O camarão marinho capturado no litoral brasileiro representa um importante segmento do setor pesqueiro devido, particularmente, ao valor de mercado. Sendo um alimento altamente perecível, requer cuidados especiais para a comercialização, conservação e industrialiazação; o controle da qualidade inicia-se na manipulação pós-captura ainda no barco. As operações imediatas realizadas após a captura do camarão no porto de desembarque de Ubatuba/SP, são conduzidas em condições inadequadas e, assim, colaboram para a alteração do camarão a ser utilizado como matéria-prima, através da decomposição autolítica, decomposição bacteriana e formação de melanose. Foram estudadas etapas do pré-processamento do camarão, entre elas, a recepção no entreposto de desembarque, a lavagem com hipoclorito e o tratamento com antimelanóticos. Camarões da espécie Xyphopenaeus kroyeri foram submetidos a quatro concentrações de antimelanóticos, sendo duas de metabissulfito de sódio (1,25 e 2,5%) e duas de 4-hexylresorcinol (0,01 e 0,1%), buscando verificar o desempenho destes conservantes a partir de observações de parâmetros físico-químicos, microbiológicos, sensoriais e de cor instrumental. Paralelamente estudaram-se camarões, comercializados e tratados com metabissulfito de sódio, do "Mercado de Peixes" de Ubatuba/SP. Avaliaram-se os níveis residuais de SO2 dos camarões submetidos aos tratamentos com metabissulfito. Foram avaliadas as composições centesimal, mineral e de ácidos graxos em camarões não tratados com antimelanóticos. Os camarões submetidos ao tratamento com metabissulfito não apresentaram boa conservação, não diferindo estatisticamente do tratamento controle. Os camarões obtidos do "Mercado de Peixes" sofreram a mais rápida perda de frescor; este tratamento também foi o que apresentou maior variação nos componentes avaliados, indicando a falta de padronização nos processamentos pós-captura realizados em Ubatuba/SP. O tratamento com 4-hexylresorcinol (0,1%) conservou adequadamente o produto por pelo menos 10 dias, do ponto de vista da melanose e, em relação às demais análises, manteve os teores sempre menores. O sulfito residual nos tratamentos com metabissulfito excedeu os limites máximos permitidos pela legislação vigente para camarão resfriado (100 g de SO2 residual/kg de camarão) estando inapropriadas para utilização na prática. O tempo de armazenamento influenciou significativamente (P < 0,05) nos níveis de sulfito residual, porém não foram suficientes para uma redução para os níveis legais. O 4-hexylresorcinol é uma alternativa ao tradicional sulfito podendo evitar o efeito residual deste. Os camarões foram considerados fontes expressivas de proteínas e minerais, principalmente, cálcio, fosfóro, zinco, cobre e magnésio; e as quantidades de lipídeos e calorias foram baixas. O camarão teve proporção de ácidos graxos saturados de 30,54 a 33,97% e de ácidos graxos poliinsaturados de 21,84 a 36,89%. Os ácidos graxos ômega-3 (n-3), eicosapentaenóico (EPA) e docasahexaenóico (DHA) apresentaram proporção de 6,98 a 10,7% e de 6,67 a 14,72%, respectivamente. / Sea shrimp captured in the Brazilian coast represents an important segment of the seafood particularly due to the market value. Being a highly perishable food, it requests special cares for commercialization, conservation and industrialization. The control of the quality begins as soon as post-capture in the vessel. The immediate operations accomplished after the capture in the port of Ubatuba/SP are lead in inadequate conditions and, like this, they collaborate for the degradation of the shrimp to be used as raw material, through the autolysis, bacterial decomposition and melanosis or black spot formation. Xyphopenaeus kroyeri were studied of the previous processing, among them, the reception in the warehouse, the wash with hypochlorite and the treatment with conservants. Shrimps were submitted to four conservants concentrations, being 1.25 and 2.5% of sodium metabisulphite and 0.01 and 0.1% of 4-hexylresorcinol being looked for the best concentration starting from observations of physical-chemical, microbiologicals, colour parameters and melanosis score. In the same moment shrimps were obtained from commercial fishing at the Seafood Market in Ubatuba/SP, which were previously treated with sodium metabisulphite. It was also evaluated the residual levels of SO2 in the shrimps submitted to metabisulphite. Samples not submitted to melanosis inhibitor were analyzed to centesimal, mineral and fatty acid composition. The metabisulphite treatments had not presented good conservation in relation to the others being similar to