Orientador: Renato Wendhausen Jr. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Muitas naftoquinonas como o lapachol, podem ser encontradas em plantas da família Bignoniaceae e são conhecidas por desempenharem diversas atividades biológicas, acompanhadas, entretanto, por efeitos indesejáveis. A atividade citotóxica apresentada pelas naftoquinonas está relacionada ao aparecimento de espécies reativas de oxigênio in vivo que causam severo estresse oxidativo no interior das células. O isolapachol e a atovaquona são análogos estruturais do lapachol, sendo que a atovaquona é comercializada como fármaco para o tratamento de malária e certos tipos de pneumonia. Devido ao grande potencial biológico apresentado pelas naftoquinonas, várias tentativas no sentido de obtenção de derivados desprovidos de efeitos colaterais vêm sendo realizadas. Além disso, a determinação da segurança e eficácia dos fármacos está intimamente ligada ao estudo da formação de derivados in vivo por ocasião do metabolismo. A utilização de fungos filamentosos na predição do metabolismo que os fármacos sofreriam após administração oral, bem como de bactérias do trato gastrointestinal, pode contribuir substancialmente para a elucidação da rota metabólica de fármacos fornecendo informações sobre a geração de substâncias farmacologicamente ativas, inativas ou tóxicas e ainda sobre a produção de substâncias capazes de inibir a biotransformação de outros fármacos. Estudos de biotransformação também podem contribuir para a obtenção de novos esqueletos químicos. Dessa forma, o presente trabalho relata estudos do metabolismo microbiano do lapachol e do seu sal de potássio por bactérias do trato gastrointestinal e fungos filamentosos, além da correlação desses com as reações que ocorrem quando o isolapachol e a atovaquona são utilizados como substratos para os mesmos micro-organismos. Os experimentos de biotransformação utilizando lapachol e seu sal de potássio foram conduzidos por até dez dias, em diferentes meios de cultura, empregando-se quatro linhagens de bactérias presentes no trato gastrointestinal, além de 11 linhagens de fungos filamentosos. Foram obtidos sete metabólitos, sendo dois inéditos e dois anteriormente detectados em estudos sobre o metabolismo do lapachol em mamíferos. Durante a realização dos experimentos com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis verificou-se a capacidade desse fungo em mimetizar uma reação muito importante em química orgânica, conhecida como oxidação de Hooker. As condições mais promissoras para a biotransformação do lapachol foram utilizadas nos estudos com a atovaquona e o isolapachol. A biotransformação da atovaquona possibilitou, pela primeira vez, a caracterização estrutural de um metabólito desse fármaco. Já os estudos realizados com o isolapachol permitiram inferências sobre a especificidade enzimática apresentada pelos micro-organismos avaliados. Todos os metabólitos obtidos foram submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a linhagens celulares normais e tumorais, o que possibilitou obter conclusões sobre a relação estrutura-atividade e sobre a citotoxicidade seletiva apresentada pelos metabólitos. Destaca-se o resultado obtido com um dos metabólitos do lapachol, ?-xiloidona, o qual se mostrou mais tóxico para a linhagem tumoral que o lapachol e não apresentou toxicidade frente à linhagem normal. O metabólito obtido a partir da biotransformação da atovaquona apresentou maior toxicidade não seletiva que a substância de partida. / Several naphthoquinones, as lapachol, can be found in the Bignoniaceae family and they present several biological activities with some unwanted effects. The cytotoxic activity displayed by naphthoquinones is correlated to the presence of reactive oxygen species, which are formed in vivo and cause severe oxidative stress within cells. Isolapachol and atovaquone are structural analogs of lapachol, and atovaquone is in the market as a drug for the treatment of malaria and some types of pneumonia. Because of the great biological potential presented by naphthoquinones, several studies have been carried out to obtain derivatives without side effects. Furthermore, the drug safety and efficacy are closely related to the study of the formation of in vivo derivatives during metabolism. The filamentous fungi and the bacteria from the gastrointestinal tract can be used in the prediction of drug metabolism after oral administration, which is an interesting tool to elucidation of the metabolic pathway of drugs, providing information on the generation of pharmacologically active, inactive or toxic substances and still on the production of compounds able to inhibit the biotransformation of other drugs. Biotransformation studies can also contribute to the obtention of new chemical skeletons (hits). Thus, the present work reports the study about the microbial metabolism of lapachol and its potassium salt by filamentous fungi and bacteria from the gastrointestinal tract, beyond the correlation of the reactions that occur when the isolapachol and atovaquone are used as substrates for the same microorganisms. The biotransformations of lapachol and its potassium salt were evaluated for up to ten days, in different culture media, catalyzed by four bacteria from the gastrointestinal tract and 11 filamentous fungi