Les bases fondamentales de la biologie suggèrent que tous les organismes actuels partagent un dernier ancêtre commun, le cenancêtre. Dès que la comparaison moléculaire des organismes des trois domaines du vivant (archées, bactéries et eucaryotes) est devenue possible, d’importants débats ont émergé sur l’habitat du cenancêtre, son rapprochement des origines de la vie, sa nature unique ou communautaire et ses relations avec les trois domaines du vivant. Cependant, jusqu’à il y a peu les informations disponibles sur les organismes modernes n’étaient pas suffisantes pour décrire précisément sa biologie. Notamment, la découverte chez les archées de membranes dont les composants principaux, les phospholipides, sont synthétisés par des mécanismes très différents de ceux des bactéries et les eucaryotes a conduit à proposer que chaque mécanisme de synthèse des phospholipides soit apparu indépendamment dans les lignées modernes. Dans ces hypothèses le cenancêtre aurait été dépourvu de phospholipides et, donc, de membranes. Cela met en cause la nature cellulaire du cenancêtre, qui semblait pourtant soutenue par d’autres indices indirects. Ces contradictions posent la question de l’existence de traces dans les organismes modernes d’une synthèse des phospholipides chez le cenancêtre. Dans cette thèse j’ai profité de l’explosion récente des données génomiques pour répondre à cette question. Il avait déjà montré que des membres de deux superfamilles protéiques universelles pouvaient avoir synthétisé de façon non spécifique chez le cenancêtre les énantiomères de glycérol phosphate servant d’ossature aux phospholipides. Les phospholipides archéens sont composés d’isoprénoïdes et les bactériens et eucaryotes d’acides gras. J’ai donc étudié l’évolution des voies de synthèse de ces molécules ainsi que celle de l’assemblage de tous les composants dans des phospholipides. Mes résultats montrent que la voie de synthèse des isoprénoïdes des eucaryotes et une voie hypothétique de synthèse des acides gras chez les archées avaient probablement des ancêtres moins spécifiques chez le cenancêtre. Une partie au moins de la machinerie d’assemblage des phospholipides semble aussi avoir été présente chez le cenancêtre.Ceci suggère que le cenancêtre avait probablement des mécanismes peu spécifiques de synthèse des phospholipides et que les différences entre les membranes actuelles sont dues à la spécialisation de la machinerie ancestrale dans chaque lignée. Mes observations soulignent aussi l’importance d’étudier le cenancêtre à partir des informations issues des organismes actuels pour éviter toute confusion avec les origines de la vie. / The main bases of Biology suggest that all extant organisms share a last common ancestor, namely the cenancestor. As soon as the comparison of molecular characters of organisms representative of the whole diversity of life became possible, hot debates emerged about the environmental conditions in which the cenancestor lived, its closeness to the origins of life, its single or community nature and its relationships with the three domains of life (Archaea, Bacteria and Eucarya). However, available information about current organisms was for a long time inadequate to precisely describe the biology of this organism. For instance, the observation that the main archaeal membrane components, called phospholipids, are synthesized by different means than their bacterial/eukaryotic counterparts was proposed to reveal that modern phospholipid biosynthesis pathways emerged late in independent lineages and were, therefore, absent in the cenancestor. This hypothesis argued that the cenancestor had no lipid membranes, so it could not be a cellular organism although other indirect clues indicated the opposite. These contradictions raise the question of the presence in modern organisms of traces that the cenancestor had a phospholipid biosynthesis machinery.In this dissertation, I took advantage from the recent accumulation of genomic data to address this issue. Previous work had shown that the members of two universal protein superfamilies could be present in the cenancestor to carry out the non-specific synthesis of the glycerol phosphate enantiomers that are the backbones of modern phospholipids. Bacterial and eukaryotic phospholipids use fatty acids whereas archaeal phospholipids are made up of isoprenoids. Thus, I studied the evolution of the metabolic pathways that synthesize these molecules and build up the phospholipids from their components. My results show that the eukaryotic isoprenoid biosynthesis pathway and a hypothetical archaeal fatty acid biosynthesis pathway are likely to have had less specific ancestors in the cenancestor. In addition, the phospholipid assembly machinery was also probably present in the cenancestor.These results suggest that the cenancestor was likely able to enzymatically synthesize its phospholipids by means less specific than modern ones. Dissimilarities in modern membrane phospholipids would result from the specialization of each biosynthesis system in each lineage. My work also stresses the fact that the cenancestor should be described on the basis of the comparison of modern organisms to avoid frequent confusions between the cenancestor and the origins of life.

