Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-05T14:48:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-11-05T12:52:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-11-05T12:52:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) Previous issue date: 2006 / INTRODUÇÃO: Mesmo com a Constituição brasileira definindo o país como um Estado laico, observa-se grande dificuldade de transição entre o Estado confessional, seguido até o Século XIX, e a secularidade pública hoje requerida. OBJETIVO: Estudar as implicações religiosas relacionadas com as Propostas de Emenda Constitucional (PECs) e Projetos de Lei (PLs) e os respectivos apensos, cujos conteúdos estejam relacionados direta ou indiretamente com a temática da clonagem terapêutica humana. METODOLOGIA: Foram analisados as PECs e PLs em tramitação no Congresso Nacional brasileiro entre os anos 2001 e 2005 e que continham as palavras-chave células-tronco, clonagem humana, clonagem terapêutica e embriões humanos. RESULTADOS: Foram identificadas três PECs e cinco PLs neste contexto. Todas as PECs são contrárias ao uso de embriões humanos e definem o início da vida desde a sua concepção. Com relação aos PLs, verifica-se que: um projeto permite o uso de células-tronco por meio da técnica de clonagem terapêutica; um segundo projeto autoriza pesquisas com embriões transferidos para o útero materno e abortados espontaneamente; os três restantes proíbem as pesquisas com embriões humanos em qualquer situação ou estágio de desenvolvimento. DISCUSSÃO: A análise das proposições revelou que dos oito projetos analisados, seis possuem conteúdo que proíbe o uso de embriões humanos, a partir de incisivas justificativas religiosas. Dos dois restantes, um deles permite a clonagem de embriões humanos para fins terapêuticos e o outro abre espaço conciliatório para discussão da matéria. CONCLUSÃO: Todas as três PECs analisadas e três dos cinco PLs apresentam forte conteúdo religioso e nenhuma base científica tanto nos conteúdos legislativos como nos pronunciamentos parlamentares adicionais. O Estado laico deve ser rigorosamente neutro com relação às diferentes confissões religiosas, não permitindo a imposição de valores morais não compartilhados por todos os representantes de uma sociedade pluralística. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / INTRODUCTION: Even though the Brazilian Constitution defines the nation as a laic State, a great difficulty has been observed in the transition from the confessional State, following up to the XIX Century, to the public secularity presently required. OBJECTIVE: To study the religious implications related to the Constitutional Amendment Bills (PEC) and the Legislative Bills (PL), as well as the respective attached documents, which contents are related, either directly or indirectly, to the human therapeutic cloning issue. METHODOLOGY: Both, the PECs and the PLs under consideration in the Brazilian National Congress between 2001 and 2005, which incorporated the keywords: stem cells; human cloning; therapeutic cloning; and human embryos, were analyzed. RESULTS: Three PECs and five PLs were identified within this context. All the PECs are against the use of human embryos defining the onset of live since its conception. As far as the PLs are concerned, it was verified that: one legislative bill allows the use of stem cells by means of the therapeutic cloning technique; the second one authorize research with embryos transferred to the motherly uterus and aborted spontaneously; and the remaining three forbid the research with human embryos in any situation and development stage. DISCUSSION: The analysis of the propositions revealed that, from the eight projects which were investigated, six have contents that forbid the use of human embryos based on incisive religious justifications. From the remaining two, one of them allows the cloning of human embryos for therapeutic purposes and the other opens a space for a conciliatory discussion of the subject. CONCLUSION: All the three PECs analyzed and three of the five PLs presented a strong religious content and no scientific reason, on both the legislation itself as well as the additional parliamentarians’ pronunciations. The laic state must be rigorously neutral regarded to the different religious believes, not allowing the imposition of moral values which are not common sense among all representatives of a pluralistic society.