FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Lectinas representam um grupo diversificado de proteÃnas, tanto em termos de tamanho e estrutura, quanto com relaÃÃo Ãs atividades biolÃgicas que desempenham sobre diferentes organismos. A maioria das lectinas tem sido isolada de plantas e algumas podem exercer atividades antifÃngicas marcantes. Este trabalho apresenta o efeito de cinco lectinas estruturalmente relacionadas, as quais foram purificadas, respectivamente, das sementes de Canavalia ensiformis (ConA), C. boliviana (Cbol), C. maritima (ConM), C. brasiliensis (ConBr) e C. gladiata (ConG), sobre o crescimento in vitro dos fungos fitopatogÃnicos Mucor sp., Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae e C. lindemuthianum. No sentido de determinar o efeito das lectinas, os esporos fÃngicos foram devidamente isolados, tratados com cada uma das lectinas na concentraÃÃo de 500 μg/mL durante 24 horas e entÃo inoculados para crescimento a 27ÂC em placas de poliestireno de 96 poÃos contendo caldo batata dextrose. O crescimento dos fungos foi avaliado em diferentes tempos atravÃs da determinaÃÃo da densidade Ãptica a 620 nanÃmetros. O controle negativo foi feito com NaCl 0,15 M. No sentido de verificar se o efeito das lectinas sobre o crescimento fÃngico era meramente proteico, os fungos foram crescidos na presenÃa de albumina sÃrica bovina (BSA). Os resultados mostraram que o crescimento de Mucor sp. foi diminuÃdo quando seus esporos foram tratados com ConA. Por outro lado, todas as outras lectinas promoveram o aumento de seu crescimento. Com relaÃÃo Ãs outras espÃcies, observou-se que o crescimento fÃngico à aumentado quando os esporos sÃo tratados com as lectinas. / Lectins represent a diversified group of proteins, both in terms of size and structure, as well as in relation to biological activities that they play on different organisms. Most of lectins have been isolated from plants and some of them can exert remarkable antifungal activities. This work shows the effect of five structurally related lectins, which were purified from the seeds of Canavalia ensiformis (ConA), C. boliviana (Cbol), C. maritima (ConM), C. brasiliensis (ConBr) and C. gladiata (ConG), respectively, on the in vitro growth of phytopathogenic fungi Mucor sp., Rhizoctonia solani, Colletotrichum musae and C. lindemuthianum. In order to determine the effect of lectins, fungal spores were properly isolated, treated with each lectin in a concentration of 500 μg/ml for 24 hours and then inoculated to growth at 27ÂC in 96-well polystyrene plates containing potato dextrose broth. The fungal growth was assessed at different times by measuring the optical density at 620 nanometers. The negative control was performed with 0.15 M NaCl. In order to verify if the effect on fungal growth occurred merely by the presence of protein, the fungi were grown in the presence of bovine serum albumin (BSA). The results showed that the growth of Mucor sp. is decreased when spores were treated with ConA. On the other hand, all the other lectins enhanced its growth. With respect to other species, it was observed that fungal growth is increased when the spores were treated with lectins.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] pertence à famÃlia Fabaceae e à bastante utilizado na alimentaÃÃo humana como fonte de proteÃnas, carboidratos, vitaminas e minerais. Dentre as principais caracterÃsticas do feijÃo-de-corda, seu elevado conteÃdo proteico e a boa tolerÃncia Ãs condiÃÃes de baixa disponibilidade de Ãgua nos solos, altas temperaturas e relativa tolerÃncia à salinidade, condiÃÃes tÃpicas das regiÃes semi-Ãridas do nordeste do Brasil, sÃo algumas das que podem ser citadas. Entretanto, apesar da considerÃvel capacidade de tolerÃncia Ãs diferentes condiÃÃes de estresses, parte da produtividade do feijÃo-de-corda à ameaÃada pela aÃÃo de diversos fitopatÃgenos, dentre os quais se destacam os fungos como maiores causadores de patologias desta cultura, a exemplo da Antracnose, resultado da infecÃÃo por C. gloeosporioides, caracterizada por manchas marrom-avermelhadas nas nervuras foliares que podem se prolongar por todos os ÃrgÃos da planta hospedeira. Felizmente, o feijÃo-de-corda possui cultivares que apresentam caracterÃsticas diferenciadas de resistÃncia, frente ao C. gloeosporioides, no que concerne à ativaÃÃo das defesas da planta em interaÃÃes ditas incompatÃveis, haja vista que o patÃgeno nÃo consegue deliberar a infecÃÃo. Partindo dessa premissa, à vÃlido mencionar que grande parte dos mecanismos de resistÃncia de plantas aos patÃgenos està relacionada com a expressÃo gÃnica diferencial de proteÃnas que funcionariam como marcadores de defesa em resposta à infecÃÃo. Nesse sentido, esse estudo propÃe a anÃlise proteÃmica diferencial da interaÃÃo incompatÃvel (resistÃncia) entre plantas de feijÃo-de-corda, genÃtipo BR3, e o isolado LPVD-1, do fungo C. gloeosporioides a fim de identificar possÃveis marcadores proteicos determinantes da resistÃncia para esse patossistema. Por meio da utilizaÃÃo da abordagem Eletroforese Bidimensional em combinaÃÃo com Espectrometria de Massas ESI-Q-TOF MS/MS, foram identificadas 118 proteÃnas diferencialmente expressas, considerando proteÃnas superexpressas (102) e subexpressas (16), envolvidas em diversos processos celulares, tais como: Metabolismo energÃtico, fotossÃntese, metabolismo de proteÃnas e Ãcidos nucleicos, resposta ao estresse, transporte celular, homeostase redox, sinalizaÃÃo e defesa, com destaque para expressÃo das proteÃnas PR-10 (relacionada à patogÃnese), Remorina e Ascorbato peroxidase que apresentaram alteraÃÃes significativas em todos os tempos experimentais testados. Esses achados demonstram a complexidade dos mecanismos envolvidos durante a resistÃncia vegetal e auxiliam no direcionamento dos programas de melhoramento genÃtico dessa cultura frente ao ataque de fungos. AlÃm de favorecerem o entendimento das interconexÃes bioquÃmicas e fisiolÃgicas que decorrem