Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El ejercicio físico afecta tanto el metabolismo energético del músculo esquelético, como el crecimiento de este, incluyendo cambios a nivel de la síntesis de proteínas y de la expresión de genes. El calcio es una importante señal en la regulación de la transcripción. Resultados del laboratorio indican que la despolarización de células musculares esqueléticas resulta en señales de calcio rápida y lenta, muy definidas en localización subcelular y cinética, y en la activación de algunos intermediarios clásicos de la expresión génica. Entre estos intermediarios se encuentran ERK 1/2 y el factor de transcripción CREB, cuya activación depende de la señal lenta de calcio. El nivel de fosforilación de estas proteínas, que representa activación, es reflejo de la actividad de quinasas y fosfatasas. Sin embargo, en general se les ha dado mayor atención a las quinasas, conociéndose con menor profundidad las fosfatasas En músculo esquelético en particular, no se conoce cuales fosfatasas desfosforilan CREB y ERK activados por despolarización. En este trabajo se determinó que la fosfatasa calcineurina, es activada en nuestro modelo celular por la despolarización generada por dos protocolos, alta concentración de K+ extracelular y estimulación eléctrica. En ambos casos la señal lenta de calcio participa parcialmente en la activación de calcineurina. La despolarización de miotubos en presencia de un inhibidor de calcineurina genera un aumento significativo de los niveles de ERK 1 /2 y de CREB fosforilados, indicando la participación de esta fosfatasa en la desfosforilación de ambos intermediarios. Estudiamos además, el posible rol de las fosfatasas PP1 y PP2A. No hubo cambios significativos en los niveles de activación de CREB y ERK1/2 en miotubos despolarizados en presencia de un inhibidor farmacológico de ambas fosfatasas. Con esta memoria de título se han complementado estudios del laboratorio, cuyo objetivo es determinar los mecanismos de transducción de señales involucradas en la activación por calcio de CREB y ERK1/2 / PROYECTO FONDECYT N°1030988

MACÊDO, Ramila de Brito. Efeito da inibição da calcineurina pela ciclosporina a em células planctônicas e biofilme de complexo Candida parapsilosis. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:04:52Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:06:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T16:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) Previous issue date: 2013 / Candida parapsilosis Complex comprises three species, C. parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis, which have the same phenotypic characteristics, can be differentiated only by the genotype using PCR with restriction enzyme. The C. parapsilosis Complex is gaining prominence in the global epidemiology of candidiasis to be the second or third most isolated species, moreover, reports of resistance to some antifungal agents are worrying. Calcineurin molecule also responsible for resistance to antifungal drugs and thinking of new molecular targets with the objective of this study was to evaluate the potential synergistic antifungal and calcineurin inhibitor, cyclosporin A, against planktonic and biofilm forms of strains C. parapsilosis Complex from clinical sources. The susceptility assays with amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and cyclosporin A were performed by microdilution in accordance with the guidelines of the Clinical Laboratory Standards Institute. The method board in microdilution assay performed tests for synergism against planktonic cells of strains of C. parapsilosis Complex. Antifungal combinations formed by cyclosporin A were evaluated against biofilms forming and mature in polystyrene plates, where differences in the pattern of antifungal susceptibility among species were observed, but strains of C. parapsilosis sensu stricto were more sensitive to cyclosporin A to C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Synergism between the antifungal and cyclosporin A was observed in strains of C. parapsilosis Complex. The combinations formed by antifungal and cyclosporin A were able to prevent the growth of the species in the planktonic phase of the complex, as well as in biofilm formation in CIM10X and CIM50X and showed inhibitory effect against mature biofilms of C. parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis in CIM50X. These results support the potential of inhibiting fungal calcineurin as a promising approach for increasing the efficiency of antifungal drugs. / O Complexo Candida parapsilosis compreende três espécies, C. parapsilosis stricto sensu, C. metapsilosis e C. orthopsilosis, que possuem características fenotípicas iguais, podendo ser diferenciadas apenas pelo genótipo utilizando a técnica de PCR com enzima de restrição. O Complexo C. parapsilosis vem ganhando destaque na epidemiologia mundial da candidíase por ser a 2a ou 3a espécies mais isolada, além disso, relatos de resistência a alguns antifúngicos são preocupantes. A calcineurina molécula responsável, também, pela resistência aos antifúngicos e pensando em novos alvos moleculares para as drogas que o objetivo desse trabalho foi, avaliar o potencial sinérgico de antifúngicos e do inibidor de calcineurina, ciclosporina A, contra formas planctônicas e biofilmes de cepas do Complexo C. parapsilosis de origens clínicas. Os ensaios de sensibilidade com anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e ciclosporina A foram realizadas pela técnica de microdiluição, em conformidade com as orientações do Clinical Laboratory Standards Institute. Os testes de sinergismo contra células planctônicas de cepas do Complexo C. parapsilosis foram realizados pelo método de Checkerboard, em ensaio de microdiluição. Combinações formadas por antifúngicos com ciclosporina A foram avaliados contra biofilmes em formação e maduros, em placas de poliestireno, onde diferenças no padrão de sensibilidade aos antifúngicos entre as espécies não foram observadas, porém cepas de C. parapsilosis stricto sensu foram mais sensíveis à ciclosporina A que C. orthopsilosis e C. metapsilosis. O sinergismo entre os antifúngicos e ciclosporina A foi observado em cepas do Complexo C. parapsilosis. As combinações formadas por antifúngicos e ciclosporina A foram capazes de impedir o crescimento das espécies do Complexo na fase planctônica, bem como, na formação de biofilme nas CIM10X e CIM50X e mostrou efeito inibitório contra biofilmes maduros de C. parapsilosis stricto sensu, C. metapsilosis e C. orthopsilosis nas CIM50X. Os resultados obtidos reforçam o potencial de inibição da calcineurina fúngica como uma abordagem promissora para aumentar a eficiência de drogas antifúngicas.

