capacity of the GAPF protein structure prediction suite ( Genetic Algorithms for Protein Folding ), developed in our research group GMMSB/LNCC. As some of the solvation models require the value of solvent accessible surface area (SASA) in their calculations, it was also necessary to implement a method that unites accuracy and computational efficiency. The methodology used in the POPS program was implemented for the calculation of the SASA, and the program MSMS is used as a reference for validation. Four solvation models were analyzed: EAS, I-SOLV, EEF1 e GBobc (used as reference). The thermal unfolding of 15 proteins via molecular dynamics (using the GROMACS simulation package) was carried out to evaluate the solvation models before these were placed in the context of a program for protein structure prediction. Seeking to evaluate the impact of each solvation model on GAPF, large scale tests on the ab initio prediction of structures of a set of 24 proteins were performed. The results show that: (i) the use of the POPS methodology is a good alternative for calculating the SASA; (ii) the solvation models I-SOLV, EEF1 and GBobc reflect the behavior of the SASA in their solvation free energies; (iii) with the exception of EAS, all the models were able to discriminate folding from unfolding structures; (iv) no model was able to discriminate close to native structures from structures with similar compression but with high RMSD (folded incorrectly); (v) the I-SOLV and EEF1 were the solvation models that came closest to the reference model GBobc; (vi) the solvation models I-SOLV and EEF1 provided an improvement in RMSD of predicted structures in the program GAPF with respect to experimental structures; (vii) the I-SOLV and EAS have the lowest computational cost among the evaluated solvation models, being faster than GBobc. The solvation models I-SOLV and EEF1 are the best alternative among those studied to model the effects of the solvation in the protein structure prediction. / O problema da predição da estrutura nativa de proteínas a partir da sua seqüência de aminoácidos é um dos grandes desafios da biologia computacional e implica em altíssimo custo computacional. Várias tentativas vêm sendo realizadas na busca de algoritmos e de modelos simplificados e eficientes para a predição de estruturas de proteínas. Nesse sentido, a inclusão e a correta descrição dos efeitos das interações entre a proteína e o solvente são essenciais para o sucesso desses métodos, haja vista que o solvente tem um papel fundamental no processo de enovelamento e estabilidade estrutural das proteínas. Apesar dos recentes progressos, a modelagem da interação proteína-solvente em simulações computacionais ainda é um desafio. Os modelos implícitos de solvatação utilizam diferentes estratégias para reproduzir os efeitos do solvente sem representar de forma discreta suas moléculas, e o fazem através de uma estimativa direta da energia livre de solvatação. O objetivo geral deste trabalho foi implementar e realizar uma análise comparativa de modelos implícitos de solvatação descritos na literatura, além de avaliar o impacto de tais modelos na capacidade preditiva do programa de predição ab initio de estruturas de proteínas GAPF, desenvolvido no GMMSB/LNCC. Como alguns modelos de solvatação requerem o valor da área de superfície acessível ao solvente (SASA) em seus cálculos, tornou-se também necessário, a implementação de um método que atrele acurácia e eficiência computacional. A metodologia utilizada no programa POPS foi implementada para o cálculo da SASA e o programa MSMS foi usado como referência para a validação da mesma. Quatro modelos de solvatação foram analisados: EAS, I-SOLV, EEF1 e GBobc (usado como referência). O desenovelamento térmico de 15 proteínas via dinâmica molecular (utilizando o pacote de simulação GROMACS) foi realizado com o objetivo de avaliar os modelos de solvatação antes desses serem inseridos no contexto de um programa de predição de estrutura de proteínas. Buscando apreciar o impacto de cada modelo de solvatação no programa GAPF, foram realizados testes em larga escala para a predição ab initio de estruturas de um conjunto de 24 proteínas. Os resultados obtidos mostram que: (i) o uso da metodologia do POPS apresenta-se como uma boa alternativa para o cálculo da SASA; (ii) os modelos de solvatação I-SOLV, EEF1 e GBobc refletem o comportamento da SASA nas suas energias livres de solvatação; (iii) com exceção do EAS, os demais modelos se mostram capazes de discriminar estruturas enoveladas de estruturas