FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / nÃo hà / Soyatoxina 2 (SYTX-2) à uma proteÃna tÃxica isolada de sementes de soja [Glycine max (L.) Merril], genÃtipo BR-10, sendo letal para camundongos quando administrada por via intraperitoneal (DL50 4,5  0,1 mg/Kg de peso corpÃreo). Os sintomas observados apÃs sua administraÃÃo foram piloereÃÃo, taquicardia, estiramento de patas e da cauda, diurese e convulsÃes tÃnico-clÃnicas, que precederam a morte do animal. A SYTX-2 foi purificada do extrato bruto de soja por fracionamento com sulfato de amÃnio, cromatografias de troca iÃnica (DEAE-celulose), de afinidade (Sepharose-4B-tripsina) e de filtraÃÃo em gel (Superdex 200HR 10/30). A inclusÃo de ditiotreitol 0,005 M no tampÃo de extraÃÃo e em outros tampÃes utilizados durante o processo de purificaÃÃo foi crucial para obtenÃÃo da SYTX-2 num estado altamente homogÃneo e preservaÃÃo da toxicidade. A SYTX-2 nÃo à uma glicoproteÃna e apresenta massa molecular aparente de 28,0 e 25,4 kDa, quando avaliada por PAGE-SDS e filtraÃÃo em gel em coluna de Superdex 200HR 10/30, respectivamente, e coeficiente de extinÃÃo molar (ε1%1cm) de 16,9. Sua seqÃÃncia NH2-terminal exibiu uma identidade de 75%, quando relacionada com aquela de uma endoquitinase acÃdica da classe III de sementes de soja. Ao lado de sua atividade tÃxica, a SYTX-2 apresentou atividade quitinÃsica de 1,34 nKat/mgP. Essa toxina, quando em contato com o nervo ciÃtico de ratos foi capaz de aumentar a amplitude pico-a-pico, comprovando sua aÃÃo neurotÃxica. A SYTX-2 tambÃm mostrou atividade prÃ-inflamatÃria, induzindo migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal de ratos, cujo pico se deu 8 h apÃs sua administraÃÃo. AvaliaÃÃo de seu papel fisiolÃgico, mostrou que a SYTX-2 exerceu efeitos negativos sobre o desenvolvimento do inseto-peste de feijÃo-de-corda Callosobruchus maculatus, particularmente na emergÃncia do adulto e no tempo mÃdio de desenvolvimento larval. Adicionalmente, SYTX-2 foi tÃxica para ninfas de Dysdercus peruvianus, causando reduÃÃo no ganho de peso corpÃreo e na taxa de sobrevivÃncia. A SYTX-2 tambÃm atuou negativamente sobre o nematÃide Meloidogyne incognita, impedindo sua mobilidade. Por outro lado, a SYTX-2 nÃo foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos e nem o desenvolvimento de hifas dos fungos Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum e Aspergillus niger, nas condiÃÃes de ensaio realizadas no presente trabalho. Em resumo, este trabalho apresenta, pela primeira vez, dados de uma proteÃna neurotÃxica contendo uma atividade quitinÃsica nÃo usual, cujo papel parece estar relacionado aos mecanismos de defesa da planta. Nesse contexto, SYTX-2 possui potencial para aplicaÃÃo biotecnolÃgica como um novo agente de defesa vegetal contra insetos-peste e nematÃide-parasitas / Soyatoxin 2 (SYTX-2) is a toxic protein isolated from soybean seeds [Glycine max (L.) Merril], genotype BR-10, lethal to mice upon intraperitoneal injection (LD50 4.5  0.1 mg/Kg body weight). The symptoms observed upon administration were pilloerection, tachycardia, paw and tail extending, diuresis and tonic-clonic convulsions prior to death. The SYTX-2 was purified from soybean crude extract by ammonium sulfate fractionation, ion-exchange (DEAE-cellulose), affinity (Sepharose-4B-trypsin) and gel filtration (Superdex 200HR 10/30) chromatography. Inclusion of 0.005 M dithiothreitol in the extracting and other buffers used during the purification process was crucial to obtain highly homogenous SYTX-2 and to preserve the toxicity. SYTX-2 is not a glycoprotein and has apparent molecular masses of 28.0 and 25.4 kDa as measured by SDS-PAGE and gel filtration in Superdex 200HR 10/30 column, respectively, and a molar extinction coefficient (ε1% 1cm) of 16.9. Its NH2-terminal sequence shows 75% identity with a class III acidic endochitinase from soybean seeds. Therefore, besides to its toxic properties, SYTX-2 presented chitinase activity of 1.34 nKat/mgP. This toxin, when in contact with the sciatic nerve of rats was able to increase the peak-to-peak amplitude, confirming its neurotoxic action. Moreover, SYTX-2 presented pro-inflammatory activity, inducing neutrophil migration into the peritoneal cavity of rats which peaked at 8 h after administration. Evaluation of its physiological role showed that SYTX-2 exerted negative effect on the development of the cowpea pest insect Callosobruchus maculates, particularly on adult emergence and in the mean larval development time. Additionally, SYTX-2 was toxic to Dysdercus peruvianus nymphs, as it caused reduction of both the body weight gain and survival rate. SYTX-2 also acted negatively on the root-knot nematode Meloidogyne incognita by hindering its mobility. On the other hand, SYTX-2 did not inhibit neither the spore germination nor the hyphal development of the phytopathogenic fungi Colletotrichum lindemuthianum, C. gloesporioides, Rhizoctonia solani, Cercospora kikuchii, Fusarium solani, F. oxysporum and Aspergillus niger, under the assay conditions carried out in this present work. In summary this study presents, for the first time, data on a neurotoxin protein with additional unusual chitinase activity, whose physiological role is likely related to the plant defense mechanisms. Accordingly, SYTX-2 possesses potential biotechnological application as a novel plant defensive agent against insect pests and parasitic nematodes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi avaliar parÃmetros fisiolÃgicos e bioquÃmicos em trÃs espÃcies vegetais com graus diferenciados de tolerÃncia ao estresse salino, a fim de melhor entender suas diferenÃas na tolerÃncia à salinidade. Para isto, sementes de algodÃo, feijÃo-de-corda e sorgo foram semeadas em copos plÃsticos contendo vermiculita umedecida com soluÃÃo nutritiva de Hoagland  forÃa (SNH Â), sendo o experimento conduzido em casa de vegetaÃÃo. PlÃntulas de cinco dias de idade foram transferidas para meio hidropÃnico (SNH Â), onde permaneceram por um perÃodo de seis dias para aclimataÃÃo. ApÃs esse perÃodo, as plantas foram submetidas a trÃs tratamentos salinos com valores de condutividade elÃtrica (CE) de 0,9 dS m-1 (baixa salinidade), 4,0 dS m-1 (mÃdia salinidade) e 8,0 dS m-1 (alta salinidade). A coleta foi realizada aos 25 dias apÃs o inÃcio do estresse. A salinidade reduziu significativamente a Ãrea foliar e a massa seca da parte aÃrea das trÃs espÃcies