Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-08-09T23:35:51Z No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-08-15T22:34:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T22:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) Previous issue date: 2015-04-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Nas Am?ricas, a infec??o por Leishmania tem como principal agente etiol?gico Leishmania infantum. Nos ?ltimos 30 anos o padr?o de distribui??o das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doen?a tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infec??o por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro cl?nico desde o acometimento da pele, mucosas e v?sceras. Dos indiv?duos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doen?a, sabe-se que 90% da infec??o humana ? assintom?tica e diversos fatores est?o envolvidos no curso da infec??o. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doen?a s?o a resposta imune do hospedeiro, a esp?cie e o conte?do g?nico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreens?o acerca da sintomatologia dos indiv?duos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade gen?tica de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintom?ticos e assintom?ticos e c?es de ?reas end?micas do Rio Grande do Norte. A variabilidade gen?tica de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doen?a visceral, doen?a cut?nea e infec??o assintom?tica foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintom?ticos e assintom?ticos, e c?es foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram constru?dos aplicando o m?todo neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das infer?ncias sobre as rela??es entre as variantes de Leishmania. As sequ?ncias dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de refer?ncia Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identifica??o de 36 contigs. As informa??es dos SNPs v?lidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anota??es do genoma foram ent?o transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequ?ncias consenso de todos os cromossomos (com m?nimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As ?rvores filogen?ticas foram calculadas de acordo com c?lculos de m?xima verossimilhan?a e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 n?o foram capazes de definir variabilidade gen?tica entre os isolados de humanos e c?es; nem para os isolados de cultura e de sangue perif?rico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento gen?mico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte rela??o entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as an?lises, sugerindo que existe proximidade genot?pica e geogr?fica entre os isolados. As amostras isoladas na d?cada de 1990 apresentaram uma maior diversidade genot?pica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, n?o encontramos correla??o entre as formas cl?nicas sintom?ticas e assintom?ticas e o conte?do g?nico dos isolados brasileiros de Leishmania. / Leishmania infantum is the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in the New World. The pattern of distribution of leishmaniasis has changed substantially and has presented an emerging profile within the periphery of the Large Urban Centers. Leishmania infection can compromise skin, mucosa and viscera. Only 10% of the individuals infected develop the disease and 90% of human infection is asymptomatic. The main factors involved in the development of the disease are the host immune response, the vector?s species and the parasite?s genetic content. The sequencing of Leishmania isolated seeks to increase the understanding of the symptoms of individuals. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of circulating Leishmania strains among humans, and symptomatic and asymptomatic, and dogs from endemic areas of Rio Grande do Norte State and analyze sandflies from endemic areas for cutaneous and visceral disease. The genetic variability was evaluated by the use of markers hsp70 , ITS1 and a whole genome sequencing was also carried out. The amplified hsp70 and ITS1 of samples were analyzed and assembled using a Phred / Phrap package. The dendograms were constructed using the same methodology, but adding 500 bootstraps, followed by inferences on the relationships between Leishmania variants. The sequences of the 20 Brazilian isolates were mapped to the reference genome L. infantum JPCM5, using the Bowtie2 program and the identification of 36 contigs. The information of the valid SNPs were used in the PCA. SNPs were visualized by Geneious 7.1 and IGV. The genome annotations were transferred to their respective chromosomes and displayed on Geneious. The matching sequences of all chromosomes were aligned using Mauve. The phylogenetic trees were calculated according to maximum likelihood and JTT models. Sandflies were analyzed by PCR for the identification of Leishmania infection, a blood meal source and GAPDH sand fly. As a result, hsp70 and ITS1 were not capable of identifying genetic variability among human isolates from symptomatic and asymptomatic, and dogs. The complete sequencing of the 20 Brazilian isolates revealed a strong similarity between the circulating Leishmania strains in Rio Grande do Norte. The isolates collected in the city of Natal from humans and canines remained grouped in all analyzes, suggesting that there is genotypic and geographic proximity among the isolates. The isolated samples in the 1990s had a higher genotypic diversity when compared to freshly isolated samples. All isolates presented 36 chromosomes with variable ploidy among them, no correlation was found between the number of amastina genes copies, gp63, A2 and SSG with such clinic forms. In general, we did not find correlation between symptomatic and asymptomatic clinical forms and the gene content of the Brazilian isolates of Leishmania. 34,28% of the sandflies collected in the upper west region were L. longipalpis and the main sources of blood meal were humans, dogs and chickens.