Neuromodulation, such as spinal cord stimulation (SCS) and deep brain stimulation (DBS), has been shown to modulate pathophysiological brain activity and provide symptomatic therapy for several neurological disorders, including Parkinson’s Disease. The effectiveness of this therapy could likely be further improved by neuromodulation that is adaptive, delivering stimulation more selectively, by monitoring a biomarker in recorded brain signals, which indicates the presence of a pathological state. In the treatment of Parkinson’s Disease, the most commonly proposed solutions for adaptive neuromodulation are relying on excessive beta-band oscillatory activity as a biomarker, which is however often highly variable between patients during movement and in conjunction with neuromodulatory treatment, such as levodopa. These limitations hinder broader use of this biomarker and prompts further research for alternative solutions. In this work, we instead present the use of a novel feature of evoked electrophysiological activity, which utilizes the inter-trial phase coherence between stimulation pulses, to classify parkinsonian brain states in 6-OHDA lesioned rats. We developed a method, which relates to the rate of decay in inter-tral phase coherence, evoked by single SCS or DBS pulses, that is able to statistically separate experimental conditions recorded from a dopaminergic depleted hemisphere from conditions a non-depleted hemisphere, while also being able to separate conditions with levodopa treatment from conditions without treatment. For animals undergoing SCS we can classify phase decay measurements from pharmacologically treated or untreated parkinsonian states, using a Bayesian model, with a high accuracy and strong classifier performance for a single channel (AUC 0.85 – 0.99) in the motor cortex and striatum. In ongoing experiments, similar implementation of adaptive DBS is being evaluated. Our results support the implementation of our feature in a protocol aimed at performing closed-loop neuromodulation in the 6-OHDA rat model of Parkinon’s Disease, that can serve as the basis for further studies. / Neuromodulering, såsom ryggmärgsstimulering (SCS) och djup hjärnstimulering (DBS), har visat sig kunna modulera patofysiologisk hjärnaktivitet och ge symtomatisk behandling av flera neurologiska sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom. Effekten av denna behandling skulle sannolikt kunna förbättras ytterligare genom neuromodulering som är adaptiv och ger stimulering mer selektivt, genom övervakning av en biomarkör i registrerade hjärnsignaler, som indikerar förekomsten av ett patologiskt tillstånd. Vid behandling av Parkinsons sjukdom förlitar sig de vanligaste lösningarna för adaptiv neuromodulering på överdriven beta-bands oscillatorisk aktivitet som en biomarkör som dock ofta är mycket varierande mellan patienter, under rörelse och i samband med behandling så som levodopa. Dessa begränsningar hindrar en bredare användning av denna biomarkör och ytterligare forskning krävs för att hitta alternativa lösningar. I detta arbete presenterar vi istället en ny egenskap hos väckt elektrofysiologisk aktivitet, som utnyttjar faskoherens mellan stimuleringspulser för att klassificera parkinsonistiska hjärntillstånd hos 6-OHDA-lesionerade råttor. Vi har utvecklat en metod som relaterar till avklingningshastigheten i faskoherens, framkallad av enstaka SCS- eller DBS-pulser, som kan statistiskt särskilja de experimentella tillstånden i en dopaminergiskt utarmad hemisfär från liknande tillstånd, fast i en icke utarmad hemisfär. Den kan även statistiskt särskilja tillstånd med levodopabehandling från tillstånd utan behandling. För djur som genomgår SCS kan vi klassificera fasförfallsmätningar från farmakologiskt behandlade eller obehandlade parkinsontillstånd, med hjälp av en Bayesiansk modell, med hög noggrannhet och stark klassificeringsprestanda för en enda kanal (AUC 0,85 - 0,99) i motorcortex och striatum. I pågående experiment utvärderas en liknande implementering av adaptiv DBS. Våra resultat stöder implementeringen av vår funktion i ett protokoll som syftar till att utföra sluten neuromodulering i 6-OHDA-råttmodellen för Parkinons sjukdom, som kan tjäna som grund för ytterligare studier.