da interaÃÃo incompatÃvel planta-fungo. / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] belongs to the family Fabaceae and is widely used in food as a source of protein, carbohydrates, vitamins and minerals. Among the main features of cowpea, its high protein content and good tolerance to conditions of low water availability in soils, high temperatures and relative tolerance to salinity conditions typical of semi-arid regions of northeastern Brazil, are some of which can be cited. However, despite the considerable capacity of tolerance to different stress conditions, the productivity of cowpea is threatened by the action of various pathogens, among which stand out as major causes of fungal diseases of this crop, the example of Anthracnose as a result of infection by C. gloeosporioides, characterized by reddish-brown spots on the leaf veins that can be extended by all organs of the host plant. Fortunately, the cowpea has cultivars that have different characteristics of resistance against C. gloeosporioides, regarding the activation of plant defenses in incompatible interactions said, given that the pathogen is unable to resolve the infection. From this premise, it is worth mentioning that most of the mechanisms of plant resistance to pathogens is related to the differential gene expression of proteins that act as markers of defense in response to infection. Thus, this study proposes a differential proteomic analysis of the incompatible interaction (resistance) between plants of cowpea genotype BR3, and isolated LPVD-1, the fungus C. gloeosporioides in order to identify potential protein markers for the determinants of this resistance pathossystem. By using the approach 2D-PAGE in addition with mass spectrometry ESI-Q-TOF MS / MS, we have identified 118 differentially expressed proteins, whereas proteins overexpressed (102) and down-expressed (16), involved in various cellular processes, such as : energy metabolism, photosynthesis, protein and nucleic acids metabolism, stress response, cellular transport, redox homeostasis, signaling and defense, with emphasis on expression of PR-10 proteins (pathogenesis-related), remorina and ascorbate peroxidase that had significant alterations at all time points tested. These findings demonstrate the complexity of the mechanisms involved in plant resistance and assist in directing the programs of genetic improvement of this crop against fungal attack. Furthermore, itâs promoting the understanding of the biochemical and physiological interconnections arising from incompatible plant-fungus interaction.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O feijÃo-caupi, de origem africana, à uma das espÃces mais importantes no Nordeste brasileiro, principalmente no aspecto social, como geradora de empregos e garantia de subsistÃncia, utilizando mÃo-de-obra familiar e tÃcnicas de cultivo, que vÃo das rudimentares Ãs mais modernas. NÃo obstante, o feijÃo-caupi se desenvolve no semi-Ãrido brasileiro sob condiÃÃes ambientais adversas, nas quais predominam irregularidades hÃdricas, temperaturas elevadas e solos salinizados. O excesso de sais na soluÃÃo do solo pode causar estresse osmÃtico nas culturas, pela reduÃÃo do potencial hÃdrico do solo, e toxicidade iÃnica especÃfica, em funÃÃo do acÃmulo excessivo de Ãons salinos (Na+ e Cl-) no tecido vegetal. Os efeitos da salinidade sobre o metabolismo vegetal sÃo complexos e atingem processos metabÃlicos associados ao dÃficit hÃdrico, desbalanÃo nutricional e iÃnico, comportamento estomÃtico, eficiÃncia fotossintÃtica e capacidade de assimilaÃÃo e alocaÃÃo de carbono. Neste estudo, duas cultivares, (PitiÃba e PÃrola) de feijÃo-caupi foram comparadas quanto a mecanismos fisiolÃgicos ligados com a resistÃncia ao estresse salino. Sementes de feijÃo-caupi das cultivares foram utilizadas apÃs uma seleÃÃo entre 55 genÃtipos. A resistÃncia destas cultivares ao estresse salino foi averiguada durante a germinaÃÃo e o desenvolvimento inicial em condiÃÃes controladas (27Â2C, fotoperÃodo de 12 h, 240 mol.m-2 s-1) e de casa de vegetaÃÃo, nas quais as plantas foram submetidas a tratamentos com concentraÃÃes crescentes de NaCl (0, 25, 50, 75 e 100 mM). Em casa de vegetaÃÃo, as irrigaÃÃes foram baseadas em curva de absorÃÃo e retenÃÃo de Ãgua pelo substrato, mantendo-se a umidade equivalente à capacidade de campo (70%). Nos experimentos de germinaÃÃo, os efeitos dos tratamentos salinos foram verificados sobre a massa fresca, massa seca, porcentagem de umidade, conteÃdo de Na+ e K+, porcentagem de germinaÃÃo (%G) e Ãndice de velocidade de germinaÃÃo (IVG). Durante o desenvolvimento inicial, massa fresca, massa seca, porcentagem de umidade, CRA e particionamento de Na+ e K+ foram determinados na planta completa, ao passo que a atividade de enzimas antioxidativas (SOD, CAT, APX e POX), %VE e TBARS foi determinada em folhas. As cultivares PÃrola e PitiÃba apresentaram respostas diferenciais à salinidade causada pelo NaCl, especialmente durante a germinaÃÃo. Apesar de apresentar maior conteÃdo de reservas, a cultivar PÃrola se mostrou mais sensÃvel aos tratamentos salinos, possivelmente pela maior permeabilidade do tegumento, que permitiu rÃpida embebiÃÃo e maior acÃmulo de Na+. Assim, os tecidos desta cultivar estariam mais propensos a sofrer danos de membrana e distÃrbios metabÃlicos que os da cultivar PitiÃba. O conteÃdo de Na+ em folhas da cultivar PÃrola foi maior quando comparado com a cultivar PitiÃba. O estresse salino afetou severamente o crescimento de feijÃo-caupi durante o estÃdio de estabelecimento das plÃntulas. Esta restriÃÃo de crescimento ocorreu associada ao acÃmulo excessivo de Na+ e Cl- nos diferentes ÃrgÃos, sem alteraÃÃes significativas do conteÃdo de K+. Plantas de feijÃo-caupi apresentam carÃter excluidor de Na+ da parte aÃrea, acumulando este Ãon preferencialmente nas raÃzes. A cultivar PitiÃba acumulou mais Cl- nas folhas e apresentou melhor performance de crescimento, indicando que o conteÃdo de