estudadas, especialmente as das plantas de feijÃo-de-corda e em menor proporÃÃo as do algodÃo. O potencial osmÃtico de folhas e raÃzes das trÃs espÃcies foram significativamente reduzidos nos tratamentos a 4,0 e 8,0 dS m-1 em comparaÃÃo com o de 0,9 dS m-1, exceto nas raÃzes de sorgo. Jà o teor relativo de Ãgua foliar nÃo apresentou alteraÃÃes com o aumento da CE do meio de crescimento. Os Ãons Na+ e Cl- aumentaram nas folhas e raÃzes das trÃs espÃcies, sendo que o algodÃo foi a espÃcie que mais reteve esses Ãons nos tratamentos a 4,0 e 8,0 dS m-1. As concentraÃÃes de K+ nas folhas de algodÃo e feijÃo-de-corda foram aumentadas pelos nÃveis crescentes de salinidade, enquanto nas plantas de sorgo foram diminuÃdas. Jà nas raÃzes as concentraÃÃes desse Ãon foram significativamente reduzidas nas trÃs espÃcies. De maneira geral, nos tratamentos de mÃdia e alta salinidade comparados com o de baixa salinidade, as concentraÃÃes de NO3- foram reduzidas em folhas e raÃzes das trÃs espÃcies. Os tratamentos a mÃdia e alta salinidade reduziram as concentraÃÃes de carboidratos solÃveis no algodÃo, enquanto aumentaram no feijÃo-de-corda e no sorgo. A concentraÃÃo de proteÃna solÃvel nÃo se alterou no feijÃo-de-corda em funÃÃo da salinidade, enquanto foi reduzida nas outras duas espÃcies. Os N-aminossÃluveis foram aumentados nas trÃs espÃcies, enquanto para a prolina, esses aumentos sà foram observados a 8,0 dS m-1. De modo geral, os parÃmetros de emissÃo de fluorescÃncia da clorofila a e a leitura SPAD nÃo foram alterados pela salinidade. Os nÃveis de peroxidaÃÃo lipÃdica foram significativamente aumentados nos tratamentos de mÃdia e alta salinidade no feijÃo-de-corda, nÃo sofreram alteraÃÃo no sorgo, enquanto foram reduzidos no algodÃo, quando comparados com o de baixa salinidade. A atividade das enzimas dismutase do superÃxido (SOD), catalase (CAT), peroxidases do ascorbato (APX) e do guaiacol (GPX) em folhas, nÃo foi alterada pelos tratamentos salinos a 4,0 e 8,0 dS m-1, com exceÃÃo de reduÃÃes nas atividades da SOD e GPX no algodÃo e da CAT no feijÃo-corda e, aumentos para a GPX no sorgo. Nas raÃzes, foram observados aumentos para a SOD no algodÃo e aumentos para a GPX no sorgo e feijÃo-de-corda, enquanto houve reduÃÃes da APX e GPX para o algodÃo. Os dados de crescimento aqui apresentados confirmam a maior tolerÃncia do algodÃo e a maior sensibilidade do feijÃo-de-corda ao estresse salino, enquanto que as alteraÃÃes na peroxidaÃÃo dos lipÃdios e nas enzimas antioxidativas nos levam a sugerir que o sistema enzimÃtico antioxidativo do algodÃo parece ser mais eficiente do que o das outras duas espÃcies estudadas, na eliminaÃÃo dos danos oxidativos ocasionados pela salinidade. à possÃvel, tambÃm, que a maior capacidade do algodÃo de acumular Ãons tÃxicos (Na+ e Cl-) nos tecidos fotossintetizantes contribua, pelo menos em parte, para sua maior tolerÃncia à salinidade. / The objective of this study was to evaluate physiological and biochemical parameters in three plant species with different degrees of salt tolerance in order to better understand their differences in salinity tolerance. For this, cotton seed, bean-to-string and sorghum were sown in plastic cups containing vermiculite moistened with  Hoagland solution strength ( SNH), the experiment being conducted in a greenhouse. Seedlings of five days of age were transferred to hydroponic medium (SNH Â), where they remained for a period of six days for acclimatization. After this period, the plants were subjected to three saline treatments with values ​​of electrical conductivity (EC) of 0.9 dS m-1 (low salinity), 4.0 dS m -1 (mean salinity) and 8.0 dS m 1 (high salt). Data were collected at 25 days after the onset of stress. Salinity significantly reduced leaf area and shoot dry mass of all species, especially, bean-to-string and to a lesser extent those of cotton. The osmotic potential of leaves and roots of the three species were significantly reduced in the treatments at 4.0 and 8.0 dS m-1 compared to 0.9 dS m-1 except the root sorghum. Since the leaf relative water content did not change with the increase in the EC medium. The Na + and Cl-increased in leaves and roots of three species, and cotton was the species that most of these ions retained in treatments 4.0 and 8.0 dS m-1. The concentrations of K + in leaves of cotton and bean-to-string were increased by increasing salinity levels, while in sorghum plants were decreased. Since the roots of this ion concentrations were significantly reduced in all three species. In general, the treatment of medium and high salinity compared with the low salinity, the concentrations of NO3-were reduced in leaves and roots of three species. Treatments at medium and high salinity reduced concentrations of soluble carbohydrates in cotton, while increased in the-string-beans and sorghum. The soluble protein concentration did not change the jack bean-string a function of salinity was reduced while the other two species. The N-aminossÃluveis were increased in all three species while for proline, the increases were only observed at 8.0 dS m-1. In general, the parameters of emission of fluorescence of chlorophyll SPAD readings were not affected by the salinity. Levels were significantly increased lipid peroxidation in the treatment of medium and high salinity of the bean-string, the sorghum did not change while the cotton were reduced compared with that of low salinity. The activity of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and guaiacol (GPX) in leaves was not affected by saline treatments at 4.0 and 8.0 dS m-1, except for reductions in the activities of SOD and GPX in cotton and string beans in CAT and GPX to increases in sorghum. In roots, increases were observed for SOD in cotton and increases for sorghum and beans in GPX-of-string while there were reductions of APX and GPX for cotton. The growth data presented here confirm the increased tolerance of cotton and the higher sensitivity of the jack bean-string to salt stress, whereas changes in lipid peroxidation and antioxidant enzymes lead us to suggest that the antioxidant enzyme system appears to be cotton more efficient than the other two species, the removal of oxidative damage caused by salinity. It is also possible that the greater ability of cotton to accumulate toxic ions (Na + and Cl-) in photosynthetic tissues contributes at least in part to its greater tolerance to salinity.