strains. Seven metabolites were obtained, from which two are new and two were previously detected in the mammals metabolism of lapachol. The filamentous fungus Aspergillus brasiliensis showed to be capable of mimicking the Hooker oxidation, an important organic chemistry reaction. The best conditions for the lapachol biotransformation have been used in the studies with isolapachol and atovaquone. The atovaquone biotransformation provided, for the first time, the structural characterization of a metabolite from this drug. The studies with isolapachol allowed inferences about the enzyme specificity shown by the evaluated microorganisms. All obtained metabolites were submitted to cytotoxicity assays against human cancer and tumoral cell lines. Several conclusions about the structure activity relationship and about the selective cytotoxicity showed by the metabolites were taken. It should be highlighted the obtained result with a lapachol metabolite, ?-xyloidone, which showed to be more toxic than lapachol against tumoral cell line and did not show cytotoxicity to normal cell line. The atovaquone metabolite displayed higher toxicity than pattern structure, and this activity was not selective.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-10-13T04:00:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334829.pdf: 1141175 bytes, checksum: 790483c51ee9852c13a77edb288beefe (MD5) Previous issue date: 2014 / Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) estão entre os principais contaminantes nos ambientes aquáticos. Dentre os HPAs, o fenantreno é um dos mais abundantes nos ambientes marinhos. Além dos danos causados ao ecossistema, a bioacumulação deste xenobiótico pelos animais pode alterar sua homeostase, através da indução de várias respostas para sua eliminação. Entre estas, está a indução de genes que codificam proteínas envolvidas com a biotransformação, defesas antioxidantes e apoptose. Mecanismos de defesas contra xenobióticos são amplamente estudados em animais vertebrados principalmente mamíferos, no entanto em invertebrados ainda existem poucas informações, comparativamente. A compreensão dos mecanismos moleculares de defesas desses animais auxiliará na sua utilização como biomarcadores de contaminação ambiental. Para esses estudos são necessários organismos modelos, como a ostra do mangue Crassostrea brasiliana, que se apresenta como um organismo sentinela adequado para avaliação e monitoramento de ambientes contaminados. Este trabalho analisa a transcrição de genes relacionados a vias de biotransformação e de defesa celular contra xenobióticos no manto desta espécie. O xenobiótico utilizado foi o HPA fenantreno, sendo realizada a exposição dos animais em duas concentrações subletais (100 µg.L-1 e 1000 µg.L-1), e três tempos de exposição (1, 5 e 10 dias). Foi observada uma indução na transcrição de genes da biotransformação de fase I (CYP2AU1, CYP2C8-like, CYP17A1-like e CYP3A-like) e genes envolvidos com a apoptose (Caspases 7, 8 e a p53), principalmente nos animais expostos na concentração de 1000 µg.L-1 de fenantreno. Os resultados observados mostram que a exposição desses animais ao fenantreno, desencadeia uma série de respostas transcricionais, evidenciando estratégias de proteção do organismo frente a uma agressão química, de forma semelhante ao que ocorre em mamíferos. Os resultados demonstram ainda que o manto apresenta respostas destes sistemas de transcrição mais tardias em relação à brânquia e a glândula.<br> / Abstract : Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are among the main contaminants in aquatic environments. Among the PAHs phenanthrene is one of the most abundant in marine environments. In addition to the damage to the ecosystem, bioaccumulation of xenobiotic by animals can change its homeostasis, by inducing several defense systems to its elimination. Among these is the induction of genes that encode proteins involved in biotransformation, antioxidant defenses and apoptosis. Defense mechanisms against xenobiotic exposure are widely studied in mammals mainly vertebrates, however in invertebrates there is little information, comparatively. Understanding the molecular mechanisms of defense of these animals will aid in their use as biomarkers of environmental contamination. Model organisms are required to run these studies, such as the mangrove oyster Crassostrea brasiliana, which is a suitable sentinel organism for evaluation and monitoring of contaminated environments. This work analyzes the transcription of genes related to biotransformation pathways and cellular defense against xenobiotics in the mantle of this species. Phenanthrene, a model PAH, was used in the exposure of the animals. Experiments were carried out using two sublethal concentrations (100 and 1000 ?g.L-1), and three exposure times (1, 5 and 10 days). Induction was observed in the transcription of genes Phase I biotransformation (CYP2AU1, CYP2C8-like CYP17A1-like and CYP3A-like), and genes involved in apoptosis (Caspases 7, 8 and p53), especially in animals exposed to the concentration 1000 ?g.L-1 phenanthrene. Our results show that exposure of these animals to phenanthrene, triggers a cascade of transcriptional responses, indicating protection strategies of the organism to a chemical aggression, similarly to what occurs in mammals. The results further demonstrate that the mantle shows later transcriptional responses than the gill and the gland when exposed to this chemical.