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PaulaRM_TESE_CAPA_PAG_145.pdf: 2412975 bytes, checksum: 1debc39154a40b289790305c460cc983 (MD5) Previous issue date: 2012-09-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The temporal allocation of the active phase in relation to light and dark cycle (LD) changes during puberty in humans, degus, rats and rhesus. In marmosets, the animal model used in several biomedical researches, there is evidence of a delay at the beginning of the active phase and an increase in total daily activity after onset of puberty. However, as this aspect was evaluated in animals maintained in natural environmental conditions, it was not possible to distinguish between the effects of puberty and of seasonality. Furthermore, as motor activity is the result of different behaviors in this species, it is also important to characterize the diurnal distribution of other behaviors in juvenile stage. With the aim of characterizing the circadian rhythm of motor activity and the diurnal profile of affiliative behavior in marmosets, the motor activity of 5 dyads juveniles between 4 and 12 months of age and their parents was recorded continuously for act?metro. The families were maintained under artificial LD 12:12 h, constant temperature and humidity. The duration of grooming behavior, proximity and social play among juveniles was recorded 2 times a week in sessions of 15 minutes each hour of the active phase. Afetr onset of puberty in juvenile, it was observed that there was no change in the parameters of circadian motor activity rhythm which were common to most animals. Despite the absence of pubertal modulation, it was observed that the circadian activity profiles have stronger synchrony between individuals of the same family than that of different families, which may indicate that the circadian activity rhythm was modulated by the dynamics of social interactions. In relation to age, the total daily activity and the ratio between evening and morning activity (EA/MA) were higher in juveniles than in adults, which may be associated with differences in the circadian timing system between age groups. Furthermore, the onset of the 10 consecutive hours of higher activity (M10) occurred earlier in adult males than in other members of the group, probably as a way to avoid competition for resources in one of the first activities of the day that is foraging. During the juvenile stage, there was an increase in total daily activity that may be associated with increased motor ability of juveniles. In addition to the circadian activity rhythm, the daytime profile of proximity and social play behaviors was similar between the 5th and 12th month of life of juveniles, in which the interval between 7- 10 h in the morning showed the highest values of proximity and lower values of play social. Moreover, the duration of the grooming showed a similar distribution to adults from the 8th month, wherein the higher values occurring at the interval between 11 14 h of day. Considering the results, the parameters of the circadian activity rhythm had a greater influence of social factors than puberty. In relation to age, there were no changes related to the allocation of the active phase in relation to the LD cycle, but total daily activity, the ratio AV/AM and the start of the M10 is possible to observe differences between juveniles and adults / A aloca??o temporal da fase ativa em rela??o ao ciclo claro e escuro (CE) modifica-se durante a puberdade em humanos, degus, ratos e rhesus. Em sagui, modelo animal utilizado em diversas pesquisas biom?dicas, h? evid?ncias de um avan?o no in?cio da fase ativa e um aumento no total di?rio da atividade ap?s a entrada na puberdade. Entretanto, como este aspecto foi avaliado em animais mantidos em condi??es ambientais naturais, n?o foi poss?vel distinguir entre os efeitos da puberdade e da sazonalidade. Al?m disso, como a atividade motora ? resultado dos diversos comportamentos nessa esp?cie, torna-se importante tamb?m caracterizar a distribui??o diurna de outros comportamentos na fase juvenil. Com o objetivo de caracterizar o ritmo circadiano de atividade motora e o perfil circadiano dos comportamentos afiliativos em saguis, a atividade motora de 5 d?ades de juvenis entre o 4? e 12? meses de vida e seus respectivos pais foi registrada continuamente por act?metro. As fam?lias estavam vivendo sob ciclo CE artificial 12:12 h e temperatura e umidade constantes. A dura??o dos comportamentos de cata??o, proximidade e brincadeira social entre os juvenis foi registrada 2 vezes por semana, em sess?es de 15 minutos a cada hora da fase ativa. Ap?s a entrada na puberdade dos juvenis, observou-se que n?o houve modifica??es nos par?metros do ritmo circadiano da atividade motora que fossem comuns a maioria dos animais. Apesar da aus?ncia de modula??o puberal, foi observado que os perfis circadianos da atividade t?m sincronia mais forte entre os indiv?duos de uma mesma fam?lia do que entre fam?lias diferentes, o que pode indicar que o ritmo circadiano de atividade motora foi modulado pela din?mica das intera??es sociais. Em rela??o ?s faixas et?rias, o total di?rio da atividade e a raz?o entre a atividade vespertina e matutina (AV/AM) foram maiores nos juvenis do que nos adultos, o que pode est? associado a diferen?as no sistema de temporiza??o entre as faixas et?rias. Al?m disso, o in?cio das 10 h consecutivas de maior atividade (M10) ocorreu mais cedo nos machos adultos do que nos demais membros do grupo, provavelmente como forma de evitar a competi??o por recursos em uma das primeiras atividades do dia que ? o forrageio. Ao longo da fase juvenil, houve um aumento no total di?rio da atividade que pode estar associado ao aumento da habilidade motora nos juvenis. Al?m do ritmo circadiano de atividade motora, o perfil diurno dos comportamentos de proximidade e brincadeira social foi semelhante entre o 5? e o 12? m?s de vida dos juvenis, nos quais o intervalo entre 7-10 h da manh? apresentou os maiores valores da proximidade e os menores valores da brincadeira social. Por outro lado, a dura??o da cata??o apresentou uma distribui??o semelhante aos adultos a partir do 8? m?s, em que os maiores valores ocorreram no intervalo entre 11-14 h. Tendo em vista os resultados, os par?metros do ritmo circadiano de atividade motora tiveram uma influencia maior dos fatores sociais do que puberais. Em rela??o ? faixa et?ria, n?o houve modifica??es relacionadas ? aloca??o da fase ativa em rela??o ao ciclo CE, mas no total di?rio da atividade, na raz?o AV/AM e no in?cio do M10 ? poss?vel observar diferen?as entre juvenis e adultos