Le groupe Substances Naturelles Marines du LCMBA (UMR 6001 CNRS-UNSA) se consacre à l'isolement et à la caractérisation de nouvelles molécules bioactives à partir d'invertébrés marins (spongiaires et cnidaires principalement). Suivant l'intérêt que ces molécules originales suscitent, leur valorisation peut concerner autant le domaine de la pharmaceutique que celui de la biosynthèse ou de l'écologie chimique. Ce manuscrit présente les travaux de recherche réalisés sur les deux éponges Pandaros acanthifolium et Agelas oroides, et sur les deux cnidaires Astroides calycularis et Parazoanthus axinellae. P. acanthifolium, très peu étudié, a permis l'isolement d'une nouvelle famille de saponines stéroïdiennes. La famille des orthidines et une nouvelle aplysinopsine, ont été isolées pour la première fois d'A. calycularis. Enfin, nous décrivons une nouvelle famille d'alcaloïdes isolée de P. axinellae qui nous a permis de distinguer deux morphotypes de P. axinellae d'après leurs profils chimiques. A. oroides a été choisi comme modèle d'étude pour la mise en place d'un nouveau protocole de biosynthèse in vivo des alcaloïdes de type pyrrole-2-aminoimidazoles (P2AI). Ces études permettent de confirmer l'utilisation de la proline dans la biosynthèse des P2AI.

Peu d'enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l'identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l'analyse de l'expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l'analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d'une rose parfumée à ceux d'une rose non parfumée a permis de corréler l'expression d'un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d'un rosier dont l'expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l'allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l'émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L'absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l'isoforme dans les cellules

Catharanthus roseus est une plante médicinale produisant divers types d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt en santé humaine. Ainsi, les AIM dimères comme la vinblastine et la vincristine sont utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et les alcaloïdes monomères de type hétéroyohimbine présentent diverses activités pharmacologiques. La fabrication de ces molécules dans la plante est fort complexe. Elle requiert un haut niveau de compartimentation tissulaire et subcellulaire et met en jeu plus d’une trentaine d’étapes enzymatiques, dont certaines sont encore très mal connues. Dans ce contexte, l’objectif de la thèse a consisté à élucider plusieurs étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse des AIM. Nos travaux ont permis de caractériser de nouvelles isoformes enzymatiques de la famille des cytochromes P450 ainsi que les réductases qui leur sont associées. Ils ont abouti à l’identification de nouvelles déshydrogénases et mis en évidence, in planta, leurs interactions avec la strictosidine synthase suggérant une biosynthèse orientée vers les divers alcaloïdes de type hétéroyohimbine. Enfin, en ayant recours à l’ingénierie métabolique, un segment de la voie de biosynthèse a été transféré dans la levure Saccharomyces cerevisiae, lui conférant la capacité de bio-transformer la tabersonine en vindoline, l’un des deux précurseurs finaux des alcaloïdes dimères. / Catharanthus roseus is a medicinal plant producing various types of monoterpene indole alkaloids (MIA) with a great interest in human health. Dimeric alkaloids such as vinblastine and vincristine are used in cancer chemotherapy and monomeric heteroyohimbine alkaloids exhibit various pharmacological activities. The production of these molecules in the plant is very complex. It requires a high level of tissular and subcellular compartmentalization and involves more than thirty enzymatic steps, some of which are largely unknown. In this context, the aim of this thesis was to elucidate several enzymatic steps of the MIA biosynthetic pathway. Our work allowed us to characterize new enzyme isoforms of cytochrome P450 and their associated reductases. They also resulted in the identification of new dehydrogenases and highlighted their interactions with the strictosidine synthase suggesting a directed biosynthesis towards various heteroyohimbine type of alkaloids. Finally, engineered yeast containing a segment of the MIA biosynthetic pathway was able to convert tabersonine into vindoline, one of the two final precursors of the dimeric alkaloids.