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by claudia teixeira (claudiadtx@gmail.com) on 2011-06-22T00:06:57Z No. of bitstreams: 1 2010_DanielaFerreiraAraújo.pdf: 426000 bytes, checksum: 71813e9376cc8c000b705365aa96ba71 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-06-29T14:09:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_DanielaFerreiraAraújo.pdf: 426000 bytes, checksum: 71813e9376cc8c000b705365aa96ba71 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-29T14:09:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_DanielaFerreiraAraújo.pdf: 426000 bytes, checksum: 71813e9376cc8c000b705365aa96ba71 (MD5) / A polpa dentária, por ser fonte de células-tronco multipotentes, tem merecido inúmeras pesquisas para se conhecer melhor suas características. Este estudo teve como objetivo sistematizar os conhecimentos, avanços científicos, limitações e perspectivas relacionados à aplicação de células-tronco de tecido pulpar (Artigo 1: "Células-tronco da polpa dental- Atualidades e perspectivas"); e avaliar se os dentes extraídos e mantidos em temperatura e pressão ambientes por diferentes períodos de tempo ainda apresentavam suas células viáveis (Artigo 2: Cultura de células de polpa dental humana após diferentes períodos pós-exodontia). O Artigo 1 foi resultado de uma revisão da literatura que incluiu artigos que abordavam os tópicos relacionados ao desenvolvimento das possibilidades de utilização da polpa dentária para cultivo e viabilidade de células-tronco. No Artigo 2, foi realizado trabalho experimental com utilização de 21 dentes permanentes hígidos, divididos em 5 grupos de acordo com o tempo aguardado para colocação da polpa em meio de cultura após a exodontia. Os tempos testados foram: imediatamente; 30 minutos, 1 hora, 2 horas e 5 horas. Realizou-se análise morfológica, ensaio de MTT e contagem celular para efeito de comparação da viabilidade celular. O comportamento de todos os grupos foi semelhante. Concluiu-se que as possibilidades de uso e o potencial regenerativo das células do tecido pulpar são vastos, e por isso, é importante a atualização dos conhecimentos, avanços científicos, limitações e perspectivas relativos à sua aplicação (Artigo 1). Além disso, as conclusões sobre a viabilidade das células pulpares após a exodontia são que aguardar até 5 horas para remover o tecido pulpar e estabelecer a cultura não impede a proliferação celular (Artigo 2). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dental pulp, as a source of multipotent stem cells, has motivated numerous researches to better understand its characteristics. The study aimed to systematize knowledge, scientific advances, limitations and perspectives related to the application of stem cells from pulp tissue (Article 1: "Dental pulp stem cells- Update and perspectives”); and to evaluate whether the extracted teeth that were maintained in ambient temperature and pressure for different periods of time would still present their cells viable (Article 2: Culture of human dental pulp cells after different times post-extraction). Article 1 was the result of a review. In Article 2, the experimental research was performed with 21 permanent healthy teeth, which was divided into five groups according to the time projected for placing the pulp into the culture medium after the extraction. The experimental times were: immediately, 30 minutes, 1 hour, 2 hours and 5 hours. Morphological analysis, MTT assay and cell counting were evaluated. The behavior of all groups was similar. It was concluded that the possibilities of use and regenerative potential of dental pulp cells are vast, and therefore the update of knowledge, scientific advances, limitations and prospects for its implementation is important (Article 1). Moreover, conclusions about the viability of pulp cells after extraction is that to wait until 5 hours to remove the pulp tissue and establish a culture does not impair their proliferation (Article 2).

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

Orientação: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T01:18:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_PriscilaMeirelles_M.pdf: 16438409 bytes, checksum: 1276810b9fc2617332f439ef171bc3ce (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: As células natural killer uterinas (NKu) estão presentes no útero de roedores durante a gestação, período em que surgem e se diferenciam, desaparecendo por completo ao final deste. Os fatores envolvidos nos mecanismos de diferenciação e ativação destas células, bem como as funções por estas desempenhadas são pouco conhecidas. A dificuldade na compreensão plena das funções das NK do ambiente uterino é atribuída à complexidade e dinamismo do ambiente uterino durante a gestação. Os estudos realizados in vitro são igualmente inconclusivos devido à falta do estabelecimento de uma condição padrão nos ensaios realizados. O presente trabalho teve o intuito de padronizar uma condição de obtenção e manutenção de células NKu viáveis para ensaios in vitro, a partir do cultivo primário da glândula metrial. Foram utilizados