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T07:17:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 196062.pdf: 1368246 bytes, checksum: 13b6642c2e3a9864ea02a867fa27e9a0 (MD5) / Estudo da capacidade das leveduras Candida oleophila e Candida guilliermondii em biotransformar os substratos ácido ricinoleico e ricinoleato de metila à gamadecalactona. Análise do perfil do comportamento celular e cinético através da determinação da curva de crescimento celular e velocidade máxima específica das leveduras em quatro meios de cultura: YMA (meio fermento-malte-ágar), MBAR (meio de biotransformação com ácido ricinoleico), MSA (meio salino "A") e MSB (meio salino "B"). Monitoramento do pH dos meios utilizados para crescimento celular e biotransformação. Biotransformação nos meios com os substratos ácido ricinoleico e ricinoleato de metila (MBAR e MBRM) para detecção por cromatografia gasosa da presença de gamadecalactona (GDL) utilizando as leveduras Candida oleophila e Candida guilliermondii.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:34Z : No. of bitstreams: 1 000826291_20160226.pdf: 249345 bytes, checksum: 83f89ae928cff063c6487a962a573dfb (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:55Z: 000826291_20160226.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:50Z : No. of bitstreams: 1 000826291.pdf: 818795 bytes, checksum: 47d05f49fd9ee2c1e61968aa35f0ab40 (MD5) / A biocatálise consiste no uso de enzimas (microbianas, vegetais ou animais) para catalisar transformações químicas, principalmente em compostos orgânicos. Em geral, as reações enzimáticas apresentam muitos atrativos quando comparadas às respectivas versões químicas clássicas, por utilizarem catalisadores potencialmente quimio-, regio- e estereosseletivos, biodegradáveis, oriundos de fontes renováveis que requerem condições brandas de reação (pH, temperatura e pressão) e solventes ambientalmente amigáveis (água, fluidos supercríticos, líquidos iônicos). Por isso, e associado às pressões de cunho sócio-econômico-ambiental sofridas pelas indústrias para a utilização de processos sustentáveis e mais eficientes, a busca por novos biocatalisadores tem aumentado consideravelmente. As enzimas envolvidas na conversão de nitrilas estão entre as mais utilizadas industrialmente. Além de seu valor sintético, estas enzimas exercem um papel fundamental em termos de proteção ambiental, pois têm sido empregadas com sucesso na biodegradação e biorremediação de áreas contaminadas com organonitrilas de origem antropogênica. Assim, neste trabalho realizou-se a prospecção de micro-organismos da biodiversidade brasileira quanto à presença de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrilas, mais especificamente nitrilases (Nase), nitrila-hidratases (NHase), amidases e as hidroxinitrila liases (HNLase) através de ensaios colorimétricos. Nesse estudo foram encontrados 1 hit positivo para nitrila-hidratase/amidase, 8 para nitrilases e 3 micro-organismos com sistema enzimático indefinido dentre 29 micro-organismos analisados. Para a enzima hidroxinitrila liase, foram avaliados 76 micro-organismos e foram encontrados 27 hits positivos. Estes resultados foram confirmados por técnicas cromatográficas e espectrométricas. Os micro-organismos positivos das triagens colorimétricas foram... / Biocatalysis is the use of enzymes (microbial, plant or animal) to catalyze chemical transformations, primarily of organic compounds. Generally, enzymatic reactions are much more attractive than the classical chemical alternatives, as they use catalysts that are potentially chemo-, region- and stereoselective, biodegradable, which come from renewable sources and that require mild reaction conditions in terms of pH, temperature and pressure and the use of environmentally friendly solvents (water, supercritical fluids, ionic liquids). Therefore and associated to the socioeconomic and environmental pressures exerted on industries to use sustainable and more efficient processes, the search for new biocatalysts has increased considerably. Nitriles converting enzymes are among the most widely ones used industrially. In addition to their synthetic value, these enzymes play a key role in protecting the environmental as they have been successfully used in the biodegradation and bioremediation of areas contaminated by man-made organic nitriles. Thus, herein we intend to investigate microorganisms from Brazilian biodiversity in terms of enzymes involved in the metabolism of nitriles, more specifically nitrilases (Nase), nitrile hydratase (NHase), amidases and hydroxynitrile lyase (HNLase) through colorimetric assays. It was found 1 positive hit for nitrile hydratase/amidase, 8 for nitrilases and 3 microorganisms with undefined enzymatic system within the 29 evaluated microorganisms. Regarding the enzyme hydroxinitrile lyase, 76 microorganisms were evaluated and 27 positive hits were found. Those colorimetric assays were confirmed through chromatographic and spectrometrically techniques. The positive hits found in the colorimetric assay were applied in the study of biodegradation of Totril® herbicide. These reactions were monitored by HPLC-MS/MS and there were found 5 biodegradation products...