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-02T13:30:50Z No. of bitstreams: 1 EmmanuelDuarteBarbosa_DISSERT.pdf: 9706329 bytes, checksum: cf979f942793c968afbd04719854d7f0 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-02-08T19:26:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 EmmanuelDuarteBarbosa_DISSERT.pdf: 9706329 bytes, checksum: cf979f942793c968afbd04719854d7f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T19:26:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EmmanuelDuarteBarbosa_DISSERT.pdf: 9706329 bytes, checksum: cf979f942793c968afbd04719854d7f0 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / A enzima Delta Aminolevul?nico Desidratase (ALAD) ? uma metaloprote?na citos?lica essencial em v?rios processos biol?gicos, uma vez que ? respons?vel pelo segundo passo da cat?lise enzim?tica na forma??o de porfobilinog?nio, um precursor dos tetrapirr?licos (heme, clorofila). Esta enzima ? bastante sens?vel a metais pesados e tem sido classicamente usada como um marcador na intoxica??o por chumbo. Sua inibi??o se d? pela substitui??o desses metais pesados no s?tio de liga??o a metais. Na ALAD humana, o Zinco (Zn2+) ocupa funcionalmente este s?tio sendo essencial para a coordena??o das cadeias de ?cido aminolevul?nico durante a cat?lise enzim?tica. Embora muitos ensaios in vitro, in vivo e in s?lico j? tenham demonstrado a import?ncia do Zn2+ nesse s?tio, n?o se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em abordagem qu?ntica com o intuito de elucidar esta intera??o de forma mais detalhada. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar as muta??es missense que acometem o s?tio de liga??o ao zinco e descrever atrav?s de m?todos qu?nticos a energia de intera??o entre a enzima e o zinco com maior acur?cia utilizando o m?todo do Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC), quantificando energeticamente os res?duos de amino?cidos posicionados at? uma dist?ncia de 8,5 ? do centroide do ligante. Foi identificado as altera??es bioqu?micas na estrutura monom?rica dos mutantes, as quais resultam na diminui??o da atividade enzim?tica. Foram identificados um total de 30 res?duos com valores energ?ticos variados que interagem com o zinco no bols?o de liga??o. Aqueles que apresentaram valores significativos (de atra??o ou repuls?o) e est?o relacionados funcionalmente ? atividade enzim?tica foram: Lis199, Lis252, Arg 209, Arg 174, Cis122, Cis124 e Cis132; e aqueles que demonstraram relev?ncia para a perman?ncia do ?on no s?tio de liga??o foram: Asp169, Gli130, Gli133, Asp120 e Ser168. A partir disso, p?de-se concluir que al?m dos grupos nucle?filos (grupos tiolatos) dos res?duos Cis122, Cis124 e Cis132, os res?duos Asp169, Asp120 e Ser168 s?o fundamentais na composi??o do bols?o, uma vez que demonstraram grande quantidade de energia de intera??o atrativa com o ?on Zn2+. / The enzyme Delta Aminolevulinic Dehydratase (ALAD) is a cytosolic metalloproteinase essential in several biological processes since it participates in the second step in porphobilinogen formation pathway, a tetrapyrrolic precursor of heme and chlorophyll. This enzyme is very sensitive to heavy metals and has traditionally been used as a biomarker in lead poisoning. Its inhibition occurs when these heavy metals are replaced inside the metal binding site. In human ALAD, Zinc (Zn2+) functionally occupies this site and it is essential for coordination of two chains of aminolevulinic acid for the enzymatic catalysis. Although many in vitro, in vivo and in silico works have already demonstrated the importance of Zn2+ at that site, to the best of our knowledge, there isn?t any studies on literature based on quantum approach in order to elucidate this interactions in more details. Therefore, the aim of the present study was to analyse the missense mutations that affect the zinc binding site and describe through quantum methods the energy interaction between zinc and ALAD with greater accuracy using the method of Molecular fractionation with conjugated caps (MFCC) by quantifying amino acid residues? energy positioned at 8.5 ? of distance with the ligand centroid. It was identified biochemical changes in the monomeric structure of mutants, which result in decreased enzyme activity. It were identified a total of 30 residues with a wide range of energy values. The residues with significant (atractition or repulsion) values and functionally related to enzymatic activity were: Lys199, Lys252, Cys122, Cys124 and Cys132; and those that demonstrated relevance to the ion permanence inside the binding site were: Asp169, Gly130, Gly133, Asp120 and Ser168. Thus, it could be concluded that in addition to the nucleophilic groups (thiolates groups) from Cys122, Cys124 and Cys132, others residues such as Asp169, Asp120 and Ser168 are fundamental in the catalytic pocket composition, since they showed high attractive interaction energy with Zn2+ ion.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-17T19:43:30Z No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-02-18T00:27:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-18T00:27:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Macroalgas marinhas s?o importantes fontes de polissacar?deos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacol?gico. A macroalga marrom Lobophora variegata ? conhecida por apresentar polissacar?deos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obten??o de 6 fra??es polissacar?dicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracteriza??o f?sico-qu?mica das fra??es, escolheu-se a F1 para purifica??o de seus componentes polissacar?dicos. An?lises de cromatografia l?quida de exclus?o molecular levaram a observa??o que F1 apresenta polissacar?dicos de baixa (~ 5 kDa) at? alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separa??o por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfra??es polissacar?dicas com tamanhos m?dios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfra??es foram analisadas f?sico-qu?micamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia l?quida de alta efici?ncia, assim como, por an?lises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citot?xicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de a??cares totais acima de 55% em todas as subfra??es, j? prote?nas e compostos fen?licos n?o foram observados. As fra??es F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), j? F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfra??es apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produ??o/libera??o de ?xido n?trico (NO) por c?lulas RAW 264.7 ficou aumentada apenas na presen?a F1-5 (10 ?M, p<0,05), F1-75 (10 ?M, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 ?M, p<0,001) cuja presen?a aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas c?lulas foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 ?M) (p<0,001) proporcionaram produ??o/libera??o de ON. As demais fra??es n?o interferiram na a??o do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produ??o/libera??o de citocinas. Somente F1>100 (10 ?M) foi citot?xica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfra??es apresentaram efeito citot?xico para linhagem de c?lulas RAW 264.7 (macr?fagos) ou para linhagem de c?lulas tumorais Hep-G2 (carcinoma hep?tico). J? com a linhagen de c?lulas 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 n?o apresentou atividade citot?xica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfra??o F1-20, no caso contra c?lulas B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfra??o promove uma parada das c?lulas na fase G1 do ciclo celular (10 ?M, p<0,01). An?lises de resson?ncia magn?tica nuclear levaram a proposta de que F1-20 ? uma ?