fragmentos (explantes) da glândula metrial obtidos de camundongos prenhes no 8° dia de gestação (ddg). Estes explantes foram cultivados por 24 e 48 horas, em meios de cultivo MEM e RPMI, com ou sem a adição de MCE (meio condicionado esplênico). Os explantes em O hora (controle) e após 24 ou 48 horas de cultivo, assim como as células derivadas destes explantes (aderidas e em suspensão) no cultivo, foram processados para as análises histoquímicas de PAS e lectina DBA (Dolichos biflorus aglutinin) e para análises ultra-estruturais em MET. Os resultados demonstraram que tanto as formas aderidas quanto em suspensão apresentaram positividade à reação histoquímica de PAS e lectina DBA, sendo identificadas como sendo células NKu. O explante residual mostrou sinais de degeneração acentuada após 24 horas, independentemente das condições de cultivo empregadas. Pela MET, o maior índice de células NKu com boa preservação ultra-estrutural foi observada nas células NKu aderidas obtidas após 24 horas de cultivo em meio RPMI padrão, sem suplementação do meio condicionado esplênico (MCE). Estas condições de cultivo foram estabeleci das como padrão para a obtenção de células NKu morfologicamente bem preservadas, sendo utilizadas nos ensaios ín vítro, para avaliar a viabilidade destas células. Sob o efeito da lectina DBA, as células NKu demonstraram variações nos padrões morfológicos e de marcação pela lectina DBA, dependentes da concentração e tempo de ação, constatadas pelas microscopias de tluorescência e eletrônica de varredura (M EV). Pelos resultados obtidos, estabeleceram-se as condições de cultivo para obtenção de células NKu preservadas a partir do cultivo de explantes da glândula metrial, sendo estas células passíveis de serem utilizadas em ensaios in vítro. Pelo padrão de resposta das células NKu em conseqüência da ação da lectina DBA utilizada para avaliar a viabilidade destas células ín vítro, sugere-se que o substrato presente na superfície das células NKu poderia ser um potencial receptor de membrana envolvido no mecanismo de resposta celular / Abstract: During the pregnancy, uterine natural killer (uNK) cells appear in the rodent uterus, differentiate and disappear at the end of this period. H oweve r, which factors are involved in the differentiation[activation mechanisms of uNK cells, as well as in their functions, remain to be solved. The advancing on knowledge about these cells has been due to the complexity and dynamism of the uterine environment during pregnancy. Even the in vitro studies are inconclusive since no standard condition has been established. The present work proposed to establish a standard condition of culture to obtain and maintain uNK cells and further evaluate their viability for in vitro assays. Metrial gland fragments (explants) were obtained from the uterus of mice on 8th days of pregnancy and used as explants of culture The explants were cultured during 24 and 48 hours, in MEM and RPMI media, added or not with spleen-conditioned medi um (SCM). The O hour explants and after 24 or 48 hours of incubation, as well as explants derived cells (adherents and notadherents), were processed for PAS and DBA (Dolichos biflorus agglutinin) histochemistry analyses and for ultrastructural analyses in TEM. The results showed positive reaction to PAS and DBA histochemistries both for adherent and not-adherent cell forms in the culture. The residual explant showed degenerative signals after 24 hours, in despite of the culture conditions. The highest index of well-preserved uNK cells evaluated at ultrastructural levei was found to adherent uNK form, after 24 hours in standard RPMI, without the supplementation with SCM. This procedure was established as standard culture conditions to obtain morphologically well preserved uNK cell that was used to in vitro assays for evaluation of cellular viability. Under the effect of DBA lectin, uNK cells showed changes in morphology and labelling patterns, upon dependence of concentration and time lapsed effect, as noticed by fluorescence and scanning electron microscopes (SEM). Altogether, our findings allowed to establish the conditions to obtain wel / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:10:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaCarolina_D.pdf: 3693187 bytes, checksum: 65dcd416d067ae66b391e67841a7b240 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é a micose sistêmica de maior incidência no Brasil. Estudos anteriores demonstraram que a resistência ou suscetibilidade a essa infecção podem ser associadas, respectivamente, a padrões de resposta Th1 ou Th2. Recentemente, foram descritas novas subpopulações de linfócitos T, dentre elas as células Th17, que tem se mostrado importantes na proteção contra infecções