Cl- acumulado nas folhas nÃo atingiu concentraÃÃes tÃxicas, e que a toxicidade iÃnica na espÃcie està associada principalmente ao Na+. O efeito do NaCl no crescimento pode ser observado atravÃs da TCR das duas cultivares. As cultivares apresentaram reduÃÃo da taxa de crescimento em torno de 70%, quando tratadas com NaCl 100 mM. Apesar do %VE ter sido aumentado devido ao tratamento salino em folhas, o conteÃdo de TBARS sofreu aumento discreto. AlÃm disso, as atividades de SOD, APX e POX foram aumentadas em ambas as cultivares, enquanto a atividade de CAT foi reduzida, indicando um possÃvel efeito protetor dos tecidos foliares contra danos oxidativos. Assim, à provÃvel que os danos fisiolÃgicos causados por NaCl nÃo foram, na sua maioria, causados por estresse oxidativo. Inversamente, o conteÃdo de TBARS, juntamente com as atividades de SOD, CAT, APX e POX, podem nÃo ser bons indicadores fisiolÃgicos para explicar a intensidade dos danos oxidativos causados por NaCl em folhas de plantas de feijÃo-caupi. Contudo, a habilidade de folhas de feijÃo-caupi em resistir ao estresse oxidativo causado por salinidade, podem envolver diferentes vias de remoÃÃo de EROs. / The cultivation of cowpea is fundamental in the Northeast of Brazil due to its social features in employment and subsistence. In this region, cowpea develops under adverse environmental conditions, including irregular precipitation, high temperatures and salinizated soils. The excessive soil salinity could lower the soil water potential, causing osmotic stress in plants, as well as salt stress could induce ionic toxicity due to the accumulation of saline ions (Na+ and Cl-) in the plant tissues. The effects of salinity in the plant metabolism are complex and include processes associated to water deficit, nutritional imbalance, photosynthetic efficiency and carbon assimilation and allocation. In this work, two cowpea cultivars were confronted in relation to physiological mechanisms associated to salt stress. Cowpea seeds of the PÃrola and PitiÃba cultivars were selected to this work after a preliminary screening among 55 genotypes. The resistance of these cultivars against NaCl-salinity were assessed during the germination and the initial growth under controlled (27Â2C, photoperiod of 12 h, 240 mol.m-2 s-1) and greenhouse conditions, subjecting plants to increasing external concentrations of NaCl (0, 25, 50, 75 and 100 mM). At greenhouse conditions, watering were performed according to the substrate field capacity (70%). In the germination assays, the effects of the salt treatments were assessed in fresh weight, dry weight, Na+ , Cl- and K+ content, germination percentage (%G) and germination velocity index (GVI). During the initial growth, fresh weight, dry weight, relative water content and Na+, Cl- and K+ partitioning were determined in the whole plants, while electrolyte leakage, TBARS and the activity of antioxidative enzymes (SOD, CAT, APX e POX) were measured only in the leaves. The tested cultivars presented differential responses to NaCl-salinity, especially during seed germination. Although the PÃrola seeds contained more food reserves, they appeared more sensible to the salt treatments, probably due to tegument permeability, which allowed fast imbibition and higher Na+ accumulation. Then, the tissues of PÃrola seeds could be more exposed to membrane damages and metabolic disturbances caused by NaCl than that of the PitiÃba cultivar. Additionally, the salt treatments also affected severely the growth of both cultivars during the seedling establishment. This growth restriction was related to saline ion accumulation in the different organs of cowpea seedlings, without considerable changes in the K+ content. Cowpea seedlings excluded Na+ from the shoot and accumulated this ion preferentially in the roots. The PitiÃba seedlings accumulated more Cl- in the shoot than that of the PÃrola cultivar and presented better growth performance, indicating that the accumulated Cl- probably did not reach toxic concentrations. Then, ionic toxicity in this species could be related more to Na+ than to Cl- accumulation. Although the salt treatment induced a considerable increase of the electrolyte leakage in cowpea leaves, it provoked only a slight augment of TBARS in these organs. In addition, the activity of SOD, APX and POX was increased in salt-treated plants of both cultivars, while the CAT activity was reduced, indicating a possible protective effect against oxidative damages in leaf tissue. In this way, it seems that the physiological disturbances caused by NaCl stress were not attributable to a secondary oxidative stress. Conversely, the TBARS content jointly with the activity of SOD, CAT, APX and POX could not be recommendable parameters to assess the oxidative damages caused by NaCl in cowpea leaves. Finally, the ability of cowpea leave to overcome salt-induced oxidative stress could involve different pathways of ROS scavenge.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O tÃxon genÃrico Burkholderia apresenta grande diversidade metabÃlica, possibilitando que estas proteobactÃrias vivam numa variedade de habitats, dentre os quais destacamos o solo, Ãgua (incluindo Ãgua do mar), plantas, fungos, animais e atà mesmo seres humanos. Uma das aplicaÃÃes biotecnolÃgicas mais marcantes à a capacidade de promover a biodegradaÃÃo de poluentes. Assim, este estudo visou a identificaÃÃo do isolado de Burkholderia SMF 090, bem como a avaliaÃÃo do potencial na utilizaÃÃo da gasolina como fonte de carbono e a identificaÃÃo de vias metabÃlicas possivelmente envolvidas na degradaÃÃo dos componentes da gasolina atravÃs da realizaÃÃo de anÃlises proteÃmicas. A identificaÃÃo do isolado SMF 090 e anÃlise da filogenia molecular foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Posteriormente, foram realizadas anÃlises de filogenia molecular e reconstruÃÃo de Ãrvores filogenÃticas com outras bactÃrias do gÃnero. Para a caracterizaÃÃo do perfil de