Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:20:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346382.pdf: 2254834 bytes, checksum: c7329745b16fad665ca5c57d63a02308 (MD5) Previous issue date: 2017 / As células-tronco cancerosas (CTCs) foram observadas e isoladas em diversas lesões malignas com base na expressão de seus marcadores proteicos. Essas células estão associadas à iniciação e progressão tumoral, bem como, à resistência ao tratamento. Este trabalho teve como objetivo investigar a presença das proteínas marcadoras de CTCs NANOG, NESTIN e ß-tubulina, em queilite actínica (QA), carcinoma epidermoide de lábio (CEL) e epitélio não neoplásico (ENN). Trinta casos de QA, trinta casos de CEL e 20 casos de ENN foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica para avaliação das três proteínas. A imunomarcação de NANOG foi significativamente mais presente em QA quando comparada com ENN (Núcleo p=0,007; Citoplasma p=0,012) e, na comparação entre os diferentes graus de displasia em QA, foi mais presente nos casos de alto risco (AR) segundo a classificação binária (Núcleo p=0,017; Citoplasma p=0,044). Já em CEL, sua expressão foi maior nos casos bem diferenciados (BD), sugerindo fortemente sua participação nas fases iniciais da carcinogênese. A expressão de NESTIN foi predominante citoplasmática e significantemente menos presente em ENN quando comparada com QA (p=0,001) e com CEL (p=0,003). Além disso, apresentou tendência a maior expressão em QA com displasia epitelial intensa (DEI) ou AG e CEL BD (sem significância estatística), fato que poderia sugerir a participação de NESTIN também nas fases iniciais da carcinogênese. A marcação de ß-tubulina foi predominantemente citoplasmática e intensa em todas as lesões estudadas, sem relevância estatística. Os resultados sugerem a participação das proteínas marcadoras de CTCs NANOG e NESTIN no comportamento biológico de QA e CEL principalmente no desenvolvimento e transformação da lesão pré-maligna (QA) em maligna (CEL).<br> / Abstract : Cancer stem cells have been observed and isolated in several malignant lesions based on the expression of their protein markers. These cells are associated with tumor initiation and progression as well as resistance to treatment. In this study we investigated the presence of cancer stem cells protein markers NANOG, NESTIN and ß-tubulin in actinic cheilitis (AC), lip squamous cell carcinoma (LSCC) and non-neoplastic epithelium (NNE). Thirty cases of AC, thirty cases of LSCC and twenty cases of NNE were submitted to the immunohistochemical protocol to evaluate the presence of the three proteins. Immunostaining of NANOG was significantly higher in AC when compared to NNE and (Nucleus p=0,007; Cytoplasm p=0,012), when comparing different degrees of dysplasia in AC, it was more present in high grade cases, according to the binary classification (Nucleus p=0,017; Cytoplasm p=0,044). In LSCC, its expression was higher in well differentiated cases, strongly suggesting its participation in the early stages of carcinogenesis. The expression of NESTIN was predominantly cytoplasmic and significantly less present in NNE when compared to AC (p=0,001) and LSCC (p=0,003). In addition, there was a trend of higher expression in intense epithelial dysplasia or high grade AC and well differentiated LSCC (without statistical significance), which could suggest a participation of NESTIN also in the early stages of carcinogenesis. The labeling of ß-tubulin was predominantly cytoplasmic and intense in all studied lesions, with no statistical relevance. The results suggest the participation of NANOG and NESTIN in the biological behavior of AC and LSCC, mainly in the development and transformation of premalignant (AC) to malignant (LSCC) lesions.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

Submitted by MARIANA MIZIARA DE ABREU TEODORO null (marimiziara@gmail.com) on 2016-03-21T18:48:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mariana Miziara de Abreu Teodoro.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T20:37:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 teodoro_mma_me_bot.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T20:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 teodoro_mma_me_bot.pdf: 1597455 bytes, checksum: f121a89794f14989756c7e7c5208127a (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Doença de Chagas (DC), cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), tornou-se nos últimos anos um grave problema de saúde pública, mesmo em países não-endêmicos. Um importante desafio para os pesquisadores da doença de Chagas é estabelecer os eventos que levam alguns pacientes a desenvolver a doença crônica assintomática, ou forma indeterminada, enquanto outros evoluem para uma doença severa, com lesões em tecidos cardíacos ou gastrointestinais. Alguns estudos têm sugerido que a ausência de sintomas clínicos em indivíduos com a forma crônica indeterminada está associada a um controle eficaz da resposta imune efetora contra o parasita, que evita uma resposta inflamatória excessiva, o que resultaria em lesão tecidual. Não existem estudos com o objetivo de confirmar este mecanismo em pacientes com a forma digestiva da DC, especialmente em relação ao controle modulador de mecanismos efetores envolvendo células Th17, por células Treg. No presente estudo, nós avaliamos em pacientes com a forma digestiva da DC e em pacientes com a forma indeterminada ou assintomática a taxa de ativação Th17/Treg, através da avaliação da