-glucana formada por ?-(1?3) glucoses com ramifica??es, compostas por um res?duo de glicose, na posi??o 6. A propor??o ? de nove res?duos de glucose 1?3 ligados para cada ponto de ramifica??o. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citot?xico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado. / Seaweeds are important sources of neutral and negative polysaccharides with important industrial and pharmacological potential. The brown macroalgae Lobophora variegata is known for presenting sulfated polysaccharides (heterofucans) and neutral (laminarins). In this work, it is shown getting 6 polysaccharide fractions (F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2). From the data of physicochemical characterization of fractions, F1 was chosen for next purification steps. Liquid chromatography of molecular exclusion analysis showed that F1 contain polysaccharide from low (~ 5 kDa) to high (> 100 kDa) molecular weight. These components were separated according to their molecular weight using separation by molecular size devices. Thus, it was obtained subfractions with an average polysaccharide size of 5, 20, 40, 75 and above 100 kDa, named F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 and F1>100 kDa, respectively. These subfractions were analyzed physico-chemically by agarose gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography, as by analysis of their antioxidant, immunomodulatory and cytotoxic/antiproliferative properties. As result, total sugar content in all subfractions was above 55%, since proteins and phenolic compounds were not observed. The fractions F1-5, F1-20 and F1-40 showed only glucose (glucans), as F1-75 and F1> 100 exhibit glucose, galactose and fucose (heterofucans). All subfractions showed chelating activity of metals, but only F1-75 and F1>100 were more effective as radical scavenger. The production/release of nitric oxide (NO) by RAW cells was increased only in the presence F1-5 (10 ?M, p <0.05), F1-75 (10 ?M, p<0.001) and, especially, F1>100 (10 ?M, p <0.001) whose its presence increased about 12 times the amount of NO. However, when these cells were activated with LPS only F1-20 and F1>100 (10 ?M) (p<0.001) yielded production/release of NO. The other fractions did not interfere in the LPS action. Only F1-5 and F1>100 stimulated the production/release of cytokines. Only F1>100 (10 ?M) was cytotoxic to line 3T3 (fibroblast) (p<0.01). None of subfractions showed cytotoxicity effect to cell line RAW 264.7 (macrophages) or tumor cell line Hep-G2 (hepatocellular carcinoma). On the other hand, only F1-40 did not showed cytotoxic activity (p>0.05) against 786-0 renal carcinoma cells. The highest cytotoxicity values were obtained with the subfraction F1-20, in the case against B16F10 cells (melanoma). Flow cytometry data indicate that this subfraction stopped of cells in the G1 phase of the cell cycle (10 ?M, p<0.01). Nuclear magnetic resonance analysis led to the proposal that F1-20 is a ?-glucan formed by ?-(1?3) glucosides with branches, comprising a glucose residue at position 6. The ratio is nine glucose residues 1,3 connected to each branching point. The data point F1-20, being an antioxidant, immunomodulating and cytotoxic as a compound pluripotent whose potential should be further investigated.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-05-31T20:46:06Z No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / Introdu??o: Os c?es s?o considerados os principais reservat?rios dom?sticos de Leishmania infantum no Brasil e apresentam um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, variando de perda de peso, anemia grave, hepatoesplenomegalia e les?es d?rmicas disseminadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de express?o g?nica em c?lulas do ba?o e do sangue perif?rico de c?es naturalmente infectados por L. infantum e investigar as altera??es histopatol?gicas no ba?o, f?gado, intestino e pele, visando identificar poss?veis vias imunorreguladoras envolvidas na patog?nese da LVC. Metodologia: Vinte e um c?es oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN foram estudados e um subgrupo destes animais (n=8) foi utilizado para estudos de express?o g?nica global. A carga de Leishmania nos diversos tecidos, foi estimada por qPCR e cultura para Leishmania foi realizada. O RNA total do ba?o e do sangue perif?rico foi extra?do e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequ?ncias obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A express?o g?nica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anota??o funcional e as caracter?sticas moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG atrav?s do pacote STRINGdb. Fragmentos de f?gado, duodeno, pele e ba?o foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluoresc?ncia para an?lises histopatol?gicas. Resultados: As cargas parasit?rias estimadas para ba?o e f?gado apresentam correla??o, por?m n?o h? correla??o entre a carga parasit?ria destes tecidos com aquela presente no sangue. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no ba?o de animais sintom?ticos, como CTLA4, CCL2 e IL27; al?m destes, cerca de 1.190 genes apresentaram express?o reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. As vias de ativa??o de c?lulas NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like expressas no ba?o de animais sintom?ticos estavam com express?o elevada, enquanto as vias de s?ntese de ?ncoras de GPI e ativa??o do imunoproteossoma estavam reprimidas. A progress?o da LVC resulta em desorganiza??o da citoarquitetura do ba?o, com perda parcial da delimita??o entre polpa branca e vermelha. ? observado infiltrado inflamat?rio no f?gado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluoresc?ncia a presen?a de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no ba?o de animais sintom?ticos. Conclus?es: A desregula??o de mecanismos tipicamente associados ? imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Al?m disso, uma alta efici?ncia no processamento e apresenta??o de ant?genos parecem ser respons?veis, pela resist?ncia ao desenvolvimento dos sinais cl?nicos e integridade tissular durante a infec??o por L. infantum em c?es. / Background: Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum in Brazil. Those animals present a wide spectrum of clinical manifestations, varying from weight loss, anemia to hepatosplenomegaly and skin lesions. The goal of this study was to evaluate the gene expression profile in the spleen and peripheral blood cells from naturally Leishmania-infected dogs and to study the histology of the spleen, liver, gut and skin, in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 dogs was studied and a sub group (n=8) was selected for transcriptomic studies. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR and parasite was isolated from the spleen by culture. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: Parasite load estimated in the spleen and liver were strongly associated, however no correlation was observed between them and circulating parasite estimation. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatic dogs, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. We found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways are highly expressed in the spleen of symptomatic dogs, while GPI-anchors synthesis and immunoproteasome activation related genes are downregulated in these animals. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, with partial loss of the delimitation between white and red pulp. Furthermore, an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirming the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 are overexpressed the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: These findings suggest that misregulation of innate immunity is involved in CVL and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.

nÃo hà / Cristais da lectina de sementes de Canavalia maritima (ConM) nativa foram obtidos pelo mÃtodo da difusÃo de vapor em gota suspensa com soluÃÃo do reservatÃrio contendo tampÃo Hepes 0,1M pH 8.43 com 4% v/v de polietilenoglicol 400 e 2M de sulfato de amÃnio. AtravÃs de âsoakingâ dos cristais com ligantes glicÃdicos foram produzidos cristais da lectina complexada aos aÃucares maltose e trealose. Os cristais obtidos de ConM nativa difrataram a uma resoluÃÃo mÃxima de 1,56 Ã, pertencendo ao grupo primitivo ortorrÃmbico, P21212 com parÃmetros de cÃlula de a=67.9, b=71.0, c=97.6 à e apresentando um dÃmero na unidade assimÃtrica (VM = 2,4 A3 Da-1). Com base nas densidades eletrÃnicas dos resÃduos da estrutura tridimensional resolvida, constatou-se que a sequencia de Perez et al (1991) apresentava erros, que quando corrigidos e comparados com a seqÃÃncia de ConA, aumentaram para 98% o grau de similaridade entre as duas lectinas. A estrutura de ConM nativa exibe um alto grau de enovelamento terciÃrio, tÃpico das lectinas de leguminosas, com visÃvel conservaÃÃo do sÃtio de ligaÃÃo a metais e loops envolvidos na oligomerizaÃÃo molecular. Embora a especificidade e o nÃmero de pontes de hidrogÃnio formadas na interaÃÃo com os dissacarÃdeos maltose e trealose seja a mesma, estruturalmente ocorrem diferenÃas no padrÃo de formaÃÃo de pontes de hidrogÃnio, principalmente na distribuiÃÃo do nÃmero de pontes de hidrogÃnio entre os dois resÃduos de glicose dos dissacarÃdeos. Os ensaios de atividade biolÃgica mostraram que o efeito relaxante concentraÃÃo-dependente da lectina de sementes de Canavalia maritima em anÃis de aorta isolados ocorre provavelmente atravÃs da interaÃÃo com um sÃtio de ligaÃÃo lectina-especÃfico presente no endotÃlio, resultando em liberaÃÃo de Ãxido nÃtrico. / Crystals of Canavalia maritima seeds lectin (ConM) were obtained using the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix with reservatory solution containing 0,1 M HEPES, pH 8,43, 4% Polyethylene Glycol 400 and 2 M ammonium sulfate. The soaking technic was used to produce lectin crystals complexed with the carbohydrates maltose and trehalose. ConM native crystals diffracted to 1.56 à resolution, belonging to the primitive orthorhombic space group P21212, with unit-cell parameters a=67.9, b=71.0, c=97.6 Ã, consisting in a dimer in the asymmetric unit (VM = 2,4 A3 Da-1), with two metal binding sites per monomer, and loops involved in the molecular oligomerization. The structure was solved by standard molecular replacement techniques. The wrong amino acids residues previously suggested by manual sequencing by Perez et al. (1991) are now determinated as I17, I53, S129, S134, G144, S164, P165, S187, V190, S169, T196 and S202. These modifications confer 98% of similarity between ConM, ConA and ConBr. ConM structure presents a high level of tertiary protein folding, typically of legume lectins. Despite the specificity and the numbers of hydrogen bonds formed in the interaction with the disaccharides maltose and trehalose be the same, structurally changes occurs in the pattern of formation of the hydrogen bonds, especially in the distribution in the number of hydrogen bonds between the two glucose residues of the disaccharides. Our biological activity data show that the relaxant concentration-dependent effect of the seed lectin of Canavalia maritima on isolated aortic rings probably occurs via interaction with a specific lectin-binding site on the endothelium, resulting in a release of nitric oxide.

nÃo hà / PolissacarÃdeos sulfatados de algas marinhas sÃo polÃmeros heterogÃneos que representam biomolÃculas de interesse comercial, principalmente nas indÃstrias alimentÃcia e farmacÃutica. O presente trabalho teve como finalidade avaliar os efeitos dos polissacarÃdeos sulfatados totais (PST) da alga marinha verde Caulerpa mexicana em modelos clÃssicos de nocicepÃÃo e inflamaÃÃo aguda em animais. Foram utilizados camundongos Swiss machos (18-25 g) e ratos Wistar machos (120-260 g). O rendimento de PST obtidos da extraÃÃo por digestÃo enzimÃtica foi de 1,7%. Na anÃlise por espectroscopia na regiÃo do infravermelho foram caracterizados como polissacarÃdeos contendo, principalmente, galactose sulfatada e Ãcido urÃnico. Os PST da alga C. mexicana foram capazes de reduzir (p<0,05) o nÃmero de contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico (1%) em 31,8; 74,5 e 88,9% nas doses de 5, 10 e 20 (mg/kg; i.v.), respectivamente. No teste da formalina, os PST inibiram (p<0,05) o tempo de lambedura da pata somente na segunda fase do teste (88,6 e 98,5% para as doses 10 e 20 mg/kg; i.v., respectivamente). No teste da placa quente, os PST nÃo demonstraram efeito antinociceptivo no decorrer dos 90 minutos do teste. Desta forma, os resultados sugerem que os PST exerceram um efeito antinociceptivo de aÃÃo perifÃrica. Em adiÃÃo, os PST (5, 10 e 20 mg/kg) apresentaram efeito anti-inflamatÃrio quando administrados por via s.c. em ratos Wistar no modelo de edema de pata induzido por carragenana, dextrana e histamina. Para analisar o envolvimento da via heme oxigenase (HO) no efeito anti-inflamatÃrio dos PST (20 mg/kg; s.c.), os animais foram prÃ-tratados por via s.c. com um inibidor de HO especÃfico (zinco protopofirina IX). Os resultados