Banco do Nordeste do Brasil / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A pro-lectina de sementes de Dioclea grandiflora apresentou-se ativa quando expressa de forma recombinante (r-pro-DGL) no citoplasma do modelo procariÃtico Escherichia coli. Obtida de forma solÃvel a partir do vetor pET32a, a proteÃna recombinante apresentou massa aparente (25 kDa) e sequÃncia (obtida por espectrometria de massas) idÃnticas ao precursor natural, mostrando-se atipicamente funcional em comparaÃÃo a outras lectinas de leguminosas expressas de forma heterÃloga, possuindo uma atividade especÃfica de 134.217.728 (U.H./mg). Diferentemente de sua contraparte silvestre a r-pro-DGL nÃo reconheceu especificamente glicose, sendo apenas fracamente inibida por manose. Em decorrÃncia da alta homologia de sequÃncia entre os precursores de lectinas na subtribo Diocleinae e lectinas ligantes de galactose pertencentes a outras tribos de leguminosas, hà a hipÃtese de que o processamento pÃs-traducional peculiar dessa subtribo poderia influir de forma decisiva sobre a especificidade fina dessas proteÃnas. Entretanto, a r-pro-DGL nÃo apresentou afinidade por galactose ou lactose, demonstrando ser a topologia do sÃtio de ligaÃÃo, bem como a conformaÃÃo das alÃas que os estruturam, os principais fatores determinantes da especificidade a monossacarÃdeos. Assim, pode-se afirmar que precursores de lectinas na subtribo Diocleinae apresentam-se ativos enquanto deglicosilados, sendo ainda capazes de formar oligÃmeros e estabelecer ligaÃÃes cruzadas entre membranas celulares. / The pro-lectin from Dioclea grandiflora presented active when expressed in recombinant (r-pro-DGL) in the cytoplasm of the model prokaryotic Escherichia coli. Obtained in soluble form from the pET32a vector, the recombinant protein presented apparent mass (25 kDa) and sequence (obtained by mass spectrometry) identical to the natural precursor, being unusually functional compared with other lectins of the pulses expressed heterologously having a specific activity of 134 217 728 (HU / mg). Unlike its counterpart wild r-Pro-DGL not specifically recognize glucose, and only weakly inhibited by mannose. Due to the high sequence homology among the forerunners in the subtribe lectins Diocleinae and galactose-binding lectin belonging to other tribes of legumes, there is the hypothesis that post-translational processing of this peculiar subtribe could influence decisively on the fine specificity of these proteins. However, the pro-r-DGL showed no affinity for galactose or lactose, showing that the topology of the binding site and the conformation of the loops that structure, the main specificity determinants of the monosaccharides. Thus, it can be stated that in the subtribe lectins precursors Diocleinae presents deglicosilados active while being still able to form oligomers and to establish cross-links between cell membranes.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As sementes de Platymiscium floribundum Vogel, uma espÃcie pertencente à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina manose/N-acetil-D-glicosamina especÃfica, que aglutina eritrÃcitos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas de coelho. A lectina de sementes de P. floribundum foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio seguida por cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-manose. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de PFL. O processo de purificaÃÃo da PFL foi monitorado por SDS-PAGE e atividade hemaglutinante especÃfica, observou-se que a lectina purificada à caracterizada por um perfil eletroforÃtico composto por uma Ãnica banda, com massa molecular aparente de aproximadamente 29 kDa, tanto na presenÃa quanto na ausÃncia de um agente redutor. A anÃlise por espectrometria de massa indicou que PFL possui massa molecular de 27.054  2 Da, e teve sua estrutura primaria parcialmente sequenciada atravÃs de espectrometria de massa sequencial. PFL à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 60  C por 1 hora e na faixa de pH de 7,0 a 9,0. A PFL nÃo apresentou atividade anti-inflamatÃria.em modelo de edema de pata. PFL foi cristalizada em diferentes condiÃÃes de cristalizaÃÃo. / Platymiscium floribundum Vogel seeds, a species of the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a lectin mannose/N-acetyl-D-glucosamine specific rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from P. floribundum was purified by precipitation with ammonium sulfate followed by affinity chromatography on Sepharose-mannose. This procedure resulted in a purified lectin, named PFL. PFL purification process was monitored by SDS-PAGE and showed that the purified lectin is characterized by an electrophoretic profile consists of a single band with apparent molecular mass of approximately 29 kDa, in both presence and absence of an reducer agent. The analysis by mass spectrometry indicated that PFL has a molecular mass of 27,054 Da, and its primary structure was partially sequenced. PFL is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain its haemagglutinating activity after exposure to temperatures up to 60 ÂC for one hour and at pH 7.0 to 9.0. The PFL showed no anti-inflammatory activity in paw edema model. PFL was crystallized under different crystallization.