Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Seven outbreaks and an isolated case of meningoencephalitis caused by bovine herpesvirus-5 (BoHV-5) in cattle from Rio Grande do Sul, Brazil, occurring in 2002-2004 are described. From a total population at risk of 1,359 cattle, 54 1-18-month-old calves from both sexes and several breeds were affected and 50 died spontaneously or were euthanatized while moribund. The highest frequency of cases were in recently weaned calves or calves submitted to other stressing factors. General rates of morbidity, mortality and lethality were respectively 3.97%, 3.67% e 92.59%. Clinical courses varied from 3-10 days and included depression, nasal and ocular discharge, grinding of teeth, circling, blindness, fever, nistagmus, trembling, anorexia, dysphagia, drooling, incoordination, head pressing, rough hair coat, tachycardia, tachypnea, abdominal pain, melena, falls, recumbency, opisthotonus, convulsions and paddling. Nineteen calves were necropsied. Necropsy findings were characterized by hyperemia of leptomeninges, swollen of rostral portions of the telencephalon, and flattening of frontal lobes gyri; frequently in these frontal areas there were segmental brown-yellow discoloration and softening (malacia) of the cortex. In cases with more protracted clinical courses there were extensive swelling, softening and hemorrhaging of the telencephalic frontal lobes. Microscopically, all affected cattle had a necrotizing non-suppurative meningoencephalitis with variable distribution among the 19 cases and among the various telencephalic regions of the same case. The severity of these changes were more marked, in decreasing order of intensity, in the telencephalic frontal cortex, basal ganglia (nuclei), thalamus, brain stem, parietal telencephalic cortex, occipital telencephalic cortex and cerebellum. Perivascular inflammatory infiltrate consisted predominantly of lymphocytes, plasm cells, and, less frequently, neutrophils. Additional microscopic findings included variable degrees of gliosis, edema, neuronal necrosis in the telencephalic cortex characterized by shrinking and eosinophilia of perikaria and nuclear picnosis (red neuron); basophilic intranuclear inclusion bodies in astrocytes and neurons (21.05% of the cases); sattelitosis; and neuronophagia. The areas of softening in the cortical substance consisted of necrosis of the neuroctodermal elements with maintenance of mesenchymal structures (vessels and microglia), infiltrate of gitter cells, and, in more severe cases, extensive hemorrhages. In chronic cases, only vascular structures and a few gitter cells remained in the cortical area leaving a cavity between white matter and leptomeninges (residual lesion). The diagnosis was based on the epidemiological, clinical, necropsy and histopathologial findings. Viral isolation, immunofluorescent antibody technique and polymerase chain reaction were performed in three outbreaks. / São descritos sete surtos e um caso isolado de meningoencefalite por herpesvírus bovino-5 (BoHV-5) em bovinos no Rio Grande do Sul entre 2002-2004. Foram afetados bovinos de 1-18 meses, de diversas raças e ambos os sexos. A maior freqüência foi observada em bovinos recém-desmamados e submetidos a outros fatores de estresse. Nesses surtos, de uma população total sob risco de 1.359 bovinos, 54 foram afetados, quatro se recuperaram e 50 morreram espontaneamente ou foram submetidos à eutanásia quando moribundos. Os índices gerais de morbidade, mortalidade e letalidade foram, respectivamente, de 3,97%, 3,67% e 92,59%. A evolução clínica variou de 3-10 dias e os sinais eram caracterizados por depressão, corrimento nasal ou ocular, ranger de dentes, andar em círculos, cegueira, febre, nistagmo, tremores, anorexia, disfagia, sialorréia, incoordenação, pressão da cabeça contra objetos, pêlos arrepiados, taquicardia, taquipnéia, dor abdominal, melena, quedas, decúbito, opistótono, convulsões e movimentos de pedalagem. Dezenove bezerros foram necropsiados. Achados de necropsia foram caracterizados por hiperemia das leptomeninges, tumefação das porções rostrais do telencéfalo, com achatamento das circunvoluções dos lobos frontais; nessas áreas havia focos marromamarelados e amolecidos (malacia). Nos casos de evolução clínica mais longa era observada acentuada tumefação, amolecimento e extensas áreas de hemorragia nos lobos frontais telencefálicos. Microscopicamente, todos os bovinos afetados apresentaram meningoencefalite não-supurativa e necrosante, que variou quanto à localização e intensidade nos 19 casos examinados e nas seções de encéfalo de um mesmo caso. A intensidade dessas lesões foi mais acentuada, em ordem decrescente, no córtex telencefálico frontal, nos núcleos da base, tálamo, tronco encefálico, córtex parietal, córtex occipital e cerebelo. O infiltrado inflamatório perivascular era constituído predominantemente por linfócitos e plasmócitos e, menos freqüentemente, neutrófilos. Outros achados incluíam variados graus de gliose, edema, necrose neuronal no córtex