Orientador: Cíntia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: André Luis Meleiro Porto / Resumo: A biocatálise consiste no uso de enzimas (microbianas, vegetais ou animais) para catalisar transformações químicas, principalmente em compostos orgânicos. Em geral, as reações enzimáticas apresentam muitos atrativos quando comparadas às respectivas versões químicas clássicas, por utilizarem catalisadores potencialmente quimio-, regio- e estereosseletivos, biodegradáveis, oriundos de fontes renováveis que requerem condições brandas de reação (pH, temperatura e pressão) e solventes ambientalmente amigáveis (água, fluidos supercríticos, líquidos iônicos). Por isso, e associado às pressões de cunho sócio-econômico-ambiental sofridas pelas indústrias para a utilização de processos sustentáveis e mais eficientes, a busca por novos biocatalisadores tem aumentado consideravelmente. As enzimas envolvidas na conversão de nitrilas estão entre as mais utilizadas industrialmente. Além de seu valor sintético, estas enzimas exercem um papel fundamental em termos de proteção ambiental, pois têm sido empregadas com sucesso na biodegradação e biorremediação de áreas contaminadas com organonitrilas de origem antropogênica. Assim, neste trabalho realizou-se a prospecção de micro-organismos da biodiversidade brasileira quanto à presença de enzimas envolvidas no metabolismo de nitrilas, mais especificamente nitrilases (Nase), nitrila-hidratases (NHase), amidases e as hidroxinitrila liases (HNLase) através de ensaios colorimétricos. Nesse estudo foram encontrados 1 hit positivo para nitrila-hidratase/amidase, 8 para nitrilases e 3 micro-organismos com sistema enzimático indefinido dentre 29 micro-organismos analisados. Para a enzima hidroxinitrila liase, foram avaliados 76 micro-organismos e foram encontrados 27 hits positivos. Estes resultados foram confirmados por técnicas cromatográficas e espectrométricas. Os micro-organismos positivos das triagens colorimétricas foram... / Abstract: Biocatalysis is the use of enzymes (microbial, plant or animal) to catalyze chemical transformations, primarily of organic compounds. Generally, enzymatic reactions are much more attractive than the classical chemical alternatives, as they use catalysts that are potentially chemo-, region- and stereoselective, biodegradable, which come from renewable sources and that require mild reaction conditions in terms of pH, temperature and pressure and the use of environmentally friendly solvents (water, supercritical fluids, ionic liquids). Therefore and associated to the socioeconomic and environmental pressures exerted on industries to use sustainable and more efficient processes, the search for new biocatalysts has increased considerably. Nitriles converting enzymes are among the most widely ones used industrially. In addition to their synthetic value, these enzymes play a key role in protecting the environmental as they have been successfully used in the biodegradation and bioremediation of areas contaminated by man-made organic nitriles. Thus, herein we intend to investigate microorganisms from Brazilian biodiversity in terms of enzymes involved in the metabolism of nitriles, more specifically nitrilases (Nase), nitrile hydratase (NHase), amidases and hydroxynitrile lyase (HNLase) through colorimetric assays. It was found 1 positive hit for nitrile hydratase/amidase, 8 for nitrilases and 3 microorganisms with undefined enzymatic system within the 29 evaluated microorganisms. Regarding the enzyme hydroxinitrile lyase, 76 microorganisms were evaluated and 27 positive hits were found. Those colorimetric assays were confirmed through chromatographic and spectrometrically techniques. The positive hits found in the colorimetric assay were applied in the study of biodegradation of Totril® herbicide. These reactions were monitored by HPLC-MS/MS and there were found 5 biodegradation products... / Mestre