Omkring 20 miljoner nya cancerfall inträffar över hela världen varje år, och under 2020 uppskattades det att 10 miljoner dödsfall var förknippade med cancer. En av de vanligaste behandlingarna för cancer är cytostatika (cellgifter) som angriper alla snabbväxande celler. Detta kan i sin tur leda till allvarliga biverkningar, exempelvis hematologiska toxicitetsreaktioner som kan vara livshotande och till och med dödliga, men hur allvarligt en patient kommer att reagera på behandlingen är mycket individuellt. För närvarande finns det ingen definitiv förklaring på vad som är den bakom- liggande orsaken till dessa allvarliga toxicitetsreaktioner. Det kan vara en genetisk komponent och det antas att genetiska variationer finns i genomets regulatoriska sekvenser som kan vara bidragande faktorer. För detta examensarbete har det identifierats varianter som finns inom eller nära någon enhancer där motsvarande enhancer kan vara kopplad till gener relevanta för de allvarliga toxicitetsreaktioner som vissa patienter upplever. Syftet är att validera att dessa enhancers faktiskt reglerar genuttrycket av dessa gener genom CRISPR-interferens (CRISPRi). Genom att rikta in sig på de identifierade enhancer-varianterna med CRISPRi-systemet, med hjälp av flera olika sgRNA, skulle en mätbar förändring i genuttryck kunna uppnås. Den slutliga valideringen av dessa enhancers, om de faktiskt modulerar genuttrycket, har inte utförts på grund av tidsbrist. Dock  har  alla  nöd- vändiga komponenter förberetts såsom att integrera de erforderliga sekvenserna för CRISPRi till genomet av cancercellinjen K562 och sorterat ut de celler med framgångsrik integrering, därigenom skapat en stabil cellinje. / Around 20 million new cancer cases occur worldwide every year, and in 2020 alone it was estimated that 10 million deaths were associated with cancer. One of the most common treatments for cancer is the use of chemotherapy drugs which are nonspecific and target all fast dividing cells. This in turn can lead to serious haematological toxicity reactions among other adverse side effects that could be life threatening and even fatal, but how severely a patient will react to the treatment is very individual.  As of now there is no definite answer to what the underlying cause for these severe toxicity reactions is.  There could be a genetic component and it is hypothesised that there are variants residing in the regulatory sequences of the genome that could be contributing factors. For this degree project, variants that are located within or near an enhancer have been identified where the corresponding enhancer might be linked to genes relevant for why some patients might experience severe toxicity re- actions. The aim is to validate that these enhancers do in fact regulate the gene expression of these genes through the use of CRISPR-interference (CRISPRi). By targeting around the identified enhancer variants with the CRISPRi system, using several different sgRNA, there could be a measur- able change in gene expression. The final validation of the enhancers, if these do in fact modulate the gene expression, was not performed due to lack of time. However, all necessary components were prepared such as integrating the required sequences for CRISPRi into the genome of the cancer cell line K562 and sort for successful integration, thereby creating a stable cell line.

Fagmider är ett kraftfullt verktyg som använts för att uttrycka heterologa proteiner på fagvirus i metoder som exempelvis riktad evolution via fagdisplay av proteinbinliotek. Monovalent uttryck genom fagemider lider av ett överflöd av kala fager som är svåra att rensa bort. Effektiviteten hos detta system kan förbättras genom att använda tekniker för att selektivt fånga uttryckande fag. Biotinylering och infångning med streptavidin kan vara ett användbart verktyg för sådana ändamål och enzymatisk biotinylering med AviTag™-BirA-systemet är ett lovande alternativ. En fagemidvektor skapades genom amplifiering och kloning av sekvensen av AviTag™ in i en linjäriserad pAffi1#336-vektor. Sekvenser av två affikroppar, Zher2 och Zwt, som binder till två olika mål, Her2 och trastuzumab, klonades in i denna Avi-märkta vektor. Denna sammansatta fagemidvektor transformerades därefter till tre Escherichia coli-stammar: XL1Blue, ER2738, TG1. En plasmid innehållande BirA-enzym avsett för platsspecifik biotinylering av proteinerna som bär AviTag™ samtransformerades tillsammans med fagemiden i vissa transformationer för att undersöka biotinylering in vivo. Produktionsnivåerna för var och en av dessa stammar tillsammans med deras tillväxtkurvor beräknades för att analysera om plasmidbelastningen påverkar någon av stammarnas tillväxt. Det observerades att XL1Blue kunde växa i en takt som var jämförbar med de andra stammarna och samtidigt lyckades producera tillräckligt högre titrar. Superinfektion av hjälparfager för dessa produktioner var också mycket lovande. ER2738 och TG1 var avsevärt dåliga, den förra i termer av alla aspekter och den senare saknade bra superinfektionskarraktär men uppvisade anmärkningsvärt högre tillväxt och avsevärt högre titrar. Fagen biotinylerades in vitro genom att använda BirA som producerades och renades internt och dess biotinyleringsgrad jämfördes med den biotinylerade in vivo fagen som producerades i dessa tre stammar. Dessa fager utvärderades för deras förmåga att binda till