desenoveladas; (iv) nenhum dos modelos foi capaz de discriminar de forma satisfatória estruturas enoveladas de estruturas com compactação similar e alto RMSD (enoveladas incorretamente); (v) os modelos I-SOLV e EEF1 foram os que mais se aproximaram do modelo de referência GBobc; (vi) os modelos de solvatação I-SOLV e EEF1 proporcionaram uma melhora no RMSD das estruturas preditas no programa GAPF em relação às estruturas experimentais; (vii) o ISOLV e o EAS apresentam o menor custo computacional dentre os modelos de solvatação avaliados, sendo mais rápidos que o GBobc. Os modelos de solvatação ISOLV e EEF1 apresentam-se como as melhores alternativas, dentre as estudadas, para a modelagem dos efeitos da solvatação na predição de estrutura de proteínas.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GOLIATT_PVZC_thesis.pdf: 13370494 bytes, checksum: 2621901d59798613ae8fdb2d938dda20 (MD5) Previous issue date: 2011-06-27 / The knowledge of the three-dimensional (3D) conformation of the native structure of proteins has assisted biotechnological researches as those focused on protein design and structure based drug design. As an alternative to the techniques of experimental prediction and theoretical prediction via comparative modeling, the theoretical prediction via ab initio technique has been increasingly exploited. In the ab initio technique, the 3D protein structure prediction (PSP) is performed based only on its amino acid sequence and in their physicochemical properties. However, to obtain solutions that represent native structures, methods of ab initio PSP require a large number of function evaluations which limits their use in studies of more complex proteins. In the CG model, the representation of each amino acid is reduced to a set of few interaction sites, significantly reducing the number of degrees of freedom to be treated, and thus reducing the computational cost needed to evaluate each structure during the optimization process. In this work, we developed and implemented a CG model applied to the PSP problem, including the ability to simulate the presence of disulfide bonds. This model was adapted to the GAPF program (Genetic Algorithm for Protein Folding), previously developed by the "Grupo de Modelagem Molecular de Sistemas Biológicos" (GMMSB/ LNCC) and originally implemented for the PSP via ab initio technique using an all-atom model representation. The CG model has been tested on a set of 36 structures with sizes ranging from 18 to 106 amino acid residues, and covering the different classes of proteins (i.e. mainly alpha, alpha+beta and mainly beta). The results showed that the CG model proposed promoted improvements in predictive ability of GAPF program, now being able to predict β-sheet structures, and a decrease of approximately 80% of computational time. / O conhecimento da conformação tridimensional (3D) da estrutura nativa de uma proteína tem auxiliado pesquisas biotecnológicas como as voltadas à engenharia de proteínas e ao desenho racional de fármacos. Como alternativa às técnicas de predição experimental e à técnica de predição teórica via modelagem comparativa, a técnica de predição teórica via ab initio tem sido cada vez mais explorada. Na técnica ab initio, a predição da estrutura 3D de uma proteína (PSP) é feita baseando-se apenas na sua sequência de resíduos de aminoácidos e nas propriedades físico-químicas dos mesmos. Entretanto, os métodos de PSP ab initio, para chegarem à soluções que representem estruturas nativas, requerem um grande número de avaliações de função o que limita suas aplicações em estudos de proteínas mais complexas. Uma possível solução para este problema é o uso de uma representação simplificada do sistema (modelo coarse-grained - CG). No modelo CG, a representação de cada aminoácido é reduzida a um conjunto de poucos sítios de interação, diminuindo significativamente o número de graus de liberdade a serem tratados e, portanto, reduzindo o custo computacional necessário na avaliação de cada estrutura durante o processo de otimização. Neste trabalho, foi desenvolvido e implementado um modelo CG aplicado ao problema de predição de estruturas 3D de proteínas, incluindo-se a possibilidade de simular a presença de ligações dissulfídicas. Este modelo foi adaptado ao programa GAPF (Genetic Algorithm for Protein Folding), previamente desenvolvido no Grupo de Modelagem Molecular de Sistemas Biológicos (GMMSB/ LNCC) e originalmente implementado para a PSP via técnica ab initio usando um modelo de representação de todos os átomos do sistema. O modelo CG desenvolvido foi testado em um conjunto de 36 estruturas, de tamanhos variando entre 18 e 106 resíduos de aminoácidos, e abrangendo as distintas classes de proteínas (i.e. preferencialmente alfa, alfa+beta e preferencialmente beta). Os resultados obtidos mostraram que o modelo CG proposto resultou em melhorias na capacidade preditiva do programa GAPF, sendo agora capaz de predizer conformações em folha-β, e na redução de aproximadamente 80% do tempo computacional.