Les composés de type pyrrocidine sont des polykétides PKS-NRPS possédant des activités biologiques intéressantes comme antifongique ou antibiotique. La synthèse totale de ces composés est un réél challenge comme il est constitué de 10 centres chiraux et d'un macrocycle complexe. L'étude de leur biosynthèse pourrait être d'une aide importante afin de comprendre le mécanisme de formation de cette structure spéciale, et en particulier l'étape de la cyclisation complexe.Le précurseur linéaire de ces polykétides étant composé par une chaine nonakétide (partie PKS) et d'une L-tyrosine (partie NRPS), des hypothèses sur leur biosynthèse ont été émises dans cette thèse. Des expériences d'incorporation de précurseurs marqués ou non vont être réalisées dans différents milieux de culture en vue d'obtenir des informations sur cette biosynthèse, et plus précisément le passage du précurseur linéaire vers la structure polycyclique complexe. En parallèle, des supplémentations des cultures d'A. zeae avec des dérivés de la tyrosine seront faites dans le but d'obtenir des analogues pouvant avoir des activités biologiques nouvelles ou meilleures que les pyrrocidines. / Pyrrocidine and its related compounds are PKS-NRPS polyketides having biological interests such as antifungal or antibiotic activities. The total synthesis of these entities has been challenging since the family of hirsutellone is composed by 10 chiral centers and a complex macrocycle. Studying the biosynthesis of these compounds can be an asset for the comprehension of this special molecular structure, especially for the complex cyclization step. Knowing that the linear precursor of these molecules is constituted by a nonaketide chain (PKS part) and by an L-tyrosine (NRPS part), hypotheses about the biosynthesis of hirsutellone-related compounds have been developed in this thesis. Some incorporation experiments of labeled or unlabeled compounds has been done in different culture media in order to have more information about this biosynthesis, in particular the conversion of the linear precursor into this complex polycyclic structure. In parallel, the supplementation of L-tyrosine derivatives will help us to get some analogs of pyrrocidine which can have new or better activities than natural products.

Ki-67 maintient l'hétérochromatine constitutive lors de la prolifération cellulaire. La protéine Ki-67 est fortement exprimée dans le noyau des cellules de mammifères en prolifération. Sa présence est devenue un marqueur de référence en histopathologie diagnostic dans le cancer avec 330 millions de références sur des sites Internet et plus de 18 000 articles indexés avec le mot clé Ki-67 dans PubMed. Malgré son utilisation comme référence incontestable de la prolifération cellulaire, les rôles fonctionnels, les régulations et les mécanismes moléculaires où Ki-67 est impliquée demeurent obscurs. Depuis l'identification de Ki-67 en 1983, les différentes études avec l'utilisation d'outils moléculaires (anticorps, oligonucléotide antisens, shRNA, siRNA) qui inhibent l'expression de Ki-67 dans des cellules cancéreuses de tous types ont mis en évidence une forte régression à leur prolifération. La localisation prédominate de Ki-67 est dans le nucléole, son inactivation photodynamique abroge la transcription de l'ARN ribosomal qui est requis pour la prolifération cellulaire. Le consensus est que Ki-67 favorise la prolifération cellulaire, mais à ce jour aucune étude n'a mis en évidence ni un mécanisme d'action, ni un rôle essentiel de Ki-67 dans la prolifération cellulaire in vivo. Dans notre travail, nous abordons la question du rôle de Ki-67 dans les cellules humaines cancéreuses non transformées en culture ainsi qu'in vivo chez la souris. Nous avons montré que Ki-67 n'est pas nécessaire pour la prolifération cellulaire. En revanche, Ki-67 est indispensable pour maintenir la structure de l'hétérochromatine constitutive. Nous avons mis en évidence des nouveaux mécanismes de régulation de l'expression de Ki-67 au cours du cycle cellulaire, sa transcription étant contrôlé par CDK4/6 via la phosphorylation de la protéine rétinoblastome, et sa dégradation en G1 tardive via APC/C-Cdh1. Après extinction de l'expression de Ki-67 par ARNi ou par ablation du gène de Ki-67 par la nouvelle approche TALEN, nous n'avons observé aucun effet sur la synthèse de l'ARN ribosomique, sur le déroulement normal du cycle cellulaire, sur le développement embryonnaire ou la fertilité de la souris. Par contre, son extinction inhibe la progression des tumeurs dans des modèles de Xénogreffes, et induit un remodelage du paysage de l'expression de certain gènes. Notre étude par protéomique des protéines interragissant avec Ki-67 a identifié des protéines nucléolaires à l'interface entre l'hétérochromatine périnucléolaires et les composants granulaires nucléolaires. Ces complexes protéiques empêchent la dispersion de l'hétérochromatine constitutive au cours du cycle cellulaire. Au vu de nos résultats, nous concluons que dans les cellules non-proliférantes l'anémie de Ki-67 est associée à la