telencefálico, caracterizada por encarquilhamento e eosinofilia do citoplasma e picnose nuclear (neurônio vermelho), corpúsculos de inclusão basofílicos intranucleares em astrócitos e neurônios (21,05% dos casos), satelitose e neuronofagia. As áreas de amolecimento do parênquima eram caracterizadas por necrose do componente neuroectodérmico e manutenção das estruturas mesenquimais (vasos e micróglia), com infiltrado de células gitter e, em casos mais graves, áreas de hemorragia. Nos casos crônicos apenas estruturas vasculares e poucas células gitter permaneciam, formando uma cavidade entre a substância branca e as leptomeninges (lesão residual). O diagnóstico foi realizado com base nos achados epidemiológicos, clínicos, de necropsia e histopatológicos. Adicionalmente, foi realizado isolamento viral, imunofluorescência e reação em cadeia da polimerase em três surtos.

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After three cycles of selection (biopanning) and amplification, 44 clones were isolated and their amino acid sequences were determined by sequencing generating 16 different sequences. ELISA, demonstrating the efficiency of selection from the specific antibodies, confirmed the reactivity of pooled clones. Another ELISA evaluated the individual specificity of the most frequent clones, the M13 phage was used as a negative control. We selected three peptides (B, C and E) with affinity for anti-BoHV-1 antibodies, and the E peptide (pepE), showed to have potential as antigen for antibody detection in a serological test for BoHV-1. Immunization of rabbits with the peptides induced specific production of serum antibodies, but they were not able do neutralize BoHV-1 cell lysis. The in silico analysis of the dodecapeptide E (1DRALYGPTVIDH12) enabled the identification of a new discontinuous epitope on the envelope glycoprotein B (gB Env) of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1). There is a short motif (338YKRD341) within a region of the env gB BoHV-1 with high similarity to motifs shared by dodecapeptide the N-terminal region (5YxARD1) of gB and HSV-1 (326YARD329), wherein the 328Arg residue is described as a target for neutralizing monoclonal antibodies (mAb) for HSV-1 gB. Besides the characterization of an antibody-binding site of the BoHV-1 Env gB, we have demonstrated that the phage-fused peptide has potential use as a reagent for virus diagnosis by phage-ELISA assay, discriminating BoHV-1 positive serum samples from negative ones. / Membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, o herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) tem sido associado a diferentes condições clínicas em bovinos (doenças respiratórias, genitais e falhas reprodutivas). Não existe um procedimento padrão para medidas de controle e profilaxia das infecções causadas por herpesvírus. Nesse sentido, o phage display foi utilizado com o objetivo de selecionar novos antígenos mimetopos de glicoproteínas do herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) e que apresentam potencial para uso em vacinas e diagnóstico. A técnica de phage display foi realizada com a utilização de uma biblioteca de peptídeos randômicos e lineares composta de 12 resíduos de aminoácidos fusionada à pIII de fagos M13 (sem peptídeo), contra anticorpos anti-BoHV-1, purificados em coluna de cromatografia por afinidade. Após três ciclos de seleção (biopanning) e amplificação, 44 clones foram isolados e as sequências de aminoácidos dos peptídeos foram determinadas pelo sequenciamento gerando 16 sequencias diferentes. A reatividade do pool de clones foi confirmada por ELISA, demonstrando a eficiência da seleção a partir dos anticorpos específicos. Para avaliação da especificidade individual, realizou-se o ELISA dos clones mais frequentes, tendo como controle negativo o fago M13. Foram selecionados três peptídeos (B, C e E) com afinidade por anticorpos anti-BoHV-1, e um destes, o peptídeo E (pepE), apresentou potencial antigênico na detecção de anticorpos para o diagnóstico sorológico do BoHV-1. Nos testes de imunização em coelhos, os três peptídeos induziram a produção de anticorpos específicos, porém, estes não foram capazes de neutralizar a lise celular ocasionada pelo BoHV-1 em placa. A análise in silico do dodecapeptídeo E (1DRALYGPTVIDH12) possibilitou a identificação de um novo epitopo descontínuo na glicoproteína B de envelope (Env gB) do BoHV-1. Há um curto motivo (338YKRD341) dentro de uma região do gene Env gB do BoHV-1, com alta similaridade com os motivos compartilhados pelo dodecapeptídio da região N-terminal (5YxARD1) da gB e do Herpesvirus Humano 1 (HSV-1) (326YARD329), em que o resíduo 328Arg é descrito como um alvo para anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb) para a gB do HSV-1. Concluindo, além da caracterização de um sítio de ligação ao anticorpo na Env gB do BoHV-1, o pepE expresso pelo fago tem potencial de utilização como reagente para o diagnóstico virológico por ensaio ELISA-fago, que discrimina amostras de soro positivas e negativas para o BoHV-1.