fúngicas, mas cujo papel ainda não foi estudado na PCM humana. A diferenciação de células T CD4+ é modulada após o reconhecimento do patógeno por células dendríticas (DCs) por meio de vários receptores de reconhecimento padrão (PRRs), os quais modulam a diferenciação de células Th1, Th2 e Th17. Neste trabalho investigamos o papel dos receptores TLR2, TLR4 e Dectina-1 no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis (Pb) por DCs derivadas de monócitos, assim como, a capacidade dessas DCs em modular a diferenciação de linfócitos T CD4+. Observamos que DCs expostas a células leveduriformes de Pb apresentam um fenótipo maduro (expressão de CCR7, CD83, CD86 e MHC II) e produzem citocinas (IL- ?, IL-6, IL-23, TNF-? e TFG- ?), levando à diferenciação de linfócitos T CD4+ produtores de IL-17, IFN-?, IL-22, IL-17/IL-22 e IL-17/IFN- ?. Também observamos que DCs estimuladas com células leveduriformes de Pb apresentam ativação de moléculas envolvidas na sinalização via TLRs e Dectina-1 (JNK, p38, Akt e ERK para os TLRs e Syk para Dectina-1), e que o bloqueio de Dectina-1 e/ou TLR2 resultou em um número menor de células Th17. Ao analisar a produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico, observamos que pacientes com a FJ da PCM apresentam produção aumentada de IL-4 e que pacientes com a FA apresentam produção elevada de IL-17 e IFN- ?. Em conjunto nossos resultados demonstram que a Dectina-1 e TLR2 são os receptores mais importantes para o reconhecimento de leveduras de Pb por células dendríticas e que esse reconhecimento pode levar à diferenciação de linfócitos T efetores produtores de IL-17 e IFN- ?. Além disso, podemos concluir que a FA da PCM apresenta uma resposta imunológica mista, com participação de linfócitos Th17 / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), is the most prevalent systemic mycosis in Brazil. Previous studies showed that resistance or susceptibility to PCM can be associated to a Th1 or Th2 responses respectively. More recently, Th17 response was showed to be protective in fungal infections, but there is no data about Th17 cells in human PCM. T CD4+ differentiation is elicited and shaped after pathogen recognition by dendritic cells (DCs) through several PRRs, which modulate Th1, Th2 and Th17 generation. In this study we evaluated the role of TLR-2, TLR-4 and Dectin-1 in the recognition of Pb yeast cells by monocytes derived DCs, as well as, the capability of these DCs to modulate T CD4+ lymphocytes differentiation. We observed that DCs exposed to Pb presented a mature phenotype (expression of CCR7, CD83, CD80, CD86 and MHC II) and produce cytokines (IL-1, IL-6, IL-23, TNF-? and TGF- ) that promote the differentiation of TCD4+ lymphocytes producing IL- 7, IFN-?, IL-22, IL-17/IL-22 and IL-17/IFN-?. We also observed that DCs stimulated by Pb presented activation of molecules involved in the TLRs and dectin-1 signaling (JNK, p38, AKT, ERK - for TLRs and Syk for dectin- The blockage of dectin-1 and/or TLR2 diminished the differentiation of Th17 cells. We also analyzed PBMCs from patients with the acute/juvenile form (JF) or the chronic/adult form (AF) of PCM. Our results showed that patients with JF present elevated production of IL-4 and AF patients present higher production of IL-17. Altogether our results showed that Dectin-1 and TLR-2 are the most important receptors for human DCs to recognize Pb yeast cells and to produce cytokines such as IL- , IL- ? and TNF-?. After DC activation and cytokine production these cells are able to induce Th1 and Th17 differentiation through these receptors. Also we showed that Th17 cells are a major population in AF patients / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La regulación epigenética es un proceso clave en la expresión génica, participando en silenciamiento y activación de genes durante la diferenciación multilinaje de células madre mesenquimales (CMM). El objetivo del presente estudio fue cuantificar la expresión de enzimas de metilación del ADN (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B), metilación de histonas (EZH2) y demetilación de histonas (KDM6A) en CMM fetales bovinas durante la diferenciación in vitro osteogénica, condrogénica y adipogénica. Las CMM fueron aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) y cultivadas en presencia de factores de diferenciación. La expresión génica fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). En la diferenciación osteogénica, se detectó al día 24 un aumento (P<0,05) en la expresión de KDM6A comparado al día 0. La expresión de DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, EZH2 y KDM6A fue menor (P<0,05) en CMM diferenciadas el día 7 de cultivo condrogénico en relación al día 0 y al control. Se detectó una disminución (P<0,05) en la expresión de DNMT1 en CMM diferenciadas al día 6 de cultivo adipogénico comparado al día 0. Adicionalmente, durante este cultivo se detectó un aumento (P<0,05) en la expresión de DNMT3A, DNMT3A y EZH2 en CMM diferenciadas los días 12 y 18 de diferenciación, en comparación al día 0. En conclusión, se detectó un aumento de KDM6 durante la diferenciación osteogénica, y un aumento de todas las enzimas evaluadas durante la diferenciación adipogénica. En contraste, no se detectó aumento de enzimas durante la diferenciación condrogénic / Proyecto FONDECYT 11100205