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Latex of Calotropis procera was described as a source of pharmacologically active proteins such as anti-inflammatory and analgesic activities. This study evaluated the cytotoxic activity in vitro of proteins (LP) recovered from the latex of the medicinal plant C. procera against human cancer cells and the in vivo growth inhibition of Sarcoma 180. LP exhibited significant cytotoxicity for cell lines with IC50 values ranging from 0.11 to 1.36 Âg/ml for tested cell lines (HL-60, SF295, HCT-8 and MDA-MB-435). There were no visible effects on the viability or morphology of healthy mononuclear cells exposed to PL (10 Âg / ml) for 72 h, showing that PL was selective for malignant cells. Fractionation of PL by ion exchange chromatography (pH 5.0) gave rise to three new protein fractions (PI, PII and PIII) and almost all cytotoxicity present in PL was retained in fraction PI. The cytotoxic effects of PL and PI were diminished when pre-treated with pronase or 2-mercaptoethanol, reinforcing the protein nature of active molecules. PI was absent on cysteine protease activity, indicating that this enzyme abundantly found in PL is not involved in cytotoxicity. Mechanistic studies of LP cytotoxicity using HL-60 cells revealed that PL induces apoptosis probably due to changes in DNA topology since PL interfered in the activity of topoisomerase I. The cytotoxic activity present in PI seems to be performed by the synergic action of different proteins. This hypothesis is suggested since PI subjected to gel filtration chromatography produced distinct protein peaks that shared cytotoxic activity, although with lower extent than PI. Studies on growth inhibition of Sarcoma 180 showed that animals treated with PL by oral (10 or 20 mg/kg) or intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) rout reduced tumor growth significantly (up 51.83%, po) and increased life span of transplanted animals for up to four days. The inhibitory activity of tumor growth was lost when the LP was subjected to proteolysis, acidic treatment or collected in iodoacetamide. On the other hand, LP maintained its in vivo activity after heat treatment, suggesting that thermo stable proteins are involved in the suppression of tumor growth. Biochemical parameters such as the enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the content of urea in serum were not affected in animals treated with LP. Treatment of animals with LP induced increasing of leukocyte numbers and protected from leukopenia induced by 5-FU administration. In addition, no significant changes in the histopathology of liver of animals treated with oral LP were seen. In vivo antitumor activity was retained in the PII and this activity was observed even when animals received a single dose of PII. It seems that the in vivo action of latex proteins is related to an immunestimulant event and not to the cytotoxic action of protein on cells Sarcoma 180. PII-3, recovered after PII fractionation on ion exchange column at pH 6.0, retained the tumor growth inhibition activity found in PII. PII-3 was shown to possess cysteine proteinase and papain inhibitor activities; however is not completely clear weather this molecules are involved in the antitumor activity. This study confirms the pharmacological potential of latex proteins from C. procera to control the development of tumor cells. / O lÃtex de Calotropis procera foi descrito como uma fonte de proteÃnas farmacologicamente ativas como atividade antiinflamatÃria e analgÃsica. O presente trabalho avaliou a atividade citotÃxica in vitro das proteÃnas (PL) recuperadas do lÃtex da planta medicinal C. procera contra cÃlulas de cÃncer humano e a inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 transplantado em camundongos. PL apresentou significante citotoxicidade para as linhagens celulares com valores de IC50 variando entre 0,11 a 1,36 Âg/ml para as linhagens celulares testadas (HL-60, SF295, HCT-8 e MDA-MB-435). NÃo foram observados efeitos visÃveis sobre a viabilidade ou a morfologia de cÃlulas mononucleares saudÃveis expostas a PL (10 Âg / ml) por 72 h, mostrando que PL apresentou seletividade para cÃlulas tumorais. O fracionamento de PL por cromatografia de troca iÃnica (pH 5,0) deu origem a trÃs novas fraÃÃes (PI, PII e PIII) e quase toda citotoxicidade presente em PL ficou retida na fraÃÃo PI. Os efeitos citotÃxicos de PL e PI foram diminuÃdos quando previamente tratados com pronase, ou 2-mercaptoetanol, sugerindo uma natureza protÃica de molÃculas ativas. PI nÃo apresentou atividade de proteinase cisteÃnica, indicando que esta enzima, encontrada em abundÃncia em PL, nÃo està envolvida na citotoxicidade. Estudos do mecanismo da aÃÃo citotÃxica de PL utilizando cÃlulas HL-60 revelou que PL induz apoptose celular provavelmente devido a alteraÃÃes na topologia de DNA, jà que PL interferiu na atividade de topoisomerase I. A atividade citotÃxica presente em PI parece ser desempenhada pela aÃÃo combinada de diferentes proteÃnas uma vez que PI submetida à cromatografia de filtraÃÃo em gel gerou picos protÃicos distintos que compartilharam atividade citotÃxica, embora com menor potÃncia que PI. Estudo de inibiÃÃo do crescimento do Sarcoma 180 revelou que animais tratados com PL por via oral (10 or 20 mg/kg) ou intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) reduziram de modo significativo o crescimento do tumor (em atà 51,83%; v.o.) e prolongou o tempo de sobrevivÃncia dos animais transplantados por atà quatro dias. A atividade inibitÃria do crescimento do tumor foi perdida quando a fraÃÃo PL foi submetida à proteÃlise, tratamento Ãcido ou com iodoacetamida. No entanto, PL conservou a sua atividade in vivo apÃs o tratamento tÃrmico, sugerindo que proteÃnas termoestÃveis estÃo envolvidas na supressÃo do crescimento tumoral. Os