crescimento do isolado SMF 090 foram realizadas curvas de crescimento em meio nutritivo (TY), meio sem fonte de carbono (BH), BH suplementado com gasolina comercial e BH suplementado com D-glicose. O estudo das proteÃnas diferencialmente expressas ocorreu atravÃs de eletroforese bidimensional, de espectrometria de massa e anÃlises de bioinfomÃtica. AtravÃs da anÃlise do 16S rDNA, sugeriu-se que SMF 090 està relacionada à Burkholderia sabiae Br3407 e ambos descendem de um ancestral comum recente. A bactÃria estudada foi capaz de crescer em meio mineral contendo gasolina como Ãnica fonte de carbono. Foi possÃvel observar proteÃnas diferencialmente expressas entre os grupos testados, as quais podem estar associadas ao metabolismo de degradaÃÃo de hidrocarbonetos. As anÃlises dos gÃis de 2DE e os dados de espectrometria de massas permitiram a identificaÃÃo de vÃrias proteÃnas das vias de catabolismo dos hidrocarbonetos aromÃticos monocÃclios e policÃclicos. Portanto, o estudo apresentou informaÃÃes relevantes sobre o metabolismo de Burkholdeiras como potenciais biodegradadoras de gasolina. / The generic taxon Burkholderia presents a high metabolic diversity that allows these protobacteria live in a wide range of habitats, among these are the soil, water (including sea water), plants, fungi, animals and even humans. A remarkable biotechnological application is the capacity to promote the pollutants biodegradation. Thus, this study aimed the identification of Burkhoderia SMF 090 isolate, as well the evaluation of its potential on the utilization of gasoline as a carbon source and the identification of metabolic pathways possibly involved in the degradation of gasoline on its components through realization of proteomic analysis. The identification of the SMF 090 isolate and the analysis of molecular phylogeny were carried out by 16S rRNA gene sequencing. In addition, the molecular phylogeny was analyzed and phylogenetic trees were reconstructed using other bacteria from the same genus. In order to characterize the growth pattern of SMF 090, bacterial growth curves were assessed using the media TY (a nutritive media), BH (a medium without carbon), BH plus commercial gasoline and BH plus D-glucose. The study of differentially expressed proteins was performed using bidimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics analysis. After the 16S rRNA analysis was suggested that SMF 090 is related to Burkholderia sabiae Br3407 and both descended from a recent common ancestral. The strain grown in mineral media containing gasoline as the unique carbon source. Differentially expressed proteins were observed between the tested groups and these proteins may be associated to the metabolic degradation of hydrocarbons. The analysis of data provided by 2DE electrophoresis and mass spectrometry allowed the identification of various proteins related to the monocyclic and polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism pathway. Therefore, this study showed relevant results about the growth of Burkholderia as a potential gasoline biodegradant.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The seaweed Gracilaria are important sources of agar sulfated polysaccharides that are commonly used in the food, pharmaceutical and biotechnology industries. For characterization of the media, the kelp was subjected to analysis of their chemical composition, which indicated their percentages of moisture, ash, protein and lipids. Extractions in which extraction by enzymatic digestion native extract (a seaweed is not subjected to pretreatments and obtaining the polysaccharides is by their boiling) is: For evaluation of red seaweed polysaccharides Gracilaria intermedia fractions were obtained for the following extraction methods seaweed is pretreated with NaOH and KOH in concentrations of 1% and 5%. The extracted material was subjected to colorimetric test chemical composition (protein content determination and quantification of carbohydrates, sulfate and 3,6-anhydro-galactose). The material was further analyzed by infrared spectroscopy with Fourier transform and Nuclear Magnetic Resonance ( NMR). Antioxidant activity with each of the fractions obtained tests were performed. Antioxidants tests (total antioxidant capacity, chelation of ferrous ion) indicated that such polysaccharides have the ability to scavenge free radicals and significant dose-dependent manner. Due to these results, the polysaccharide obtained from seaweed Gracilaria show potential intermediate that they will not be used as a synthetic antioxidant compound. Experiments to evaluate the rheological behavior of aqueous solutions of polysaccharides under study were performed at 25  1 ÂC, using stationary and dynamic oscillatory measurements, which indicated that the material obtained should be classified as pseudoplastic and highlighted the skills of such polymer solutions in acting as thickeners and gelling agents. / Algas marinhas do gÃnero Gracilaria sÃo importantes fontes de Ãgar, polissacarÃdeos sulfatados que sÃo comumente usados nas indÃstrias alimentÃcia, farmacÃutica e biotecnolÃgica. Para caracterizaÃÃo do material de trabalho, a alga marinha foi submetida à anÃlise de sua composiÃÃo centesimal, a qual indicou seus percentuais de umidade, cinzas, proteÃnas, lipÃdios e carboidratos totais. Para avaliaÃÃo dos polissacarÃdeos da alga vermelha Gracilaria intermedia foram obtidas fraÃÃes pelas seguintes metodologias de extraÃÃo: 1. extraÃÃo por meio de digestÃo enzimÃtica, 2. extraÃÃo nativa (a alga nÃo à submetida à prÃ-tratamentos e a obtenÃÃo dos polissacarÃdeos ocorre pela sua fervura) e 3. extraÃÃes nas quais a alga à prÃ-tratada com NaOH e KOH nas concentraÃÃes de 1% e 5%. Os materiais extraÃdos foram submetidos a testes colorimÃtricos de composiÃÃo quÃmica (determinaÃÃo do teor de proteÃnas e quantificaÃÃo de carboidratos, sulfato e 3,6 anidrogalactose). Os materiais foram ainda analisados por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e