Orientador: Vanderlan da Silva Bolzani / Co-orientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Humberto Márcio Santos Milagre / Banca: Alessandra Regina Pepe Ambrozin / Resumo: Os ciclotídeos são produtos natura is de estrutura polipeptídica, contendo de 2 8 a 37 resíduos de aminoácidos, sendo seis deles resíduos de cisteína, altamente conservados e formados por ligações dissulfeto as quais exib em ciclização tipo "cabeça - cauda". Ess e arranjo estrutura l característico co nfere aos ciclotí deos uma estabilidade excepcional e resistência à proteólise . Devido a estas peculiaridades moleculares os ciclotídeos são substâncias com importante s funç ões biológica s, entre elas, de stacam - se as de defesa e adaptação dos organismos que as acumulam . São de gran de interesse para agricultura, agindo como inseticida s e, no uso medicinal p or apresentarem atividades anti - HIV, anti - helmíntic a, antimicrobian a e efeitos uterotônicos . A presente dis sertação trata d o estudo de ciclotídeos isolados d a planta Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, pertencente à família Violaceae, um táxon de ocorrência frequente n a Mata Atlântica . Já existem dados na literatura sobre o estudo de ciclotídeos das raíze s e o presente estudo é importante na medida que registra a ocorrência desta classe de substâncias e a sua caracterização nas folhas e galhos desta espécie, levando a informações mais completas sobre a ocorrência de ciclotídeos em Violaceae . A extração de c iclotídeos do material vegetal ( galhos e folhas secos e moído s ) foi feita mediante maceração hidrometanólica até esgotamento do material vegetal, seguid a de partição líquido - líquido com diclorometano. A fase polar foi concentrada e submetida à crom atografia em coluna, empregando octadecilsilano (C 18 ) como fase estacioná ria, obtendo - se frações ricas em peptídeos. O processo de purificação foi realizado p or HPLC preparativ o e/ou analític o com eluição gradiente, empregando - se acetonitrila e ág ua como fase móv e l, o que permitiu a obt... / Abstract: C yclotides are pol ypeptide str uctures, c omprise 2 8 - 37 amino acid residues, six of the m, are cysteine residues, highly conserved and formed by disulfide bonds, which exhibit "head - tail" cyclization type. This structural feature gives to cyclotides remarkable stability and resistance to proteolysis. Due to these singularities, such compound s have disclosed important biological functions . A mong the m ; the literature has highlighted important ecological properties as defense and adaptation of the organisms, which accumulate these natural products. Accordingly, they are of great interest to agri culture, acting as insecticide, and to medicine, since some compounds have displayed anti - HIV activity, anthelmintic, antimicrobial and uterotonic properties. This research deals with the study of cyclotides isolated Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, belonging to the taxon Violaceae, which frequently occurs in the Atlantic Forest. There are several studies in the literature on the occurr ence of this class of compounds and their characterization in the leaves and branches of Violaceae plant species, le ading to more complete information on the occurrence of cyclotides, and their biological significance for these plants. The cyclotides extraction of plant material (dried and ground branches and leaves) was carried out by maceration with methanol/water, fo llowed by a liquid - liquid partition with dichloromethane. The polar phase was concentrated and subjected to chromatographic column using octadecylsilane (C 18 ) as stationary phase, achieving several fractions rich in peptides. The purification process was p erformed by analytical and/or preparative HPLC, in gradient of acetonitrile and water as mobile phase, which led to the isolation of the cyclotides. The amino acid sequence (primary structure) of the isolated compounds was established by MALDI - TOF /TOF by r eduction and alkylation re... / Mestre

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-16T17:18:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) PPGEE_Tese_52_Jose_Sampaio_de_Lemos_Neto.pdf: 1571594 bytes, checksum: dd2d6975cfe8298526b68cb91a703bf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-16T17:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) PPGEE_Tese_52_Jose_Sampaio_de_Lemos_Neto.pdf: 1571594 bytes, checksum: dd2d6975cfe8298526b68cb91a703bf1 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / FACEPE / Um código ciclicamente permutável (código CP) é um código de bloco binário cujas palavrasc ódigo são ciclicamente distintas e possuem ordem cíclica plena, isto é, ordem cíclica igual ao comprimento do bloco. Um código CP pode ser construído por meio de um código cíclico. Para isto, selecionam-se as palavras do código cíclico que são ciclicamente distintas e possuem ordem cíclica plena. Um procedimento que seleciona diretamente, por meio de uma condição matemática, as palavras de um código CP a partir de um código cíclico é denominado de construção. SendoM e n, respectivamente, o