parÃmetros bioquÃmicos, como a atividade enzimÃtica da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e o teor de urÃia no soro, nÃo foram afetados nos animais tratados com PL. PL induziu aumento no nÃmero de leucÃcitos de animais tratados e ainda eliminou completamente a leucopenia induzida pela administraÃÃo do 5-FU. Em adiÃÃo, nÃo foram observadas mudanÃas na histopatologia do fÃgado de animais tratados com PL por via oral. Atividade antitumoral in vivo ficou retida no PII e esta atividade foi observada mesmo quando animais transplantados receberam uma Ãnica dose de PII sugerindo que a aÃÃo in vivo de proteÃnas do lÃtex està relacionada a um evento imunoestimunate de proteÃnas e nÃo à aÃÃo citotÃxica sobre as cÃlulas do Sarcoma 180. PII-3, obtido apÃs fracionamento de PII em coluna de troca iÃnica em pH 6,0 reteve a atividade de inibiÃÃo do crescimento tumoral de PII. Esta fraÃÃo possui atividade de proteinase cisteÃnica e atividade de inibidor de papaÃna, porÃm nÃo à completamente claro o envolvimento dessas molÃculas na atividade in vivo. Este estudo confirma o potencial farmacolÃgico das proteÃnas do lÃtex de C. procera para controlar o desenvolvimento de cÃlulas tumorais.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As lectinas da subtribo Diocleinae pertencem à famÃlia de Leguminosas e sÃo caracterizadas pela alta homologia entre suas sequÃncias de aminoÃcidos. Apesar da alta similaridade estrutural o mesmo nÃo acontece nas atividades biolÃgicas das lectinas dessa famÃlia. Estudos mostram que a modificaÃÃo de poucos aminoÃcidos em suas sequÃncias à capaz de provocar grandes alteraÃÃes nas atividades biolÃgicas dessas lectinas, dessa forma o entendimento mais detalhado das estruturas tridimensionais dessas proteÃnas à essencial para a anÃlise da relaÃÃo entre estrutura e funÃÃo. A lectina de Dioclea violacea foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50. A proteÃna foi cristalizada na presenÃa do ligante X-Man e os cristais foram obtidos pelo mÃtodo de difusÃo de vapor em matriz esparsa por gota suspensa. Foram utilizando os kit âcristal screenâ I e II da Hampton Research e a condiÃÃo que obteve melhor cristal foi a condiÃÃo 33 do kit I composta por 4M Formato de sÃdio. O cristal foi difratado a 2,61à e apresenta grupo espacial I222 com cela unitÃria com dimensÃes de a = 61,34, b = 66,11, c = 106,69à e Ãngulos de α = β = γ = 90Â. Foi observada a presenÃa de um monÃmero na unidade assimÃtrica contendo 42,04% de solvente no cristal. A substituiÃÃo molecular foi feita utilizando a estrutura da lectina de Dioclea rostrata (PDB: 2ZBJ). O refinamento final obteve Rfactor de 0,23 e Rfree de 0,27 com ausÃncia aminoÃcidos em regiÃes nÃo permitidas do grÃfico de Ramachandran. O ligante X-Man foi co-cristalizado e sua estrutura foi observada perfeitamente encaixada no domÃnio de reconhecimento a carboidratos. Em relaÃÃo ao equilÃbrio dÃmero tetrÃmero, a lectina de Dioclea violacea apresenta o aminoÃcido HIS 131 e a posiÃÃo da HIS 51 à semelhante ao mesmo aminoÃcido da Dioclea grandiflora, caracterizando esta lectina como tetrÃmero mesmo em pH baixo. Foram feitas comparaÃÃes entre as atividades biolÃgicas de outras lectinas do gÃnero Dioclea e as distÃncias entre os resÃduos do sÃtio de ligaÃÃo a carboidrato. Essa analise mostrou que a variaÃÃo nessas distÃncias influi no efeito e eficÃcia da atividade vasorelaxante em aorta de ratos. / Lectins from subtribe Diocleinae belong to the family from Leguminosae and are characterized by high homology among their amino acid sequences. Despite this high structural similarity the same is not true in the biological activities from this lectin family. Studies show that the modification of a few amino acids can cause large changes in biological activities of these lectins. Thus more detailed understanding of three dimensional structures of these proteins is essential for structure/function analyses. The Dioclea violacea lectin was purified by affinity chromatography on a column of Sephadex G-50. The protein was crystallized in the presence of the ligand X-Man and the crystals were obtained by the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix. Crystallization kits âCrystal Screen I and IIâ from Hampton Research were used to obtain protein crystals and the better condition was 33 from kit I4 M sodium formate. The crystal was diffracted to 2.61à with space group I222 with unit cell dimensions a = 61.34; b = 66.11; c = 106.69à and α = β = γ = 90Â. It was observed the presence of a monomer in asymmetric unit containing 42.04% of solvent in the crystal. The molecular replacement was made using Dioclea rostrata structure (PDB: 2ZBJ). The final refinement obtained Rfactorof 0.23 and Rfree of 0.27 in absence of any amino acid in regions not allowable in Ramachandran plot. The structure of X-Man was co-crystallized and observed perfectly placed in the carbohydrate recognition domain. Regarding the balance of the dimmer-tetramer associations of plant lectins, the lectin from Dioclea violacea has the amino acid HIS 131 and the position of HIS 51 is similar to the same amino acid in Dioclea grandiflora lectin, characterizing these lectins as a tetramer even at low pH. It was made comparisons between the differences in biological activities of other lectins from Diocleainae and the distances of the residues from carbohydrate site. It was observed that differences in biological activities in vasorelaxant effects on vascular smooth muscle are probably related to the distances between the residues that compose the carbohydrate domain.