sina mål och deras grad av biotinylering. Ett märkbart mönster som observerades fag visade minskad bindning till humant serumalbumin, vilket gjorde deras målbindning svår att tolka. / Phagemids have been a convenient and powerful tool used to display heterologous proteins on phage in methods such as directed evolution by phage display of protein libraries. Monovalent display through phagemids suffers from an overabundance of bald phage which are difficult to deplete. The efficiency of this system can be improved by using techniques to selectively capture expressing phage. Biotinylation and capture using streptavidin can be a useful tool for such purposes and enzymatic biotinylation using the AviTag™-BirA system is a promising option. A phagemid vector was created by the amplification and cloning of the sequence of AviTag™ into a linearized pAffi1#336 vector. Sequences of two affibodies, Zher2 and Zwt, binding to two different targets, Her2 and human IgG, were cloned into this Avi-tagged vector. This assembled phagemid vector was subsequently transformed into three Escherichia coli strains: XL1Blue, ER2738, TG1. A plasmid containing BirA enzyme intended for site-specific biotinylation of the proteins that carry the AviTag™ was co-transformed along with the phagemid in some transformations to investigate in vivo biotinylation. The production levels of each of these strains along with their growth curves were calculated to analyse if the plasmid burden impacts either of the strains’ growth. It was observed that XL1Blue was able to grow at a pace comparable to the other strains and managed to produce sufficiently high titers. The superinfection rate of these productions was also very promising. ER2738 and TG1 were considerably poor, the former in terms of all aspects and the latter only lacking in the superinfection rate but notable displaying higher growth and considerably higher titers. The phage was biotinylated in vitro by using BirA that was produced and purified in-house and its biotinylation degree was compared against the in vivo biotinylated phage that were produced in these three strains. The phage were then evaluated for their ability to bind to their targets and their degree of biotinylation. One noticeable pattern that was observed was that the Avi- tagged phage displayed reduced binding to the Human Serum Albumin which made their target binding hard to interpret.

Lungcancer är en heterogen sjukdom som kräver många histopatologiska analyser för att diagnostisera och behandla effektivt. Dessa analyser utförs för närvarande med singelplex immunohistokemi (IHC) vilket kräver mycket vävnadsprovmaterial om flera markörer behöver färgas för. I den här studien testades två tillvägagångssätt för multiplex immunfluorescens (IF) (indirekt sekventiell IF och multiplex tyramide signal amplification med spektral avblandning) för att se om en panel av 7 markörer, som rutinmässigt används kliniskt, kunde färgas i ett enda experiment på samma vävnadsprov. För att göra detta användes COMET- och LabSat-instrumenten från Lunaphore och de utvärderades utifrån kvalité och användarvänlighet. På COMETen kunde alla sju markörer inkluderas i panelen medan tillvägagångssättet med TSA på LabSat var begränsat till sex markörer på grund av protokollet för spektral separation. Panelen optimerades på COMET och sedan gjordes multiplexa färgningar med båda instrumenten. Färgningarna från LabSat avbildades med mikroskopet på PhenoImager Fusion-instrumentet. Alla färgningar på COMET var av god kvalité medan LabSat hade behövt vidare optimering för att prestera på samma nivå. COMETen fanns också vara det mer användarvänliga instrumentet pga det integrerade mikroskopet och mindre behov av användarintervention. Denna studie visade att det är möjligt att översätta singelplexa IHC-analyser till multiplex IF med vissa optimeringar och byte av några antikroppskloner. / Lung cancer is a heterogeneous group of malignancies that requires many histopathological analyses to diagnose and treat efficiently. These analyses are currently performed with singleplex immunohistochemistry (IHC) which needs a lot of tissue sample material if multiple markers have to be stained for. In this study, two different multiplexed immunofluorescence (IF) approaches (indirect sequential IF and multiplexed tyramide signal amplification with spectral unmixing) were tested to see if a panel of 7 markers routinely used in clinic to could be stained in a single experiment on the same tissue sample. To do this, the COMET and LabSat instruments from Lunaphore were used and evaluated in regards to quality and ease of use. With the COMET all seven markers could be included in the panel while the TSA approach on LabSat was limited to six markers due to the spectral unmixing protocol. The panel was optimized on COMET and then multiplexed stainings were performed on both instruments. The LabSat staining was imaged on the PhenoImager Fusion microscope. All the stainings were of good quality on the COMET while the LabSat would have needed further optimization to perform at the same level. The COMET was also found to be the more user-friendly instrument due to its integrated microscope and lesser need for user intervention. This study showed that it is possible to translate singleplex IHC analyses into multiplexed IF with some optimizations and change of a few antibody clones.