número de palavras e o comprimento do bloco de um código cíclico, se o número de palavras do código CP for igual ao limitante superiorM/n, então a construção é ótima neste sentido. Além do mais, a distância mínima do código cíclico deve ser a maior possível para os valores deM e n. Nesta tese, é proposto um método para construir códigos CP por meio de códigos lineares cíclicos q-ários, sendo q uma potência de um número primo, assim como também por meio de códigos lineares constacíclicosp-ários, sendo p um número primo. Para ambos os casos, mostra-se que o procedimento proposto para gerar códigos CP é direto, logo pode ser quali cado como construção. Além do mais, em ambos os casos, a construção é ótima pois atinge o limitante superior. Por m, uma construção proposta nesta tese é usada na aplicação de códigos CP como sequências de protocolo para o canal de colisão sem realimentação. / A cyclically permutable code (CPC) is a binary code the codewords of which are cyclically distinct and have full cyclic order, i.e., cyclic order equal to the block length. A CPC can be constructed by means of a cyclic code. In this way, the codewords of the cyclic code which are cyclically distinct and have full cyclic order should be selected. A procedure that selects codewords of a CPC from a cyclic code in a straightforward manner, by means of a mathematical condition, is called a construction. Let M and n be, respectively, the number of codewords and the block length of a cyclic code. If the number of codewords of a CPC reaches the upper bound M/n, then this construction is optimum in this sense. Furthermore, the minimum distance of the cyclic code should be the highest possible for the values of M and n. In this thesis we propose a method to construct CPC's using q-ary linear cyclic codes, where q is a power of a prime, as well as using p-ary linear constacyclic codes, where p is a prime number. In both cases, it is shown that the proposed procedure to generate CPC's is straightforward, so can be quali ed as a construction. Moreover, in both cases, the construction is optimal in the sense that the number of codewords selected for the CPC reaches the upper bound. Finally, a construction proposed in this thesis is used in the application of CPC's as protocol sequences for the collision channel without feedback.

A dominância lateral para controle motor tem sido proposta ser devida a uma capacidade superior em lidar com a dinâmica do movimento com o hemisfério/lado corporal dominante. A partir desta hipótese, é esperado que o braço dominante apresente tanto trajetórias mais precisas quanto modos de coordenação mais estáveis. Além disso, tal assimetria motora deveria ser mais evidente em movimentos mais rápidos. No presente estudo foi avaliada a assimetria interlateral de desempenho na coordenação interarticular/ intramembro em movimentos realizados em diferentes frequências. Foi analisada a coordenação interarticular entre o ombro e o cotovelo do mesmo braço em uma tarefa de realizar movimentos circulares com as mãos, comparando o desempenho entre os braços dominante e não-dominante. O estudo foi realizado com 16 adultos jovens, que realizaram a tarefa em cinco frequências de movimento, variando de 40% a 100% da frequência individual máxima. Movimentos angulares das articulações foram analisados através de marcadores refletivos fixados no ombro, cotovelo e punho de ambos os braços. Os marcadores foram rastreados automaticamente por meio de um sistema optoeletrônico, com frequência de aquisição de 240 Hz, e análise em 3D. Os resultados demonstraram que o desempenho com o braço não-dominante apresentou as seguintes diferenças em comparação com o braço dominante: trajetória da mão e amplitudes angulares mais variáveis, maior participação do cotovelo, coordenação em modo antifase (braço dominante: relação de fase de aproximadamente 120º) e maior variabilidade de modo de coordenação. De forma geral, as assimetrias interlaterais foram acentuadas em frequências de movimento mais altas. Estes resultados indicam que a vantagem de desempenho com o braço dominante é devida a um modo de coordenação mais consistente e efetivo em realizar a trajetória desejada / Lateral dominance for motor control has been proposed to be due to a superior capacity to deal with motion dynamics with the dominant cerebral hemisphere/body side. From this conjecture, it is expected the dominant arm to present both an increased capacity to perform more accurate trajectories and a more stable interjoint coordination. Moreover, such motor asymmetry should be more evident in fast movements. We assessed interjoint coordination between the shoulder and the elbow on a circle drawing task, comparing performance between the dominant and the non-dominant arm. The study was conducted with 16 young adults, who performed the task on five movement frequencies, ranging from 40% to 100% of the individual maximum. Angular motion of the joints was recorded through reflective markers attached at the shoulder, elbow and wrist of both arms. Markers were tracked automatically by using an optoelectronic system, with data sampling frequency set at 240 Hz, and 3D analysis. The results showed that performance with the non-dominant arm had the following differences in comparison with the dominant arm: more variable hand trajectory and joint amplitudes, interjoint coordination in antifase (dominant arm: phase relation of approximately 120º) and increased variability in the coordination mode. Overall, interlateral asymmetries were amplified in higher movement frequencies. These results indicate that the advantage of the dominant arm resides in a more stable and effective mode of coordination in performing the desired trajectory