diffusion de l'hétérochromatine constitutive. Ki-67 est indispensable à la maintenance de cette hétérochromatine qui serait essentielle pour le développement des tumeurs. / Ki-67 links constitutive heterochromatin maintenance to cell proliferation.Ubiquitous nuclear expression of Ki-67 in proliferating mammalian cells has led to its use as a benchmark diagnostic marker for cell proliferation, especially in cancer histopathology. Its importance is reflected by over 330 million hits when searching using the keyword “Ki-67” on Google, and over 18,000 papers on PubMed. In spite of its use as a surrogate marker for cell proliferation, the mechanisms of regulation of Ki-67 expression and its physiological functions in cell proliferation remain obscure. Early functional studies found that inhibition of Ki-67 expression by injection of antisense oligonucleotides or inactivating antibodies into cultured cancer cells inhibited cell proliferation. This is in agreement with later results obtained by peptide-nucleic acid, antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA experiments in various cancer cell lines. Photodynamic inactivation of Ki-67 abrogates ribosomal RNA transcription, consistent with its predominantly nucleolar localisation and apparent requirement for cell proliferation. However, a recent study in HeLa cells found only minor effects on the cell cycle distribution upon Ki-67 knockdown. Nevertheless, Ki-67 is required for localising several nucleolar proteins to the mitotic chromosome periphery, potentially providing a mechanism for nucleolar assembly, as previously suggested by segregating nucleolar components upon cell division and chromosome segregation. Therefore, although the consensus is that Ki-67 promotes cell proliferation, this has not been clearly demonstrated, and no studies have ascertained requirements for Ki-67 in vivo.In this work, we address these questions in non-transformed human cells and cancer cells in culture and in vivo in mice. We have shown that Ki-67 is dispensable for cell proliferation but is required to maintain constitutive heterochromatin. We found that Ki-67 expression is cell cycle-dependent due to dynamic control by CDK4/6 and Cdh1. However, silencing of Ki-67 by RNAi or a TALEN-mediated Ki-67 gene ablation had no effect on ribosomal RNA synthesis, cell cycling, mouse development or fertility, but prevented tumour progression and led to remodelling of the gene expression landscape in cycling cells. Interaction proteomics and functional assays revealed that Ki-67 defines the boundary between perinucleolar heterochromatin and the nucleolar granular components, and prevents dispersal of constitutive heterochromatin during cell cycling. Conversely, Ki-67 downregulation in non-proliferating cells is associated with constitutive heterochromatin dispersal. The results suggest that Ki-67 mediates organisation of heterochromatin, and allows efficient tumour progression.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) possèdent deux propriétés fondamentales : l'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en lignées hématopoïétiques de tout type. Les CSH se maintiennent dans la moelle osseuse et se renouvellent par division asymétrique. En revanche, les divisions symétriques caractérisent les cellules qui s'engagent dans la différenciation. L'environnement pauvre en oxygène de la moelle osseuse favorise la glycolyse anaérobique et l'oxydation des acides gras, préservant, respectivement, la quiescence et les divisions asymétriques. Que l'engagement des CSH vers la différenciation lymphoïde, myéloïde ou érythroïde dépende ou entraîne une reprogrammation métabolique n'est toujours pas connu. En effet, de nombreuses études ont montré que cytokines et contacts cellulaires sont indispensables pour l'engagement des CSH vers une lignée donnée, alors que l'impact potentiel des nutriments et du métabolisme sur ce processus reste très peu étudié. La différenciation est associée à une prolifération qui nécessite des besoins métaboliques accrus pouvant être supportés par diverses sources d'énergie, telles que le glucose, les acides gras, le lactate ou la glutamine. Le glucose et la glutamine sont des précurseurs de l'ATP, des lipides et des nucléotides. Toutefois, leurs contributions relatives aux voies métaboliques contrôlant l'engagement des CSH n'ont pas été évaluées. Pour autant, nos études ainsi que celles menées par d'autres laboratoires ont montré que l'expression du transporteur de glucose Glut1 n'augmente qu'au cours des dernières étapes de la différenciation érythroïde, suggérant l'implication potentiel d'autres nutriments dans la régulation des étapes précoces de l'engagement vers la voie érythroïde. Ainsi, mon travail de thèse a consisté à déterminer si la disponibilité et l'utilisation des nutriments régulent la différenciation des CSH vers la lignée érythroïde. De fait, j'ai montré que le transporteur de glutamine ASCT2 est hautement exprimé dans les CSH et que la répression d'ASCT2 ou le blocage du métabolisme de la glutamine empêche la différenciation