control treatment. The tratment of Seafood Market quickly degradated; this treatment presented a large variation in the components, indicating the lack of standardization. The treatment with 4-hexylresorcinol (0.1%) conserved properly the product for at least 10 days of the melanosis score, and in relation to the other analyses it always maintained the smaller values. The metabisulphite treatments exceeded the maximum limits allowed by the legislation for cold shrimp (100g of SO2 shrimp residual.kg-1) being inappropriate for consumers. The time of storage influenced significantly (P<0.05) in the sulphite levels, however they were not enough for a reduction at levels of Brazilian legislation. The 4-hexylresorcinol is an alternative to the traditional sulphite. Shrimps were considered an expressive source of the proteins and minerals, particulary, calcium, phosphorus, zinc, copper and magnesium; while quantities of lipids and calories were low. Shrimp had a low proportion of saturated (30.54 to 33.97%) and a higher proportion of polyunsaturated fatty acids (21.84 to 36.89%). Long chain omega-3 (n-3) polyunsaturated fatty acids (PUFA) eicosapentaenoic (EPA) (6.98 to 10.7%) and docosahexaenoic (DHA) (6.67 to 14.72%) were observed.

O camarão marinho capturado no litoral brasileiro representa um importante segmento do setor pesqueiro devido, particularmente, ao valor de mercado. Sendo um alimento altamente perecível, requer cuidados especiais para a comercialização, conservação e industrialiazação; o controle da qualidade inicia-se na manipulação pós-captura ainda no barco. As operações imediatas realizadas após a captura do camarão no porto de desembarque de Ubatuba/SP, são conduzidas em condições inadequadas e, assim, colaboram para a alteração do camarão a ser utilizado como matéria-prima, através da decomposição autolítica, decomposição bacteriana e formação de melanose. Foram estudadas etapas do pré-processamento do camarão, entre elas, a recepção no entreposto de desembarque, a lavagem com hipoclorito e o tratamento com antimelanóticos. Camarões da espécie Xyphopenaeus kroyeri foram submetidos a quatro concentrações de antimelanóticos, sendo duas de metabissulfito de sódio (1,25 e 2,5%) e duas de 4-hexylresorcinol (0,01 e 0,1%), buscando verificar o desempenho destes conservantes a partir de observações de parâmetros físico-químicos, microbiológicos, sensoriais e de cor instrumental. Paralelamente estudaram-se camarões, comercializados e tratados com metabissulfito de sódio, do "Mercado de Peixes" de Ubatuba/SP. Avaliaram-se os níveis residuais de SO2 dos camarões submetidos aos tratamentos com metabissulfito. Foram avaliadas as composições centesimal, mineral e de ácidos graxos em camarões não tratados com antimelanóticos. Os camarões submetidos ao tratamento com metabissulfito não apresentaram boa conservação, não diferindo estatisticamente do tratamento controle. Os camarões obtidos do "Mercado de Peixes" sofreram a mais rápida perda de frescor; este tratamento também foi o que apresentou maior variação nos componentes avaliados, indicando a falta de padronização nos processamentos pós-captura realizados em Ubatuba/SP. O tratamento com 4-hexylresorcinol (0,1%) conservou adequadamente o produto por pelo menos 10 dias, do ponto de vista da melanose e, em relação às demais análises, manteve os teores sempre menores. O sulfito residual nos tratamentos com metabissulfito excedeu os limites máximos permitidos pela legislação vigente para camarão resfriado (100 g de SO2 residual/kg de camarão) estando inapropriadas para utilização na prática. O tempo de armazenamento influenciou significativamente (P < 0,05) nos níveis de sulfito residual, porém não foram suficientes para uma redução para os níveis legais. O 4-hexylresorcinol é uma alternativa ao tradicional sulfito podendo evitar o efeito residual deste. Os camarões foram considerados fontes expressivas de proteínas e minerais, principalmente, cálcio, fosfóro, zinco, cobre e magnésio; e as quantidades de lipídeos e calorias foram baixas. O camarão teve proporção de ácidos graxos saturados de 30,54 a 33,97% e de ácidos graxos poliinsaturados de 21,84 a 36,89%. Os ácidos graxos ômega-3 (n-3), eicosapentaenóico (EPA) e docasahexaenóico (DHA) apresentaram proporção de 6,98 a 10,7% e de 6,67 a 14,72%, respectivamente. / Sea shrimp captured in the Brazilian coast represents an important segment of the seafood particularly due to the market value. Being a highly perishable food, it requests special cares for commercialization, conservation and industrialization. The control of the quality begins as soon as post-capture