Os erros cíclicos nas escalas das máquinas de medir a três coordenadas (MM3Cs) exercem influência significativa nos resultados das medições efetuadas em comprimentos pequenos. Um dos fatores que contribuem para a ocorrência dos erros cíclicos é a acuracidade limitada dos métodos utilizados na fabricação de escalas. As MM3Cs utilizam escalas desenhadas e fabricadas por métodos fotográficos ou riscadas em máquinas tipo \"step and repeat\". Ambos os métodos produzem um erro sistemático entre traços sucessivos. Desta forma, a medida que o número de traços aumenta as parcelas do erro sistemático somam-se e quando atingem um determinado valor este erro é compensado. Esta correção é feita a cada distância cujo valor corresponde ao de um período cíclico de baixa freqüência e o processo repete-se até que toda a escala seja riscada. Outro fator que contribui para a existência dos erros cíclicos origina-se da resolução exigida pela MM3C, que é sempre bastante alta e ultrapassa as capacidades existentes atualmente para fabricação de escalas. O que se faz para lidar com o problema da resolução é subdividir eletronicamente o espaço entre traços consecutivos da escala. Esta divisão eletrônica está associada a um sinal seno gerado pelas franjas de Moiré. A digitalização e subdivisão deste sinal geram erros periódicos, também conhecidos como erros cíclicos de alta freqüência. Embora diversos erros das MM3Cs tenham sido largamente estudados, ainda hoje, não foi realizada uma observação sistemática para que se tenha a exata medida da influência dos erros cíclicos, na medição a três coordenadas. Para suprir essa necessidade e contribuir na busca de novos métodos de avaliação, este trabalho apresenta os procedimentos de medição dos erros cíclicos de baixa e de alta freqüência, bem como a aplicação de Análise de Fourier aos conjuntos de dados obtidos. A medição da distância entre as linhas consecutivas da régua móvel da MM3C também foi realizada e os resultados comprovaram a existência dos erros de fabricação, a ocorrência de compensação periódica e também sugeriram os erros de subdivisão eletrônica. Além disso, no levantamento dos erros cíclicos de baixa freqüência foi confirmada a existência de um período cíclico de quatro milímetros. / Cyclic errors in scales of Coordinate Measuring Machines (CMMs) have a significant influence in measuring results on a very small displacement hindering most of the measuring tasks. One of the factors that contribute to the appearance of the cyclic errors is the limited accuracy of the used manufacturing methods of the scales. CMMs use scales drawn and manufactured by photographic methods or marked in step and repeat machines. In both methods the distances between succeeding lines are prone to systematic errors and therefore, with the increasing of the number of lines systematic errors are added up. Error compensation is provided when the amount of errors reaches a predetermined value. The error correction made at predetermined lengths defines a period what one can call the low frequency cyclic error. This process must be repeated all along the scale. Another factor that contributes to the existence of cyclic errors originates from high resolution required by CMM that goes beyond the existent manufacturing capacities of scales. This problem is somewhat solved by means of an electronic signals splitting up. The electronic sign obtained as two consecutive lines on the scale is probed can be associated to a sine signal what is generated by Moiré type fringes. Digital conversion and electronic division of these signals also generate periodic errors and can be called high frequency cyclic error. Although several types of errors in CMMs have been largely studied,there is a lack regarding the cyclic errors. A huge need for a systematic study and observation of these errors is needed to permit an exact measure of its influence on coordinate measurements. To cope with the urgent need and to contribute in the search for new evaluation methods of the cyclic errors, this work presents a measuring procedure of low and high frequency cyclic errors and the application of Fourier Analysis to the testing data. Measurements of distances between consecutive lines of the scale were also obtained and the results have shown the existent manufacturing errors and suggested frequencies and period of errors of electronic division. A cyclic period of four millimeters was confirmed in the low frequency tests.