A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por um quadro clínico complexo e multifatorial, que envolve perdas cognitivas, déficit de memória e prejuízo na convivência social, observadas mais precocemente nessa população. O tecido cerebral dos portadores apresenta perdas neurais, disfunções neurovasculares, processos inflamatórios, gliose e lesões características da doença como as placas neuríticas e os emaranhados neurofibrilares. Ademais, as evidências apontam para similaridade entre DA e a demência induzida por diabetes mellitus, visto haver uma relação direta que liga a resistência e a deficiência na sinalização da insulina, com as mudanças no metabolismo da glicose. Essas alterações resultam em redução no estado de O-glicosilação com N-acetil-glucosamina das proteínas intracelulares, ativação das células gliais e o desequilíbrio homeostático na relação entre cinase/fosfatase desencadeada pela redução de metabólitos endógenos e aumento de cálcio intracelular. A resposta direta dessas mudanças é caracterizada pela expressão de marcadores celulares e liberação de mediadores inflamatórios que contribuem para a progressão e severidade da doença. Ainda, interações entre variações metabólicas e a ativação inflamatória alteram o microambiente do sistema nervoso central, ativando aguda e cronicamente astrócitos e microglia. Neste estudo investigamos a hipótese de que a infusão intracerebroventricular da estreptozotocina (STZ) desencadeia alterações patofisiológicas e moleculares em hipocampos. Em nossos experimentos, foram avaliadas as mudanças promovidas pela infusão de STZ após 1 e 4 semanas. Nossos resultados demonstram que a STZ afeta elementos importantes na via de sinalização da insulina no hipocampo, declínio da funções cognitivas e alterações neuroquímicas. Demonstramos que o grupo STZ apresentou níveis elevados da serina 307 do IRS-1 e redução na captação de glicose no hipocampo, possivelmente, através da resistência local à insulina e por disfunções astrocíticas. Além disso, demonstramos o impacto da ativação excessiva da calcineurina e a sinalização do fator nuclear de ativação das células T (NFAT), têm consequências a curto e longo prazo na progressão dos processos neurodegenerativos observados no modelo de DA esporádico. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a complex and multifactorial clinical presentation, which includes cognitive loss, memory deficits, and impairment in social coexistence, observed earlier in this population. The patients’ brain tissue presents neural losses, neurovascular dysfunctions, inflammatory processes, gliosis, and characteristic lesions of the disease, such as senile plaques and neurofibrillary tangles. In addition, the evidence indicates to similarity shared AD and dementia induced by diabetes mellitus by occur a direct relationship of insulin resistance and deficiency in insulin signaling with changes in glucose metabolism. These changes result in lower levels of protein modified by glycosylation with O-linked β-N-acetyl-glucosamine of intracellular, in activation of glial cells, and homeostatic imbalance in the kinase/phosphatase relationship triggered by the decrease of endogenous metabolites and increase of intracellular calcium. The direct response of these changes is characterized by the expression of cellular markers and the release of inflammatory mediators that contribute to the progression and severity of the disease. Furthermore, interactions among metabolic variations and inflammatory activation alter the microenvironment of the central nervous system, activating acute and chronic astrocytes and microglia. We hypothesized that intracerebroventricular infusion of streptozotocin (STZ) triggers pathophysiological and molecular changes in hippocampus. The changes promoted by the STZ infusion were evaluated after one and four weeks. Our results show that insulin STZ affects important elements of the insulin-signaling pathway in the hippocampus, cognitive decline and neurochemical changes. Here, we show that STZ group had elevated levels of serine 307 phosphorylation of IRS-1 and decrease in the uptake of glucose into the hippocampus, possibly, through local resistance to insulin and by astrocytic dysfunction. In addition, these results indicate that aberrant calcineurin activation and nuclear factor of activated T cells (NFAT) signaling develop earlier and later consequences in the progression of the neurodegenerative processes observed in the sporadic AD model.