freqüência de células Th17 e Treg por citometria de fluxo; da expressão do mRNA para Rorγt e Foxp3, fatores de transcrição envolvidos na diferenciação dessas células, respectivamente; bem como os níveis de IL-17a e IL-10 em sobrenadantes de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC’s). Foi demonstrado no presente estudo, que em pacientes com a forma digestiva da DC há um desequilíbrio na taxa de ativação de células Th17/Treg, favorecendo o perfil Th17, enquanto que em pacientes com a forma indeterminada, este desequilíbrio favorece o perfil Treg. Os nossos resultados apoiam a hipótese de que o desequilíbrio na taxa de ativação Th17/Treg observado no grupo de pacientes digestivos, favorecendo Th17 em detrimento de Treg, geraria um ambiente não regulador, que resulta em uma resposta inflamatória exacerbada, responsável pelas lesões dos tecidos gastrointestinais apresentadas por estes pacientes. / Chagas disease (CD) whose etiological agent is the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in recent years became a serious problem of public health even in nonendemic countries. One important challenge for the researchers of Chagas disease is to establish the events that lead some patients to develop asymptomatic or indeterminate chronic disease, while others undergo severe disease with lesions in cardiac or gastrointestinal tissues. Some studies have suggested that absence of clinical symptoms in individuals with the indeterminate chronic form is associated to a fine control of effector immune responses against the parasite that avoid a perpetuated inflammatory process which results in tissue injury. There are no studies aiming to confirm this mechanism in patients with digestive form of the disease, particularly in relation to the modulatory control by Treg cells of effector mechanisms involving Th17. Here, we studied in patients with the digestive form of CD and in those with the indeterminate or asymptomatic form of the disease, the ratio Th17/Treg activation by evaluating the frequency of Th17 and Tregs cells by flow cytometry, mRNA expression for Rorγt and Foxp3, the transcription factors involved in the differentiation of these cells respectively as well as the levels of IL-17a and IL-10 in peripheral blood mononuclear cells culture supernatants. We showed that in patients with digestive form of the disease there is an imbalance in the ratio Th17/Treg cells activation in favor of Th17, while in patients with the indeterminate form, this imbalance favour Treg activation. Our findings support the hypothesis that in contrast with indeterminate patients a non regulatory environment observed in patients with digestive CD, which results in an exacerbated inflammatory response exerted by Th17, due to lower Treg activation, may be responsible for tissue lesions in these patients. / FAPESP: 2013/02223-7

Resumo

El objetivo general del presente trabajo de título es estudiar la viabilidad de obtener celdas solares de bajo costo, con la finalidad de fabricar una celda solar con los equipos y tecnología disponibles en la actualidad en la Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas de la Universidad de Chile. Para esto se estudiaron las etapas de obtención de una celda solar, tal como el proceso de formación de textura en el sustrato, deposición y difusión de distintas capas dopantes y formación de contactos metálicos. En la actualidad, nuestra facultad ha considerado la importancia que existe en la investigación de este tipo de energía. Es por esto que la Dra. Denise Criado, del Departamento de Ciencias de los Materiales de la Universidad de Chile, ha iniciado esta línea de investigación, comenzando con la fabricación y caracterización de películas delgadas para aplicación en celdas solares de bajo costo en un laboratorio convencional. Sin duda, para desarrollar esta tecnología es necesario disponer de un laboratorio con las características adhoc, el cual no está disponible. Por lo tanto, es necesario reacondicionar equipos e instalaciones para cumplir los requerimientos mínimos de fabricación y limpieza. Los procesos iniciales de fabricación fueron destinados para acondicionar y mejorar las condiciones de construcción y poder definir factores que influían de forma relevante en los flujos de corriente del dispositivo definitivo. Para esto se determinaron volúmenes óptimos de películas a través de los experimentos y literatura, tiempos óptimos de exposición y deposición dentro de los diversos procesos involucrados. Se logró fabricar una juntura de aluminio, silicio y fósforo, para posteriormente depositar contactos metálicos y así lograr medir flujos de corriente. A su vez, se probó una celda solar, donde los contactos eran proporcionados por un polímero conductor. De estas medidas se logró determinar la existencia de aumentos en el flujo de corriente, tanto en junturas con contactos poliméricos como en junturas con contactos metálicos comparadas con medidas realizadas a la juntura sin contacto. El mayor aumento en el flujo de corriente fue obtenido en una celda con contactos metálicos, llegando cerca de 49 mA, por sobre el flujo de 3,3 mA obtenido en celdas con contacto polimérico, sobre probetas de 1 in2 . Se obtuvo una eficiencia de 1,5 % para la celda de contactos metálicos, valor que puede aumentar mejorado procesos que lleven a un mejor contacto metálico, disminuir resistencias en el cuerpo de la celda y en los contactos, disminuir impurezas, mejorar gradiente de difusión y minimizar contacto lateral entre capas.

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. A glândula prostática é alvo dos hormônios androgênicos que são responsáveis pela diferenciação e crescimento do epitélio e estroma prostáticos. Os mecanismos proliferativos da próstata envolvem uma série de fatores que operam em conjunto para manter o equilíbrio entre inibição e/ou proliferação celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos na proliferação de células epiteliais prostáticas humanas derivadas de HPB. As células foram incubadas com diferentes concentrações de dihidrotestosterona (DHT). Uma baixa concentração de DHT (10-13 M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células. Para se verificar se o efeito proliferativo ocorre via receptor de androgênio (AR), as células foram tratadas com o antiandrogênio hidroxiflutamida e a proliferação foi inibida. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em diferentes tempos de tratamento e concentrações de DHT. Os níveis de mRNA do AR aumentaram significativamente nos grupos tratados com DHT.10-13 M em 3, 4 e 6 horas de estímulo hormonal, sendo que um aumento marcante na expressão do AR foi observado em 4 horas de tratamento. Em relação às diferentes concentrações de DHT testadas no tempo de 4 horas (DHT.10-8, DHT.10-10 e DHT.10-13 M), a expressão do AR aumentou significativamente no grupo tratado com DHT.10-13 M em relação ao grupo controle. Buscando averiguar o possível papel de genes envolvidos na proliferação celular que podem ser modulados pela ação androgênica, em células epiteliais prostáticas, avaliou-se também por RT-PCR a expressão do p21 e do bcl-2. A expressão gênica do p21 foi verificada no intervalo de tempo de zero à 6 horas de tratamento com DHT.10-13 M, não apresentando diferença em seus níveis de mRNA nos tempos avaliados. Quando as células foram incubadas durante 4 horas com diferentes concentrações de DHT, observou-se que a concentração mais alta (10-8 M) provocou um aumento significativo nos níveis de mRNA do p21 em relação ao grupo tratado com DHT.10-13 M. O gene do bcl-2 teve sua expressão avaliada no mesmo intervalo de tempo do p21. Os níveis de mRNA do bcl-2 aumentaram significativamente em 15 minutos de tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tempo zero e aos grupos tratados por 1 e 4 horas. Os dados obtidos neste trabalho indicam que baixas concentrações de dihidrotestosterona estimulam a proliferação das células epiteliais prostáticas derivadas de HPB, por uma via que parece envolver a expressão do AR, do p21 e do bcl-2.

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Orientador: Rogério Martins Amorim / Coorientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Banca: Ana Liz Garcia Alves / Banca: Wilson Roberto Fernandes / Resumo: A utilização de células-tronco adultas autólogas surgiu como uma alternativa terapêutica no tratamento de equinos, com resultados bastante promissores. Adicionalmente, a terapia com células alogênicas viabiliza a manutenção de um banco de células, proporcionando assim seu uso imediato. O objetivo deste trabalho foi avaliar, morfologicamente, a resposta inflamatória e detectar as células-tronco mesenquimais (CTMs) marcadas, autólogas e alogênicas, após a inoculação no músculo gluteus medius de equinos. Para tal, foram utilizados 15 equinos, divididos igualmente em três grupos de cinco animais, sendo o grupo 1 (controle), grupo 2 (células autólogas), grupo 3 (células alogênicas). Os animais foram submetidos à punção de medula óssea e após o cultivo, essas células foram caracterizadas fenotipicamente por citometria de fluxo e submetidas à diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, para caracterização da linhagem mesenquimal. Em seguida, as células autólogas e alogênicas foram marcadas com o nanocristal Qtracker 655® e inoculadas no músculo gluteus medius dos grupos 2 e 3, respectivamente. No grupo 1 foi inoculado PBS (solução salina tamponada com fosfato). Em cada grupo foi realizada uma biópsia 30 dias antes e outra 24h após o transplante das células e à inoculação do PBS. A análise dos resultados das biópsias demonstrou, por meio de colorações como Hematoxilina-Eosina, Gomori Modificado e NADH-tr, que a morfologia e o metabolismo das fibras foram mantidos tanto no grupo controle como nos grupos tratados. Além disso, foi possível detectar as CTMs marcadas no tecido muscular por meio de imunofluorescência. Portanto, concluiu-se que as CTMs autólogas e alogênicas transplantadas foram detectadas no tecido muscular de equinos e morfologicamente, não provocaram reação inflamatória 24h após o transplante / Abstract: The use of autologous adult stem cells appeared as therapeutic alternative in treatment of horses with promising results. Allogeneic cell therapy enables maintenance a bank of cells, thereby providing immediate use. The aim of this study was to evaluate the inflammatory response and tracker autologous and allogeneic, mesenchymal stem cell (MSCs) after gluteus medius muscle horse injection. In this research, we used fifteen horses that were divided equally into three groups of five animals each, with Group 1 (control), Group 2 (autologous cells) and Group 3 (allogeneic cells). The animals undergo bone marrow aspiration for culture and isolation of mesenchymal cells. These cells, after culture were phenotypically characterized by flow cytometry and differentiation for characterization of the mesenchymal lineage. Upon such identification, autologous and allogeneic cells were marked with Qtracker 655® and inoculated in the gluteus medius muscle of groups 2 and 3, respectively. In group 1 was inoculated an equal volume of PBS (phosphate buffered saline). In each group a biopsy was done thirty days before and 24h after inoculation of the cells and PBS. Biopsies results showed through stains such as hematoxylin-eosin, modified Gomori and NADH-tr, that the tissue integrity and fiber metabolism was maintained in both, control and treated groups. Additionally, was possible to detect MSCs tracked in muscle tissue through immunofluorescence. Therefore, we conclude that autologous and allogeneic BM-MSCs could be detected in muscle tissue and through morphology analysis, caused no inflammatory reaction, 24 hours after transplantation / Mestre

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: As células tronco mesenquimais tem por definição a autorrenovação, fonte de proliferação e a diferenciação celular em várias linhagens, sendo cartilagem, osso e tecido adiposo. Quanto características funcionais destacam-se cinco características: Suporte estrutural ou arcabouço, controle da inflamação, inibição da apoptose, ação anti-fibrose e por fim a diferenciação, cada um sendo responsável por secretar citocinas e hormônios de crescimento. As plaquetas, os hormônios de crescimento e fase de remodelamento de feridas crônicas abrangem várias etapas, começando pela fase da hemostasia e terminando na fase do remodelamento que vai garantir a força e o fechamento da ferida. Cada fase tem sua importância e secretam também inúmeros fatores de crescimento e citocinas importantes. A linha de curativos biológicos vem sendo desenvolvida há 15 anos no Laboratório de Engenharia Celular. Os resultados com o uso destes biocurativos têm sido excelentes, no entanto observa-se que quanto mais antiga é a lesão, ou maior a idade, maior é também a dificuldade no fechamento da área, e o risco de infecção secundária aumenta. Diante disto, encontrou-se uma oportunidade de melhoria do produto com os avanços no cultivo de células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo, esta técnica propicia a obtenção de diferentes fatores de crescimento que modulam o fechamento de feridas. Uma das etapas do projeto foi avaliar pacientes idosos com feridas crônicas acima de três anos, a média obtida dos hor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells are by definition self-renewal, a source of proliferation and cell differentiation in various strains, being cartilage, bone and adipose tissue. As for functional characteristics, five characteristics stand out: structural support or framework, inflammation control, inhibition of apoptosis, anti-fibrosis action and finally differentiation, each one being responsible for secreting cytokines and growth hormones. Platelets, growth hormones and chronic wound remodeling phase span several stages, beginning with the hemostasis phase and ending at the remodeling phase that will ensure strength and wound closure. Each phase has its importance and also secrete countless important growth factors and cytokines. The line of biological dressings has been developed for 15 years in the Laboratory of Cellular Engineering. The results with the use of these bio-curatives have been excellent, however, it is observed that the older the lesion, or the greater the age, the greater the difficulty in closing the area, and the risk of secondary infection increases. In view of this, there was an opportunity to improve the product with advances in the cultivation of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue, this technique provides the achievement of different growth factors that modulate the closure of wounds. One of the steps of the project was to evaluate elderly patients with chronic wounds over three years, the average obtained from growth hormones compared to healt... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.