Trippelnegativ bröstcancer (TNBC) är den mest maligna formen av bröstcancer utan någon framträdande behandlingsbar biomarkör. Således har den djupa återfallsfrekvensen och bristen på behandlingsalternativ öppnat behovet av att förstå TNBC: s etiopatogenes och molekylära mekanism. Huvudsyftet är att kartlägga det genomomfattande differentiella uttrycket av den förmodade cancergenen (en prenyleringsgen) och dess betydelse vid trippelnegativ bröstcancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) är en teknik som genererar högupplösta promotor-förstärkare interak- tioner med nästan en-förstärkare upplösning.Vi arbetade med cancercellinjer, MDA-MB_231, med och utan den förmodade genen. Hi-C-tekniken optimerades i enlighet därmed för cancer- cellinjen för att generera en högupplöst berikad region. Resultaten kan vidare användas för att utföra biblioteksförberedelser och bioinformatikanalys. Dessa fynd kommer att ägnas åt att upptäcka nya vägar involverade i prenylering och TNBC. / Triple-negative Breast cancer (TNBC) is the most malignant form of breast cancer with no prominent treatable biomarker. The profound recurrence rate and lack of treatment options have opened the need to understand the etiopathogenesis and molecular mechanism of TNBC. The main objective of this study is to map the genome-wide differential expression of the putative cancer gene (a prenylation gene) and its importance in Triple-Negative Breast cancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) is a technique which generates high-resolution promoter-enhancer interactions with almost single-enhancer resolution. We worked with cancer cell lines, MDA-MB_231, with and without the putative gene. The Hi-C technique was optimized accordingly for the cancer cell line to generate a high-resolution enriched region. The results can be further used to perform library prep and bioinformatics analysis. These findings will devote to discovering novel pathways involved with prenylation and TNBC.

High-throughput Sequencing (HTS)-tekniker fortsätter att utvecklas snabbt, vilket ökar genomströmningen och minskar sannolikheten för fel. MGI Tech Co., Ltd. (MGI) är ett ledande HTS-varumärke som använder DNBSEQ-teknologi och finns i Center for Translational Microbiome (CTMR). MGI:s sequencers har en hög känslighet och det är viktigt att följa protokollen när proverna hanteras för att undvika introduktion av kontaminering. Detta projekt kommer att utforska tidigare genererade data vid CTMR för att fastställa hur och var i sekvenseringsprocessen kontaminering har introducerats. Data delas in i två huvudkategorier: primärdata, eller verkliga data (RD), och sekundära data, vidare uppdelad i Never Used Barcodes (NUB) och Non-Sequenced (NS). RD:n är sann mot provet, medan NUB och NS anses vara hämtade från bakgrundsbrus. RD, NUB och NS var föremål för taxonomiska analyser, på släkt- och artnivå, och streckkodsanalyser med hjälp av RStudio-gränssnittet för att identifiera och kontrastera de vanligaste i varje kategori. Dessutom var RD också föremål för dekontamineringsanalys på två databaser, VaMyGyn och KOLBIBAKT. Dekontaminering används för att identifiera förorenande arter i ett samhälle. Efter analysen fanns det inga starka bevis som tydde på laboratoriekontamination eller kontaminerade reagenser. Några av dessa NUB delade subsekvenser med RD barcodes, där antal reads för varje par var korrelerade mellan prover. Det kan vara en indikation på att RD barcoded med sekvenseringsfel blir inkorrekt tolkade som NUB. En djupare analys skulle krävas för att bekräfta det.CTMR är numera medveten om att kontaminering från laboratoriet, reagenser eller manipulation inte är orsaken till hämtning av bakgrundsljud. / High-throughput sequencing (HTS) technologies keep developing rapidly, increasing throughput and lowering probabilities of errors. MGI Tech Co., Ltd. (MGI) is a leading HTS brand that uses DNBSEQ technology and is present in the Centre for Translational Microbiome (CTMR). MGI’s sequencers have a high sensitivity and it is critical to follow the protocols when the samples are being handled to avoid introduction of contamination. This project will explore the previously generated data at CTMR to determine how and where in the sequencing process contamination has been introduced. Data is divided into two main categories: the primary data, or real data (RD), and secondary data, further divided into Never Used Barcodes (NUB) and Non-Sequenced (NS). The RD is true to the sample, while NUB and NS are considered background noise retrieved. The RD, NUB, and NS were subject to taxonomic analyses, at genus and species level, and barcode analyses using the RStudio interface to identify and contrast the most frequent in each category. Moreover, RD was also subject to decontam analysis on two databases, VaMyGyn and KOLBIBAKT. Decontam is used for the identification of contaminant species in a community. After the analysis, there was no strong evidence suggesting lab contamination or contaminated reagents. Some of the barcodes from NUB shared substrings with RD barcodes for which the amount of reads were correlated across samples. This may indicate that RD barcodes with sequencing errors are falsely identified as NUB, however, more analyses are needed to verify this. CTMR is now aware that contamination from the lab, reagents, or manipulation are not the causes for the background noise retrieval.