Nosso grupo de pesquisa vem se dedicado, há vários anos, ao estudo das reações de ciclização eletrofílica de substratos insaturados que contêm um nucleófilo interno (oxigênio ou nitrogênio). Este trabalho teve como objetivo obter derivados de éteres cíclicos de cinco e seis membros diferentemente funcionalizados. Compostos 1,3-dicarbonílicos e ß-hidróxi carbonílicos, contendo dupla ligação em posição apropriada, foram submetidos à reação de ciclização mediada tanto por iodo quanto por dimetildioxirana. De maneira semelhante, ß-enamino ésteres alquenilados foram submetidos à reação de iodociclização visando à síntese de diidropirróis, pirrolidínas e tetraidroindóis. Os heterociclos funcionalizados com iodo foram submetidos à reação de desidroiodação, promovida por base, fornecendo os correspondentes produtos de eliminação. / Our research group has been studying, for several years, eletrophilic cyclization reactions of unsaturated substrates bearing internal nucleophiles such as oxygen or nitrogen. This work aimed to obtain five and six membered cyclic ether derivatives differently functionalized. 1,3-Dicarbonyl and ß-hydroxy carbonyl compounds bearing double bonds suitably positioned were submitted to cyclization reaction mediated by either iodine or dimethyldioxirane. Similarly, alkenyl substituted ß-enamino esters were also prepared and submitted to iodo-cyclization reaction leading to dihydropyrrols, to pyrrolidines or to tetrahydroindols. The heterocyclic compounds bearing iodine were submitted to the corresponding dehydroiodination reaction mediated by base, furnishing elimination products

O uso de peptídeos na terapêutica apresenta inúmeras limitações, desde características físico-químicas até perfil farmacocinético inadequado para absorção oral. Entretanto, novas estratégias sintéticas para redução de custos e aumento da estabilidade química e metabólica de peptídeos, associada a vias alternativas de administração foram desenvolvidas e permitiram o acesso a essas moléculas no mercado farmacêutico. Diante disso, peptídeos naturais bioativos, subexplorados do ponto de vista químico medicinal, são considerados bons protótipos para o desenvolvimento de biblioteca de análogos não-naturais, gerando informações relevantes para a compreensão da relação entre a estrutura química e a atividade biológica destes compostos. No presente estudo, os peptídeos cíclicos rufomicina B (tuberculostático), chaiyaphumine A (anti-malárico), ciclozantoxilano A e desotamide B (antibiótico) foram estudados do ponto de vista sintético sob diferentes metodologias. Para tal, os aminoácidos Fmoc-N-Metil-L-Leucina e Fmoc-L-crotil-glicina foram sintetizados com rendimentos satisfatórios para síntese do antibiótico rufomicina B. O aminoácido Fenil-acetil-L-treonina foi obtido em bons rendimentos e a síntese de chaiyaphumine A e derivado foi testada em fase sólida, em solução e empregando combinação dos dois métodos. O peptídeo desotamide B e ciclozantoxilano A foram sintetizados, mesmo que em baixo rendimentos, em fase sólida com ciclização solução. Ainda, a síntese de desotamide B também foi possível através da metodologia \"safety-catch\". Por fim, realizamos análise sistemática das propriedades físico-químicas e estruturais dos peptídeos no mercado e em fase clínica e comparamos os resultados obtidos com os alvos desse estudo / The use of peptides in therapy presents several limitations, from physicochemical characteristics to inadequate pharmacokinetic profile for oral absorption. However, new synthetic strategies for cost reduction and increase of the chemical and metabolic stability of peptides associated with alternative routes of administration were developed and allowed access to these molecules in the pharmaceutical market. Therefore, natural bioactive peptides, is an underexploited class from the medicinal chemist\'s point of view, are considered good prototypes for the development of similar series, generating information relevant to understanding the relationship between chemical structure and biological activity of these compounds. In the present study, cyclic peptides rufomycin B (antituberculosis activity), chaiyaphumine A (anti-malarial), cyclozanthoxylane A and desotamide were studied from the synthetic point of view, through different metodologies. In this sense, the amino acids Fmoc-N-Methyl-L-Leu and Fmoc-L-crotyl-Gly were synthetized in good yields for the total synthesis of rufomycin B. The amino acid Phenyl-acetyl-L-threonine was obtained in high yield and the synthetic studies on the chaiyaphumine A and analogue has been performed in solution and solid phase peptide synthesis and also through the combination of the 2 methods. The peptides desotamide B and cyclozanthoxylane A were synthetized, in low yields, in solid phase and in solution cyclization. Desotamide B could also be synthetized through safety-catch solid phase method. At end, we performed a systematic review of the physical chemical properties of all market and on clinical trial peptide drugs and we compared the results with the target molecules in this study.