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alex.pdf: 2178182 bytes, checksum: 4e4873404ccf1ab02089a71aff029235 (MD5) Previous issue date: 2012-04-11 / At the American continent several hantavirus cause hantavirus pulmonary syndrome, considered an emerging and important public health problem. In Brazil, since the first outbreak at the beginning of the 1990s, more than 1440 cases have been documented in 14 of the 27 states, with a mortality rate of 40 to 70%. Interestingly, despite the absence of reported cases at states of the Espírito Santo, Mato Grosso do Sul and Rio de Janeiro which bordering states with high incidence, different studies conducted had identified infected rodents reservoirs with pathogenic hantaviruses at this places, leading to a series of questions that couldn't be answered until this moment. The main objective of this study was to contribute to an understanding to the genetic diversity of hantaviruses identified in Brazil analyzing the complete sequence of genomic S segment. Initially a survey was conducted in online databases (GenBank) in order to obtain the complete nucleotide sequences of the S segment of different hantavirus, with emphasis on Brazilian sequences. From a total of 334 sequences retrieved, only 14 belonged to Brazil, all sequences recovered from human samples; 12 were genotype Araucaria (Juquitiba) and two, genotype Araraquara,. With this result, biological seroreactive animal samples, stored at Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses IOC FIOCRUZ, were selected and submitted to PCR. Primers were designed and developed to amplify the entire genomic S segment. The sequencing of 23 samples of wild rodents in endemic and non-endemic areas from seven Brazilian states made possible to provide (i) the first description and molecular characterization of a hantavirus in the state of the Espírito Santo, (ii) the first description of the genotype Juquitiba in the rodent species Oligoryzomys fornesi in Brazil, (iii) the complete sequence of the first S segment Jabora genotype. The phylogenetic analysis showed, in a unpublished way, the wide genetic diversity of Brazilian hantavirus. It wasn t possible to observe an association pattern between host or geography, confirming results obtained in available recent studies. / No continente americano vários hantavírus causam síndrome pulmonar por hantavírus, um emergente e importante problema de saúde pública nas Américas. No Brasil, desde o primeiro surto da doença no inicio da década de 1990, mais de 1.440 casos já foram documentados em 14 dos 27 estados brasileiros, com uma taxa de letalidade de 40 a 70%. Curiosamente, apesar da ausência de notificação de casos, nos estados como Espírito Santo, Mato Grosso do Sul e Rio de Janeiro, localizados na divisa de estados de elevada incidência, estudos desenvolvidos têm identificado roedores reservatórios infectados com hantavírus patogênicos, levando a uma série de questionamentos que, até a presente data, não pode ser respondido. O objetivo principal deste trabalho foi contribuir para o conhecimento da diversidade genética dos hantavírus identificados no Brasil a partir das sequências completas do segmento genômico S. Inicialmente um levantamento foi realizado em bases de dados on-line (GenBank®) visando à obtenção das sequências completas de nucleotídeos do segmento S dos diferentes hantavírus, com ênfase nas sequências brasileiras. De um total de 334 sequências recuperadas, somente 14 sequências foram de hantavírus brasileiros sendo 12 delas do genótipo Araucária (Juquitiba) e duas do genótipo Araraquara, todas recuperadas de amostras humanas. Diante deste resultado, amostras biológicas de animais sororreativos acondicionadas no Laboratório de Hantavíroses e Rickettsioses IOC FIOCRUZ foram selecionadas e submetidas à PCR. Para isso, iniciadores (primers) foram desenhados e desenvolvidos para amplificação de todo o segmento genômico S. O sequenciamento de 23 amostras de roedores silvestres em áreas endêmicas e não endêmicas, em sete estados brasileiros, possibilitou a (i) primeira descrição e caracterização molecular de um hantavírus no estado do Espírito Santo; (ii) a primeira descrição do genótipo Juquitiba no roedor da espécie Olygorizomys fornesi no Brasil; (iii) a primeira sequência completa do segmento S do genótipo Jaborá. Na avaliação filogenética foi observada, em caráter inédito, a ampla diversidade genética dos hantavírus brasileiros. Não foi possível visualizar um padrão de associação hospedeiro ou geográfico, corroborando com os resultados obtidos em estudos recentes disponíveis.