A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por um quadro clínico complexo e multifatorial, que envolve perdas cognitivas, déficit de memória e prejuízo na convivência social, observadas mais precocemente nessa população. O tecido cerebral dos portadores apresenta perdas neurais, disfunções neurovasculares, processos inflamatórios, gliose e lesões características da doença como as placas neuríticas e os emaranhados neurofibrilares. Ademais, as evidências apontam para similaridade entre DA e a demência induzida por diabetes mellitus, visto haver uma relação direta que liga a resistência e a deficiência na sinalização da insulina, com as mudanças no metabolismo da glicose. Essas alterações resultam em redução no estado de O-glicosilação com N-acetil-glucosamina das proteínas intracelulares, ativação das células gliais e o desequilíbrio homeostático na relação entre cinase/fosfatase desencadeada pela redução de metabólitos endógenos e aumento de cálcio intracelular. A resposta direta dessas mudanças é caracterizada pela expressão de marcadores celulares e liberação de mediadores inflamatórios que contribuem para a progressão e severidade da doença. Ainda, interações entre variações metabólicas e a ativação inflamatória alteram o microambiente do sistema nervoso central, ativando aguda e cronicamente astrócitos e microglia. Neste estudo investigamos a hipótese de que a infusão intracerebroventricular da estreptozotocina (STZ) desencadeia alterações patofisiológicas e moleculares em hipocampos. Em nossos experimentos, foram avaliadas as mudanças promovidas pela infusão de STZ após 1 e 4 semanas. Nossos resultados demonstram que a STZ afeta elementos importantes na via de sinalização da insulina no hipocampo, declínio da funções cognitivas e alterações neuroquímicas. Demonstramos que o grupo STZ apresentou níveis elevados da serina 307 do IRS-1 e redução na captação de glicose no hipocampo, possivelmente, através da resistência local à insulina e por disfunções astrocíticas. Além disso, demonstramos o impacto da ativação excessiva da calcineurina e a sinalização do fator nuclear de ativação das células T (NFAT), têm consequências a curto e longo prazo na progressão dos processos neurodegenerativos observados no modelo de DA esporádico. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a complex and multifactorial clinical presentation, which includes cognitive loss, memory deficits, and impairment in social coexistence, observed earlier in this population. The patients’ brain tissue presents neural losses, neurovascular dysfunctions, inflammatory processes, gliosis, and characteristic lesions of the disease, such as senile plaques and neurofibrillary tangles. In addition, the evidence indicates to similarity shared AD and dementia induced by diabetes mellitus by occur a direct relationship of insulin resistance and deficiency in insulin signaling with changes in glucose metabolism. These changes result in lower levels of protein modified by glycosylation with O-linked β-N-acetyl-glucosamine of intracellular, in activation of glial cells, and homeostatic imbalance in the kinase/phosphatase relationship triggered by the decrease of endogenous metabolites and increase of intracellular calcium. The direct response of these changes is characterized by the expression of cellular markers and the release of inflammatory mediators that contribute to the progression and severity of the disease. Furthermore, interactions among metabolic variations and inflammatory activation alter the microenvironment of the central nervous system, activating acute and chronic astrocytes and microglia. We hypothesized that intracerebroventricular infusion of streptozotocin (STZ) triggers pathophysiological and molecular changes in hippocampus. The changes promoted by the STZ infusion were evaluated after one and four weeks. Our results show that insulin STZ affects important elements of the insulin-signaling pathway in the hippocampus, cognitive decline and neurochemical changes. Here, we show that STZ group had elevated levels of serine 307 phosphorylation of IRS-1 and decrease in the uptake of glucose into the hippocampus, possibly, through local resistance to insulin and by astrocytic dysfunction. In addition, these results indicate that aberrant calcineurin activation and nuclear factor of activated T cells (NFAT) signaling develop earlier and later consequences in the progression of the neurodegenerative processes observed in the sporadic AD model.