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Elas são obtidas pela fermentação de Xanthomonas campestris, geralmente consideradas seguras e aprovadas para uso em indústrias alimentícias e farmacêuticas, como espessantes. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar, do ponto de vista estrutural, coloidal e reológico; goma xantana biossintetizada a partir de glicose, visando avaliar seu estado de agregação em solução aquosa. A xantana foi produzida em um meio contendo 1,5% de glicose, 0,5% de K2HPO4, 0,2% de NH4Cl, 0,1% de NaCl, 0,01% de MgSO4 e 0,1% de extrato de levedura inoculado com Xanthomonas campestris pv. manihotis e incubadas a 30 oC (72 h), em duplicata, obtendo-se as amostras XantG1 e XantG2. Visto que biopolímeros têm sido amplamente utilizados na indústria farmacêutica, sobretudo, na fabricação de sistemas de liberação controlada de fármacos, este trabalho objetivou também a investigação do complexo formado através da complexação da xantana com o antibiótico catiônico doxiciclina. As xantanas puras foram caracterizadas no estado sólido por espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) e análises térmicas (TGA e DTA). Em solução, foram caracterizadas por medidas de condutividade elétrica, espalhamento de luz dinâmico (DLS), potencial zeta (ZP) e reologias estacionária e dinâmico-oscilatória, todas a 25 oC. As interações entre doxiciclina e xantana foram investigadas utilizando-se os mesmos métodos, além da calorimetria isotérmica de titulação (ITC) que foi utilizada para medida dos parâmetros termodinâmicos de complexação. A ação antimicrobiana do complexo Dox/Xant foi avaliada através de estudos biológicos. Os espectros de infravermelho e as análises térmicas foram muito semelhantes para as duas amostras de xantana pura (XantG1 e XantG2), além de muito semelhantes aos encontrados para outras xantanas da literatura, mostrando a reprodutibilidade dos processos de síntese e purificação. Quando em solução aquosa, ambas mostraram estabilidade química por pelo menos 23 dias, já que a condutividade elétrica praticamente não se alterou. As medidas de diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta, condutividade elétrica e reologia demonstraram que as xantanas comportam-se como polieletrólitos que sofrem diferentes níveis de agregação em solução, dependendo da concentração. A solução de xantana a 2 g/L mostrou forte pseudoplasticidade decorrente da existência dos emaranhados moleculares, o que justifica seu uso como espessante. Quanto ao complexo doxiciclina/xantana, sua formação foi monitorada por titulações calorimétrica, reológica e por potencial zeta. Os dados de calorimetria isotérmica mostraram que a xantana apresenta dois sítios distintos de interação com a doxiciclina, sendo uma das etapas de complexação exotérmica e a outra endotérmica. Os experimentos de titulação reológica mostraram forte redução da viscosidade durante a titulação, sugerindo que a interação doxiciclina/xantana gera um colapso na estrutura dos polímeros, quebrando os emaranhados. Finalmente, a atividade antimicrobiana dos complexos e dos precursores foi avaliada frente à Staphylococcus aureus 323886023, por determinação da dose letal mediana e curva de morte. Os resultados obtidos demonstraram que a formação dos complexos levou a um aumento da atividade antimicrobiana, através da redução da dose letal mediana e do tempo de inibição. Isto demonstra que a preparação de complexos de xantanas com a doxiciclina pode ser uma alternativa promissora para o desenvolvimento de uma nova formulação para liberação controlada desse fármaco. / Xanthans are branched polysaccharides of high molecular mass (> 106 Da), consisting of glucose, mannose and glucuronic acid. They are usually obtained by the fermentation of Xanthomonas campestris, which has been considered safe and approved for use in the food and pharmaceutical industries, as thickeners. The present work aimed to characterize xanthan gums biosynthesized from glucose from structural, colloidal and rheological point of view, aiming to evaluate its state of aggregation in aqueous solution. They were produced in duplicate using a medium containing 1.5% glucose, 0.5% K2HPO4, 0.2% NH4Cl, 0.1% NaCl, 0.01% MgSO4 and 0.1% yeast extract inoculated with Xanthomonas campestris pv. manihotis and incubated at 30 oC (72 h), in order to obtain the XantG1 and XantG2 samples. Since biopolymers have been widely used in the pharmaceutical industry, especially in the manufacture of controlled drug delivery systems, this work also aimed to investigate the complex formed through the complexation of xanthan and the cationic antibiotic doxycycline. The pure xanthans had their chemical structures characterized in solid state by FTIR and their thermal profile evaluated by TGA/DTA thermal analysis. Moreover, measurements of electrical conductivity, hydrodynamic diameter (by DLS), Zeta potential and stationary and oscillatory dynamic rheologies were used to investigate their aggregations state at different concentrations. Further, the complexes xanthan/doxycycline (Xant/Dox) were characterized in solid state by infrared spectroscopy and thermal analysis (TGA and DTA), while the complexation process was monitored by zeta potential, DLS, viscosimetric and isothermal calorimetry (ITC) titrations. Stationary rheology studies at 25 oC where used to know the flow profile of the so-produced suspensions after titration. Antimicrobial action of the complexes was evaluated through biological studies. The infrared spectra and the thermal analyzes were very similar for the two pure xanthan samples, showing the reproducibility of the synthesis and purification processes, besides being very similar to those found for other xanthanes in the literature. The electrical conductivity data as a function of time showed chemical stability of the compounds for at least 23 days in aqueous solution. The hydrodynamic diameter, zeta potential, electrical conductivity and rheology measurements showed that xanthanes behave as polyelectrolytes that undergo different levels of aggregation in solution depending on the concentration. The solution of xanthan at 2 g / L showed strong pseudoplasticity due to the existence of molecular entanglements, which justifies its use as a thickener. As for the doxycycline/xanthan complex, its formation was monitored by calorimetric, rheological and zeta potential titrations. The data of isothermal calorimetry showed that xanthan presents two distinct sites of interaction with doxycycline, being one of the exothermic and the other endothermic complexation stages. The rheological titration experiments showed strong reduction of viscosity during titration, suggesting that the doxycycline/xanthan interaction causes a collapse in the structure of the polymers, breaking the entanglements. Finally, the antimicrobial activity of the complexes and precursors was evaluated against Staphylococcus aureus 32388602 by lethal dose and death curve assays. The results showed that the formation of the complexes led to an increase in the antimicrobial activity, through the reduction of the lethal dose and the time of inhibition. This demonstrates that the preparation of xanthan complexes with doxycycline may be a promising alternative for the development of a novel formulation for controlled release of that drug.