in the vessel. The immediate operations accomplished after the capture in the port of Ubatuba/SP are lead in inadequate conditions and, like this, they collaborate for the degradation of the shrimp to be used as raw material, through the autolysis, bacterial decomposition and melanosis or black spot formation. Xyphopenaeus kroyeri were studied of the previous processing, among them, the reception in the warehouse, the wash with hypochlorite and the treatment with conservants. Shrimps were submitted to four conservants concentrations, being 1.25 and 2.5% of sodium metabisulphite and 0.01 and 0.1% of 4-hexylresorcinol being looked for the best concentration starting from observations of physical-chemical, microbiologicals, colour parameters and melanosis score. In the same moment shrimps were obtained from commercial fishing at the Seafood Market in Ubatuba/SP, which were previously treated with sodium metabisulphite. It was also evaluated the residual levels of SO2 in the shrimps submitted to metabisulphite. Samples not submitted to melanosis inhibitor were analyzed to centesimal, mineral and fatty acid composition. The metabisulphite treatments had not presented good conservation in relation to the others being similar to control treatment. The tratment of Seafood Market quickly degradated; this treatment presented a large variation in the components, indicating the lack of standardization. The treatment with 4-hexylresorcinol (0.1%) conserved properly the product for at least 10 days of the melanosis score, and in relation to the other analyses it always maintained the smaller values. The metabisulphite treatments exceeded the maximum limits allowed by the legislation for cold shrimp (100g of SO2 shrimp residual.kg-1) being inappropriate for consumers. The time of storage influenced significantly (P<0.05) in the sulphite levels, however they were not enough for a reduction at levels of Brazilian legislation. The 4-hexylresorcinol is an alternative to the traditional sulphite. Shrimps were considered an expressive source of the proteins and minerals, particulary, calcium, phosphorus, zinc, copper and magnesium; while quantities of lipids and calories were low. Shrimp had a low proportion of saturated (30.54 to 33.97%) and a higher proportion of polyunsaturated fatty acids (21.84 to 36.89%). Long chain omega-3 (n-3) polyunsaturated fatty acids (PUFA) eicosapentaenoic (EPA) (6.98 to 10.7%) and docosahexaenoic (DHA) (6.67 to 14.72%) were observed.

Improvements to highway safety have become a high priority for highway authorities due to increasing public awareness and concern of the high social and economic costs of accidents. However, satisfying this priority in an environment of limited budgets is difficult. It is therefore important to ensure that the funding available for highway safety improvements is efficiently utilized. In attempt to maximize the overall highway safety benefits, highway professionals usually invoke an optimization process. The objective of this thesis study is to develop a model for the selection of appropriate improvements on a set of black spots which will provide the maximum reduction in the expected number of accidents (total return), subject to the constraint that the amount of money needed for the implementation of these improvements does not exceed the available budget. For this purpose, a computer program, BSAP (Black Spot Analysis Program) is developed. BSAP is comprised of two separate, but integrated programs: the User Interface Program (UIP) and the Main Analysis Program (MAP). The MAP is coded in MATLAB and contains the optimization procedure itself and performs all the necessary calculations by using a Binary Integer Optimization model. The UIP, coded in VISUAL BASIC, was used for monitoring the menu for efficient data preparation and providing a user-friendly environment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-30Bitstream added on 2014-06-13T20:06:05Z : No. of bitstreams: 1 bernardo_era_dr_botfca.pdf: 350867 bytes, checksum: 5ac2bf8356b892e6a8597025678f2c2e (MD5) / O Brasil é o maior produtor de laranja e o maior exportador mundial de suco concentrado. A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa, é uma doença de grande importância econômica, principalmente para o Estado de São Paulo. O interesse no controle biológico de fitopatógenos, como alternativa de controle e como forma de reduzir os problemas ocasionados pelo uso intensivo de fungicidas, tem levado ao desenvolvimento de técnicas alternativas para uma agricultura mais sustentável. O trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de