Os pesticidas organofosforados são amplamente utilizados na agricultura, pois são muito eficazes no controle de pragas, promovendo um aumento na produtividade dos alimentos. Contudo, sua utilização indiscriminada provoca graves problemas ambientais e para a saúde humana, uma vez que são tóxicos também para as espécies que não são alvos e acumulam grandes quantidades de metabólitos tóxicos, como por exemplo, fenois. Os compostos fenólicos enquadram-se nos resíduos resultantes da degradação de compostos naturais e xenobióticos da atividade antrópica. Este trabalho teve por objetivo estudar as reações de conjugação de fase II em compostos fenólicos derivados da hidrólise de pesticidas organosfosforados (clorpirifós, metil paration e profenofós) e a biotransformação de outros fenois por enzimas provenientes de fungos de ambiente marinho. Primeiramente foi realizado um screening com os fungos de ambiente marinho Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 1241, Penicillium decaturense CBMAI 1234, P. raistrickii CBMAI 931, P. raistrickii CBMAI 1235 e Trichoderma sp. CBMAI 932 para avaliar a resistência destes microrganismos frente à toxicidade dos pesticidas organofosforados para posterior escolha da cepa mais resistente e melhor adaptada aos pesticidas testados nesse trabalho. O fungo selecionado para as reações em meio líquido de malte 2%, que melhor adaptou-se na presença dos pesticidas testados foi a cepa do fungo A. sydowii CBMAI 935. Foram realizadas curvas analíticas com o objetivo de estimar a extensão da biodegradação dos pesticidas clorpirifós, metil paration, profenofós e seus respectivos produtos de hidrólise, os fenois 3,5,6-tricloro-2-piridinol, 4-nitrofenol e 4-bromo-2-clorofenol, respectivamente. As reações de biotransformação em meio líquido de malte 2% foram avaliadas com 10, 20, 30 d de reação com concentração inicial dos pesticidas organofosforados de 50 mg.L-1. Todos os metabólitos encontrados nas reações de biotransformação dos pesticidas organofosforados com o fungo A. sydowii CBMAI 935 foram comparados com os seus padrões analíticos e sintéticos (metilação) com o objetivo de corroborar as reações de bioconjugação. Através deste estudo foi possível sugerir a presença de enzimas fosfotriesterases e enzimas metiltransferases provenientes do fungo A. sydowii CBMAI 935. Enzimas que promoveram a hidrólise e metilação dos pesticidas e compostos fenólicos testados nesse trabalho. Segundo a literatura, as reações de biotransforrmação e bioconjugação dos pesticidas orgafosforados, diminuem consideravelmente a toxicidade desses compostos recalcitrantes. / Organophosphate pesticides are widely used in agriculture, as they are very effective in pest control, promoting an increase in productivity of food. However, indiscriminate use causes serious problems environmental and for human health, since they are also toxic to non-target species and accumulate large amounts of toxic metabolites, such as phenols. Phenolic compounds are part of the waste resulting from the degradation of natural compounds and xenobiotics of human activity. This work aimed to study the phase II conjugation reactions in phenolic compounds derived from hydrolysis of pesticides organophosphates (chlorpyrifos, methyl parathion and profenofos) and the biotransformation of other phenols for enzymes from marine environment fungi. First was conducted a screening with the marine environment fungi. Aspergillus sydowii CBMAI 934, A. sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 1241, Penicillium decaturense CBMAI 1234, P. raistrickii CBMAI 931, P. raistrickii CBMAI 1235 and Trichoderma sp. CBMAI 932 to evaluate the resistance of these microorganisms front the toxicity of organophosphate pesticides to later choose the most resistant strain and better adapted to pesticides tested in this work. The fungus selected to the reactions in liquid medium 2% malt, which best adapted in the presence of the pesticide tested was the fungal strain of A. sydowii CBMAI 935. Standard curves were performed in order to estimate the extent of biodegradation of pesticides chlorpyrifos, methyl parathion, profenofos and their hydrolysis products, phenols 3,5,6-trichloro-2-pyridinol, 4-nitrophenol and 4-bromo- 2-chlorophenol, respectively. The biotransformation reactions in liquid medium 2% malt were evaluated in 10, 20, 30 days reaction of with initial concentration of organophosphate pesticides of 50 mg.L-1. All metabolites found in the biotransformation reactions of organophosphate pesticides with the fungus A. sydowii CBMAI 935 were compared with their synthetic and analytical standards (methylation) in order to corroborate the bioconjugation reactions. Through this study was possible suggest the presence of enzymes phosphotriestesterases and methyltransferases from fungus A. sydowii CBMAI 935. Enzymes that promote hydrolysis and methylation of pesticides and phenolic compounds tested in this work. According to the literature, the reactions of biotransformation and biodegradation of organophosphate pesticides, greatly reduce the toxicity of recalcitrant compounds.