As florações de cianobactérias em reservatórios de águas utilizadas para consumo humano são freqüentes hoje em dia e normalmente são atribuídas à crescente eutrofização destas águas. Em anos recentes o aparecimento de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas tem preocupado bastante os responsáveis pelo monitoramento da qualidade das águas, uma vez que estas toxinas representam risco para a saúde pública. A detecção precoce da presença de linhagens tóxicas nesses reservatórios é essencial para que ações corretivas de controle das florações tenham sucesso. No presente trabalho, a diversidade de cianobactérias presentes em alguns locais das represas Billings e Guarapiranga foi avaliada utilizando a técnica de DGGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante) e/ou construções de mini-bibliotecas de amplicons do gene de rRNA 16S e da região do espaço intergênico da ficocianina (PC-IGS). A DGGE, utilizando os iniciadores CYA359F/CYA781R específicos para o gene de rRNA 16S de cianobactérias, mostraram que estes organismos estavam presentes nas onze amostras de água analisadas. Microcystis aeruginosa (94-97% de identidades), Geitlerinema (89% de identidade) e Synechococcus (89% de identidade) puderam ser identificadas. A mini-biblioteca construída com os amplicons de rRNA 16S obtidos usando os iniciadores 27F1/1494Rc produziu seqüências de outro grupo de bactéria (Actinobacteria), indicando a inespecificidade desses iniciadores. Entretanto, na mini-biblioteca construída com os amplicons de PC-IGS obtidos usando os iniciadores PCβF/PCαR, somente seqüências de cianobactérias foram geradas. Nessa mini-biblioteca foram identificadas várias linhagens de Microcystis aeruginosa (98-100% de identidades) e também de Anabaena (89% de identidade). Esses dois gêneros de cianobactérias conhecidos por produzirem microcistinas, foram detectados na amostra de água que continha alta concentração desta toxina (23,49 μg/L). Os oligonucleotídeos iniciadores OMETF/OMETR foram desenhados para amplificar uma região pequena e variável do domínio da N-metiltransferase do gene mcyA e foram testados em treze espécies de cianobactérias isoladas das represas Billings e Guarapiranga. Seqüências geradas por esses iniciadores foram isoladas, clonadas e sequenciadas com sucesso em duas espécies controle (M. aeruginosa NPJB1 e M. panniformis SPC702) e em dois isolados das represas (M. aeruginosa SPC777 e M. protocystis SPC697). A amplificação dessa região do mcyA a partir dos DNAs dos isolados de cianobactérias permitiu identificar linhagens do gênero Microcystis potencialmente produtoras da toxina microcistina. Essa técnica uma vez bem estabelecida para organismos isolados, poderá proporcionar base suficiente para uma melhor detecção de comunidades aquáticas de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistinas em ambientes naturais. / Cyanobacterial blooms in water reservoirs used for human consumption are frequent nowadays and are usually attributed to the increasing water eutrophization. In recent years, the appearance of toxin-producing cyanobacterial strains has concerned managers of water quality since these toxins represent a public health risk. Early detection of the presence of toxic strains in these reservoirs is essential for the success of bloom control corrective actions. In the present work, cyanobacterial diversity was evaluated in several sites of Billings and Guarapiranga reservoirs using DGGE (denaturing gradient gel eletrophoresis) and/or mini-library constructions of both 16S rRNA gene and phycocyanin intergenic spacer (PC-IGS) region amplicons. The DGGE, using CYA359F/CYA781R primers, specific for cyanobacterial 16S rRNA gene, showed the presence of these organisms in the eleven water samples analyzed. Microcystis aeruginosa (identities of 94-97%), Geitlerinema (identity of 89%) and Synechococcus (identity of 89%) were identified. The mini-library constructed with 16S rRNA amplicons obtained using 27F1/1494Rc primers produced sequences of another group of bacteria (Actinobacteria), indicating the unespecificity of these primers. However, the mini-library constructed with PC-IGS amplicons obtained using PCβF/PCαR primers, generated cyanobacterial sequences only. In this mini-library several Microcystis aeruginosa strains (identities of 98-100%) and Anabaena (identity of 89%) were identified. These two cyanobacterial genera known to produce microcystins were detected in a water sample containing a high concentration of this toxin (23.49 g/L). The OMETF/OMETR primers were designed to amplify a small and variable region of the N-methyltransferase domain of mcyA gene and were tested in thirteen cyanobacterial strains isolated from Billings and Guarapiranga reservoirs. Sequences generated with these primers were successfully isolated, cloned and sequenced in two control species (M. aeruginosa NPJB1 and M. panniformis SPC702) and in two isolates from these reservoirs (M. aeruginosa SPC777 and M. protocystis SPC697). The amplification of this region of mcyA using cultured cyanobacteria DNAs allowed the identification of Microcystis strains with the potential to produce microcystin toxin. This technique, after it is well established for cultured organisms, will provide a basis for better detection of potential microcystin-producing cyanobacterial aquatic communities in natural environments.

Spiro-γ-lactones are widely distributed among natural products, several of them being well known by their interesting biological activities. We describe herein the synthesis of 1-oxaspiro[4.4]nonan derivatives and (+-)-andirolactone starting from easily available Diels-Alder adducts of 5-methylene-2(5H)-furanome 1 and classical dianes / La química de les espiro-γ-lactones ha despertat un considerable interès principalment degut a què moltes molècules que posseeixen aquesta estructura presenten diverses i significatives activitats biològiques. En aquesta tesi doctoral, prenent com a precursors els adductes de Diels-Alder, s’han investigat noves rutes sintètiques cap a 2(3H)-dihidrofuanones 5.5-disubstituïdes i oxaspiro[4.4]nonans polifuncionalitzats. Es presenten dues noves síntesis de (+-)-andirolactona 2, sesquiterpenoid amb estructura d’espiro-γ-butirolactona, recentment aïllat del Cedrus Libanotica i interessant per les seves propietats medicinals i biològiques potencials

Submitted by ANTONIO FERNANDEZ BOBEY null (antoniofernandezbobey86@yahoo.es) on 2016-04-12T19:44:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Versão Final_ Repositorio Unesp.pdf: 2495633 bytes, checksum: f7ff8d9ec49134a24d9a1082b09926dc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-15T17:37:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandezbobey_a_me_araiq_par.pdf: 909965 bytes, checksum: 12ae7f0b3b5f6a97678bcbd7f2a70506 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T17:37:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandezbobey_a_me_araiq_par.pdf: 909965 bytes, checksum: 12ae7f0b3b5f6a97678bcbd7f2a70506 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os ciclotídeos são produtos naturais de estrutura polipeptídica, contendo de 28 a 37 resíduos de aminoácidos, sendo seis deles resíduos de cisteína, altamente conservados e formados por ligações dissulfeto as quais exibem ciclização tipo "cabeça-cauda". Esse arranjo estrutural característico confere aos ciclotídeos uma estabilidade excepcional e resistência à proteólise. Devido a estas peculiaridades moleculares os ciclotídeos são substâncias com importantes funções biológicas, entre elas, destacam-se as de defesa e adaptação dos organismos que as acumulam. São de grande interesse para agricultura, agindo como inseticidas e, no uso medicinal por apresentarem atividades anti-HIV, anti-helmíntica, antimicrobiana e efeitos uterotônicos. A presente dissertação trata do estudo de ciclotídeos isolados da planta Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, pertencente à família Violaceae, um táxon de ocorrência frequente na Mata Atlântica. Já existem dados na literatura sobre o estudo de ciclotídeos das raízes e o presente estudo é importante na medida que registra a ocorrência desta classe de substâncias e a sua caracterização nas folhas e galhos desta espécie, levando a informações mais completas sobre a ocorrência de ciclotídeos em Violaceae. A extração de ciclotídeos do material vegetal (galhos e folhas secos e moídos) foi feita mediante maceração hidrometanólica até esgotamento do material vegetal, seguida de partição líquido-líquido com diclorometano. A fase polar foi concentrada e submetida à cromatografia em coluna, empregando octadecilsilano (C18) como fase estacionária, obtendo-se frações ricas em peptídeos. O processo de purificação foi realizado por HPLC preparativo e/ou analítico com eluição gradiente, empregando-se acetonitrila e água como fase móvel, o que permitiu a obtenção das substâncias. A sequência de aminoácidos (estrutura primária) dos ciclotídeos isolados foi estabelecida por Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF com o auxílio das reações de redução, alquilação e digestão enzimática empregando as enzimas: endoproteinase de ácido glutâmico (endoGlu-C), tripsina e quimiotripsina. Também, foi realizada a análise de aminoácidos das substâncias, permitindo a quantificação de cada aminoácido presente. A presente pesquisa resultou no isolamento de seis compostos de galhos e três oriundos de folhas, totalizando sete diferentes possíveis ciclotídeos, visto que dois deles foram comuns para ambos os tecidos. Até o momento foi possível determinar a estrutura primária de quatro deles: Os ciclotídeos Nor B (substância F20-2), massa molecular 3180,416 Da, Nor C (substância F20-3), massa molecular 3282,472 Da, Nor D (substância F17-1), massa molecular 3249,474 Da e Nor E (substância F21-1), massa molecular 3170,472 Da. Todos eles reportados pela primeira vez no presente estudo. As demais substâncias isoladas se encontram em processo caracterização estrutural. / Cyclotides are polypeptide structures, comprise 28-37 amino acid residues, six of them, are cysteine residues, highly conserved and formed by disulfide bonds, which exhibit "head-tail" cyclization type. This structural feature gives to cyclotides remarkable stability and resistance to proteolysis. Due to these singularities, such compounds have disclosed important biological functions. Among them; the literature has highlighted important ecological properties as defense and adaptation of the organisms, which accumulate these natural products. Accordingly, they are of great interest to agriculture, acting as insecticide, and to medicine, since some compounds have displayed anti-HIV activity, anthelmintic, antimicrobial and uterotonic properties. This research deals with the study of cyclotides isolated Noisettia orchidiflora (Rudge) Gingins, belonging to the taxon Violaceae, which frequently occurs in the Atlantic Forest. There are several studies in the literature on the occurrence of this class of compounds and their characterization in the leaves and branches of Violaceae plant species, leading to more complete information on the occurrence of cyclotides, and their biological significance for these plants. The cyclotides extraction of plant material (dried and ground branches and leaves) was carried out by maceration with methanol/water, followed by a liquid-liquid partition with dichloromethane. The polar phase was concentrated and subjected to chromatographic column using octadecylsilane (C18) as stationary phase, achieving several fractions rich in peptides. The purification process was performed by analytical and/or preparative HPLC, in gradient of acetonitrile and water as mobile phase, which led to the isolation of the cyclotides. The amino acid sequence (primary structure) of the isolated compounds was established by MALDI-TOF/TOF by reduction and alkylation reactions as well as enzymatic digestion using the enzymes: endoproteinase glutamic acid (endoGlu-C), trypsin and chymotrypsin. Also, the quantification of each amino acid present in the cyclotide structures was performed, and this amino acid analysis was fundamental for the characterization of these substances. Therefore, this research resulted in the isolation of the six compounds accumulated in the branches, and 3 of them were also found in the leaves. A complete analysis of all peptides suggested that seven are cyclotides, while two of them were common for both twigs and leaves tissues. Until now it was possible to determine the primary structure of four cyclotides, which is being described in plants for the first time: The cyclotides Nor B (F20-2 substance), molecular weight 3180.416 Da, Nor C (F20-3 substance), molecular weight 3282.472 Da, Nor D (substance F17-1), molecular mass 3249.474 Da Nor E (F21-1 substance), molecular weight 3170.472 Da. All these cyclotides are being reported for the first time in this study, however, 3 of these are currently under further analytical studies aimed at the complete structural characterization. / CNPq: 133418/2014-6

As florações de cianobactérias em reservatórios de águas utilizadas para consumo humano são freqüentes hoje em dia e normalmente são atribuídas à crescente eutrofização destas águas. Em anos recentes o aparecimento de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas tem preocupado bastante os responsáveis pelo monitoramento da qualidade das águas, uma vez que estas toxinas representam risco para a saúde pública. A detecção precoce da presença de linhagens tóxicas nesses reservatórios é essencial para que ações corretivas de controle das florações tenham sucesso. No presente trabalho, a diversidade de cianobactérias presentes em alguns locais das represas Billings e Guarapiranga foi avaliada utilizando a técnica de DGGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante) e/ou construções de mini-bibliotecas de amplicons do gene de rRNA 16S e da região do espaço intergênico da ficocianina (PC-IGS). A DGGE, utilizando os iniciadores CYA359F/CYA781R específicos para o gene de rRNA 16S de cianobactérias, mostraram que estes organismos estavam presentes nas onze amostras de água analisadas. Microcystis aeruginosa (94-97% de identidades), Geitlerinema (89% de identidade) e Synechococcus (89% de identidade) puderam ser identificadas. A mini-biblioteca construída com os amplicons de rRNA 16S obtidos usando os iniciadores 27F1/1494Rc produziu seqüências de outro grupo de bactéria (Actinobacteria), indicando a inespecificidade desses iniciadores. Entretanto, na mini-biblioteca construída com os amplicons de PC-IGS obtidos usando os iniciadores PCβF/PCαR, somente seqüências de cianobactérias foram geradas. Nessa mini-biblioteca foram identificadas várias linhagens de Microcystis aeruginosa (98-100% de identidades) e também de Anabaena (89% de identidade). Esses dois gêneros de cianobactérias conhecidos por produzirem microcistinas, foram detectados na amostra de água que continha alta concentração desta toxina (23,49 μg/L). Os oligonucleotídeos iniciadores OMETF/OMETR foram desenhados para amplificar uma região pequena e variável do domínio da N-metiltransferase do gene mcyA e foram testados em treze espécies de cianobactérias isoladas das represas Billings e Guarapiranga. Seqüências geradas por esses iniciadores foram isoladas, clonadas e sequenciadas com sucesso em duas espécies controle (M. aeruginosa NPJB1 e M. panniformis SPC702) e em dois isolados das represas (M. aeruginosa SPC777 e M. protocystis SPC697). A amplificação dessa região do mcyA a partir dos DNAs dos isolados de cianobactérias permitiu identificar linhagens do gênero Microcystis potencialmente produtoras da toxina microcistina. Essa técnica uma vez bem estabelecida para organismos isolados, poderá proporcionar base suficiente para uma melhor detecção de comunidades aquáticas de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistinas em ambientes naturais. / Cyanobacterial blooms in water reservoirs used for human consumption are frequent nowadays and are usually attributed to the increasing water eutrophization. In recent years, the appearance of toxin-producing cyanobacterial strains has concerned managers of water quality since these toxins represent a public health risk. Early detection of the presence of toxic strains in these reservoirs is essential for the success of bloom control corrective actions. In the present work, cyanobacterial diversity was evaluated in several sites of Billings and Guarapiranga reservoirs using DGGE (denaturing gradient gel eletrophoresis) and/or mini-library constructions of both 16S rRNA gene and phycocyanin intergenic spacer (PC-IGS) region amplicons. The DGGE, using CYA359F/CYA781R primers, specific for cyanobacterial 16S rRNA gene, showed the presence of these organisms in the eleven water samples analyzed. Microcystis aeruginosa (identities of 94-97%), Geitlerinema (identity of 89%) and Synechococcus (identity of 89%) were identified. The mini-library constructed with 16S rRNA amplicons obtained using 27F1/1494Rc primers produced sequences of another group of bacteria (Actinobacteria), indicating the unespecificity of these primers. However, the mini-library constructed with PC-IGS amplicons obtained using PCβF/PCαR primers, generated cyanobacterial sequences only. In this mini-library several Microcystis aeruginosa strains (identities of 98-100%) and Anabaena (identity of 89%) were identified. These two cyanobacterial genera known to produce microcystins were detected in a water sample containing a high concentration of this toxin (23.49 g/L). The OMETF/OMETR primers were designed to amplify a small and variable region of the N-methyltransferase domain of mcyA gene and were tested in thirteen cyanobacterial strains isolated from Billings and Guarapiranga reservoirs. Sequences generated with these primers were successfully isolated, cloned and sequenced in two control species (M. aeruginosa NPJB1 and M. panniformis SPC702) and in two isolates from these reservoirs (M. aeruginosa SPC777 and M. protocystis SPC697). The amplification of this region of mcyA using cultured cyanobacteria DNAs allowed the identification of Microcystis strains with the potential to produce microcystin toxin. This technique, after it is well established for cultured organisms, will provide a basis for better detection of potential microcystin-producing cyanobacterial aquatic communities in natural environments.