agentes de controle biológico (Bacillus subtilis e Trichoderma harzianum) e produtos alternativos (biofertilizantes e leite) no controle da pinta preta dos frutos cítricos em cultivos convencional e orgânico. Além disso, foi avaliado o efeito de Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus e Streptomyces sp. no controle de G. citricarpa e Penicillium digitatum em pós-colheita. Os experimentos em campo foram realizados em pomar de laranja`Valência´ e `Pêra´, localizadas nos municípios de Conchal e Santa Eudóxia, SP, respectivamente. Em cultivo convencional de `Valência´ foram avaliados dois biofertilizantes (Microgeo® e Bio2), nas safras 2003/2004 e 2004/2005, com 15 repetições por tratamento, sendo uma planta por repetição. As árvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o início em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. Na safra 2003/2004 as concentrações utilizadas do biofertilizante Microgeo® foram 0; 10; 20; 30 e 40%. Na safra 2004/2005 foram repetidos os mesmos tratamentos dasafra anterior e incluído tratamento com o biofertilizante Bio2 nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%. Para as avaliações foram utilizadas uma escala de notas de 1=0,5% a 6=49% da área do fruto atacada. Os biofertilizantes apresentaram comportamento... / Brazil is the worldwide biggest producer and exporter of orange and orange juice. The citrus black spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa, is a disease of great economic importance, mainly for the São Paulo State. The interest in biological control of plant pathogens, as mitigation of the problems caused by intensive use of fungicides, has led to development of alternative techniques for a more sustainable agriculture. The objective of this work was to evaluate the effects of biocontrol agents (Bacillus subtilis and Trichoderma sp.) and other biocompatible products (cow milk and biofertilizers) for managing CBS in organic and conventional systems. Besides, the effect of B. subtilis, Paenibacillus lentimorbus and Streptomyces sp. for control of G. citricarpa and Penicillium digitatum, in post-harvest was also evaluated. The filed experiments were carried through in trees of `Valencia' and `Pera´, located in Conchal and Santa Eudóxia, SP, respectively. In `Valencia´ conventional system were evaluated two biofertilizers (Microgeo® and Bio2). The experiments were conducted at harvests 2003/2004 and 2004/2005. The trees were sprayed in 28 days intervals, and the first was in 08 December 2003 in 2003/2004 harvest, and 08 November 2004 in 2004/2005 harvest.

This is a study with the purpose of looking over the pattern of consumption of people visiting tourist attractions associated with war, death and suffering; dark tourism. The demarcation of the work has been to look into attractions inside the Stockholm area which do commercial business with the three aspects of dark tourism. With the help of qualitative and quantitative methods, the authors have collected the material needed for the purpose of the study. These qualitative methods have been interviews with visitors of dark tourism and the commercial business themselves, and with observations on three different attractions in Stockholm. The quantitative method, together with some qualitative aspects, has been a poll, with in-depth questions, to get an understanding of the subject at hand. The places for the observations was Stockholm Ghost Walk, the Vasa museum, and the Army museum. As a result of the study, the authors learned that most visitors didn’t know about dark tourism and that they were, in fact, visiting attractions that was called dark. The phenomena itself was unknown to most of them even though they all had visited at least one place under the dark tourism phenomena. / Detta är en undersökning vars syfte är att se över människors konsumtionsmönster på platser associerade med krig, död och lidande; mörk turism. Avgränsningen för arbetet har varit till de attraktioner i Stockholmsområdet som gör kommersiellt nöje av dessa tre aspekter. Med hjälp av kvalitativa och kvantitativa metoder har författarna samlat in det material de behöver för arbetets syfte. Dessa har varit kvalitativa intervjuer med besökare och aktörer på den mörka turism-marknaden i Sverige och observationer på tre attraktioner, samt en kvalitativ och kvantitativ enkät som förarbete för att få en förståelse kring ämnet. De platser som observerades var Stockholm Ghost Walk i Gamla Stan, Vasamuseet samt Armémuseet. Resultatet visar att mörk turism inte alltid är uppenbart som fenomen för besökaren, även om det är ett fenomen som ofta besöks.