obtidos demonstraram que os PST foram capazes de reduzir o edema de pata induzido por carragenana na terceira hora, cujo resultado foi comprovado pela quantificaÃÃo da mieloperoxidase. AlÃm disso, os PST reduziram o edema induzido por dextrana ou histamina em modelos de edema de pata nos primeiros 30 minutos apÃs a aplicaÃÃo dos agentes flogÃsticos. O efeito anti-inflamatÃrio dos PST no edema de pata induzido por carragenana nÃo foi observado apÃs inibiÃÃo prÃvia por zinco protopofirina IX. Portanto, sugerimos que o efeito anti-inflamatÃrio dos PST da alga C. mexicana pode estar relacionado com a inibiÃÃo da liberaÃÃo de histamina, reduÃÃo da migraÃÃo celular e ativaÃÃo da via da HO. Para avaliar os efeitos sistÃmicos dos PST, estes foram administrados por via i.v. (20 mg/kg) em camundongos em dose Ãnica e as alteraÃÃes sistÃmicas avaliadas durante 48 h. Os resultados obtidos demonstraram que os PST nÃo causaram mortalidade e nem alteraÃÃes macroscÃpicas significativas dos ÃrgÃos e dos parÃmetros bioquÃmicos avaliados, sendo, portanto, considerados seguros na dose testada. Em resumo, os PST da alga C. mexicana apresentaram efeitos antinociceptivos e anti-inflamatÃrios significativos, tornando-se uma importante ferramenta biotecnolÃgica para estudos posteriores. / Sulfated polysaccharides from seaweed are heterogeneous polymers representing biomolecules of commercial interest, especially in food and pharmaceutical industries. The aim this study was to evaluate the effects of total sulfated polysaccharides (TSP) of the green seaweed Caulerpa mexicana in classical models of nociception and acute inflammation in animals. Swiss male mice (18-25 g) and male Wistar rats (120-260 g) were used. The yield of the extraction of TSP obtained by enzymatic digestion was 1.7%. In analysis by Fourier transformed infrared were characterized as polysaccharides containing mainly sulfated galactose and uronic acid. The TSP of the alga C. mexicana were able to decrease (p <0.05) the number of writhes induced by acetic acid (1%) on 31.8, 74.5 and 88.9% at doses of 5, 10 and 20 mg/kg; i.v., respectively. In the formalin test, the TSP inhibited (p <0.05) the licking time of the paw only on the second of the test phase (88.6 and 98.5% for the doses 10 and 20 mg/kg; i.v., respectively). In the hot plate test, the TSP did not show antinociceptive effect in the course of 90 minutes of the test. Thus, the results suggest that the TSP presented analgesic effect by a peripheral action. In addition, TSP (5, 10 and 20 mg/kg) showed anti-inflammatory effect when administered s.c. in rats on paw edema models induced by carrageenan, dextran or histamine. To analyze the involvement of heme oxygenase (HO) pathway in the anti-inflammatory effect of TSP (20 mg/kg, sc), the animals were pretreated (s.c.) with a specific HO inhibitor (zinc protoporphirin IX). The results showed that the TSP were able to reduce the paw edema induced by carrageenan in the third hour, which was confirmed by myeloperoxidase quantification. In addition, the TSP reduced the edema induced by dextran or histamine in paw edema models in the first thirty minutes after application the flogistic agents. The anti-inflammatory effect of TSP on paw edema induced by carrageenan was not observed after prior inhibition by zinc protoporphyrin IX. Therefore, we suggest that the anti-inflammatory effect of TSP of the alga C. mexicana algae may be related to inhibition of the histamine release, reduction of cell migration and activation of the HO pathway. To evaluate the systemic effects of TSP, they were administered (i.v.) in mice (20 mg/kg) in a single-dose and evaluated the systemic changes for 48 h. The results showed that the TSP did not cause mortality or significant alterations on organs and on biochemical parameters being considered safe in the tested dose. In summary, the TSP from the algae C. mexicana have showed significant antinociceptive and anti-inflammatory effects, becoming an important biotechnological tool for further studies.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / PolissacarÃdeos ocorrem em grandes quantidades nas sementes como componentes da parede celular ou como reserva. Dentre estes Ãltimos, incluem-se as xiloglucanas cotiledonÃrias e as galactomananas endospÃrmicas. As xiloglucanas apresentam uma cadeia principal de &#946;-D-(1&#8594;4)-glucana ramificada com ligaÃÃes &#945;-(1&#8594;6) por resÃduos D-xilopiranosÃdeos ou &#946;-D-galactopiranosÃdeo-(1&#8594;2)-D-xilopiranosÃdeos, enquanto as galactomananas endospÃrmicas consistem em cadeias polimÃricas de resÃduos &#946;-D-manopiranosil (1&#8594;4) ligados, substituÃdos em O-6 por unidades de &#945;-D-galactopiranosil. O objetivo deste trabalho foi analisar a interaÃÃo de xiloglucanas e galactomananas com lectinas galactose-ligantes e, assim, sugerir o uso de tais polissacarÃdeos como alternativa barata e eficaz na preparaÃÃo de matrizes cromatogrÃficas para o isolamento e determinaÃÃo da especificidade anomÃrica de novas lectinas. Dessa forma, as interaÃÃes das lectinas das sementes de Artocarpus integrifolia (frutalina), Artocarpus incisa (jacalina), Ricinus communis (ricina) e Arachis hypogaea (PNA) com matrizes de xiloglucanas de sementes de Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei e Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectivamente) e de galactomananas de Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina e Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectivamente) foram analisadas. As galactomananas apresentaram melhor capacidade de retenÃÃo da jacalina (MA â 0,92 mg ; MM â 1,48 mg ; MD â0,88 mg ; MS â 0,83 mg) e da frutalina (MA â 0,99 mg ; MM â 1,09 mg ; MD â 0,94 mg ; MS â 0,85 mg), lectinas que possuem especificidade por &#945;-D-galactose. Vale destacar que a galactomanana de M. scabrella apresentou melhor capacidade de retenÃÃo da lectinas testadas. Por outro lado a ricina, capaz de ligar-se aos dois anÃmeros, mas que se liga preferencialmente ao anÃmero &#946;, teve maior massa retida nas colunas de xiloglucana (MMu â 2,17 mg ;MJ â 1,30 mg; MC â 2,83 mg). Houve diferenÃa nos perfis de retenÃÃo da PNA, que tambÃm se liga aos anÃmeros &#945; e &#946; da galactose, sendo que a melhor retenÃÃo foi na coluna contendo matriz de M. sloanei (0,12 mg). As colunas foram todas saturadas com extrato bruto a partir das farinhas das sementes, para que se utilizasse a capacidade mÃxima de retenÃÃo de cada matriz. Atividade hemaglutinante foi detectada em ambos os picos PI e PII. Para a ricina, atividade tÃxica foi realizada e detectada para todos os PII obtidos. Por meio de SDS-PAGE, a pureza de cada uma das lectinas foi confirmada. Diante dos resultados