Orientador: Samir Issa Samara / Banca: Sandra Possebon Gatti / Banca: Edvirges Maristela Pituco / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é um dos patógenos pertencentes ao complexo respiratório bovino. Apesar de não provocar enfermidade severa na maioria dos casos, há evidências de que este vírus possa facilitar o estabelecimento de outros patógenos. Assim, o presente estudo buscou estabelecer a possibilidade de relação entre o BRSV e o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1), em três propriedades leiteiras, localizadas em três municípios do noroeste do Estado de São Paulo. Além disso, visou também monitorar ao longo do tempo os títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros desde o nascimento. Com base em dados previamente estabelecidos, essas propriedades foram categorizadas como tendo alta, média e baixa prevalência de BoHV-1, respectivamente, propriedade A, no município de Viradouro, (78,6%); propriedade B, no município de Altinópolis, (40%); e, propriedade C, no município de Jaboticabal, (1,6%). Com relação à prevalência de BRSV, a propriedade B apresentou maior prevalência sorológica (82,4%), possivelmente por possuir fatores de risco facilitadores para o desenvolvimento da infecção, enquanto que as propriedades A e C mostraram prevalências estatisticamente equivalentes (45,6% e 59,1%, respectivamente), sem qualquer correlação entre as prevalências de BRSV e BoHV-1. A curva dos títulos de anticorpos contra o BRSV em bezerros nas propriedades A e B monitorados ao longo de um ano foi semelhante, pois ambas apresentaram redução dos títulos a partir do sexto até o oitavo mês de idade dos animais, com seguida retomada de títulos cada vez mais elevados, fato característico de infecção natural. A propriedade C apresentou uma dinâmica semelhante, porém, a maior parte dos bezerros manteve-se positiva durante todo o período, com títulos que decresceram e voltaram a aumentar. / Abstract: The Bovine Respiratory Syncytial Vírus (BRSV) is one of the Bovine Respiratory Complex pathogens. The disease caused by this virus is often mild, but there are evidences that this pathogen may ease the establishment of other pathogens. Data on the epidemiology of BRSV are still scarce. Based on that, this study aimed to determine the prevalence and evaluate antibody titers in calves from three farms. Moreover, the relationship between BRSV and the Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) was investigated, based on epidemiological data previously determined in these farms. The three farms were categorized as A, in Viradouro municipality, with high prevalence of BHV-1 (78.6%); B, in Altinópolis municipaltity, with intermediate prevalence for this agent (40%); and C, in Jaboticabal municipality, with low prevalence of BHV-1 (1.6%). Farm B showed higher BRSV prevalence (82.4%), maybe due to larger herd and colder climate than farms A and C, which showed equivalent prevalences for BRSV (45.6% and 59.1%, respectively). The curve of antibody titers against BRSV in calves from farms A and B over one year were similar, as both showed lower titers by 6 to 8 months of age, rising up again due to antigenic induction. Farm C showed equivalent dynamics, but calves remained positive all over the year. In disagree to literature data, this experiment did not showed correlation between BRSV and BHV-1 prevalences, maybe due to lack of circulation of the latter. / Mestre

A bovinocultura de leite é importante para o abastecimento do mercado interno brasileiro, tendo o Estado do Rio Grande do Sul como o segundo maior produtor. Doenças virais ocasionam diversos prejuízos na cadeia de produção bovina. Com o objetivo de manter e aprimorar o nível de produção, torna-se importante estabelecer programas sanitários que permitam o controle de doenças que possam resultar em grandes perdas econômicas. Para o sucesso de tais programas, é importante levar em consideração o conhecimento da epidemiologia da doença em conjunto com técnicas laboratoriais adequadas, além de buscar fatores associados à permanência do vírus no rebanho Os objetivos desse estudo foram o de avaliar a prevalência e fatores de risco do vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e herpervirus bovino tipo 1 (BoHV-1) em rebanhos leiteiros não vacinados de uma cooperativa de produtores de leite no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Amostras de tanques de leite de 281 rebanhos leiteiros selecionados de forma aleatória simples foram testados para anticorpos contra o BVDV utilizando um kit comercial de ELISA e contra glicoproteína B do BoHV-1 através de um kit comercial de ELISA de bloqueio. Em cada propriedade avaliada, aplicou-se um questionário epidemiológico para investigar os fatores de risco para estas doenças. Uma prevalência de rebanho de 42,70% (120/281; IC 95%: 36% - 48%) para infecção pelo BVDV e de 27,88% (75/269; IC 95%: 22% - 33%) para infecção pelo BoHV-1 foram encontradas na população estudada. Dentre os fatores de risco avaliados, a utilização de inseminação artificial foi considerado como fator de risco para infecção pelo vírus da diarreia viral bovina e possuir suínos na propriedade foi considerado como fator de proteção para infecção pelo herpesvirus bovino tipo 1. O presente estudo identificou 10,3% de rebanhos com infecção ativa de BVDV e uma prevalência moderada para ambas as doenças em uma população de pequenos rebanhos leiteiros criados em sistemas semi-intensivos de produção que não utilizam medidas específicas de controle de infecção. / The dairy cattle is important to supply the Brazilian market, with the state of Rio Grande do Sul as the second largest producer. Viral diseases cause several damages in the bovine production. In order to maintain and improve the level of production, it becomes important to establish health programs that allow the control of diseases that can result in large economic losses. For the success of such programs, it is important to take into account the knowledge of the epidemiology of the disease in conjunction with appropriate laboratory techniques, and risk factors associated with persistence of the virus in the herd. The objectives of this study were to assess the prevalence and risk factors for the bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in unvaccinated dairy herds of a cooperative of milk producers in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Bulk tank milk samples from 281 dairy herds selected by simple random sampling were tested for BVDV antibodies using a commercial ELISA kit and against the glycoprotein B of BoHV-1 using a commercial ELISA kit of blocking. In each assessed property, we applied an epidemiological questionnaire to investigate risk factors for these diseases. A herd prevalence of 42.70% (120/281, 95% CI: 36% - 48%) for BVDV infection and 27.88% (75/269, 95% CI: 22% - 33%) for BoHV-1 were observed in the studied population. Among the risk factors evaluated, the use of artificial insemination was considered as a risk factor for infection with bovine viral diarrhea virus and pigs on the property have been considered as a protective factor for infection by bovine herpesvirus type 1. The present study identified 10.3% of herds with active BVDV infection and a moderate prevalence for both diseases in a population of small dairy herds reared in semi-intensive systems of production which do not use specific measures to control infection.

A bovinocultura de leite é importante para o abastecimento do mercado interno brasileiro, tendo o Estado do Rio Grande do Sul como o segundo maior produtor. Doenças virais ocasionam diversos prejuízos na cadeia de produção bovina. Com o objetivo de manter e aprimorar o nível de produção, torna-se importante estabelecer programas sanitários que permitam o controle de doenças que possam resultar em grandes perdas econômicas. Para o sucesso de tais programas, é importante levar em consideração o conhecimento da epidemiologia da doença em conjunto com técnicas laboratoriais adequadas, além de buscar fatores associados à permanência do vírus no rebanho Os objetivos desse estudo foram o de avaliar a prevalência e fatores de risco do vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e herpervirus bovino tipo 1 (BoHV-1) em rebanhos leiteiros não vacinados de uma cooperativa de produtores de leite no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Amostras de tanques de leite de 281 rebanhos leiteiros selecionados de forma aleatória simples foram testados para anticorpos contra o BVDV utilizando um kit comercial de ELISA e contra glicoproteína B do BoHV-1 através de um kit comercial de ELISA de bloqueio. Em cada propriedade avaliada, aplicou-se um questionário epidemiológico para investigar os fatores de risco para estas doenças. Uma prevalência de rebanho de 42,70% (120/281; IC 95%: 36% - 48%) para infecção pelo BVDV e de 27,88% (75/269; IC 95%: 22% - 33%) para infecção pelo BoHV-1 foram encontradas na população estudada. Dentre os fatores de risco avaliados, a utilização de inseminação artificial foi considerado como fator de risco para infecção pelo vírus da diarreia viral bovina e possuir suínos na propriedade foi considerado como fator de proteção para infecção pelo herpesvirus bovino tipo 1. O presente estudo identificou 10,3% de rebanhos com infecção ativa de BVDV e uma prevalência moderada para ambas as doenças em uma população de pequenos rebanhos leiteiros criados em sistemas semi-intensivos de produção que não utilizam medidas específicas de controle de infecção. / The dairy cattle is important to supply the Brazilian market, with the state of Rio Grande do Sul as the second largest producer. Viral diseases cause several damages in the bovine production. In order to maintain and improve the level of production, it becomes important to establish health programs that allow the control of diseases that can result in large economic losses. For the success of such programs, it is important to take into account the knowledge of the epidemiology of the disease in conjunction with appropriate laboratory techniques, and risk factors associated with persistence of the virus in the herd. The objectives of this study were to assess the prevalence and risk factors for the bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in unvaccinated dairy herds of a cooperative of milk producers in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Bulk tank milk samples from 281 dairy herds selected by simple random sampling were tested for BVDV antibodies using a commercial ELISA kit and against the glycoprotein B of BoHV-1 using a commercial ELISA kit of blocking. In each assessed property, we applied an epidemiological questionnaire to investigate risk factors for these diseases. A herd prevalence of 42.70% (120/281, 95% CI: 36% - 48%) for BVDV infection and 27.88% (75/269, 95% CI: 22% - 33%) for BoHV-1 were observed in the studied population. Among the risk factors evaluated, the use of artificial insemination was considered as a risk factor for infection with bovine viral diarrhea virus and pigs on the property have been considered as a protective factor for infection by bovine herpesvirus type 1. The present study identified 10.3% of herds with active BVDV infection and a moderate prevalence for both diseases in a population of small dairy herds reared in semi-intensive systems of production which do not use specific measures to control infection.

A bovinocultura de leite é importante para o abastecimento do mercado interno brasileiro, tendo o Estado do Rio Grande do Sul como o segundo maior produtor. Doenças virais ocasionam diversos prejuízos na cadeia de produção bovina. Com o objetivo de manter e aprimorar o nível de produção, torna-se importante estabelecer programas sanitários que permitam o controle de doenças que possam resultar em grandes perdas econômicas. Para o sucesso de tais programas, é importante levar em consideração o conhecimento da epidemiologia da doença em conjunto com técnicas laboratoriais adequadas, além de buscar fatores associados à permanência do vírus no rebanho Os objetivos desse estudo foram o de avaliar a prevalência e fatores de risco do vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e herpervirus bovino tipo 1 (BoHV-1) em rebanhos leiteiros não vacinados de uma cooperativa de produtores de leite no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Amostras de tanques de leite de 281 rebanhos leiteiros selecionados de forma aleatória simples foram testados para anticorpos contra o BVDV utilizando um kit comercial de ELISA e contra glicoproteína B do BoHV-1 através de um kit comercial de ELISA de bloqueio. Em cada propriedade avaliada, aplicou-se um questionário epidemiológico para investigar os fatores de risco para estas doenças. Uma prevalência de rebanho de 42,70% (120/281; IC 95%: 36% - 48%) para infecção pelo BVDV e de 27,88% (75/269; IC 95%: 22% - 33%) para infecção pelo BoHV-1 foram encontradas na população estudada. Dentre os fatores de risco avaliados, a utilização de inseminação artificial foi considerado como fator de risco para infecção pelo vírus da diarreia viral bovina e possuir suínos na propriedade foi considerado como fator de proteção para infecção pelo herpesvirus bovino tipo 1. O presente estudo identificou 10,3% de rebanhos com infecção ativa de BVDV e uma prevalência moderada para ambas as doenças em uma população de pequenos rebanhos leiteiros criados em sistemas semi-intensivos de produção que não utilizam medidas específicas de controle de infecção. / The dairy cattle is important to supply the Brazilian market, with the state of Rio Grande do Sul as the second largest producer. Viral diseases cause several damages in the bovine production. In order to maintain and improve the level of production, it becomes important to establish health programs that allow the control of diseases that can result in large economic losses. For the success of such programs, it is important to take into account the knowledge of the epidemiology of the disease in conjunction with appropriate laboratory techniques, and risk factors associated with persistence of the virus in the herd. The objectives of this study were to assess the prevalence and risk factors for the bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in unvaccinated dairy herds of a cooperative of milk producers in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Bulk tank milk samples from 281 dairy herds selected by simple random sampling were tested for BVDV antibodies using a commercial ELISA kit and against the glycoprotein B of BoHV-1 using a commercial ELISA kit of blocking. In each assessed property, we applied an epidemiological questionnaire to investigate risk factors for these diseases. A herd prevalence of 42.70% (120/281, 95% CI: 36% - 48%) for BVDV infection and 27.88% (75/269, 95% CI: 22% - 33%) for BoHV-1 were observed in the studied population. Among the risk factors evaluated, the use of artificial insemination was considered as a risk factor for infection with bovine viral diarrhea virus and pigs on the property have been considered as a protective factor for infection by bovine herpesvirus type 1. The present study identified 10.3% of herds with active BVDV infection and a moderate prevalence for both diseases in a population of small dairy herds reared in semi-intensive systems of production which do not use specific measures to control infection.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

Rabbits have been used as animal models to study the pathogenesis of neurological infection by bovine herpesvirus type 5 (BHV-5), an important agent of meningoencephalitis in cattle. The olfactory system has been implicated as the main pathway for the virus to reach the brain after replication in the nasal mucosa. To investigate the role of the olfactory route in the pathogenesis of neurological infection, a technique of transfrontal craniotomy for ablation of the main olfactory bulbs (MOBs), using the eyes as the anatomic reference was developed and evaluated. Using this technique, twenty three 30 days-old rabbits were submitted to surgical ablation of the MOBs and subsequently inoculated with BHV-5. After skin, subcutaneous tissue and periosteum incisions, the craniotomy was performed in a point equidistant to the medial corner of the eyes, with a 3 mm drill coupled to a low intensity elyptic drilling machine. The removal of the MOB s tissue was performed by using a number 6 uretral probe coupled to a surgical vaccum pump. The anatomic references used were appropriate in allowing an adequate and easy access to the MOBs. Necropsy performed in three animals after the surgery demonstrated that the surgical procedure was efficient in completely removing the MOB tissue. This was also demonstrated by the interruption of the access of the virus to the brain after intranasal inoculation: only one animal (1/11) in the bulbectomized group developed neurological infection and disease, against 100% (10/10) of the control group. The transfrontal craniotomy using the eyes as the anatomical reference allowed for an adequate access for localization and removal of the MOBs in rabbits. This techique may be used in studies of viral pathogenesis requiring the complete interruption of the olfactory connection to the brain. / Coelhos têm sido utilizados como modelo para o estudo da neuropatogenia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5), um importante agente de doença neurológica em bovinos. O sistema olfatório tem sido apontado como a principal via de acesso do vírus ao cérebro após replicação na cavidade nasal. Para investigar a importância da via olfatória na patogenia da infecção neurológica pelo BHV-5, foi elaborada e avaliada técnica operatória de craniotomia transfrontal para remoção dos bulbos olfatórios (BOs), definindo-se as órbitas como referência anatômica. Foram utilizados 45 coelhos com 30 a 40 dias de idade, sendo 23 submetidos à ablação cirúrgica dos BOs e posteriormente inoculados pela via intranasal (IN) ou no saco conjuntival (IC) com o BHV-5. Após incisões de pele, tecido subcutâneo e periósteo, a craniotomia foi realizada em um ponto eqüidistante entre os cantos mediais dos olhos, com uma broca sulcada de 3mm acoplada a uma perfuratriz elétrica de baixa rotação. A remoção dos BOs foi realizada com uma sonda uretral nº6 acoplada a um aspirador. O estudo macroscópico de três animais após a cirurgia comprovou que o procedimento foi eficiente na remoção total dos BOs. Isso também foi comprovado pela interrupção do acesso do vírus ao córtex cerebral: apenas um animal (1/11 ou 9,1%) no grupo submetido à ablação dos BOs com inoculação IN desenvolveu enfermidade neurológica, contra 100% (10/10) dos coelhos controle. Conclui-se que a técnica de craniotomia transfrontal utilizando a órbita como referência anatômica permite o acesso adequado para localização e remoção dos BOs e pode ser utilizada em estudos de patogenia de infecções por vírus neurotrópicos que exijam a interrupção completa da via olfatória.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.