Typ 2-cytokiner, IL-4 och IL-13 är kända för att spela en viktig roll i airway hyperresponsiveness (AHR) eller luftvägshyperreaktivitet, där de glatta muskelcellerna (ASM) drar ihop sig för lätt och för mycket som svar på direkta eller indirekta stimuli. Detta gör AHR till en avgörande egenskap hos astmatiker. Det har gjorts studier som har visat involvering av typ 2-cytokiner i AHR, men deras specifika inflammatoriska mekanismer är ännu outforskade. Denna experimentella studie på glatta muskelceller från luftvägarna (ASM) syftade till att undersöka involveringen av typ 2-cytokin inducerad kontraktilitet genom att fokusera på receptoraktivering, receptoruttryck samt ge insikter om frisättning av proteiner relaterade till luftvägsfibros, så kallad remodelling. Dessutom studerar den också effekten av IL- 4/IL-13 receptor antagonisten Dupilumab (anti-IL4Ra) på cytokinbehandlade HASM. Efter stimulering av HASM med IL-13 under 24 timmar visade resultaten att IL-13 orsakar en ospecifik, icke-receptormedierad ökning av intracellulärt kalciumflöde som svar på kalciumjonoforen A23187. Detta skulle potentiellt kunna öka kontraktiliteten hos glatta muskelceller som svar på flera olika kontraktila stimuli. Denna forskning ger också preliminära resultat som tyder på att IL-13 och IL-4 också ökar kalciumflödet som svar på aktivering av receptorer för specifika kontraktila mediatorer (Histamin, Carbachol, Leukotriene D4 och Substance P), och att effekten förmedlas via IL-4/IL-13-receptorn vilket blockeras med dupilumab som verkade minska effekten. Närvaron av fler receptorer för kontraktila mediatorer kan också öka kontraktiliteten hos glatta muskelceller som svar på IL-4 och IL-13. Återigen sågs ökat uttryck av receptorer för kontraktila stimuli efter behandling med cytokinerna som inhiberades av dupilumab. Dessutom undersökte vi effekten av IL-13 och IL-4 på frisättning av prokollagen 1 (en prekursor för mogna kollagena former) från mänskliga glatta muskelceller i luftvägarna. Våra resultat visade inte några signifikanta effekter på frisättningen av just detta kollagenprotein. Sammantaget visar vi att typ 2 cytokiner kan på flera olika sätt öka kontraktiliteten av glatta muskelceller vilket ökar vår kunskap om mekanismerna som orsakar luftvägshyperreaktivitet hos astmatiker. / Type 2 cytokines, IL-4 and IL-13 are known to play an essential role in airway hyperresponsiveness (AHR) - in response to direct or indirect stimulus the smooth muscle cells (ASM) contract too easily and too heavily. This makes AHR a defining feature of asthma. There have been studies that have demonstrated involvement of type 2 cytokines in AHR. However, the specific mechanisms involved remain undefined. This experimental study in airway smooth muscle (ASM) was aimed to investigate the involvement of type 2 cytokine on AHR by focusing on the expression and activation of receptors for contractile mediators as well as provide insights on the release of proteins related to airway remodelling. Experiments were performed where human airway smooth muscle cells were treated with IL-4 and/or IL-13, with or without Dupilumab, an antagonist of the joint IL-4/IL-13 receptor (anti-IL4Ra). After stimulating HASMs with IL-13 for 24 hours, results showed that IL-13 caused a non-specific, non-receptor-mediated increase in intracellular calcium flux in response to the calcium ionophore A23187. This could potentially increase the contractility of smooth muscle cells in response to any contractile stimulus. This study also suggests that IL-13 and IL-4 increased calcium flux in response to activation of receptors for specific contractile mediators (Histamine, Carbachol, Leukotriene D4 and Substance P). The mechanism involved likely involves the common IL-4/IL-13 receptor as blocking this with dupilumab seemed to reduce the effect. The presence of more receptors for contractile mediators could also increase contractility of smooth muscle cells in response to IL-4 and IL-13. Preliminary results show that mRNA expression of receptors for Histamine (H1) and LTD4 (CYSLT1) were upregulated by type 2 cytokines and again, this upregulation appeared to be inhibited by dupilumab. Moreover, we examined the effect of IL-13 and IL-4 on release of procollagen 1 (a precursor of mature collagen forms) from human airway smooth muscle cells. Our results did not show any significant effects on the release of this particular collagen protein. Taken together these findings increase our understanding of the mechanisms whereby type 2 cytokines may increase the contractility of airway smooth muscle and provide a basis for follow-up investigations. Improved knowledge of the mechanisms underlying AHR could ultimately lead to improved treatment of asthma.