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimales (CMM) son células indiferenciadas adultas, capaces de diferenciarse hacia múltiples tipos celulares incluyendo los linajes osteogénico, condrogénico y adipogénico. Previamente se han caracterizado CMM de varias especies como la humana, murina, ovina y felina entre otras. El presente estudio tuvo como objetivo el aislamiento de CMM desde médula ósea (MO) fetal bovina y la diferenciación adipogénica de CMM bajo condiciones in vitro durante 18 días. Las CMM fueron aisladas desde MO en base a su capacidad de adherencia al plástico. Las CMM fueron analizadas por PCR cuantitativo (Q-PCR) los días 0, 6, 12 y 18 para cuantificación de los genes endógenos GAPDH y β-ACTINA, de diferenciación adipogénica PPARγ-2, AP-2 y de pluripotencia NANOG. Se determinó un aumento (P<0,05) en los niveles de ARNm de AP-2 en CMM diferenciadas los días 12 y 18 de cultivo (16,4 y 17 veces la expresión del día 0 y 2,2 y 5,1 veces la expresión del día 0 en los controles sin tratamiento). La expresión de PPARγ-2 y NANOG no mostró diferencias significativas entre tratamientos o días de cultivo. La expresión de la proteína PPARγ-2 fue detectada mediante inmunofluorescencia indirecta en las CMM diferenciadas el día 18 de cultivo. La adipogénesis fue confirmada en CMM diferenciadas por medio de la detección de vacuolas lipídicas. En base a estos resultados, se puede concluir que es posible aislar CMM bovinas desde MO fetal en base a su capacidad de adherencia al plástico. Las CMM obtenidas desde MO fetal bovina poseen el potencial de diferenciación adipogénica bajo condiciones in vitro / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1100205

Orientador : Alaide Pellegrini Mammana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Campinas / Made available in DSpace on 2018-07-15T09:12:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_PauloVentura_M.pdf: 4119197 bytes, checksum: 48cda145caac6efc4ef22925b72258ad (MD5) Previous issue date: 1982 / Resumo: Investigamos, neste trabalho, os filmes finos transparetes e condutores de dióxido de estanho (sn02),formados pela oxidação de vapores ricos em 'tetrac10reto de estanho sobre a superfície aquecida (300°C a 450°C) de substratos de vidro e quartzo; e as heterojunções fotovoltáicas obtidas pela deposição destes filmes sobre substratos monocrista1inos de silício. Estudamos a resistividade, a transmitância óptica e o índice de refração dos filmes em função da temperatura dos substratos durante a deposição e da concentração de antimônio introduzida como dopante, com o objetivo de diminuir a resistividade. Tais investigações permitiram determinar as condições de deposição para obtenção de filmes com baixa resistividade e alta transmitância óptica, para o emprego em heterojunções. As heterojunções de Sn02/Si foram construídas sobre silício tipos n e p, com diferentes resistividades. Mediram-se as características I x V com e sem ilumina ção, as características 10g I x V em função da temperatura e as características C x V para diferentes frequências do sinal de medida. As melhores células solares foram do tipo Sn02/Si-n, que apresentaram sob condiçoes AMl densidade de corrente de curto-circuito em torno de 30 ma/cm2, tensão de circuito aberto superior a 400 mV, eficiência de 6% e boa resposta espectral, especialmente para comprimentos de onda curtos. O princípal mecanismo de condução de corrente direta identificado nestas heterojunções foram os processos de recombinação e tunelamento em múltiplas etapas, através de estados na banda proibida do silício. Em altas correntes diretas surgem efeitos de resistência série, que atribuimos à presença de camadas isolantes de óxido,de silício na interface sno2/Si. Nas heterojunções de sn02/Si-p, por outro lado, observamos forte supressão de fotocorrente e nelas a eficiência sob condições AMl é inferior a 0,1%. O comportamento da corrente com a temperatura nestas heterojunções é semelhante ao observado em dispositivos meta1-iso1ante-semicondutor com alta densidade de estados de interface / Abstract: Not informed / Mestrado / Mestre em Engenharia Elétrica

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2022