érythroïde des CSH, les détournant vers la voie myéloïde, même en présence d'érythropoïétine. Dans ces conditions, nous avons montré que la différenciation érythroïde ne pouvait pas être restaurée par l'ajout d'intermédiaires du cycle de Krebs, alors que qu'elle était dépendante de la biosynthèse de novo de nucléotides. Étonnamment, le 2-désoxyglucose (2-DG), un analogue du glucose inhibant la glycolyse, accélérait l'érythropoïèse. Nous avons aussi mis en évidence in vivo, en condition de stress érythropoïétique, des influences différentes du catabolisme de la glutamine et celui du glucose dans la modulation de l'érythropoïèse. Afin de mieux élucider les mécanismes par lesquels la glutamine module la différenciation érythroïde des CSH, nous avons étudié les voies métaboliques qu'elle emprunte. Des expériences de suivi de la glutamine marquée ont montré que l'entrée de la glutamine dans le cycle de Krebs est requise pour une érythropoïèse efficace. Par contre, nous avons montré que la synthèse de novo des nucléotides était l'étape limitante de la différenciation érythroïde. De plus, nous avons observé que la différenciation érythroïde accélérée en présence du 2-DG était associée à une augmentation importante du niveau des pentoses phosphates, précurseurs des nucléotides. Ainsi, l'utilisation de la voie des pentoses phosphates par le glucose, plutôt que la glycolyse, était essentielle pour l'érythropoïèse. En conclusion, mon travail de thèse a montré que la production de nucléotides via le métabolisme coordonné du glucose et de la glutamine est la condition sine qua non pour l'engagement des CSH vers la lignée érythroïde. / Hematopoietic stem cells (HSCs) possess two fundamental characteristics; self-renewal capacity and the ability to give rise to all blood cell lineages. Before their commitment to a specific lineage, these cells are maintained in a quiescent state in the bone marrow. Asymmetric division is essential for the maintenance of the stem cell compartment while symmetric division results in HSC differentiation. The hypoxic environment of the bone marrow is conducive to anaerobic glycolysis and fatty acid oxidation, preserving stem cell quiescence and asymmetric division, respectively. However, it is not known whether the commitment of an HSC to a lymphoid, myeloid or erythroid lineage fate, is regulated by a metabolic switch. Indeed, while much research has shown a critical role for cytokines and cell-cell contacts in the commitment of HSCs to distinct hematopoietic lineages, the possibility that nutrient entry and metabolism may contribute to this process was not considered until very recently. Cell differentiation is associated with proliferation resulting in increased metabolic requirements that can be met by energy sources such as glucose, fatty acids, lactate, or glutamine, amongst others. While glucose and glutamine are both precursors for the production of ATP, lipids and nucleotides, their relative contributions to metabolic pathways driving HSC lineage commitment have not been evaluated. Interestingly, we and others previously found that the Glut1 glucose transporter is highly upregulated only during the final mitoses of HSC-driven erythroid differentiation, suggesting that other nutrients may regulate early stages of erythroid lineage commitment. During my PhD, I was interested in determining whether nutrient availability and utilization regulate HSC differentiation to the erythroid lineage. Interestingly, I found that the ASCT2 glutamine transporter is expressed at high levels on HSCs. Downregulation of ASCT2 or blocking glutamine metabolism abrogated erythroid differentiation of HSCs and diverted erythropoietin-signaled HSCs towards a myeloid fate. Under conditions where glutamine utilization was blocked, erythroid differentiation was not restored by directly replenishing the tricarboxylic acid cycle but rather, was dependent on de novo nucleotide biosynthesis. Surprisingly, 2-deoxyglucose, a glucose analogue that inhibits glycolysis, enhanced erythropoiesis. Glutamine and glucose catabolism also differentially modulated erythropoiesis in vivo, under stress conditions. To better elucidate the mechanism(s) via which glutamine supports the erythroid lineage specification of HSCs, we evaluated the metabolic pathways fueled by glutamine. Carbon/nitrogen-labeled glutamine tracing experiments showed that the rate-limiting step in EPO-induced erythroid differentiation is glutamine-dependent de novo nucleotide biosynthesis while glutamine entry into the TCA cycle (anaplerosis) is not required. Furthermore, the accelerated erythroid differentiation in the presence of 2-DG was associated with a striking increase in pentose phosphates, precursors of nucleotides. Notably, the shunting of glucose into the pentose phosphate pathway (PPP), rather than glycolysis, was essential for erythropoiesis. In conclusion, my research shows that the coordinated redirection of glucose and glutamine into the production of nucleotides is the sine qua non condition for the erythroid differentiation of HSCs.