Syftet med detta projekt var att undersöka hur vanligt använda cancerläkemedel påverkar mRNA-uttryck och kromatinorganisation i humana erytroleukemiceller. Som modell användes K562-celler från en patient i blastocystkris (2), för att utvärdera leukemicellernas svar på cancerläkemedel vinblastin och doxorubicin. Vinblastin och doxorubicin valdes på grund av deras distinkta mekanismer i cancercellen: medan doxorubicin interkaleras i DNA, hämmar topoisomeras II-aktivitet vilket orsakar celldöd, riktar vinblastin sig mot mikrotubuli för att stoppa mitotisk delning och proliferation. Uttryck av mRNA undersöktes i celler vid 0-timmar, 6-timmar och 24-timmar drogbehandling, samt efter en veckas återhämtning från 24-timmars drogbehandling. Kromatintillgänglighet med ATAC-seq undersöktes i K562-celler vid 0- timmar, 1-timmar, 6-timmar, 24-timmar och 24-timmar + en veckas återhämtning. Därefter utfördes DNA (ATAC-seq) och RNA (mRNA-seq) extraktion och biblioteksberedning på tre biologiska replikat, och öppna DNA-regioner samt mRNA expression undersöktes via sekvensering. Resultaten visade en stark korrelation mellan de biologiska replikaten, vilket indikerar att resultaten var upprepbara. Differentiellt uttryck av mRNA vid doxorubicin- och vinblastinbehandlingar utfördes genom att jämföra mRNA-nivåerna i läkemedelsbehandlade prover med obehandlade (0-timmar). Uppreglerade och nedreglerade gener identifierades och MA-grafer genererades för att visuellt analysera de differentiellt uttryckta generna vid olika tidpunkter efter läkemedelsbehandling och en veckas återhämtning. För att hitta anrikningar av funktionella genkategorier bland de läkemedelsinducerade eller -undertryckta generna, utfördes genontologianalyser. Slutligen användes verktyget Integrative Genomics Viewer (IGV) för att visuellt utforska mRNA-nivåerna och deras differentiella uttrycksmönster under läkemedelsbehandlingar. För ATAC-seq utfördes inte detaljerad dataanalys på grund av tidsbegränsning, men genomets öppenhet undersöktes visuellt genom IGV. Sammantaget inducerade doxorubicinbehandling en långsamt men långvarig förändring av genuttrycket, vilket involverade flera olika biologiska processer. Doxorubicinbehandlade K562-celler ändrade genuttryck att stöda kemoresistens snarare än att inducera apoptos eller celldöd. Behandlingen hade en långvarig inverkan på mRNA-nivåer som sträckte över återhämtningsveckan. Den totala uttrycksförändringen i återhämtningsproverna var förknippad med återhämtning av tumörigena egenskaper och återställning av mekanismener som stöder cellernas tillväxt. Vinblastine förorsakade snabb ökning av mRNA involverade i cytoskelettet. Vid 24-timmars vinblastinbehandling upplevde tumörcellerna stress på grund av grovt elongerad struktur, och de inducerade gener som stöder tumörbildning. En ökning av totala mRNA-nivåer detekterades i vinblastinbehandlade K562-leukemiceller, vilket var särskilt tydligt under återhämtningen. Resultaten visade att cellerna som överlevde vinblastinbehandling fokuserade på att återställa sin strukturella form. Sammantaget visade resultaten att monoterapi inte fungerar effektivt mot leukemiceller eftersom K562-leukemiceller inte bara överlevde läkemedelsbehandlingarna utan också inducerade mRNA som är involverade i resistens mot läkemedelsbehandlingar. / The primary objective of this project is to investigate how commonly used cancer drugs affect mRNA expression and chromatin organization in human erythroleukemia cells. As a model, K562 cells derived from a patient in blastocyst crisis (2) were utilized, evaluating the leukemia cells’ cellular responses to cancer medicines vinblastine and doxorubicin. Vinblastine and doxorubicin were chosen due to the distinct pathways they target in the cell: while doxorubicin intercalates into DNA and inhibits topoisomerase II activity, which eventually cause cell death, vinblastine targets microtubules to stops mitotic division and excessive proliferation. Expression of mRNA was investigated in cells harvested at 0h, 6h, 24h and 24h + one week recovery. Chromatin accessibility with ATAC-seq was investigated in K562 cells harvested at 0h, 1h, 6h, 24h and 24h + one week recovery. Then DNA (ATAC-seq) and RNA (mRNA-seq) extraction and library preparation were performed on three replicates, and the genome-wide results was investigated via sequencing. The results showed a strong correlation between the biological replicates, indicating that the experimental conditions were sustained in these biological variables. Differential Expression of mRNA upon doxorubicin and vinblastine treatments was performed by comparing the mRNA levels in drug-treated samples to non-treated (0h) upregulated and down regulated genes were identified and MA plots generated to visually analyze the differentially expressed genes at different time points after drug treatment and one week recovery. To find enrichments of functional gene categories among the drug-induced or -repressed genes, gene ontology analyses were performed. Finally, the Integrative genomics viewer (IGV) tool was used to visually explore the mRNA levels and their