Orientador: Wagner Bettiol / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Edson Luiz Furtado / Banca: Antonio de Goes / Banca: Katia Cristina Kupper Moretto / Resumo: O Brasil é o maior produtor de laranja e o maior exportador mundial de suco concentrado. A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa, é uma doença de grande importância econômica, principalmente para o Estado de São Paulo. O interesse no controle biológico de fitopatógenos, como alternativa de controle e como forma de reduzir os problemas ocasionados pelo uso intensivo de fungicidas, tem levado ao desenvolvimento de técnicas alternativas para uma agricultura mais sustentável. O trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de agentes de controle biológico (Bacillus subtilis e Trichoderma harzianum) e produtos alternativos (biofertilizantes e leite) no controle da pinta preta dos frutos cítricos em cultivos convencional e orgânico. Além disso, foi avaliado o efeito de Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus e Streptomyces sp. no controle de G. citricarpa e Penicillium digitatum em pós-colheita. Os experimentos em campo foram realizados em pomar de laranja'Valência' e 'Pêra', localizadas nos municípios de Conchal e Santa Eudóxia, SP, respectivamente. Em cultivo convencional de 'Valência' foram avaliados dois biofertilizantes (Microgeo® e Bio2), nas safras 2003/2004 e 2004/2005, com 15 repetições por tratamento, sendo uma planta por repetição. As árvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o início em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. Na safra 2003/2004 as concentrações utilizadas do biofertilizante Microgeo® foram 0; 10; 20; 30 e 40%. Na safra 2004/2005 foram repetidos os mesmos tratamentos dasafra anterior e incluído tratamento com o biofertilizante Bio2 nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%. Para as avaliações foram utilizadas uma escala de notas de 1=0,5% a 6=49% da área do fruto atacada. Os biofertilizantes apresentaram comportamento ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is the worldwide biggest producer and exporter of orange and orange juice. The citrus black spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa, is a disease of great economic importance, mainly for the São Paulo State. The interest in biological control of plant pathogens, as mitigation of the problems caused by intensive use of fungicides, has led to development of alternative techniques for a more sustainable agriculture. The objective of this work was to evaluate the effects of biocontrol agents (Bacillus subtilis and Trichoderma sp.) and other biocompatible products (cow milk and biofertilizers) for managing CBS in organic and conventional systems. Besides, the effect of B. subtilis, Paenibacillus lentimorbus and Streptomyces sp. for control of G. citricarpa and Penicillium digitatum, in post-harvest was also evaluated. The filed experiments were carried through in trees of 'Valencia' and 'Pera', located in Conchal and Santa Eudóxia, SP, respectively. In 'Valencia' conventional system were evaluated two biofertilizers (Microgeo® and Bio2). The experiments were conducted at harvests 2003/2004 and 2004/2005. The trees were sprayed in 28 days intervals, and the first was in 08 December 2003 in 2003/2004 harvest, and 08 November 2004 in 2004/2005 harvest. / Doutor

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:55:46Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and delimitation. Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.

A mancha preta dos citros (MPC) é uma doença que limita a exportação de laranja brasileira para o Japão e países da Europa. Exceto para Citrus aurantium e seus híbridos, todas as outras variedades são susceptíveis ao patógeno. O fungo Guignardia citricarpa, descoberto por Kiely em 1948 em New South Wales na Austrália, é o estádio sexual do agente causal da MPC e a sua fase imperfeita é Phyllosticta citricarpa. Uma importante característica da MPC é seu longo período de latência. A infecção pode ser efetuada por ascósporos e picnidiósporos. A lesão nos frutos fica restrita ao flavedo (epicarpo), sendo que o fungo não infecta o albedo (mesocarpo). O albedo é rico em celulose, carboidratos solúveis, pectinas, compostos fenólicos (flavonóides), aminoácidos e vitaminas. Os compostos fenólicos presentes nas plantas são produtos do metabolismo secundário, e podem ser resultantes da interação planta-ambiente e podem sintetizados como resposta ao ataque de fitopatógenos. Os fenólicos presentes nos citros incluem