RessonÃncia MagnÃtica Nuclear (RMN). Foram realizados testes de atividade antioxidante com cada uma das fraÃÃes obtidas. Os testes antioxidantes realizados (capacidade antioxidante total e quelaÃÃo do Ãon ferroso) indicaram que tais polissacarÃdeos possuem capacidade de sequestrar radicais livres de maneira significativa e dose-dependente. Devido a estes resultados, os polissacarÃdeos obtidos a partir da alga marinha Gracilaria intermedia mostram potencial de virem a ser utilizados como um composto antioxidante nÃo sintÃtico. Experimentos para avaliar o comportamento reolÃgico de soluÃÃes aquosas dos polissacarÃdeos em estudo foram realizados a 25  1 ÂC, usando medidas estacionÃrias e dinÃmicas oscilatÃrias, que indicaram que os materiais obtidos devem ser classificados como pseudoplÃsticos e apontaram as habilidades de tais soluÃÃes polimÃricas em atuar como agentes espessantes e gelificantes.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Protease inhibitors are proteins with the intrinsic ability to inhibit catalytic activity of enzymes and are very common in plant seeds. Proteases play a major role in development of several diseases. The control of their activity by protease inhibitors have increased interest on these molecules as chemopreventive agents, specially for cancer. The anticarcinogenic effects of legume seeds present in human diet as well as those of underexploited plant species have been extensively investigated. This study aimed to purify, perform biochemical characterization and evaluate the in vitro chemopreventive potential of protease inhibitors from Enterolobium contortisiliquum seeds upon human colorectal adenocarcinoma cells. Two protease inhibitors were purified and named EcCI and EcTI. By means of N-terminal sequence analysis, EcCI was identified as a Kunitz type inhibitor. EcTI was identified, by means of peptide mass fingerprinting and N-terminal sequence analyses, as the same EcTI purified previously (NCBI Protein BLAST; access number: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). The molecular masses of the two inhibitors determined by means of SDS-PAGE and mass spectrometry are, respectively, 18.5 kDa and 19,710.4 Da (EcCI); 20.2 kDa and 19,813.22 Da (EcTI). Both inhibitors consist of two polypeptide chains and have several isoforms with acidic pIs, ranging from 5 to 6. Towards chymotrypsin, EcCI is a non competitive inhibitor and shows ki of 8 x 10-8 M, while EcTI is a competitive inhibitor with ki of 48 x 10-8 M. Towards trypsin, EcTI shows non competitive inhibition and ki of 2.8 x 10-8 M. EcCI and EcTI show high (93%) and moderate (38%) chymotrypsin inhibition and EcTI was also able to strongly inhibit trypsin (100%). EcCI and EcTI showed high leukocyte elastase inhibition (85 and 75%), respectively, and inhibited pancreatic elastase weakly (about 10%). Neither of them was able to inhibit papain nor bromelain. Both inhibitors are functionally stable under wide temperature range (from 37 to 70 ÂC â EcCI; from 37 to 60 ÂC â EcTI), pH (from 2 to 12) and DTT concentration (from 1 to 10 mM â EcCI; from 1 to 100 mM â EcTI). Both EcCI and EcTI were able to inhibit HT29 colorectal adenocarcinoma cells with IC50 of 35.5 and 20.4 x 10-6 M, respectively. These results clearly indicate that these are molecules with interesting biotechnological features and very promising tools as chemopreventive agents. / Inibidores de proteases sÃo proteÃnas que inibem a atividade catalÃtica de enzimas, sendo bastante comuns em sementes de plantas. As proteases desempenham papÃis centrais no desenvolvimento de muitas doenÃas. O controle de sua atividade realizado por inibidores de proteases despertou o interesse sobre estas molÃculas como agentes quimiopreventivos, especialmente sobre o cÃncer. Os efeitos anticarcinogÃnicos das sementes de leguminosas presentes comumente na dieta, bem como de espÃcies vegetais subexploradas, tÃm sido extensivamente investigados. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o potencial quimiopreventivo in vitro de inibidores de proteases de sementes de Enterolobium contortisiliquum, utilizando como modelo cÃlulas de adenocarcinoma colorretal humano. Foram purificados dois inibidores de proteases denominados EcCI e EcTI. AtravÃs da sequÃncia N-terminal, EcCI foi identificado como um inibidor da famÃlia Kunitz. EcTI foi identificado, por meio de peptide mass fingerprinting e por anÃlise da sequÃncia N-terminal, como aquele descrito previamente na literatura (NCBI Protein BLAST; nÃmero de acesso: sp|P86451.1|ITRY_ENTCO). Suas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massas sÃo, respectivamente, 18,5 kDa e 19.710,4 Da (EcCI); 20,2 kDa e 19.813,22 Da (EcTI). Ambos os inibidores sÃo formados de duas subunidades proteicas e apresentam isoformas cujos pIâs sÃo Ãcidos, entre 5 e 6. Frente a quimotripsina, EcCI à um inibidor nÃo competitivo e apresenta ki de 8 x 10-8 M, enquanto EcTI à inibidor competitivo com ki de 48 x 10-8 M. Frente à tripsina, EcTI apresenta inibiÃÃo nÃo competitiva e ki de 2,8 x 10-8 M. EcCI e EcTI apresentam atividade inibitÃria de quimotripsina alta (93%) e moderada (38%), respectivamente. Apenas EcTI foi capaz de inibir a tripsina (100%). EcCI e EcTI apresentam alta atividade inibitÃria de elastase neutrofÃlica (85 e 75%, respectivamente). Os dois inibidores inibiram sutilmente a elastase pancreÃtica (ca. de 10%) e nenhum foi capaz de inibir papaÃna e bromelaÃna. Os dois inibidores apresentam alta estabilidade à variaÃÃo de temperatura (de 37 a 70 ÂC para EcCI e de 37 a 60 ÂC para EcTI), pH (2 a 12) e concentraÃÃo de DTT (de 1 a 10 mM para EcCI e de 1 a 100 mM para EcTI). EcCI e EcTI inibiram a proliferaÃÃo de cÃlulas de adenocarcinoma colorretal humano da linhagem HT29 com CI50 de 35,5 e 20,4 x 10-6 M, respectivamente, indicando que esses inibidores apresentam bom potencial quimiopreventivo e, portanto, sÃo molÃculas bastante interessantes do ponto de vista biotecnolÃgico.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A great number of plant species produce latex, including Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea and Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum is a laticifer shrub belonging to Apocynaceae family popularly known as âchapÃu-de-napoleÃoâ. It is very limited the proteomic information about this specie. Thus, a proteomic analysis of protein fraction (TpLP) from T. peruviana latex was performed using two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. A total of 33 proteins (86%) were identified, including storage proteins, peptidase inhibitor, cysteine peptidases, peroxidases and osmotins. This protein fraction showed strong proteolytic activity at pH 5.0 which was increased in the presence of low concentrations of the reducing agent DTT. The inhibition this activity in the presence of specific inhibitors E-64 and IAA and the high activity with BANA showed the predominance of cysteine peptidases in latex. A cysteine peptidase, termed peruvianin-I, was purified from the latex by a single chromatographic step involving gel filtration. The enzyme was inhibited by E-64 and iodoacetamide (IAA) and follows the Michaelis-Menten kinetics, showing high affinity for azocasein, with Km value of 17.6 uM, exhibiting an optimal pH and temperature of 5.0-6.0 and 25-37 ÂC, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry revealed that peruvianin-I (100 kDa) possesses a pI of 4.0 and five subunits (20 kDa). The N-terminal amino acid sequence of peruvianin-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) was similar to that of germin or germin-like proteins. High-resolution images from atomic force microscopy indicated the possible hexameric structure of peruvianin-I, which is organized as a trimer of dimers that form a central channel. TpLP and peruvianin-I exhibited no oxalate oxidase and superoxide dismutase activity or antifungal effects on the spore germination of Fusarium solani. This study showed that T. peruviana latex are a rich source of pathogenesis-related proteins, including cysteine peptidases. Interestingly, these peptidases exhibit different structural and biochemical characteristics that may be related to their specific physiological functions. / Um grande nÃmero de espÃcies vegetais produzem lÃtex, incluindo Apocynacea, Sapotacea, Papaveracea e Euphorbiaceae. Thevetia peruviana (Pers.) Schum à um arbusto laticÃfero pertencente à famÃlia Apocynaceae, popularmente conhecido como "chapÃu-de-NapoleÃo". SÃo bastante limitadas as informaÃÃes proteÃmicas sobre esta espÃcie. Por tanto, uma anÃlise proteÃmica da fraÃÃo proteica (TpLP) do lÃtex de T. peruviana foi realizada a partir de eletroforeses bidimensionais e espectrometria de massas. Um total de 33 proteÃnas (86%) foi identificado, incluindo proteÃnas de reserva, inibidor de peptidase, peptidases cisteÃnicas, peroxidases e osmotinas. As proteÃnas desta fraÃÃo apresentaram uma forte atividade proteolÃtica no pH 5,0, a qual foi aumentada na presenÃa de baixas concentraÃÃes do agente redutor DTT. A inibiÃÃo desta atividade na presenÃa dos inibidores especÃficos E-64 e IAA e a alta atividade com o substrato BANA evidenciou a predominÃncia de peptidases cisteÃnicas no lÃtex. Uma peptidase cisteÃnica denominada peruvianina-I, foi purificada a partir do lÃtex atravÃs de um Ãnico passo cromatogrÃfico envolvendo filtraÃÃo em gel. A enzima foi inibida por E-64 e iodoacetamida (IAA) e seguiu a cinÃtica de Michaelis-Menten, apresentando alta afinidade à azocaseÃna, com um valor de Km de 17,6 ÂM, exibindo pH e temperatura Ãtimos de 5,0-6,0 e 25-37 ÂC, respectivamente. A peruvianina-I nÃo foi reconhecida por anticorpos anti-papaÃna. As Eletroforeses bidimensionais e a espectrometria de massas revelaram que a peruvianina-I (100 kDa) possui um pI de 4,0 e cinco subunidades (20 kDa). A sequÃncia de aminoÃcidos N-terminal da peruvianina-I (1ADPGPLQDFCLADLNSPLFINGYPCRNPALAISDDF36) mostrou similaridade à germinas ou âgermin-like proteinsâ. Imagens de alta resoluÃÃo a partir da microscopia de forÃa atÃmica indicaram uma possÃvel estrutura hexamÃrica da peruvianina-I, que està organizada como um trÃmero de dÃmeros, formando um canal central. TpLP e Peruvianina-I nÃo exibiram atividade de oxalato oxidase e superÃxido dismutase ou efeitos antifÃngicos sobre a germinaÃÃo de esporos de Fusarium solani. Este estudo mostrou que o lÃtex de T. peruviana à uma fonte rica em proteÃnas relacionadas à patogÃnese, incluindo peptidases cisteÃnicas. Curiosamente, estas peptidases apresentam caracterÃsticas estruturais e bioquÃmicas diferentes, que podem estar relacionadas com as suas funÃÃes fisiolÃgicas especÃficas.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) à uma planta nativa do Brasil com grande valor comercial. Isso contribui com a geraÃÃo de milhares de empregos diretos e indiretos, especialmente na RegiÃo Nordeste, em Ãpoca de estiagem. Programas de melhoramento genÃtico vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente semiÃrido a fim de colocÃ-lo em um mercado cada vez mais competitivo. Entre os tipos de proteÃnas de sementes vÃrias tÃm funÃÃo de reserva, estrutural ou metabÃlica. AlÃm disso, as plantas sÃo dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o ataque de patÃgenos. Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito à expressÃo de proteÃnas relacionadas com a patogÃnese nas quais se inclui o grupo das quitinases. A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polÃmero de quitina para a N-acetil glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligaÃÃo β (1-4). As respostas moleculares nos perfis das plantas a nÃvel transcricional tÃm demonstrado serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto de mecanismos de defesa contra patÃgenos invasores. Usando ferramentas de bioinformÃtica foram identificados, no transcriptoma de cajueiro CCP076, dez contigs apresentando alto grau de semelhanÃa com quitinases, endoquitinases, e quitinases-like das famÃlias GH18 e GH 19 de Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus, Vitis vinifera, Aegilops tauschii e Hevea brasiliensis. Os ensaios enzimÃticos das proteÃnas da castanha confirmaram a presenÃa quitinases em seu proteoma. Ainda revelaram uma atividade catalÃtica Ãtima em pH 5. Um perfil de proteÃnas com sitio de ligaÃÃo à quitina tambÃm foi encontrado. Dessa forma, à demonstrado um grande potencial biotecnolÃgico nas quitinases provenientes da castanha de cajueiro CCP76. / The cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant native to Brazil with high market value. This contributes to the generation of thousands of direct and indirect jobs, especially in the Northeast, in the dry season. Breeding program has been selecting the best cashew cultivars adapted to semi-arid environment in order to put it in an increasingly competitive market. Among the types of seed proteins have several reservation function, structural or metabolic. Furthermore, plants are arranged in an array of defense mechanisms against pathogen attack. One of the most studied defense response with respect to the expression of pathogenesis related proteins which are included in the group of chitinases. The enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyse the polymer chitin to N-acetyl glucosamine by either endo or exo cleavage of β connection (1-4). The molecular profiles of responses in plants transcriptional level have been shown to be crucial for the establishment of a set of defense mechanisms against invading pathogens. Using bioinformatics tools were identified in the transcriptome cashew CCP076 ten contigs having high degree of similarity with chitinases, endoquitinases and chitinase-like the GH18 family and GH 19 of Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus , Vitis vinifera, Aegilops tauschii and Hevea brasiliensis. The enzyme assays of chestnut chitinase protein confirmed the presence in their proteome. Also revealed a great catalytic activity at pH 5. A protein profile with chitin-binding site was also found. Of these, it is demonstrated great potential in biotechnological chitinase from CCP76 cashew nuts.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cÃncer de mama representa o tipo de cÃncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil, depois do cÃncer de pele nÃo melanoma. Caracterizando-se como uma doenÃa clÃnica e biologicamente heterogÃnea, a detecÃÃo precoce do cÃncer de mama, uma caracterizaÃÃo fidedigna da doenÃa e um diagnÃstico preciso sÃo de fundamental importÃncia para reduÃÃo da mortalidade. Assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar anÃlises qualitativas e quantitativas de proteÃnas plasmÃticas de mulheres saudÃveis e mulheres com cÃncer de mama tipo ductal, em diferentes estÃgios. Para isso, inicialmente, as amostras de plasma foram depletadas de albumina e IgG e depois reunidas em pools representativos para cada grupo em estudo. Os pools foram entÃo fracionados por meio de cromatografias de afinidade em matrizes de Sepharose 4B imobilizadas com as lectinas vegetais α-galactose-ligante de Artocarpus incisa - Frutalina e glucose/manose-ligante de Dioclea altÃssima â DAL. Posteriormente, tantos os pools como as fraÃÃes cromatogrÃficas obtidas foram digeridas e submetidas à anÃlise independente de dados (MSE) e quantificadas (label-free) por espectrometria de massas. A utilizaÃÃo das cromatografias de afinidade com lectinas vegetais a priori da anÃlise por espectrometria de massas foi fundamental para reduzir a complexidade das amostras e estender o intervalo dinÃmico de proteÃnas, e frutalina apresentou os melhores resultados de fracionamento. Um somatÃrio de todas as anÃlises realizadas revelou a identificaÃÃo de cerca de 445.000 peptÃdeos e mais de 30.000 proteÃnas, com redundÃncia entre isoformas do mesmo grupo e entre grupos. Ademais, alÃm de fracionar, as cromatografias de afinidade com lectinas vegetais foram eficientes em isolar glicoformas especÃficas que refletem um padrÃo de glicosilaÃÃo alterado associado à doenÃa. Diversas proteÃnas diferencialmente expressas, algumas delas com mudanÃas na glicosilaÃÃo, foram identificadas, tais como apolipoproteÃna A2, apolipoproteÃna C3, fatores do sistema complemento (C3, C4b e C4A), clusterina, α-1-2-Ãcido glicoproteÃna, haptoglobina, hemopexina, paraoxonase arilesterase sÃrica, proteÃna plasmÃtica de ligaÃÃo ao retinol, plasminogÃnio e vitronectina. Dentre as proteÃnas identificadas, algumas estÃo relacionadas com a decomposiÃÃo da matriz extracelular, metabolismo lipÃdico, estresse oxidativo e outras caracterizam-se como proteÃnas de fase aguda. Finalmente, os dados de expressÃo diferencial e possÃveis alteraÃÃes de glicosilaÃÃo das proteÃnas contribuem para o desenvolvimento de um perfil protÃico, alvo para posterior validaÃÃo, que apresenta uma associaÃÃo com o desenvolvimento e a caracterizaÃÃo do cÃncer de mama em seus diferentes estÃgios. / The breast cancer presents one of the most commonly diagnosed types of cancer among women worldwide and in Brazil, after nonmelanoma skin cancer. Itâs a clinically and biologically heterogeneous disease. Therefore, early detection of breast cancer, a reliable characterization of the disease and an accurate diagnosis are crucial to reducing mortality. The aim of this work was perform a qualitative and quantitative analyzes of plasma proteins from healthy women and from women with ductal breast cancer in different stages. For this, initially, plasma samples were depleted of IgG and albumin and then pooled into samples representative for each study group. The pools were then fractionated by immobilized plant lectins (frutalin and DAL)-affinity chromatography. Subsequently, the pools and chromatographic fractions were digested and submited to and data-independent label-free mass spectrometric analysis. The use of affinity chromatography with plant lectins prior to analysis by mass spectrometry was essential to reduce