O ácido copálico é um diterpeno de esqueleto do tipo labdano descrito na literatura como um dos diterpenos majoritários e biomarcador do oleorresina das espécies do gênero Copaifera. Este oleorresina é muito utilizado na medicina popular e estudos feitos com oleorresinas de diferentes espécies revelaram várias atividades biológicas. Entretanto, não há informações sobre o metabolismo dos constituintes do oleorresina após absorção no organismo. Assim, neste trabalho foram realizados estudos de biotransformação do ácido copálico com micro-organismos que apresentam potencial para mimetizar reações que ocorrem em humanos e também com alguns microorganismos presentes no trato gastrointestinal humano. O ácido copálico foi obtido de oleorresina de Copaifera disponível no mercado nacional. Devido à complexidade química do oleorresina, houve necessidade de utilizar vários processos cromatográficos visando o isolamento do ácido copálico. Assim, foram utilizadas cromatografia sob pressão reduzida, cromatografia em coluna clássica e cromatografia em coluna clássica utilizando sílica impregnada com nitrato de prata. Partindo-se de 352,0 g de oleorresina foram isolados 1224,5 mg de ácido copálico, o qual foi identificado pelas análises dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono treze. O diterpeno isolado foi submetido à avaliação da atividade antimicrobiana frente aos microorganismos a serem avaliados nos processos de biotransformação, o que possibilitou estabelecer a quantidade máxima de ácido copálico a ser adicionada nas culturas dos diferentes micro-organismos sem causar interferência no desenvolvimento dos mesmos. Os fungos filamentosos Mucor rouxii e Aspergillus brasiliensis, bem como as bactérias do trato gastrointestinal Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Escherichia coli foram utilizados no processo de triagem visando selecionar o micro-organismo mais promissor para os estudos de biotransformação do ácido copálico. Também foram realizados estudos em cultura mista de Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. O processo de biotransformação conduzido com o fungo filamentoso Mucor rouxii evidenciou o potencial deste para biotransformar o ácido copálico. Os extratos obtidos das culturas do fungo Mucor rouxii foram submetidos às análises por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por aerossol carregado e por arranjo de diodos, sendo detectados seis produtos de biotransformação que foram isolados por cromatografia líquida de alta eficiência em escala semi-preparativa. No processo de biotransformação realizado com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis vários produtos foram detectados, mas com baixos rendimentos. Quanto aos estudos de biotransformação realizados com as bactérias, não foram detectados sinais de diterpenos nas culturas de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium sp. isoladas e em cultura mista incubadas com ácido copálico por 24 horas. Nas culturas de Escherichia coli foram detectados sinais do ácido copálico, mas não de produtos de biotransformação. Seis produtos de biotransformação foram isolados da cultura desenvolvida com o fungo Mucor rouxii. Dois destes tiveram suas estruturas químicas elucidadas. Nos dois produtos ocorreram hidroxilações no C-3 e no C-13 e em um dos produtos ocorreu também hidroxilação no C-18. Não há descrição na literatura das estruturas químicas dos produtos elucidados. / Copalic acid is a labdane type diterpene which was reported in the literature as a major constituent and biomarker of the oil resin from Copaifera species. This oil resin has been used in popular medicine and studies carried out with different species showed several biological activities. However, there is no information regarding the metabolism of the constituents after absorption in organism. Therefore, biotransformation studies were carried out using microorganisms that showed potential to mimic reactions that occur in human and also with microorganisms from the gastrointestinal tract. Copalic acid was obtained from Copaifera oil resin available in national market. Due to the chemical complexity, it was necessary to perform different chromatographic procedures in order to isolate copalic acid. Column chromatography, column chromatography under reduced pressure and column chromatography using silica gel impregnated with silver nitrate were performed. Starting from 352.0 g of oil resin, 1224.5 mg of copalic acid were isolated and the chemical structure was determined by analysis of the hydrogen and carbon nuclear magnetic ressonance. The isolated diterpene was submitted to antimicrobial activity evaluation against the microorganisms used in the biotransformation processes which enable to establish the maximum amount of copalic acid to be added into the cultures without causing inhibitory effects. The filamentous fungi Mucor rouxii and Aspergillus brasiliensis, as well as the bacteria Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Escherichia coli from the gastrointestinal tract were screened to select the most promising microorganism for biotransformation studies. In addition, biotransformation processes were carried out using mixed cultures of Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Streptococcus salivarius subesp.thermophilus. The biotransformation process performed by the filamentous fungis Mucor rouxii showed the great potential of this fungus to biotransform copalic acid. The extracts from the cultures of the fungus Mucor rouxii were submitted to high performance liquid chromatography with both charged aerosol and photodiode array detection and six biotransformation products were isolated by using high performance liquid chromatography in semi-preparative mode. Several biotransformation products were detected in the biotransformation process performed by Aspergillus brasiliensis, but with low yield. Regarding the biotransformation processes performed by bacteria, biotransformation products were not detected in the isolated and mixed cultures of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium sp. after 24 hours. Also, only the signals of copalic acid were detected in the cultures of Escherichia coli. Six biotransformation products were isolated from the culture of the fungus Mucor rouxii. The chemical structures of two products were elucidated. Hydroxyl groups were introduced at C-3 and C-13 in both compounds and another hydroxyl group was introduced at C-18 in only one compound. These structures were not reported before.