differential expression pattern during drug treatments. For ATAC-seq, detailed data analysis was not performed due to limitation of time, and data was only visually explored through IGV. Taken together, doxorubicin treatment showed slow initial response within 6h followed by an extensive change in gene expression in 24h, involving several different biological processes. The response was more inclined towards chemoresistance rather than inducing apoptosis or cell death. There was a sustained increase in mRNA levels of doxorubicin treated leukemia cells during recovery week. The overall expression change in the recovery samples was majorly linked with not only gaining back the tumourigenic properties and restoring the mechanism which were affected by doxorubicin action but, based on changes in mRNA expression, it looks like doxorubicin treatment made the tumour cells more aggressive. The initial, 6h, response to vinblastine increases mRNAs involved in cytoskeleton. Upon 24h vinblastine treatment the tumour cells experienced stress due to shear force and structural deformity, and they induced genes supporting tumourigenesis. An increase in total mRNA levels was detected in vinblastine-treated K562 leukemia cells, which was particularly evident during recovery. The results indicated that the cells that survived vinblastine treatment focused on recovering its structural form. Overall, the results indicated that monotherapy does not effectively work against leukemia cells as K562 leukemia cells not only survived the drug treatments but also induced mRNAs involved in resistance against drug treatment.

Värmechockprotein 90 kDa (HSP90) bildar ett anmärkningsvärt komplicerat nätverk med en mängd olika cochaperones. Komplexet av FK506-bindande protein 51 kDa (FKBP51) och HSP90 förmedlar proteinveckning och funktion, främjar tau aggregation vid Alzheimers sjukdom och påverkar stressrelaterade störningar, fetma, typ två-diabetes, etc. I samarbete med den molekylära chaperonen HSP90, FKBP51 har nyligen föreslagits som ett lovande terapeutiskt mål för Alzheimers sjukdom (AD). Således skapades knock-in-musen med punktmutationer i tetratricopeptide repeat (TPR) domänen av FKBP51, vilket gör den oförmögen att interagera med HSP90, för att undersöka de potentiella terapeutiska målen för behandling av dessa sjukdomar. Glukokortikoidreceptorn (GR) fungerade traditionellt som utgångspunkten för de initiala studierna av FKBP51-funktion och mekanism som kan stimuleras av den syntetiska glukokortikoiden dexametason (Dexa). Det primära målet med projektet är att förstå den biologiska betydelsen av FKBP51-HSP90 interaktioner. Det är oklart hur FKBP51-mutation påverkar protein-protein-interaktionen och glukokortikoidsignalering. Här analyserades embryonala fibroblaster (MEF) isolerade från vildtyp och FKBP51 mutant mus med avseende på proteinlokalisering, proteinuttryck och genuttryck. Även om ingen säker skillnad mellan vildtyp och mutantmöss sågs i Dexa-medierad glukokortikoidsignalering, förekommer de posttranslationella modifieringarna (PTM) vid exponering för Dexa-behandling av FKBP51 i vildtypmöss i en signifikant högre utsträckning än i Fkbp51mute-möss.Fosforyleringsmodifieringen av FKBP51 antogs initialt och bekräftades av fosforyleringsanrikningsstrategier. Bekräftelse har dock ännu inte erhållits. / Heat shock protein 90 kDa (HSP90) forms a remarkably complicated network with a variety of cochaperones. The complex of FK506-binding protein 51 kDa (FKBP51) and HSP90 mediates protein folding and function, promoting tau aggregation in Alzheimer's disease and influencing stress-related disorders, obesity, type two diabetes, etc. In collaboration with the molecular chaperone HSP90, FKBP51 has recently been proposed as a promising therapeutic target for Alzheimer's disease (AD). Thus, the knock-in mouse harboring point mutations in the tetratricopeptide repeat (TPR) domain of FKBP51 rendering it unable to interact with HSP90 were created to investigate the potential therapeutic targets for the treatment of these diseases. Glucocorticoid receptor (GR) traditionally served as the starting point for the initial studies of FKBP51 function and mechanism which can be stimulated by the synthetic glucocorticoid, dexamethasone (Dexa). The primary goal of the project is to comprehend the biological significance of FKBP51-HSP90 interactions. It is unclear how FKBP51 mutation affects the protein-protein interaction and glucocorticoid signaling. Here, embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from wildtype and FKBP51 mutant mouse were analyzed with respect to protein localization, protein expression, and gene expression. Although no certain difference between wildtype and mutant mice was seen in Dexa-mediated glucocorticoid signaling, the post-translational modifications (PTMs) in exposure to Dexa treatment of FKBP51 occur in wildtype mice to a significantly higher extent than in Fkbp51mute mice. The phosphorylation modification of FKBP51 was initially hypothesized and confirmed by phosphorylation enrichment strategies. However, confirmation has not yet been obtained.