flavonóides, antocianinas, coumarinas e psorolenos entre outros. Estes compostos podem exibir ação antimicrobiana e antiviral e podem contribuir controle da MPC. A aplicação de fungicidas é o método de controle da MPC. Uma outra possibilidade de controle seria a ativação de fatores de resistência através do uso de indutores bióticos (Saccharomyces cerevisiae) e abióticos (Bion e ácido salicílico). Deste modo, este trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do uso de extratos aquosos, metanólicos e etanólicos de albedo de laranja na germinação formação de apressório e crescimento micelial de P. citricarpa in vitro, bem como avaliar o uso da indução de resistência para o controle da MPC através dos indutores S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico em pós e pré-colheita em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’ e folhas de limão ‘Siciliano’. Os resultados experimentais mostraram que os extratos de albedo, nas concentrações de 10 e 100 mg / mL de água, foram capazes de inibir em 100% a germinação, formação de apressório e o crescimento micelial de P. citricarpa. Foi observado que os extratos, dependendo da concentração, podem ter ação fungicida ou fungistática. No tocante a utilização de S. cerevisiae, Bion e ácido salicílico, aplicados em pós-colheita, foi observado que estes agentes não foram capazes de impedir o desenvolvimento de novas lesões em frutos de laranja ‘Pêra-Rio’. Também foi constatado que S. cerevisiae e Bion, aplicados em pré-colheita, não foram capazes de induzir resistência contra P. citricarpa em folhas de limão ‘Siciliano’ inoculadas previamente a campo com G. citricarpa. Nesse sentido, sugere-se que outros estudos sejam conduzidos, principalmente no que se refere ao uso potencial de extratos do albedo de laranja como medida alternativa de controle da MPC. / Black spot of citrus (CBS) has been a limiting factor in the export of brazilian oranges to Japan and European countries and Japan. Except for Citrus aurantium and its hybrids, all commercially growing Citrus spp. are susceptible to the pathogen. The fungus Guignardia citricarpa, discovered by Kiely in 1948 in New South Wales, is the sexual stage of the causal agent of CBS and Phyllosticta citricarpa is the imperfect stage. An important characteristic of CBS is the long latent period after infection. The infection is carried out by ascospores and pycnidiospores. The fungicidal application is the most important method of control of CBS. The CBS lesion in citrus fruits is limited to the flavedo, since P. citricarpa does not infect the albedo. The albedo is rich in cellulose, soluble carbohydrates, pectin, phenolic compounds, amino acids and vitamins. The phenolics present in the plants are secondary metabolic products and are believed to be produced as a result of the plant interaction with the enviromment and synthesized as a response to attempted phytopathogen attacks. The phenolics that occur in Citrus include flavonoids, anthocyanins, coumarins and psorolens. These compounds may exhibit antiviral and antimicrobial activities, and may contribute to the control of CBS disease. An another possibility to the CBS control is the activation of factors resistance by the use of abiotics (Bion and salicylic acid) and biotics (Saccharomyces cerevisiae) “plant defence activator” (inducers). Therefore, the objectives of this paper were to study the in vitro effects of aqueous, ethanolic and methanolic albedo orange extracts on the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa as well as to evaluate the use of the S. cerevisiae, Bion and salicylic acid as “plant defence activator” at post and preharvest conditions in fruit of “Pêra-Rio” and leaves of ’Siciliano’ lemon. The results showed that the use of albedo extracts, 10 and 100 mg per mL of water, inhibited 100 % the germination, appressorium formation and mycelial growth of P. citricarpa. It was also observed that the extracts of albedo, depending upon the concentration, exhibited fungicidal or fungistatic activity. The use of S. cerevisiae, Bion and salicylic acid at postharvest conditions did not affect the development of new lesions of CBS in ‘Pêra-Rio’ orange fruit. It was also observed that the use of S. cerevisiae and Bion at preharvest conditions, did not induce resistance against P. citricarpa in leaves of ‘Siciliano’ lemon naturally infected with G. citricarpa under field conditions. Thus, it is suggested that other studies be carried out, mainly regarding the potential of orange albedo’s extracts as a alternative method for CBS control.