Muitas naftoquinonas como o lapachol, podem ser encontradas em plantas da família Bignoniaceae e são conhecidas por desempenharem diversas atividades biológicas, acompanhadas, entretanto, por efeitos indesejáveis. A atividade citotóxica apresentada pelas naftoquinonas está relacionada ao aparecimento de espécies reativas de oxigênio in vivo que causam severo estresse oxidativo no interior das células. O isolapachol e a atovaquona são análogos estruturais do lapachol, sendo que a atovaquona é comercializada como fármaco para o tratamento de malária e certos tipos de pneumonia. Devido ao grande potencial biológico apresentado pelas naftoquinonas, várias tentativas no sentido de obtenção de derivados desprovidos de efeitos colaterais vêm sendo realizadas. Além disso, a determinação da segurança e eficácia dos fármacos está intimamente ligada ao estudo da formação de derivados in vivo por ocasião do metabolismo. A utilização de fungos filamentosos na predição do metabolismo que os fármacos sofreriam após administração oral, bem como de bactérias do trato gastrointestinal, pode contribuir substancialmente para a elucidação da rota metabólica de fármacos fornecendo informações sobre a geração de substâncias farmacologicamente ativas, inativas ou tóxicas e ainda sobre a produção de substâncias capazes de inibir a biotransformação de outros fármacos. Estudos de biotransformação também podem contribuir para a obtenção de novos esqueletos químicos. Dessa forma, o presente trabalho relata estudos do metabolismo microbiano do lapachol e do seu sal de potássio por bactérias do trato gastrointestinal e fungos filamentosos, além da correlação desses com as reações que ocorrem quando o isolapachol e a atovaquona são utilizados como substratos para os mesmos micro-organismos. Os experimentos de biotransformação utilizando lapachol e seu sal de potássio foram conduzidos por até dez dias, em diferentes meios de cultura, empregando-se quatro linhagens de bactérias presentes no trato gastrointestinal, além de 11 linhagens de fungos filamentosos. Foram obtidos sete metabólitos, sendo dois inéditos e dois anteriormente detectados em estudos sobre o metabolismo do lapachol em mamíferos. Durante a realização dos experimentos com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis verificou-se a capacidade desse fungo em mimetizar uma reação muito importante em química orgânica, conhecida como oxidação de Hooker. As condições mais promissoras para a biotransformação do lapachol foram utilizadas nos estudos com a atovaquona e o isolapachol. A biotransformação da atovaquona possibilitou, pela primeira vez, a caracterização estrutural de um metabólito desse fármaco. Já os estudos realizados com o isolapachol permitiram inferências sobre a especificidade enzimática apresentada pelos micro-organismos avaliados. Todos os metabólitos obtidos foram submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a linhagens celulares normais e tumorais, o que possibilitou obter conclusões sobre a relação estrutura-atividade e sobre a citotoxicidade seletiva apresentada pelos metabólitos. Destaca-se o resultado obtido com um dos metabólitos do lapachol, ?-xiloidona, o qual se mostrou mais tóxico para a linhagem tumoral que o lapachol e não apresentou toxicidade frente à linhagem normal. O metabólito obtido a partir da biotransformação da atovaquona apresentou maior toxicidade não seletiva que a substância de partida. / Several naphthoquinones, as lapachol, can be found in the Bignoniaceae family and they present several biological activities with some unwanted effects. The cytotoxic activity displayed by naphthoquinones is correlated to the presence of reactive oxygen species, which are formed in vivo and cause severe oxidative stress within cells. Isolapachol and atovaquone are structural analogs of lapachol, and atovaquone is in the market as a drug for the treatment of malaria and some types of pneumonia. Because of the great biological potential presented by naphthoquinones, several studies have been carried out to obtain derivatives without side effects. Furthermore, the drug safety and efficacy are closely related to the study of the formation of in vivo derivatives during metabolism. The filamentous fungi and the bacteria from the gastrointestinal tract can be used in the prediction of drug metabolism after oral administration, which is an interesting tool to elucidation of the metabolic pathway of drugs, providing information on the generation of pharmacologically active, inactive or toxic substances and still on the production of compounds able to inhibit the biotransformation of other drugs. Biotransformation studies can also contribute to the obtention of new chemical skeletons (hits). Thus, the present work reports the study about the microbial metabolism of lapachol and its potassium salt