sample complexity and extend the dynamic range of proteins, and frutalin showed the best results from fractionation. A sum of all analyzes performed revealed the identification of about 445,000 peptides and more than 30,000 proteins, with redundancy between isoforms of the same group and between groups. Furthermore, in addition to fractionation, the chromatography of affinity with plant lectins were effective in isolating specific glycoforms that reflect an altered glycosylation pattern associated with the disease. Several differentially expressed proteins, some of which changes in glycosylation were identified, such as apolipoprotein A2, apolipoprotein C3, complement factors (C3, C4b and C4A), clusterin, 1-2-α-acid glycoprotein, haptoglobin, hemopexin, serum paraoxonase arylesterase, plasma retinol binding protein, plasminogen and vitronectin. Among the proteins identified, some are related to the breakdown of the extracellular matrix, lipid metabolism, oxidative stress and other characterized as acute phase proteins. Finally, the data of differential expression and possible changes in the glycosylation patterns of proteins contributes to the development of a protein profile, subject to later validation, presenting an association with the development and characterization of breast cancer in its different stages.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / The present study was carried out to elucidate the relationship between seed ageing and oxidative damage in two cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.) cultivars, namely PitiÃba and PÃrola.The seeds were articially aged at 45 ÂC and 99% relative humidity until 72 h and daily harvested. Seed germination, electrolyte leakage, lipid and protein oxidation were evaluated. Moreover, changes in superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) activity as their isoform pattern and CAT and APX mRNA expression were also investigated. Only in PÃrola seeds germinability was decreased whereas electrolyte leakage was increased with artificial ageing, indicating membrane damage. Moreover, PÃrola seeds presented higher lipid and protein oxidative damage than the PitiÃba ones. Total SOD activity was not altered by the treatment in both cultivars. Zymogram analysis reveled five different isoforms, designated SOD1 to SOD5 according to the eletrophoretic migration. No significant difference in the SOD isoenzyme pattern up to 72 h were detected. Specific inhibition with peroxide and cyanide showed SOD1 and SOD2 as SOD-Mn and SOD3, SOD4 and SOD5 as SOD-Cu/Zn isoforms. It was verified a cross-talk between CAT and APX activities through artificial ageing. At 72 h of treatment, CAT mRNA expression and activity increased in PitiÃba seeds and decreased in the PÃrola ones. Conversely, APX mRNA expression and activity showed an opposite pattern in the studied cultivars. Imunoblot analysis demostrated that no significant changes in CAT content were verified in PÃrola and PitiÃba seeds during induced aging. Thus, the CAT turnover did not necessarily involve coordinated mRNA synthesis, protein synthesis and protein degradation. In conclusion, lipid and protein oxidative damage were narrowly involved in seed aging in cowpea. PitiÃba seeds were more resistant to age-induced oxidative damage than that of PÃrola. PitiÃba seed resistance against aging were related to induced CAT expression and its activity, suggesting that this enzime play a role in oxidative damage protection. / O presente estudo foi desenvolvido na intenÃÃo de elucidar a relaÃÃo entre o envelhecimento de sementes e danos oxidativos em duas cultivares contrastantes de caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.), denominadas PitiÃba e PÃrola. As sementes foram artificialmente envelhecidas a 45 ÂC e 99% de umidade relativa atà 72 h e coletadas diariamente. GerminaÃÃo de sementes, vazamento de eletrÃlitos, oxidaÃÃo de lipÃdios e proteÃnas foram avaliados. AlÃm disso, alteraÃÃes em atividade de enzimas como dismutase de superÃxido (SOD), peroxidase de ascorbato (APX) e catalase (CAT) assim como o padrÃo de suas isoformas e expressÃo de RNAm de CAT e APX tambÃm foram investigados. Somente em sementes de PÃrola decresceu a germinabilidade enquanto que aumentou significativamente o vazamento de eletrÃlitos com o envelhecimento artificial, indicando danos de membrana. AlÃm disso, sementes de PÃrola apresentaram maiores danos oxidativos em lipÃdios e proteÃnas do que sementes de PitiÃba. A atividade total da SOD nÃo foi alterada durante o tratamento de sementes em ambas cultivares. AnÃlise de zimograma revelou cinco diferentes isoformas, designadas SOD1 a SOD5 de acordo com a migraÃÃo eletroforÃtica. NÃo houve diferenÃa significativa no padrÃo isoenzimÃtico de SOD durante as 72 h de tratamento. InibiÃÃo especÃfica com perÃxido de hidrogÃnio e cianeto revelou as isoformas SOD1 e SOD2 como SOD-Mn e SOD3, SOD4 e SOD5 com SOD Cu/Zn. Foi verificado um âcross-talkâ entre as atividades de CAT e APX durante o envelhecimento artificial. As 72 h de tratamento, a expressÃo de RNAm de CAT e sua atividade aumentaram em PitiÃba e diminuÃram em sementes de PÃrola. A expressÃo e a atividade de APX demonstrou um padrÃo oposto nas cultivares estudadas. AnÃlise de imunoblot demonstrou que nÃo houve alteraÃÃes significativas no conteÃdo de CAT em ambas as cultivares durante a induÃÃo do envelhecimento. Desse modo, o turnover de CAT nÃo envolve necessariamente a sÃntese coordenada de RNAm, sÃntese de proteÃna e degradaÃÃo de proteÃna. Em conclusÃo, danos oxidativos em lipÃdios e proteÃnas estÃo estreitamente envolvidos no envelhecimento de sementes de caupi. Sementes de PitiÃba sÃo mais resistentes aos danos oxidativos induzidos por envelhecimento do que sementes de PÃrola. A resistÃncia de sementes de PitiÃba contra o envelhecimento parece estar relacionada à induÃÃo da expressÃo e atividade de CAT, sugerindo que esta enzima realiza uma funÃÃo protetora contra danos oxidativos.