The discovery of pyrazole derivatives dates back to 1884, when the German chemist Ludwig Knorr attempted to synthesize quinoline derivatives with antipyretic activity and accidentally obtained antipyrine, a pyrazolinone, which has analgesic, antipyretic and antirheumatic activity. Since then, new pyrazole compounds, like phenylbutazone and dipyrone, were discovered. Dipyrone, probably the most widely studied pyrazole derivative, present analgesic, antipyretic and few antiinflammatory activities. The mechanism of action of pyrazole compounds seems to involve the central and peripheral inhibition of cyclooxygenase, a key enzyme in the synthesis of prostaglandin. In this work we studied the antinociceptive and antiinflammatory effects of a novel pyrazole-derived compounds: 4-methyl-5-hydroxy-5-trifloromethyl-4,5-diidro-1H-1-pyrazolcarboxyamide (NF0) and its related compound 3- methyl-5-hydroxy-5-trifloromethyl-4,5-diidro-1H-1-pyrazolcarboxyamide (NF2). The antinociceptive potential was assessed using abdominal writhing, hot plate and formalin tests in adult mice. Antiinflammatory activity was assessed by paw plethysmometry in adult rats using the carrageenin-induced paw edema test. Subcutaneous administration of NF0 (30, 100, 300 and 1000 μmol/kg) decreased time spent licking or biting the injected paw in the neurogenic phase of the formalin test. However, only 300 and 1000 μmol/kg NF0 decreased licking time in the inflammatory phase of the formalin test. On the other hand, subcutaneous administration of NF2 had no effect on licking time during the neurogenic phase, but decreased licking time in inflammatory phase of the formalin test at dose of 1000 μmol/kg. Naloxone (2,75 μmol/kg) pre-administration did not prevent NF0 and NF2-induced antinociception, suggesting that opioid mechanisms may not underlie such effects. NF0 and NF2 were devoid of antiinflammatory activity in the paw edema test in rats, and had no effect on the spontaneous locomotor activity and motor performance of mice in the rotarod test. These results suggest that NF0 induces antinociception in the neurogenic and inflammatory phases of the formalin test, while NF2 causes antinociception only inflammatory phase. Interestingly, the only difference between these compounds is the position of a methyl group in the pyrazole ring. In NF0, the methyl group is placed at position 4 of the pyrazole ring, while NF2 has such a methyl group positioned at the position 3. These results suggest an important structure-activity relationship for the antinociceptive effect these compounds. / Os derivados pirazolínicos foram descobertos por volta de 1884 pelo químico alemão Ludwig Knorr, quando ele tentava sintetizar derivados de quinolina com atividade antipirética e, acidentalmente, obteve a antipirina, uma pirazolona com atividade analgésica, antipirética e anti-reumática. Desde então, novos compostos pirazolínicos como a fenilbutazona e a dipirona foram descobertos. O derivado pirazolínico mais estudado até o momento é a dipirona, que apresenta atividade antipirética, analgésica e pouca atividade antiinflamatória. O mecanismo de ação proposto para os compostos pirazolínicos é a inibição da síntese de prostaglandinas, tanto central quanto perifericamente. Nesse trabalho avaliou-se o potencial antinociceptivo e antiedematogênico de dois derivados pirazolínicos inéditos: 4-metil-5-hidróxi-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxamida (NF0) e seu análogo 3- metil-5-hidróxi-5-trifluormetil-4,5-diidro-1H-1-pirazolcarboxamida (NF2). O potencial antinociceptivo foi avaliado nos testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético, placa quente, e formalina, em camundongos. A atividade antiedematogênica foi avaliada em ratos, pelo teste de edema de pata induzido por carragenina. Também foi avaliado o efeito dessas drogas sobre a atividade locomotora e exploratória de camundongos. A administração subcutânea do NF0 (30, 100, 300 e 1000 μmol/kg) induziu diminuição do comportamento de lamber a pata na fase neurogênica do teste de formalina, enquanto que somente as duas maiores doses foram capazes de inibir a nocicepção na fase inflamatória desse teste. Por outro lado, o NF2 não apresentou ação na fase neurogênica e foi capaz de inibir o comportamento de lamber a pata, apenas na dose de 1000 μmol/kg, na fase inflamatória. A pré-administração de naloxona (2,75 μmol/kg) não preveniu a antincicepção induzida pelo NF0 e pelo NF2. O NF0 e o NF2 não tiveram efeito antiedematogênico no teste de edema de pata induzido por carragenina, quando administrados numa dose de 200 μmol/kg. Esses compostos, também, não alteraram a atividade motora dos camundongos no teste do cilindro giratório e não modificaram o comportamento dos animais no campo aberto. Esses resultados sugerem que o NF0 induz antinocicepção nas fases neurogênica e inflamatória no teste da formalina, enquanto que o NF2 somente apresenta efeito na fase inflamatória, e que esse efeito não envolve mecanismos opióides. É importante ressaltar que a única diferença estrutural desses compostos reside na posição de um grupamento metila, que no NF0 encontra-se na posição 4 do anel pirazol e no NF2 está na posição 3 do anel, demonstrando uma importante relação estrutura-atividade no efeito antinociceptivo desses compostos.