La vigne a une importance économique majeure au niveau mondial. La plupart des vignobles sont greffés et comportent une variété (cépage, Vitis vinifera) greffée sur des porte-greffes de Vitis sauvages (hybrides de V. berlandieri, V. riparia et V. rupestris). Le potentiel qualitatif du raisin à la vendange dépend d’un équilibre subtil entre teneur en sucres, acidité, concentration en polyphénols et en précurseurs d’arômes. Les mécanismes contrôlant l’équilibre sucres/acides/polyphénols sont influencés par différentes contraintes abiotiques auxquelles la vigne est soumise, en particulier l’azote, en interaction avec le matériel végétal (cépage et porte-greffe). Des travaux antérieurs suggèrent par ailleurs qu’une partie des effets de la contrainte hydrique sont en fait liés à une carence azotée entraînée indirectement par la diminution d’absorption d’eau. Le système racinaire (porte-greffe) joue un rôle important dans l’absorption, la réduction, le transport et le stockage de l’azote, et dans l’équilibre hydrique de la plante. Dans ce contexte, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse des flavonoïdes des baies en réponse à la nutrition azotée, à la nature du porte-greffe et du greffon. Des plants des cépages Cabernet Sauvignon et Pinot Noir cultivés soit en pots en conditions semi-contrôlées soit au vignoble ont été soumis à des niveaux d’alimentation azotée différents. Les analyses agronomiques ont permis de confirmer une augmentation des teneurs en azote des différents organes de la plante (limbes, pétioles et baies) ainsi qu’une augmentation de la surface foliaire et de la masse des bois de taille sous l’effet du traitement azoté. Les analyses métabolomiques des pellicules de baies révèlent une accumulation de métabolites secondaires dont la nature diffère en fonction des différentes combinaisons porte-greffe/greffon. De plus, une augmentation de la synthèse d’anthocyanes et des flavonols a été observée dans les pellicules de baies en réponse à la diminution de la nutrition azotée. L’apport azoté se traduit aussi par une augmentation du degré de polymérisation moyen des tannins, alors que les teneurs en flavan-3-ols et procyanidines des pépins et des pellicules ne sont pas affectées par les différents apports azotés. Les analyses transcriptomiques globales (génome complet) et ciblées (qPCR) ont mis en évidence des modifications des transcrits de gènes liés au métabolisme des flavonoïdes en réponse à la nutrition azotée. La variation de l’apport azoté influence également l’expression des gènes régulateurs positifs (facteurs de transcription de type MYB) et négatifs (protéine de type Lateral organ Boundary Domain (LBD)) des gènes de la biosynthèse des flavonoïdes chez la vigne. / Grapevine has a major economic importance worldwide. Most vineyards are grafted and include a variety (Vitis vinifera) grafted over a wild Vitis rootstock (hybrids of V. berlandieri, riparia and rupestris). Grape berry quality at harvest depends on a subtle balance between acidity and the concentrations of sugars, polyphenols and precursors of aroma compounds. The mechanisms controlling the balance of sugars/acids/polyphenols are influenced by the abiotic environment, in particular nitrogen supply, and interact with the genotypes of both the scion variety and the rootstock. Previous work suggests that some of the effects of water stress are in fact linked to a nitrogen deficiency driven indirectly by the reduction of water absorption. The root system (i.e rootstock) plays an important role in the uptake, reduction, transport and storage of nitrogen, and the water balance of the plant. In this context, we studied the mechanisms involved in the regulation of the synthesis of flavonoids in berries in response to nitrogen nutrition with different scion/rootstock combinations. Two varieties (Cabernet Sauvignon and Pinot Noir) were subjected to different nitrogen supplies in two experimental systems, in pots under semi-controlled conditions and in a vineyard. Agronomic analysis confirmed that high nitrogen supply increased the nitrogen content of different organs (leaf blades, petioles and