Under senare år har målinriktad terapi varit ett växande område inom cancerterapi som en mer målinriktad behandling än kemoterapi. Dessa behandlingar baseras främst på antikroppsbaserade läkemedel som är ganska stora och komplexa, vilket ökar den totala kostnaden för behandlingen. Därför måste man hitta en alternativ metod för både upptäckt och behandling för att hjälpa patienterna. Små affinitetsdomäner har skapats med målet att förbättra vävnadspenetrationen och samtidigt upprätthålla en hög grad av målspecificitet, vilket leder till färre biverkningar. Ett av exemplen på detta är Albumin Binding Domain-Derived Affinity Protein (ADAPT). Det har baserats på en av de albuminbindande domänerna (ABD) i streptokockproteinet G, med en storlek på 6,5 kDa. Nyligen modifierades ADAPT ytterligare för att samtidigt binda albumin och ett annat relevant målprotein av intresse, vilket tyder på en längre halveringstid i patientserum och möjliggör utveckling av nyare och terapeutiska läkemedel. I detta projekt presenteras den fjärde generationen av ADAPT-biblioteket som utformats för att ha förbättrad stabilitet. Selektioner med fagdisplay utfördes mot tre målproteiner: carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5), en biomarkör för kolorektalcancer, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), en markör för flera gastrointestinala karcinom och trophoblast cell-surface antigen 2 (Trop2) som är överuttryckt i trippel-negativ bröstcancer. Resultaten visar bindning till CEACAM5, EpCAM och Trop2, vilket har visats med monoklonal fag-ELISA. Bindningsaffiniteten, sekundärstrukturen hos de utvalda bindarna och den bispecifika bindningen till serumalbumin återstår att utvärdera ytterligare. Projektet visar således att de ADAPTs som valts ut mot målen CEACAM5, EpCAM och Trop2 har en enorm potential för framtida kliniska tillämpningar som syftar till utveckling av diagnostik och terapi för dessa cancerbiomarkörer. / In recent years, targeted therapy has been a growing field of cancer therapy as a more targeted treatment than chemotherapy. These treatments are primarily based on antibody-based pharmaceuticals which are quite large and complex, increasing the overall cost of the treatment. Thus, an alternative method of both detection and treatment needs to be found to aid patients. Small affinity domains have been created with the goal of enhancing tissue penetration while maintaining a high level of target specificity, leading to fewer side effects. One of the examples for these is the Albumin Binding Domain-Derived Affinity Protein (ADAPT). It has been based on one of the albumin binding domains (ABD) of the streptococcal protein G, with a size of 6.5 kDa. Recently, the ADAPTs were further modified to simultaneously bind albumin and another pertinent target protein of interest, suggesting a longer half-life in patient serum, and enabling the development of newer therapeutics. This project presents the 4th generation of the ADAPT library designed to have improved stability. Phage display selections were performed against three target proteins: carcinoembryonic antigen- related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5), a biomarker for colorectal cancer, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), a marker for several gastrointestinal carcinomas and trophoblast cell-surface antigen 2 (Trop2) which is overexpressed in triple-negative breast cancer. The results demonstrate binding towards CEACAM5, EpCAM and Trop2, which has been shown by monoclonal phage ELISA. The binding affinity, secondary structure of the selected binders and bispecific binding towards serum albumin remain to be further assessed. The project thus reveals that the ADAPTs selected against the targets CEACAM5, EpCAM and Trop2 present a massive potential for future clinical applications aimed towards development of diagnostics and therapeutics for these cancer biomarkers.