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:58:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_PAULO_WERDT.pdf: 21786566 bytes, checksum: 03a53ac9704356741edfa085dc1c0f81 (MD5) Previous issue date: 2014-04-28 / The prediction of the three-dimensional structure of proteins (PSP) has been one of the most challenging fields of computational biology, both for its applicability in the field of medicine and drug design, as for its high complexity and computational cost. The main objective of this work was to implement and investigate the predictive potential in the context of the program GAPF (Genetic Algorithm for Protein Folding), the use of a Coarse Grained (CG) model, coupled with a genetic algorithm of multiple minimum, designed specifically to predict protein structures, using restraints of distance and angles obtained from experiments of Nuclear Magnetic Resonance (NMR). A second objective was, using structures determined by NMR and deposited in the Protein Data Bank (PDB), to identify, classify and generate statistics of those NMR restraints that might be more relevant in a process of predicting protein structures. In this sense, programs were developed, in C++ language, to read, interpret, analyze and engage the NMR information contained in the PDB files, making it possible to use the restraints contained in these files, by the program GAPF. A visualization program was also developed, using the OpenGL library, which allows the observation of protein structures with their respective NMR restraints. Simulations were performed on a test group of ten proteins with known structure, and the results were compared with those obtained using an all atom model. The results obtained with the use of the CG model were equivalent or, in most cases, exceeded the results achieved with the all atom force field. Besides allowing a significant reduction in computational cost, the use of the CG model enabled a significant reduction of the number of NMR restraints necessary for the prediction of a structure with a folding considered correct or satisfactory. / A predição da estrutura tridimensional de proteínas (PSP) tem se mostrado um dos campos mais desafiadores da biologia computacional, tanto pela sua aplicabilidade no campo da medicina e no desenho de fármacos, quanto pela sua alta complexidade e custo computacionais. O objetivo principal deste trabalho foi implementar e investigar o potencial preditivo, no contexto do programa GAPF (Genetic Algorithm for Protein Folding), do uso de um modelo Coarse Grained (CG) acoplado com um algoritmo genético de múltiplos mínimos desenvolvido especificamente para predizer estruturas de proteínas, utilizando restrições de distância e de ângulos advindas de experimentos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Um segundo objetivo foi, utilizando estruturas determinadas por RMN depositadas no Protein Data Bank (PDB), identificar, classificar e gerar estatísticas sobre as restrições de RMN que possam ser mais relevantes em um processo de predição de estruturas de proteínas. Neste sentido, foram desenvolvidos programas, na linguagem C++, para ler, interpretar, analisar e acoplar as informações de RMN contidas nos arquivos do PDB, tornando possível a utilização das restrições, contidas nestes arquivos, pelo programa GAPF. Também foi desenvolvido um programa de visualização que, utilizando a biblioteca OpenGL, permite a observação das estruturas de proteínas com as suas respectivas restrições de RMN. Foram realizadas simulações em um grupo teste de dez proteínas, de estrutura já conhecida, e os resultados foram comparados com aqueles obtidos com o uso do modelo all-atom. Os resultados obtidos com o uso do modelo CG conseguiram ser equivalentes ou, na maioria dos casos, superar os resultados obtidos com o modelo all-atom. Além de permitir uma redução significativa no custo computacional, o uso do modelo CG possibilitou uma redução significativa do número de restrições de RMN necessárias para a predição de uma estrutura com um enovelamento considerado correto ou satisfatório.