by filamentous fungi and bacteria from the gastrointestinal tract, beyond the correlation of the reactions that occur when the isolapachol and atovaquone are used as substrates for the same microorganisms. The biotransformations of lapachol and its potassium salt were evaluated for up to ten days, in different culture media, catalyzed by four bacteria from the gastrointestinal tract and 11 filamentous fungi strains. Seven metabolites were obtained, from which two are new and two were previously detected in the mammals metabolism of lapachol. The filamentous fungus Aspergillus brasiliensis showed to be capable of mimicking the Hooker oxidation, an important organic chemistry reaction. The best conditions for the lapachol biotransformation have been used in the studies with isolapachol and atovaquone. The atovaquone biotransformation provided, for the first time, the structural characterization of a metabolite from this drug. The studies with isolapachol allowed inferences about the enzyme specificity shown by the evaluated microorganisms. All obtained metabolites were submitted to cytotoxicity assays against human cancer and tumoral cell lines. Several conclusions about the structure activity relationship and about the selective cytotoxicity showed by the metabolites were taken. It should be highlighted the obtained result with a lapachol metabolite, ?-xyloidone, which showed to be more toxic than lapachol against tumoral cell line and did not show cytotoxicity to normal cell line. The atovaquone metabolite displayed higher toxicity than pattern structure, and this activity was not selective.

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T02:40:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_PatriciadaSilva_D.pdf: 8064368 bytes, checksum: 2703101b81b02efc2135d7099952c15f (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Croton cajucara Benth (sacaca) é uma espécie vegetal encontrada na região amazônica e é populannente utilizada para o tratamento de distúrbios digestivos. Foram investigadas a atividade anti-ulcerogênica e a citotoxicidade de compostos sintetizados a partir da desidrocrotonina, constituinte majoritário obtido das cascas de sacaca. Através de modelos de úlceras agudas, induzi das por agentes como etanol/HCI, indometacina e estresse, em camundongos, foi possível constatar que os derivados U (ciclohexenona reduzida) e IV (amida) reduziram significativamente as lesões ulcerativas na maioria dos modelos estudados. O derivado lU (ciclohexenona e lactona reduzidas) não aprçsentou efeito protetor sobre a mucosa gástrica. A citotoxicidade destes compostos foi avaliada em células V79 e hepatócitos usando três diferentes ensaios de viabilidade: incorporação do vermelho neutro, redução do MTT e conteúdo de ácidos nucleicos. O derivado 11 apresentou um efeito citotóxico basal sobre as células V79 (ICso entre 350 e 540 Jlm). Contudo, em cultura de hepatócitos foi verificado um efeito citotóxico seletivo observado através de uma toxicidade elevada (ICso 8 JlM) avaliada através da redução do MIT. O derivado 111 apresentou menor citotoxicidade quando comparado com a desidrocrotonina, derivado 11 e derivado IV (ICso = 1800 JlM verificado através do conteúdo de ácidos nucleicos). Os resultados obtidos neste estudo indicam que a atividade anti ulcerogênica da desidrocrotonina e dos derivados é dependente da presença de aceptores de Michael e que, a citotoxicidade está diretamente relacionada com a presença do anel da lactona / Abstract: Croton cajucara Benth is a plant species growing in the Amazon region which is popularly used to treat disorders of the digestive tract. It was investigated the antiulcerogenic activity of the bark of the sacaca. Using acute ulcer models induced byagents such as ethanol/HCI, indomethacin and stress in mice, we observed that the compound II (cyc1ohexenone moiety reduced) and compound IV (amide) significantly reduced the u1cerative lesions in the various models studied. The cytotoxicity of these derivatives from DHC was assayed on V79 cell and hepatocyte. Three independent endpoints for cytotoxicity were evaluated: the neutral red uptake (NRU), tetrazolium reduction (MTT) and nuc1eic acid content (NAC). Compound II showed a basal cytotoxic effect in V79 cells (lCso values of 540 and 350 /lM in the NRU and NAC tests, respectively). However, compound II showed in hepatocyte a selective toxicity evaluated by MTT reduction (lCso = 8 /lM). Compound III was less toxic than the others DHC derivatives (lCso = 1800 /lM) in V79 cells based on NAC assay. The results in this study indicate that the antiulcerogenic activity of the dehydrocrotonin and derivatives is dependent of the Michael acceptor presence in these compounds and the toxicity is related with the lactone presence / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular