Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2007

Tese de programa doutoral. Engenharia Biomédica. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 2011

Tese de doutoramento. Ciências de Engenharia. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto, Université Victor Segalen Bordeaux 2. 2008

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:08:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346010.pdf: 2085302 bytes, checksum: 99549ec52928f201e606c2cf4121f97b (MD5) Previous issue date: 2016 / Diversas culturas se baseiam na utilização de plantas para o tratamento de doenças. Plantas do gênero Aloe vem sendo utilizadas a séculos na medicina tradicional para cicatrização de feridas, como agente antibacteriano, como laxante e até mesmo para o tratamento do câncer. O extrato do parênquima clorofiliano (EPC) da Aloe barbadensis Miller é excretado quando a folha é cortada ou quebrada, este líquido de cor amarelada é rico em antronas, cromonas e seus derivados. Estudos com compostos isolados do EPC, aloína e Aloe emodina, mostram uma promissora atividade antitumoral dos mesmos. A incidência do melanoma cutâneo vem aumentando nos últimos anos, o que gera uma grande preocupação, uma vez que esse câncer é altamente agressivo apresentando alta possibilidade de metástase. Neste trabalho o EPC foi padronizado por HPLC, apresentando 5,6% em massa seca do isômero aloína B. A citotoxicidade foi avaliada do EPC em linhagens de fibroblastos L-929, assim como o efeito do EPC sobre a viabilidade, proliferação, morfologia e migração de duas linhagens de melanoma (SK-MEL-28 e B16-F10). De acordo com a ISO 10993-5, concentrações superiores a 185 µg·mL-1 de EPC são citotóxicas (decréscimo na viabilidade maior que 30%), sendo esse valor maior que o valor de IC50 de ambas as linhagens de melanoma, 125 e 165 µg·mL-1 para a SK-MEL-28 e B16-F10, respectivamente. Análise morfológica mostrou ponto de alta fluorescência, indicando uma reorganização dos filamentos de actina presentes no citoesqueleto. O resultado do ensaio de migração para ambas linhagens de melanoma mostrou que o EPC é mais eficaz em inibir a migração do melanoma humano SK-MEL-28. Células endoteliais (HUVEC) foram expostas ao EPC e os parâmetros de viabilidade celular, proliferação, morfologia, migração e formação de tubos foram avaliados. O EPC inibiu a migração de HUVECs mesmo em concentrações que não apresentaram efeito de decréscimo na atividade metabólica e proliferação celular. Pôde-se observar a retração das fibras de estresse em células tratadas com as concentrações de 10 e 100 µg·mL-1 de EPC. A formação de tubos em células endoteliais foi inibida na maior concentração testada (100 µg·mL-1), contudo ainda se observa a formação de brotos vasculares. Em suma o EPC proveniente de Aloe barbadensis Miller causou um decréscimo na viabilidade e proliferação celular assim como uma diminuição da capacidade de migração e alterações morfológicas de células de melanoma e endoteliais, influenciando também na formação de tubos vasculares por células endoteliais. / Abstract : Several cultures are based on the use of plants for the treatment of diseases. Plants of the genus Aloe has been used for centuries in traditional medicine, in wound healing, such as antibacterial agent, laxative and even for the treatment of cancer. The chlorophyll parenchyma extract (EPC) from Aloe barbadensis Miller is excreted when the sheet is cut or broken, this yellowish liquid is rich in anthrones, chromones and their derivatives. Studies on compounds isolated EPC, aloin and Aloe emodin, showed promising antitumor activity. The incidence of melanoma has increased in recent years, creating a great concern, since this cancer is highly aggressive and presents high possibility of metastasis. In this work the EPC was standardized by HPLC, showing 5.6% of dry weight of aloin B isomer. The EPC cytotoxicity was evaluated on fibroblast L-929 cell line, as well as the effect of EPC in cell viability, proliferation, morphology alterations and migration on two melanoma cell lines (SK-MEL-28 and B16-F10). According to ISO 10993-5, concentrations higher than 185 µg·mL-1 EPC are cytotoxic (decrease in viability was greater than 30%), this value being higher than the IC50 value of both melanoma cell lines, 125 and 165 µg·mL- 1 to SK-MEL-28 and B16-F10, respectively. Morphological analysis showed high fluorescence spots, indicating a reorganization of actin filaments present in the cytoskeleton. The result of the migration test for both melanoma cell lines showed that the EPC is more effective to inhibit the migration of human melanoma SK-MEL-28. Endothelial cells (HUVEC) were exposed to the EPC and parameters of cell viability, proliferation, morphology alterations, migration and tube formation was evaluated. The EPC inhibited HUVEC migration even at concentrations that has not shown effect in decrease of metabolic activity and cellular proliferation. It was observed the decrease of stress fibers in cells after treated with concentrations of 10 and 100 µg·mL-1of EPC. The tube formation on endothelial cells was inhibited at the highest concentration tested (100 µg·mL-1), however it was still possible to observe the formation of vascular sprouts. In short, the EPC from Aloe barbadensis Miller caused a decrease in cell viability and proliferation as well as reduced migration ability and morphological changes on melanoma and endothelial cells, also influencing the vascular tube formation by endothelial cells.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-11T04:07:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2016Bitstream added on 2017-07-11T04:21:40Z : No. of bitstreams: 1 342134.pdf: 7285031 bytes, checksum: b987d4d26a82eb2ecb193bbfe9adeb3d (MD5) / A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica caracterizada pelo acúmulo de lipídios e elementos celulares nas artérias de calibre médio e grande porte. Neste contexto, a modificação oxidativa da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e a geração de espécies reativas no ambiente vascular desempenham um papel importante no desenvolvimento desta patogênese. O disseleneto de difenila (PhSe)2, um composto orgânico de selênio, tem demonstrado relevante papel na prevenção da aterosclerose e de outras doenças relacionadas com o estresse oxidativo em diversos modelos experimentais. Os efeitos antioxidantes do (PhSe)2 estão relacionados a sua capacidade em atuar como mimético a glutationa peroxidase e também por aumentar as defesas antioxidantes celulares, através da ativação de fatores de transcrição, como o Nrf2. Neste contexto, nosso objetivo foi investigar os mecanismos moleculares envolvidos no efeito citoprotetor do (PhSe)2 em macrófagos e células endoteliais. Os nossos resultados demonstraram que o pré-tratamento com (PhSe)2 reduziu os efeitos tóxicos induzidos pela LDLox em macrófagos murinos J774, incluindo a geração de ERO, distúrbio da homeostase do ?NO, ativação de metaloproteinases de matriz, formação de células espumosas e disfunção mitocondrial. Além disso, os efeitos da sinalização redox do (PhSe)2 foram acompanhados pela regulação do fator de transcrição NF-?B, aumento dos níveis de GSH e da atividade da GGCS em macrófagos de forma dependente do tempo. Esses resultados estão relacionados com a capacidade do (PhSe)2 em promover a ativação e a translocação nuclear do fator de transcrição Nrf2. Por outro lado, o aumento da atividade da GGCS e a translocação para o núcleo do Nrf2 induzidas pelo (PhSe)2 foram revertidas pelos inibidores de PI3K, JNK e p38MAPK. Ainda, o (PhSe)2 aumentou os níveis proteicos de enzimas antioxidantes, como HO-1 e Prx-1, dependentes de Nrf2. Além disso, este composto aumentou a atividade da GPx, a qual está relacionada com o aumento nos níveis proteicos das isoformas GPx1 e GPx2 da enzima. Interessantemente, o (PhSe)2 aumenta os níveis de MnSOD e GPx2, enzimas que não são alvos de Nrf2, sugerindo que outro fator de transcrição pode estar envolvido no efeito antioxidante do (PhSe)2. Considerando o importante papel das células endoteliais vasculares no processo aterogênico, utilizando células endoteliais da aorta bovina (BAEC), investigamos o efeito citoprotetor do (PhSe)2 nestas células expostas a privação de oxigênio e glicose, seguido de reoxigenação (OGD), simulando um quadro dehipóxia. Inicialmente verificamos que o (PhSe)2, na sua forma reduzida selenol, aumentou a constante de reação com ONOO- na medida que o pH diminuiu, sugerindo apresentar um efeito protetor em casos de acidose metabólica, como ocorre na hipóxia. Além disso, o (PhSe)2 preveniu a morte celular e a geração de ERO/ERN induzidos pela OGD. Ademais, a OGD diminuiu o potencial de membrana mitocondrial e a eficiência respiratória mitocondrial, sendos esses efeitos prevenidos pelo tratamento com (PhSe)2. Este efeito protetor pode estar relacionado, em parte, a sua atividade antioxidante como mimético da GPx e, por outro lado, por sua capacidade em ativar fatores transcricionais promotores do aumento da expressão de enzimas antioxidantes, diminuindo, desta forma, os efeitos nocivos provocados por espécies reativas e melhorando, consequentemente, o ambiente redox celular. Assim, os nossos resultados sugerem que o (PhSe)2 melhorou os sistemas de defesas antioxidantes em macrófagos e em células endoteliais através da modulação de diferentes vias de sinalização.<br> / Abstract : Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease characterized by accumulation of lipids and cellular elements in the medium and large-sized arteries. In this context, the oxidative modification of low density lipoprotein (LDL) and the generation of reactive oxygen species (ROS) in the vascular environment play an important role in the development of this pathogenesis. The diphenyl diselenide (PhSe)2, an organic selenium compound, has been demonstrated significant role in prevention of atherosclerosis and other diseases associated with oxidative stress in different experimental models. The antioxidant effects of (PhSe)2 are related to its ability to act as glutathione peroxidase mimetic and also by increasing cellular antioxidant defenses, via activation of transcription factors, such as Nrf2. Thus, our goal was to investigate the molecular mechanisms involved in the cytoprotective effect of (PhSe)2 in macrophages and endothelial cells. Our results showed that pre-treatment with (PhSe)2 reduced the toxic effects induced by oxLDL in J774 murine macrophages, including ROS, disturbance of ?NO homeostasis, matrix metalloproteinase activation, foam cell formation and mitochondrial dysfunction. Moreover, the effects of redox signaling caused by (PhSe)2 were monitored by regulation of the transcription factor NF-?B, increasing GSH levels and GGCS activity in the macrophages in a time-dependent manner. These results are related to the capacity of (PhSe)2 in promoting activation and nuclear translocation of the transcription factor Nrf2. On the other hand, the increased GGCS activity and translocation of Nrf2 to the nucleus-induced by (PhSe)2 were reversed by inhibitors of PI3K, JNK and p38MAPK. Furthermore, (PhSe)2 increased the protein levels of antioxidant enzymes, such as HO-1 and Prx-1, an Nrf2-dependent mechanism. In addition, this compound increased GPx activity, which is related to the rise in the protein levels of GPx1 and GPx2 isozymes. Interestingly, (PhSe)2 increased the protein levels of MnSOD and GPx2, enzymes that are not Nrf2 targets, suggesting that another transcription factor may be involved in the antioxidant effect of (PhSe)2. Considering the important role of vascular endothelial cells in the atherogenic process, using bovine aortic endothelial cells (BAEC), we investigate the cytoprotective effect of (PhSe)2 in this cells exposed to deprivation of oxygen and glucose, followed by reoxygenation (OGD) protocol, simulating a hypoxia condition. Initially we found that the (PhSe)2, in reduced form selenol, increased reaction constant with ONOO- as the pH decreased, suggesting a protective effect in case of metabolicacidosis, as occurs in hypoxia. Furthermore, (PhSe)2 prevented cell death and generation of ROS/RNS induced by OGD. Moreover, OGD decresead the mitochondrial membrane potential and mitochondrial respiratory efficiency, being both of this effects prevented by (PhSe)2 treatment. This protective effect may be, in part, related by its antioxidant activity as GPx mimetic and, secondly, by its ability to activate transcription factors that enhance expression of antioxidant enzymes, reducing, thus, the harmful effects caused by reactive species and improving the intracellular redox environment. Thus, our results suggest that (PhSe)2 improved the antioxidant defense system in macrophages and endothelial cells through modulation of different signaling pathways.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:55:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lazarini_Mariana_D.pdf: 4089908 bytes, checksum: bf5ee8f74ac7dfe4c18c3e84bdeeecff (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes diferencialmente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Rho GTPase activating protein 21 (ARHGAP21) é uma proteína pertencente à família RhoGAP, que interage com ARF-GTPases e com alfa-catenina, modulando a dinâmica da actina associada às membranas do Golgi e à integridade das junções aderentes. O objetivo geral do presente estudo foi investigar as funções da proteína ARHGAP21 em células endoteliais e de adenocarcinoma de próstata com relação à viabilidade celular, ciclo celular, migração, adesão e expressão gênica. Neste trabalho foi demonstrado que ARHGAP21 possui atividade RhoGAP para RhoA e RhoC. Em células HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), foi observada uma localização nuclear e citoplasmática de ARHGAP21 e sua depleção induziu alterações no ciclo celular. Além disso, ensaios de microarranjos de DNA em HUVECs demonstraram modulação de genes como PAI-1, BNIP3, staniocalcina 1 e podocalyxin. Em linhagens celulares de adenocarcinoma de próstata (LNCaP e PC-3), também foi observada uma localização nuclear e citoplasmática de ARHGAP21. A diminuição da expressão desta proteína em células PC-3 resultou em redução da viabilidade e da migração celular em fibronectina. Com relação à viabilidade celular, a inibição de ARHGAP21 tem efeito adicional ao agente quimioterápico cisplatina. Em células LNCaP, por sua vez, foi observada uma menor adesão em matrigel e fibronectina das células submetidas à inibição da expressão de ARHGAP21, em comparação às células controle. Experimentos de microarranjos de DNA e RT-PCR quantitativo em tempo real em células de adenocarcinoma de próstata submetidas à inibição de ARHGAP21 demonstraram expressão alterada dos genes TGF-beta induced e dos genes BNIP3, staniocalcina 1 e podocalyxin, que também foram modulados nas células HUVECs com inibição da expressão de ARHGAP21. Em conclusão, o presente estudo identificou ARHGAP21 como uma proteína com importantes funções em células endoteliais e de adenocarcinoma de próstata, através da regulação da viabilidade, adesão e migração celular. Os achados aqui descritos sugerem que ARHGAP21 pode ser uma molécula alvo para a terapia de neoplasias, provavelmente através da sua função como reguladora da atividade de RhoA e RhoC / Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of differentially expressed genes and the function of their coding proteins. Rho GTPase activating protein 21 (ARHGAP21) is a RhoGAP protein, which interacts with ARF-GTPases and alpha-catenin, controlling actin dynamics on Golgi membranes and the integrity of adherens junctions, respectively. The aim of the present study was to investigate ARHGAP21 functions on endothelial and prostate cancer cells regarding to cell viability, cell cycle, migration, adhesion and gene expression. This study demonstrated that ARHGAP21 has RhoGAP activity for RhoA and RhoC. ARHGAP21 localized in the nucleus and cytoplasm of HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) and its depletion alteres the cell cycle phases. Furthermore, microarrays assays in HUVECs ARHGAP21 knockdown demonstrated modulation of genes such as PAI-1, BNIP3, stanniocalcin 1 and podocalyxin. In the prostate adenocarcinoma cell lines (LNCaP and PC-3), ARHGAP21 is also located in the nucleus and cytoplasm. Depletion of this protein in PC-3 cells resulted in decrease of cell viability and migration in fibronectin. Regarding to cell viability, inhibition of ARHGAP21 has an additional effect on cisplatin chemotherapeutic agent. In LNCaP cells, a lower adhesion was observed in matrigel and fibronectin of cells subjected to inhibition of ARHGAP21 expression compared to control cells. DNA microarray and quantitative RT-PCR experiments on prostate adenocarcinoma cells ARHGAP21 knockdown showed modulation of TGF-beta induced gene expression. The expression of BNIP3, stanniocalcin 1 and podocalyxin was also altered in HUVECs cells ARHGAP21 knockdown. In conclusion, this study identified ARHGAP21 as a protein with important functions in endothelial cells and prostate adenocarcinoma, by regulating cell viability, adhesion and migration. The findings described here suggest that ARHGAP21 may be a molecule target for cancer therapy, probably due to its GAP activity for RhoA and RhoC / Doutorado / Doutor em Fisiopatologia Medica

O hormônio melatonina produzido pela glândula pineal no período de escuro, participa na regulação circadiana de processos, fisiológicos e fisiopatológicos envolvendo vasos sanguíneos. Alguns destes estudos sugerem que as células endoteliais, que revestem os vasos sanguíneos são alvo para a melatonina circulante e medeiam a regulação do tônus vascular, em condições fisiológicas, e da interação neutrófilo-endotélio, em resposta a um estímulo injuriante. O óxido nítrico produzido pelas células endoteliais é um dos responsáveis por grande parte dos eventos vasculares, e a melatonina inibe a produção de óxido nítrico em diversos modelos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da melatonina na produção de óxido nítrico induzido por bradicinina em células endoteliais em cultura. Para tanto, utilizamos uma técnica de cultura primária de células endoteliais de rato e através de um marcador fluorescente de óxido nítrico intracelular, mensuramos a fluorescência em microscópio confocal. Foi verificado que a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina inibem a produção de óxido nítrico induzido por bradicinina e este efeito não ocorre pela inibição do aumento de cálcio que induz a produção de óxido nítrico. O análogo de receptores MT2 (4P-PDOT) e MT3 (5-MCA-NAT) não provocaram qualquer alteração sobre o aumento de óxido nítrico induzido por bradicinina, e a utilização do antagonista de receptores MT1 e MT2 (luzindol) não reverteu o efeito inibitório da melatonina. Portanto, nossos dados indicam que o efeito da melatonina sobre a atividade da NOS constitutiva não é mediado por receptores de membrana. Considerando que a melatonina é capaz de ligar-se à calmodulina, inibindo desta maneira a atividade da NOS endotelial constitutiva, poderíamos sugerir que este seria o mecanismo de ação. No entanto, é preciso ressaltar que tal atividade não é comprovada para a N-acetilserotonina, assim, apesar de ser este um possível mecanismo de ação, há a necessidade de demonstrar que a N-acetilserotonina está se ligando a calmodulina extraída de células endoteliais. Em resumo, neste trabalho mostramos que a melatonina em concentrações compatíveis com o pico noturno encontrado na circulação, pode modular eventos vasculares no organismo, através da inibição da produção de óxido nítrico em células endoteliais induzida por bradicinina. / Melatonin, the hormone synthesized by the pineal gland at night, signalizes darkness and modulates, in a circadian basis, blood vessels activity. Previous studies suggest that endothelial cells are the target for circulating melatonin and mediate changes in vascular tone and leukocyte-endothelial adherence properties. Melatonin effects can be mediated by several pathways, such as G protein-coupled receptors (MT1 and MT2 receptors), a putative membrane receptor, most probably an enzyme-binding site (MT3 receptor), and several intracellular mechanisms, including calmodulin binding and inhibition of constitutive and induced nitric oxide synthase. The aim of the present study was to characterize melatonin effect on the production of nitric oxide by bradykinin-stimulated endothelial cells in culture. Nitric oxide production was measured in real time at cellular level by detecting fluorescent stimulation of the probe DAF by confocal microscopy. After determining the ideal conditions for recording cumulative dose-response curves for bradykinin (1 – 100 nM) the effect of pre-incubated (1 min) melatonin and analogs was evaluated. Melatonin and its precursor, N-acetylserotonin, but not the selective ligands for receptors MT2 (4P-PDOT) and MT3 (5-MCA-NAT) receptors inhibited bradykinin-stimulated nitric oxide production. This effect was not blocked by the classical antagonist of MT1 and MT2 receptors, luzindol; excluding therefore the participation of membrane receptors. Taking into account that melatonin inhibits calmodulin activation of several enzymes, including constitutive nitric oxide synthase in brain and cerebellum, it could be suggested a similar mechanism for endothelial cells. However, this hypothesis is discussed taking into account that N-acetylserotonin was shown to do not bind neural cells calmodulin. In addition, here we discuss the relevance of the present finding according to physiological and physiopathological roles of endothelial nitridergic system. This analysis point melatonin modulation of constitutive nitric oxide synthase activity as a putative mechanism for explaining melatonin control of vascular tone.

A melatonina é produzida pela glândula pineal somente durante o escuro e atinge rapidamente a circulação, além disso, outros tecidos e células são capazes de produzir melatonina. As células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes alvos para as ações da melatonina. O entendimento dos mecanismos de ação pelos quais a melatonina desenvolve seus efeitos sobre as células endoteliais, possibilitaria o uso desta indolamina e de seus análogos como uma importante ferramenta farmacológica. No presente trabalho, demonstramos que a melatonina em concentrações compatíveis com as encontradas na circulação durante o pico noturno de produção pela pineal, atua sobre as células endoteliais inibindo a produção de NO proveniente da enzima constitutiva (eNOS), enquanto altas concentrações de melatonina, que podem ser atingidas por exemplo pela produção por células imunocompetentes ativadas, inibem a produção induzida de NO mediada pela iNOS. A melatonina (1 nM) inibe a produção constitutiva de NO induzida por agonistas que atuam através da ativação de receptores acoplados à proteína G (histamina, carbacol e ATP/P2Y), e este efeito deve-se à inibição do aumento de [Ca2+]i por liberação de estoques intracelulares, sendo independente da ativação de receptores de melatonina. A melatonina inibe os efeitos decorrentes da produção de NO induzida por bradicinina como a produção de GMPc por células endoteliais e a vasodilatação de arteríolas \"in vivo\". A melatonina inibe a produção de NO induzida por LPS também de maneira independente da ativação de seus receptores, porém, em concentrações muito maiores (1-10 µM) do que a necessária para inibir a produção constitutiva. Estes efeitos devem-se à inibição da expressão da enzima iNOS por impedir a translocação do NF-kB ao núcleo. A vasodilatação de aortas induzida por LPS também é inibida por melatonina. Podemos concluir até o momento que as células endoteliais, devido a sua localização, são excelentes sensores para as ações da melatonina e podem auxiliar no melhor entendimento do conceito \"eixo imune-pineal\". Os estudos sobre os mecanismos pelos quais a melatonina atua em condições fisiológicas e fisiopatológicas são essenciais para se conhecer o potencial terapêutico da melatonina. / Melatonin, the darkness hormone, produced at night by the pineal gland, is also synthesized in a non-rhythmic manner by other cells. Pineal and extra-pineal melatonin reaches endothelial layer, and the understanding of its mechanism of action will improve the possibilities of using this indolamine and derivates as pharmacological tools. Here we showed that melatonin, in concentrations compatible to nocturnal melatonin surge impairs the activity of eNOS, while much higher concentrations, which can be attained by activated immune competent cells, impair the induction of iNOS synthesis. As a consequence of inhibiting eNOS we showed that melatonin inhibits vasodilation of the microcirculation induced by bradykinin. The inhibitory effect of melatonin is observed only when eNOS is activated by triggering G protein-coupled receptors (bradykinin B2, muscarinic and P2Y purine receptors). Activation of eNOS by calcium-channel operated receptors (P2X) is not blocked by melatonin. Inhibition of the transcription of iNOS results in inhibition of the LPS-induced vasodilation of rat aorta. As a matter of fact, here we show that LPS effect is dependent on the endothelial layer. The mechanism of action of melatonin in inhibiting iNOS transcription is due to block of the NF-kB pathway. Our work contributed to unravel the role of endothelium cells as targets for melatonin and as a key player in the \"immune-pineal axis\". The understanding of the concentrations ranges reached by endogenous production, i.e., the discrimination between the levels achieved during physiological and physiopathological responses, are essential for using these substances as analogous therapeutical tools.

O melanoma é uma neoplasia de pele invasivo, com maior taxa de morte, sem tratamento efetivo. Nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC) tem sido empregadas com sucesso como carreadores de fármacos hidrofóbicos. Como o eugenol é um composto hidrofóbico com atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas em células cancerosas, visamos avaliar os efeitos dos tratamentos com acetileugenol (AC), LNC ou LNC contendo acetileugenol (LNC-AC) em modelo de melanoma in vivo em camundongos C57B6, e a citotoxicidade dos mesmos em células endoteliais (HUVEC) e de melanoma (SK-Mel-28) in vitro. Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamentos i.p. com as LNC ou com LNC-AC (50 mg/kg, 3-10 dia de indução do tumor) induziram toxicidade sistêmica e, somente o tratamento com LNC inibiu o desenvolvimento do melanoma. O tratamento com LNC, mas não com a mistura de triglicerídeos de cadeia média, por via oral, inibiu o desenvolvimento tumoral, sem toxicidade. Adicionalmente, os tratamentos com AC, LNC ou LNC-AC não foram eficazes quando administrados em fase tardia de evolução tumoral (50 mg/kg, 7-17 dia de indução do tumor, via oral); 2) os tratamentos agudos com AC, LNC ou LNC-AC (20 mg/kg, 200 &#181;L, e.v.) não alteraram o número de leucócitos circulantes, mas os tratamentos com LNC ou com LNC-AC reduziram o comportamento de rolling dos leucócitos em vênulas póscapilares do músculo cremaster e causaram hemólise, sendo que este último efeito também foi observado após tratamento in vitro em hemácias murinas; 3) Os estudos in vitro mostraram que as LNC e LNC-AC foram captadas pelas células HUVEC e SK-Mel-28 após 1 hora de incubação; que a incubação com LNC-AC induziu apoptose tardia e necrose com maior eficácia em SK-Mel-28 do que em HUVEC; que as incubações com LNC ou LNC-AC exerceram efeitos antiproliferativos, induzindo parada na fase G2/M do ciclo celular das duas linhagens de células avaliadas; que somente a incubação com AC ou LNC-AC inibiu a adesão ao Matrigel® com maior eficácia na linhagem SK-Mel-28 do que HUVEC; que somente a incubação com as LNC reduziram a expressão de VCAM-1 em HUVEC e que as incubações com LNC ou LNC-AC reduziram a expressão de &#946;3 integrina em SK-Mel- 28; que nenhum dos tratamentos alterou a migração celular das HUVEC ou SK-Mel- 28; que somente a incubação com LNC-AC reduziu os níveis de espécies reativas de oxigênio em HUVEC e SK-Mel-28; que a incubação com LNC ou LNC-AC aumentou a produção de óxido nítrico (NO) pelas duas linhagens de células avaliadas; que o tratamento com L-NAME reverteu os níveis de NO e a inibição sobre a proliferação celular induzida pela incubação com LNC ou LNC-AC e; que o tratamento de células de melanoma murino com LNC ou LNC-AC parece alterar a polarizar os neutrófilos para o fenótipo N1. Associados, os resultados obtidos mostram o tratamento oral com LNC inibe o crescimento do melanoma sem induzir efeitos tóxicos, e que este efeito benéfico pode ser dependente, pelo menos em parte, da nanoencapsulação dos triglicerídios de cadeia média e da supraestrutura da formulação, com toxicidade direta sobre as células de melanoma e possível modulação do microambiente tumoral. / Melanoma is the most invasive skin cancer, with high rates of death without effective treatment. Polymeric lipid-core nanocapsules (LNC) has been successfully used as carriers of hydrophobic drugs. As eugenol is an hydrophobic compound with antiproliferative and pro-apoptotic activity in cancer cells, here we aimed to evaluate the effects of treatments with acetyleugenol (AC), LNC or LNC containing acetyleugenol (LNC-AC) in an in vivo melanoma model in C57BL6 mice and the cytotoxicity of the treatments in vitro, using endothelial (HUVEC) and melanoma (SK-Mel- 28) cells. The results obtained showed that: 1) i.p. treatments with LNC or LNCAC (50 mg/kg, 3-10 days of tumor injection) induced systemic toxicity and, only the treatment with LNC inhibited the melanoma development. Treatment with LNC, but not with mix of triglycerides of medium chain, by oral route, inhibited the tumor development, without toxicity. In addition, the treatments with AC, LNC or LNC-AC were not effective when administered in the late stage of tumor evolution (50 mg/kg, 10-20 days of tumor induction, oral route); 2) the acute treatments with AC, LNC or LNC-AC (20 mg/kg, 200 &#181;L, intravenous route) did not altered the number of circulating leukocytes, but the treatments with LNC or LNC-AC reduced the rolling behavior of leukocytes in postcapillary venules of the cremaster muscle and induced hemolysis. The latter effect was also observed after in vitro treatment using murine erythrocytes; 3) In vitro studies showed that the LNC and LNC-AC suffered uptake by HUVEC and SK-Mel-28 cells after 1 hour of incubation; that the incubation with LNC-AC induced late apoptosis and necrosis more effectively in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that the incubation with LNC or LNC-AC presented antiproliferative effects, by inducing G2M arrest in cell cycle in both cells lines evaluated; that only the incubation with AC or LNC-AC inhibited the adhesion in Matrigel® with more efficaccy in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that only incubtion with LNC reduced the VCAM-1 expression in HUVEC and the incubation with LNC or LNC-AC reduced the &#946;3 integrin expression in SK-Mel-28 cells; that any treatment affected the HUVEC or SK-Mel- 28 migration; that only the incubation with LNC-AC reduced the levels of reactive species of oxygen in HUVEC and SK-Mel-28 cells; that the incubation with LNC or LNC-AC increased the nitric oxide (NO) production by both cell lines used; that the treatment with L-NAME reversed the NO levels and the inhibition on cell proliferation induced by incubation with LNC or LNC-AC and; that the in vitro treatment of murine with LNC or LNC-AC altered the neutrophil polarization to N1 phenotype. Together, results obtained show that the oral treatment with LNC inhibit the melanoma growth without any toxic effect, and that the beneficial effect could be dependent, at least in part, of nanoencapsulation of medium chain triglycerides and the supraestrucuture of the formulation, with direct toxicity on melanoma cells and possible modulation of tumor microenvironment.

A grande procura da humanidade por meios que favoreçam uma vida saudável tem impulsionado as pesquisas por novas substâncias capazes de satisfazer tais necessidades, e entre estas substâncias encontram-se os fitoestrógenos. Processos biológicos relacionados a Doenças Cardiovasculares (DCV) e outras doenças podem ser afetados por essas substâncias presentes em plantas. O fitoestrógeno resveratrol é um polifenol especialmente encontrado na uva e seus derivados, e sua ingestão tem sido associada à baixa taxa de mortalidade por câncer e DCV. Os fitoestrógenos das plantas possuem semelhança estrutural e funcional com o estrógeno, com propriedades que beneficiam o metabolismo celular através de ação antioxidante e antiagregante plaquetária. O endotélio é o principal alvo da ação dos estrógenos. Eles promovem a redução do engrossamento da parede vascular, aceleram o processo de reconstrução do endotélio após injúria vascular e favorecem a angiogênese. Os estrógenos diminuem a expressão de moléculas de adesão em resposta à citocinas e possuem efeito anti-apoptótico nas células endoteliais. Polifenóis são fitoestrógenos com alto potencial antioxidante presentes em frutas, grãos, vegetais, nozes e raízes. Estes compostos vêm sendo amplamente estudados por seus efeitos na supressão de tumores e na prevenção de DCV em modelos animais. Neste estudo, temos como objetivo geral avaliar a ação do resveratrol na produção de óxido nítrico e prostaglandina E2 em modelo in vitro de células endoteliais da linhagem ECV 304, bem como atividade antioxidante. O objetivo específico é determinar a melhor concentração do resveratrol em que se observa uma potente liberação de substâncias vasoativas e maior proteção contra radicais livres, conferindo proteção e prevenção de DCV. / The vast search of humanity for ways that favors a healthy life has driven the researches for substances capable of meeting such needs, and among these substances there are the phytoestrogens. Biological processes related to Cardiovascular Disease (CVD) and other illness can be affected by these substances present in plants. The phytoestrogen resveratrol is a polyphenol specially found in grapes and derivates, and its ingestion has been associated to low mortality rates by cancer and CVD. The plants phytoestrogens are similar structurally and functionally with estrogens, with properties that benefit cellular metabolism through their antioxidant and antiplatelet action. The endothelium is estrogen´s major target. They reduce thickening of the vascular wall, accelerate the reconstruction process of vascular endothelial after injury and promote angiogenesis. The estrogens decrease the expression of adhesion molecules in response to cytokines and have antiapoptotic effect on endothelial cells, and promotes raising in nitric oxide (NO) production. Polyphenols are phytoestrogens with high antioxidant effect present in fruits, grains, vegetables, nuts and roots. These compounds have been extensively studied due to their effect on tumors suppression and CVD prevention in animal models. In this study, we evaluated resveratrol´s action in nitric oxide production and prostaglandin E2 in in vitro model of endothelial cells ECV304, as well as it´s antioxidant activity. The specific objective is to determine the best concentration of resveratrol in which observes a potent liberation of vasoactive factors and the best anti free radical activity, leading to protection and prevention of CVD.