expostos, pode-se sugerir o uso de xiloglucanas e galactomananas para o isolamento, purificaÃÃo e determinaÃÃo da especificidade anomÃrica de lectinas galactose-ligantes. / Polysaccharides are found in large quantity in seeds and they represent the main compounds of cell wall or reservoir. Among reservoir compounds, it included cotyledonary xyloglucans and endospermic galactomannans. The xyloglucans are made of a main chain of &#946;-D-(1&#8594;4)-glucan with &#945;-(1&#8594;6) ramifications of D-xylopyranoside or &#946;-D-galactopyranoside-(1&#8594;2)-D-xylopyranoside residues. Endospermic galactomannans are polimeric chains of &#946;-D-mannopyranosil (1&#8594;4) and replaceabled in O-6 for units of &#945;-D-galactopyranosil. The aim of this work is investigate the interaction of xyloglucans and galactomannans with galactose bounding lectins and show the possibility of the usage of these polysaccharides as cheap and useful chromatographic matrices for isolation and determination of anomeric specificity of galactose bounding lectins. The interactions of lectins from seeds of Artocarpus integrifolia (frutalin), Artocarpus incisa (jacalin), Ricinus communis (ricin) e Arachis hypogaea (PNA) were performed with coluns of xyloglucans of seeds from Copaifera langsdorffii, Mucuna sloanei and Hymenaea courbaril (MC, MMu, MJ, respectively) and galactomannans from Mimosa scabrella, Stryphnodendron barbatiman, Adenanthera pavonina and Dimorphandra mollis (MM, MS, MA; MD, respectively). The galactomannans showed the best colun interaction capacity for the jacalin (MA â 0,92 mg ; MM â 1,48 mg ; MD â0,88 mg ; MS â 0,83 mg) and frutalin (MA â 0,99 mg ; MM â 1,09 mg ; MD - 0,94 mg ; MS - 0,85 mg) lectins. Remarkably the M. scabrella galactomannan showed the best colun interaction among all lectins analysed. On the other hand, ricin was better hold in coluns made of xyloglucan (MMu â 2,17 mg ;MJ â 1,30 mg; MC â 2,83 mg). For PNA lectin, differences were detected in colun interaction capacity. The best colun interaction was with the M. sloanei matrix (0,12 mg) for PNA lectin. All coluns were fill with sample extract of flour from seeds and hemagglutination assays was performed with PI and PII. In these assays, hemagglutination activity was detected in both PI and PII from the coluns. For ricin, toxic activity was made and it was detected for all obtained chromatographic samples. With SDS-PAGE it was possible confirmed the purification of the studied lectins. The bands in polyacrilamid gel were the same for the lectins purified. In conclusion, it can be suggested the usage of xyloglucans and galactomannans for isolation, purification and determination of anomeric specificity of galactose-bounding lectins.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The complete sequencing of its genome has revealed many genes encoding products of biotechnological interest. Among these products are several chitinases. Chitinases, enzymes capable of degrading chitin, an insoluble polymer of &#946;(1,4)-linked N-acetyl-&#946;-D-glucosamine (GlcNAc), are of great biotechnological interest, because they can be used to convert chitin in useful derivatives as well as being exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase, belonging to family GH18, from C. violaceum ATCC 12472. The ORF CV2935 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET303/CT-His and pPICZ&#945;A, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In both systems, the enzyme was secreted into the culture medium, in its soluble and functional form, and purified to homogeneity by affinity chromatography on a chitin matrix followed by size-exclusion chromatography on Superdex75 matrix. The yields of pure chitinase expressed in E. coli and P. pastoris were 2.6 and 44 mg per liter of culture, respectively. The recombinant chitinase produced in both microrganisms showed optimal activity at pH 3.0 and it was active after treated at temperatures up to 60 ÂC. The enzyme produced in P. pastoris (45 kDa) was N-glycosylated as revealed by Schiff&#700;s reagent and digestion with N-glycosidase F. Moreover, the glycosylated chitinase was found to be slightly more thermostable than the enzyme produced in E. coli (43 kDa). The rCV2935 showed hydrolytic activity against colloidal chitin, crab shell, and synthetic substrates containing p-nitrophenol. It was also able to hydrolyse glycol-chitin in SDS-PAGE and showed low chitosanase activity. The fluorescence spectra revealed that the proteins were produced in their folded conformation. The crystal structure of the recombinant chitinase produced in P. pastoris was determined by X-ray crystallography at a resolution of 2.1&#506;. Its catalytic domain adopts an (&#946;/&#945;)8 triose-phosohate isomerase (TIM) barrel fold, and the residues essential for catalysis are conserved. The recombinant chitinase reduced the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, and bioassays with cowpea weevil Callosobruchus maculatus showed that the rCV2935 possibly interfered with the insect feeding, which resulted in decreased weight of adults. The biochemical, biological and structural studies of rCV2935 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. O seqÃenciamento completo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos, estÃo vÃrias quitinases. Quitinases, enzimas capazes de degradar a quitina, um biopolÃmero de N-acetil-&#946;-D-glucosamina bastante insolÃvel, sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquÃmica, biolÃgica e estruturalmente uma quitinase recombinante (CV2935), da famÃlia 18 das glicosÃdeo hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A ORF codificando a proteÃna CV2935 foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET303/CT-His e pPICZ&#945;A, para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. Em ambos os sistemas, a enzima foi secretada para o meio de cultura, na sua forma solÃvel e funcional, sendo purificada a homogeneidade por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de exclusÃo molecular em matriz de Superdex75. Os rendimentos da quitinase pura, expressa em E. coli e P. pastoris, foram 2,6 e 44 mg por litro de cultura, respectivamente. A quitinase produzida em ambos os microorganismos mostrou atividade Ãtima em pH 3,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 60 ÂC. A enzima produzida em P. pastoris (45 kDa) foi N-glicosilada, como revelado por coramento com reagente de Schiff e digestÃo com N-glicosidase F, mostrando-se ligeiramente mais termoestÃvel do que a enzima nÃo glicosilada, produzida em E. coli (43 kDa). A rCV2935 apresentou atividade hidrolÃtica (endoquitinÃsica) frente a quitina coloidal, matriz de carapaÃa de caranguejo obtida comercialmente, glicol-quitina (em gel SDS-PAGE), substratos sintÃticos solÃveis contendo p-nitrofenol, alÃm de apresentar pequena atividade quitosanÃsica. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que as proteÃnas foram produzidas na sua conformaÃÃo enovelada. A enzima teve sua estrutura cristalogrÃfica resolvida a uma resoluÃÃo de 2.1à e seu domÃnio catalÃtico apresentou um dobramento do tipo barril (&#946;/&#945;)8 (barril TIM) e resÃduos essenciais para catÃlise conservados, caracterÃsticas essas, comuns Ãs proteÃnas da mesma famÃlia. A quitinase recombinante retardou o crescimento do fungo fitopatogÃnico Rhizoctonia solani, e, em bioensaios com o caruncho Callosobruchus maculatus, a rCV2935 possivelmente interferiu com a alimentaÃÃo do inseto, o que acarretou na diminuiÃÃo do peso dos mesmos. Os estudos bioquÃmicos, biolÃgicos e estruturais da rCV2935 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / BactÃrias do gÃnero Burkholderia apresentam como uma das suas aplicaÃÃes biotecnolÃgicas a capacidade de biodegradar compostos xenobiÃticos recalcitrantes. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 tolerar e utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono e realizar a anÃlise proteÃmica desta bactÃria, em resposta ao fenol, com a finalidade de identificar proteÃnas diferencialmente expressas que estÃo relacionadas à biodegradaÃÃo do fenol, à resposta ao estresse ou ainda, que participem das vias metabÃlicas de produÃÃo de energia para as cÃlulas. A avaliaÃÃo da capacidade da Burkholderia sp. SMF 07 utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono foi realizada a partir na construÃÃo da curva de crescimento em meio mineral (BH). A fim de realizar a extraÃÃo das proteÃnas totais foi realizado o crescimento bacteriano em meio de cultivo TY (Triptone-Yeast Medium), suplementado ou nÃo com 1000 mg/L de fenol, incubado a 28ÂC. A extraÃÃo das proteÃnas totais foi feita apÃs as culturas atingirem o final da fase log do crescimento bacteriano (O.D entre 0,8 e 1,0 e 0,6 e 0,8, para as condiÃÃes controle e fenol, respectivamente). As proteÃnas foram quantificadas pelo mÃtodo de Bradford (1976) e a avaliaÃÃo da pureza das amostras proteicas foi realizada por SDS-PAGE. O mapa protÃico para cada condiÃÃo testada foi determinado a partir da eletroforese bidimensional (2-D). O ajuste das imagens dos gÃis bidimensionais, a detecÃÃo de spots protÃicos e a avaliaÃÃo dos dados para determinaÃÃo de variaÃÃes quantitativas e qualitativas dos spots foi feito pelo programa ImageMasterÂ. A identificaÃÃo das proteÃnas foi feita atravÃs do ExPASy Proteomics Server, utilizando os valores de pI e MW do spot. AtravÃs dos dados obtidos foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados. Entre as proteÃnas que apresentaram expressÃo quantitativa aumentada na presenÃa do fenol destaca-se a 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolase, uma enzima envolvida na via meta de degradaÃÃo do fenol. Entre aquelas que apresentaram expressÃo reduzida na presenÃa do fenol se destacam aquelas envolvidas na biossÃntese de nucleotÃdeos e de Ãcidos graxos, molÃculas importantes para o desenvolvimento e manutenÃÃo da estrutura microbiana. As proteÃnas que tiveram sua expressÃo inibida na presenÃa do fenol estavam envolvidas principalmente na biossÃntese de aminoÃcidos, proteÃnas, lipÃdeos, ubiquinona, purinas e pirimidinas; alÃm de participarem do processamento do RNAt, sÃntese do peptideoglicano e na resposta ao estresse. Em conclusÃo, o estudo mostrou que a Burkholderia sp. SMF 07 nÃo foi capaz de utilizar o fenol como Ãnica fonte de carbono, mas apresentou capacidade de tolerar o fenol quando cultivada em meio nutritivo nas concentraÃÃes testadas. AtravÃs da anÃlise proteÃmica concluiu-se que o poluente alterou a expressÃo de proteÃnas importantes para o metabolismo e manutenÃÃo da estrutura celular. / Bacteria of the genus Burkholderia have as one of its biotechnological applications the ability to biodegrade recalcitrant xenobiotic compounds. Thus, this study aimed to evaluate the ability of Burkholderia sp. SMF 07 tolerate and using phenol as the sole carbon source and performing proteomic analysis of this bacterium, in response to phenol, in order to identify differentially expressed proteins that are related to biodegradation of phenol, the stress response or metabolic pathways involving the production of energy for cells. The evaluation of the capacity of Burkholderia sp. SMF 07 using phenol as the sole carbon source was based on the construction of the curve of growth in mineral medium (BH). For extraction of total proteins was performed bacterial growth in culture medium TY (Triptone-Yeast Medium), supplemented or not with 1000 mg/L phenol, incubated at 28ÂC. The extraction of total proteins was done after the cultures reached the end of the log phase of bacterial growth (O.D between 0.8 and 1.0 and 0.6 and 0.8 for the control conditions and phenol, respectively). The proteins were quantified by the Bradford method (1976) and assessment of protein purity of the samples was performed by SDS-PAGE. The protein map for each tested condition was determined from two-dimensional electrophoresis (2-D). The adjustment of two-dimensional images of the gels, the detection of protein spots, and data evaluation to determine quantitative and qualitative changes of spots was made by the ImageMaster  software. The identification of proteins was performed using the ExPASy Proteomics Server, using the values of pI and MW of spot. Through the data obtained was observed differentially expressed proteins between the groups tested. Among the proteins that showed increased expression quantitative in the presence of phenol is highlight 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, an enzyme involved in the degradation meta pathway phenol. Among those that showed decreased expression in the presence of phenol are highlights those involved in the biosynthesis of nucleotides and fatty acids, molecules important to the development and maintenance of microbial structure. Proteins which have inhibited its expression in the presence of phenol were mainly involved in the biosynthesis of amino acids, proteins, lipids, ubiquinone, purines and pyrimidines; beyond participate processing of tRNA, peptidoglycan synthesis, and in the stress response. In conclusion, the study showed that Burkholderia sp. SMF 07 not been able to utilize phenol as the sole carbon source but showed the ability to tolerate phenol when grown in nutrient medium at the concentrations tested. Through proteomic analysis was concluded that the pollutant alter the expression of proteins important for metabolism and maintenance of cellular structure.