berries) as well as leaf surface area and cane pruning weight. Metabolomic analyses of berry skins revealed an accumulation of secondary metabolites whose nature depended on the different rootstock/scion combinations studied. In addition, an increase in the synthesis of anthocyanins and flavonols was observed in the berry skins in response to the decrease in nitrogen nutrition. High nitrogen supply also increased the average degree of polymerization of tannins, while the contents of flavan-3-ols and procyanidins in the seeds and skins of the berries were not affected. Global transcriptome (using RNA sequencing) and targeted (qPCR) analyses showed changes in the abundance of transcripts of genes related to the metabolism of flavonoids in response to nitrogen status. Nitrogen supply also influenced the transcript amounts of positive (MYB) and negative (Lateral Boundary Organ Domain) transcription factors controlling of the biosynthesis of flavonoids.

Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse. / Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.

Peu d’enzymes de synthèse de composés odorants sont connues chez le genre Rosa. Ce travail de thèse a permis l’identification de quelques-unes de ces protéines grâce à la technologie des puces à ADN, à l’analyse de l’expression des gènes par RT-PCR quantitative en temps réel (qPCR) et à l’analyse des parfums par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Une puce confrontant les ADNc d’une rose parfumée à ceux d’une rose non parfumée a permis de corréler l’expression d’un gène, codant pour une Nudix hydrolase, très fortement exprimé dans la rose parfumée, avec la présence des monoterpènes dans le parfum de nombreux cultivars de rosiers. La caractérisation d’un rosier dont l’expression de ce gène est fortement réduite par ARN interférants, a permis de confirmer le rôle de celui-ci dans la synthèse des monoterpènes. La phénylacétaldéhyde synthase (PAAS) est une autre enzyme participant à la synthèse du parfum. Trois allèles de cette protéine ont précédemment été mis en évidence. Les résultats de qPCR et de CPG dans une population hybride ont permis de montrer que l’allèle a1 est le seul à pouvoir induire la synthèse et l’émission de 2-phényléthanol. Les activités respectives des différentes isoformes ont été testées in vitro chez la levure et in planta dans des feuilles de tabac et des cals de rosier : ces expériences montrent que les trois isoformes ont des activités comparables. L’absence de synthèse de 2-phényméthanol chez les plantes présentant les isoformes a2 et a3 réside donc dans la très faible expression de leurs allèles, induisant probablement une faible concentration de l’isoforme dans les cellules / Very few enzymes responsible for the biosynthesis of scent compounds in the genus Rosa are known so far. This PhD thesis aims to identify some of these proteins with DNA microarray technology, gene expression analysis by real-time quantitative PCR (qPCR) and scent analysis by gas chromatography (GC). An array comparing cDNA from a scented rose to those of a non-scented one, showed a correlation between expression of a yet-unknown gene, encoding a Nudix hydrolase, highly expressed in the scented rose, and the presence of monoterpenes in the scent of many rose cultivars. Characterization of a rose cultivar, in which expression of this gene has been decreased by RNA interference, confirmed its role in monoterpene synthesis. The phenylacetaldehyde synthase (PAAS) is another enzyme implicated in scent biosynthesis. Three alleles of this protein had been previously described. qPCR and GC experiments in a hybrid population showed that the a1 allele is the only one able to induce 2-phenylethanol biosynthesis. The respective activities of the different isoforms were tested in vitro in yeast, and in planta in tobacco leaves and rose calli: these experiments showed that the three isoforms have comparable activities. The lack of 2-phenylethanol production in plants having a2 and a3 isoforms is thus due to the very low expression of their respective alleles, probably inducing very low isoform concentration in cells