Methylmalonic acidemia, one of the most frequent organic acidemias, is caused by deficiency of the methylmalonyl CoA mutase, leading to tissue accumulation of Lmethylmalolonic acid (MMA). Affects individuals present lethargy, coma, vomiting, muscular hypotonia, recurrent episodes of metabolic acidosis and progressive encephalopathy. In this context, it has been proposed that MMA inhibits succinate dehydrogenase (SDH) and leads to ATP depletion, lactate accumulation and excitotoxic damage. In the present study we confirmed that MMA competitively inhibits of SDH, and later were investigated the enzymatic medium reduction alters the activity of SDH or its inhibition by MMA. SDH activity was determined in cerebral cortex homogenates, using 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT), as the electorn acceptor. The reduction enzymatic medium was promoted by preincubation with β-NADH (160 μM). The preincubation of β-NADH prevented the inhibition of the activity of SDH induzed by 5mM of the MMA [F(1,5)=9.31; p=0.028]. In addition, was determined of the kinetic parameters (Km and Vmax) and inhition constant (Ki ) of SDH preincubated in the presence and absence of β-NADH. The Km of SDH preincubated with β-NADH (Km=0.216 nmol INT) was different of the Km of SDH preincubated in the absence of the β-NADH (Km=0.272nmol INT) [T(2)=10.375; p=0.009]. The presence of β-NADH in the incubation medium did not alter Vmax= 4.72 ± 0.28.10-8 mol INT/mg protein/min) [T(2)=-1.0; p=0.423]. The Ki of the MMA by SDH activity in presence of the β- NADH (Ki =20.05 mM) is increased that of Ki of the MMA by SDH activity in absence of the β-NADH (Ki =11.60 mM), [T(2)=18.806; p=0.003]. In conclusion, we showed that, in the presence of β-NADH, SDH is less sensitive to the inhibition by MMA. / A acidemia metilmalônica, uma das mais frequentes acidemias orgânicas, é causada pela deficiência da enzima metilmalonil-CoA mutase, ocasionando acumulação tecidual de ácido L-metilmalônico (MMA). Os indivíduos afetados apresentam letargia, coma, vômito, hipotonia muscular, episódios recorrentes de acidose metabólica e encefalopatia progressiva. Em decorrência do acúmulo de MMA ocorre inibição da sucinato desidrogenase (SDH), E.C.5.5.99.2, diminuição da produção de ATP, aumento dos níveis de lactato e dano excitotóxico. No presente estudo confirmamos que o MMA inibe a SDH competitivamente e investigamos se a presença de uma agente redutor no meio enzimático alteraria a atividade da SDH, ou sua inibição por MMA. A atividade da SDH em córtex cerebral de ratos foi determinada usando o 2-(p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazólio (INT), como aceptor de elétrons. A pré-incubação com β-NADH (160 μM) preveniu a inibição da SDH causada por 5 mM de MMA [F(1,5)=9,31; p=0,028]. Posteriormente, foi determinado os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da SDH pré-incubada na presença e ausência de β- NADH. O Km da SDH pré-incubada com β-NADH (Km=0,216 nmol INT) é menor que o Km da SDH pré-incubada na ausência de β-NADH (Km=0,272nmol INT), [T(2)=10,375; p=0,009]. Por outro lado a pré-incubação da enzima com β-NADH não alterou a Vmax (4,72 ± 0,28.10-8 mol INT/mg proteína/min) [T(2)=-1,0; p=0,423]. A constante de inibição (Ki) do MMA para a SDH pré-incubada com β-NADH (Ki=20,05 mM) foi maior que o Ki do MMA para a SDH préincubada sem β-NADH (Ki=11,60 mM) [T(2)=18,806; p=0,003]. Os dados mostram que a presença de β-NADH diminui a sensibilidade da sucinato desidrogenase a inibição por ácido metilmalônico.

Excitotoxicity refers to the neurodegenerative process initiated by excessive activation of receptors for the neurotransmitter glutamate. This process is one of the most extensively studied processes of neuronal cell death, and plays an important role in many central nervous system (CNS) diseases, including CNS ischemia, trauma, and neurodegenerative disorders. Such excitotoxic cell death seems to involve excessive calcium influx and release from internal organelles, oxyradical production, apoptosis cascades. In this study, we evaluated the effects of three simple diorganyl chalcogenides (diphenyl diselenide, diphenyl ditelluride and diphenyl telluride) and ebselen on glutamate-driven 45Ca2+ influx into chick embryonic retinal cells, as well as their effects on the excitotoxic retina neuronal damage. None of the compounds tested interfered with basal 45Ca2+ uptake. Diphenyl diselenide and diphenyl ditelluride had no effects on glutamate-stimulated 45Ca2+ influx. Diphenyl telluride (100-400 μM) decreased the glutamate-stimulated 45Ca2+ and ebselen (100-400 μM) blocked the glutamate-driven 45Ca2+ influx into chick retinal explants (P < 0.01). The assessment of neuronal injury was made pectrophotometrically by quantification of cellularly reduced MTT (3(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Ebselen had no effects on retinal MTT reduction when coincubated with glutamate. However, when ebselen (100 and 400 μM) was coincubated with glutamate and remained in the incubation media until MTT evaluation (24 h after the beginning of incubation), it protected retinas against the decrease in MTT reduction induced by glutamate. These data indicate that besides its capacity to interact with Ca2+ channels, other mechanisms are involved in the neuroprotection afforded by ebselen in this work; possibly its antioxidant properties. / A excitotoxicidade refere-se ao processo neurodegenerativo iniciado pela ativação excessiva de receptores do neurotransmissor glutamato. Este processo é um dos mais extensivamente estudados processos de morte celular neuronal, e tem uma participação importante em muitas doenças do sistema nervoso central (SNC), incluindo isquemia, trauma e desordens neurodegenerativas. A morte celular excitotóxica parece envolver eventos patofisiológicos como influxo excessivo de cálcio e liberação deste íon de organelas intracelulares, produção de radicais de oxigênio e morte celular programada (apoptose). Neste trabalho, avaliamos os efeitos de três diorganil calcogenetos simples (disseleneto de difenila, ditelureto de difenila e telureto de difenila) e do ebselen sobre o influxo de 45Ca2+ estimulado por glutamato em retinas embrionárias de pintos, assim como seus efeitos sobre o dano neuronal excitotóxico nas retinas. Nenhum dos compostos testados interferiu com o influxo de 45Ca2+ basal. Os compostos disseleneto de difenila e ditelureto de difenila não apresentaram nenhum efeito sobre o influxo de 45Ca2+ estimulado pelo glutamato. O telureto de difenila (100-400 μM) reduziu o influxo de 45Ca2+ estimulado por glutamato, e o ebselen bloqueou (100-400 μM) o influxo de 45Ca2+ estimulado por glutamato (P<0,01) nas retinas isoladas de pinto. A avaliação do dano neuronal foi realizada espectrofotometricamente pela quantificação de MTT (brometo 3(4,5- dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium) celularmente reduzido. O ebselen não teve efeito sobre a redução de MTT quando foi co-incubado com o glutamato. Contudo, quando o ebselen (100-400 μM) foi co-incubado com o glutamato, e permaneceu no meio de incubação até a avaliação do MTT (24 após o início da incubação), foi capaz de proteger as retinas contra o decréscimo na redução do MTT induzido pelo glutamato. Estes resultados indicam que apesar da sua capacidade de interagir com canais de Ca2+, outros mecanismos parecem estar envolvidos na neuroproteção exercida pelo ebselen neste trabalho, possivelmente suas propriedades antioxidantes.