A citricultura é uma atividade rural extremamente importante no contexto sócio-econômico brasileiro. A laranja representa 49% de toda a produção brasileira de frutas. Entretanto, anualmente milhares de toneladas de frutos são perdidas devido à ação de fitopatógenos. A Mancha Preta dos Citros (MPC) tem sido responsável por grandes prejuízos em várias regiões produtoras de citros no mundo, sendo designada como barreira fitossanitária, principalmente no mercado Europeu. Para o consumo in natura, a aparência dos frutos é fator essencial, onde a MPC compromete a comercialização de frutas frescas. O controle químico de patógenos de plantas é geralmente o mais utilizado para minimizar os danos causados pela MPC, apesar do uso de tais produtos implicar em altos custos, tanto para os agricultores com para o meio ambiente, causando contaminação do solo e da água e aumentando a pressão de seleção sobre a população do patógeno. Dessa forma, o controle biológico torna-se uma alternativa atrativa, como uma estratégia que permite um menor impacto ambiental aliado à proteção da planta contra o patógeno. No entanto, para sua aplicação, são necessários estudos relacionados à utilização de técnicas de biocontrole, como por exemplo, a utilização de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas. Tais enzimas, como as quitinases, endoglicanases e &#946;- glicosidases têm a capacidade de digerir a parede celular de fungos e bactérias. Neste trabalho, 24 isolados de G. citricarpa foram avaliados quanto à sensibilidade aos fungicidas usados em campo para controle da doença: piraclostrobina e carbendazim, nas dosagens de 0,5; 1 e 2 mg i.a./mL, a fim de verificar o efeito da pressão de seleção causada pelo uso contínuo destes compostos. Dois dos isolados apresentaram resistência ao carbendazim em todas as dosagens testadas, indicando que o uso desse agroquímico pode selecionar mutantes resistentes, resultando na não eficiência deste produto no controle da MPC. Uma alternativa para minimizar este tipo de efeito seria a utilização deste composto em combinação com outros princípios ativos. As atividades celulolíticas e quitinolíticas de 96 isolados de fungos filogeneticamente distintos foram avaliadas para a seleção de potenciais agentes de controle biológico. Os quatro isolados que apresentaram maior atividade de cada uma destas enzimas, além de duas linhagens de Trichoderma, foram testados como potencial de biocontrole de G. citricarpa em um experimento com folhas laranja ‘Valência’, comparando a ação destes com a de fungicidas comerciais. Apesar de o melhor controle do patógeno ter sido observado em folhas tratadas com piraclostrobina, dois isolados fúngicos mostraram eficiência similar ao fungicida, inibindo o desenvolvimento de G. citricarpa, o que sugere a possibilidade de futura utilização de métodos de controle biológico para a Mancha Preta dos Citros. / Citriculture is an extreme important rural activity in social and economical national context in Brazil. Orange is 49% of total brazilian fruit production. However, thousands of tons are lost due to the action of phytopathogens annually. The Black Spot of Citrus (BSC) is responsible for great lost in various citrus producers regions all around the world, being already designed as a phytosanitary barrier, mainly in European market. For in natura fruit consuming, the fruit esthetic is a limiting factor, where BSC compromises the market of fresh affected fruits. Chemical control of plant pathogens is the most commonly way used to minimize damages in citriculture by BSC, although the application of such products implies in high costs, not only for farmers but also for environment, causing soil and water contamination and increasing the selection pressure on pathogen population. On this way, the biocontrol became an attractive way, as a strategy that permits a minor environmental impact besides the plant protection against phytopathogens. For this application, are necessary researches based on utilization of biocontrol techniques, as for example, the using of microorganism producers of hydrolytic enzymes. Such enzymes, like quitinases, endoglicanases and &#946;-glicosydases are able to digest the fungal and bacterial cell wall. In this work, 24 strains of G. citricarpa were evaluated about the sensibility to fungicides used in field for BSC control: piraclostrobin and carbendazin, in dosages of 0,5, 1,0 and 2,0 mg a.i./mL, aiming to verify the effect of selection pressure caused by continuous use of this compounds. Two of these strains presented resistance to carbendazim in all evaluated dosages, showing that the use of this agrochemical may select resistant individuals, resulting a non-efficiency of this compound for BSC control. An alternative to minimize this kind of effect must be the application of this compound in combination to others active principles. The celullolitic and chitinollitic activities of 96 fungi strains widely spread phylogenetically were evaluated for selection of potential biological control agents. Four strains that presented major activity of each enzyme, besides two Trichoderma lineages, were tested as potential biological control of G. citricarpa in an experiment with ‘Valência’ orange leaves, comparing the action of these biocontrolers with commercial fungicides. Although a better pathogen control was achieved in leaves treated with piraclostrobin, two fungi strains revealed to have the similar efficiency to fungicide, inhibiting the development of G. citricarpa, suggesting the possible future utilization of biocontrol methods to Black Spot of Citrus.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.