A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por um quadro clínico complexo e multifatorial, que envolve perdas cognitivas, déficit de memória e prejuízo na convivência social, observadas mais precocemente nessa população. O tecido cerebral dos portadores apresenta perdas neurais, disfunções neurovasculares, processos inflamatórios, gliose e lesões características da doença como as placas neuríticas e os emaranhados neurofibrilares. Ademais, as evidências apontam para similaridade entre DA e a demência induzida por diabetes mellitus, visto haver uma relação direta que liga a resistência e a deficiência na sinalização da insulina, com as mudanças no metabolismo da glicose. Essas alterações resultam em redução no estado de O-glicosilação com N-acetil-glucosamina das proteínas intracelulares, ativação das células gliais e o desequilíbrio homeostático na relação entre cinase/fosfatase desencadeada pela redução de metabólitos endógenos e aumento de cálcio intracelular. A resposta direta dessas mudanças é caracterizada pela expressão de marcadores celulares e liberação de mediadores inflamatórios que contribuem para a progressão e severidade da doença. Ainda, interações entre variações metabólicas e a ativação inflamatória alteram o microambiente do sistema nervoso central, ativando aguda e cronicamente astrócitos e microglia. Neste estudo investigamos a hipótese de que a infusão intracerebroventricular da estreptozotocina (STZ) desencadeia alterações patofisiológicas e moleculares em hipocampos. Em nossos experimentos, foram avaliadas as mudanças promovidas pela infusão de STZ após 1 e 4 semanas. Nossos resultados demonstram que a STZ afeta elementos importantes na via de sinalização da insulina no hipocampo, declínio da funções cognitivas e alterações neuroquímicas. Demonstramos que o grupo STZ apresentou níveis elevados da serina 307 do IRS-1 e redução na captação de glicose no hipocampo, possivelmente, através da resistência local à insulina e por disfunções astrocíticas. Além disso, demonstramos o impacto da ativação excessiva da calcineurina e a sinalização do fator nuclear de ativação das células T (NFAT), têm consequências a curto e longo prazo na progressão dos processos neurodegenerativos observados no modelo de DA esporádico. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a complex and multifactorial clinical presentation, which includes cognitive loss, memory deficits, and impairment in social coexistence, observed earlier in this population. The patients’ brain tissue presents neural losses, neurovascular dysfunctions, inflammatory processes, gliosis, and characteristic lesions of the disease, such as senile plaques and neurofibrillary tangles. In addition, the evidence indicates to similarity shared AD and dementia induced by diabetes mellitus by occur a direct relationship of insulin resistance and deficiency in insulin signaling with changes in glucose metabolism. These changes result in lower levels of protein modified by glycosylation with O-linked β-N-acetyl-glucosamine of intracellular, in activation of glial cells, and homeostatic imbalance in the kinase/phosphatase relationship triggered by the decrease of endogenous metabolites and increase of intracellular calcium. The direct response of these changes is characterized by the expression of cellular markers and the release of inflammatory mediators that contribute to the progression and severity of the disease. Furthermore, interactions among metabolic variations and inflammatory activation alter the microenvironment of the central nervous system, activating acute and chronic astrocytes and microglia. We hypothesized that intracerebroventricular infusion of streptozotocin (STZ) triggers pathophysiological and molecular changes in hippocampus. The changes promoted by the STZ infusion were evaluated after one and four weeks. Our results show that insulin STZ affects important elements of the insulin-signaling pathway in the hippocampus, cognitive decline and neurochemical changes. Here, we show that STZ group had elevated levels of serine 307 phosphorylation of IRS-1 and decrease in the uptake of glucose into the hippocampus, possibly, through local resistance to insulin and by astrocytic dysfunction. In addition, these results indicate that aberrant calcineurin activation and nuclear factor of activated T cells (NFAT) signaling develop earlier and later consequences in the progression of the neurodegenerative processes observed in the sporadic AD model.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2017-09-29T17:43:14Z No. of bitstreams: 1 camilamontoromfelicio_tese.pdf: 3396879 bytes, checksum: 0568a8c449b9fa50634fd25925b2f3e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-29T17:43:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camilamontoromfelicio_tese.pdf: 3396879 bytes, checksum: 0568a8c449b9fa50634fd25925b2f3e7 (MD5) Previous issue date: 2016-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Background: The use of kidneys from extended criteria donors (ECD) is associated with organs of inferior quality and, therefore, a high discarding rate. Clinical and histological tools available to assess non-ideal organs and predict outcomes of ECD have conflicting results. Objectives: To evaluated differences in the intragraft cytokine genes expression in ECD and SCD (standard criteria donors) kidney biopsies (Bx) pre and post-transplant (Tx) and sought possible changes induced by immunosuppressive regimens (ISS). Methodology: SCD and ECD recipients (RTx) were randomized to tacrolimus (Tac) or everolimus (Eve) and Bx were collected pre-implantation (T0 Bx; n = 80) and after 15 (T15 Bx; n = 64) and 90 days (T90 Bx; n = 51) post-Tx. Subgroups SCD-Tac, ECD-Tac, SCD-Eve and ECD-Eve were analyzed for clinical outcomes and clinical data were correlated with intragraft gene expression. Results: Overall, ECD-Eve and ECD-Tac had inferior one-year patient survival and ECD-Tac had lower graft survival than other groups while cytomegalovirus and de novo diabetes pos-Tx were higher in patients with Tac. After one year ECD-Eve patients had higher serum creatinine than ECD-Tac (p = 0.03). Acute rejection rates were higher in Eve group regardless donor type. T0 Bx of ECD showed higher expression of MCP-1, RANTES, TGF-β1 and IL-10 when compared with SCD. TGF-β1 related to the serum creatinine at harvesting the organ while length of donor hospitalization and ECD donor type were associated with upregulation of MCP-1 and RANTES. T15 Bx of patients from both groups taking Eve had increased FOXP3 and MCP-1. RANTES were upregulated only in the SCD-Eve group. Eve was the only variable associated with upregulation of FOXP3, MCP-1 and RANTES. Molecular profiling at T90 was similar except by an increase in FOXP3 transcripts restrict to SCD-Eve group. Positive expression of FOXP3 was associated with the use of Eve and delayed graft function (DGF) with the increased expression of MCP-1 and IL -10. We subtracted from Bx T15 and T90 gene expression values obtained in Bx T0 and two distinct types of molecular profile were found to SCD and ECD. SCD kidneys showed upregulation for all molecules, except TGF-β1 regardless of the ISS system, and ECD kidneys showed negative regulatory molecules for the same, except for slight positive FOXP3 and RANTES expressions. Conclusion: Pre-implantation Bx of ECD kidneys had an inflammatory molecular profile clearly distinct from SCD, with higher expression of RANTES, MCP-1, TGF-β1 and IL-10. Post-Tx, the ISS given modifies the initial cytokine expression pattern at different time points. / Introdução: O uso de rins de doadores com critérios estendidos (DCE) está associado com órgãos de qualidade inferior e, por isso acabam gerando alta taxa de descarte desses órgãos. Os métodos clínicos e histológicos usados como ferramentas para avaliar os órgãos “não ideais” e prever os desfechos dos DCE têm resultados conflitantes. Objetivos: Avaliar as diferenças na expressão gênica de biópsias (Bx) renais em DCE e doadores com critérios padrões (DCS) no pré e pós-transplante (Tx) e buscar possíveis alterações induzidas pelos regimes de imunossupressão (ISS). Metodologia: Receptores (RTx) de DCS e DCE foram randomizados para tacrolimo (Tac) ou everolimo (Eve) e as Bx foram coletadas no pré-transplante (T0 Bx; n = 80) e após 15 (T15 Bx; n = 64) e 90 dias (T90 Bx; n = 51) pós-Tx. Os subgrupos DCS-Tac, DCE-Tac, DCS-Eve e DCE-Eve foram analisados para os desfechos clínicos e os dados foram correlacionados com a expressão gênica intra-enxerto. Resultados: Receptores de DCE-Eve e DCE-Tac tiveram menor sobrevida em um ano pós-Tx. Infecção por citomegalovírus e diabetes mellitus pós-Tx foram maiores em pacientes tratados com Tac. Após um ano, receptores de DCE-Eve apresentaram creatinina sérica (sCr) mais elevada do que DCE-Tac. As taxas de rejeição aguda foram maiores no grupo Eve, independente do tipo de doador. Bx T0 de rins de DCE mostraram maior expressão de MCP-1, RANTES, TGF-β1 e IL-10 quando comparado com rins de DCS. TGF-β1 foi relacionado com a sCr na retirada do órgão, enquanto que o tempo de hospitalização de DCE foi associado com maior expressão de MCP-1 e RANTES. Bx T15 de pacientes dos grupos Eve apresentaram aumento de FOXP3 e MCP-1. A expressão de RANTES foi mais elevada no grupo DCS-Eve. O uso de Eve foi à única variável associada com maior expressão de FOXP3, MCP-1 e RANTES. O perfil das Bx após 90 dias foi similar exceto pelo aumento dos transcritos de FOXP3 restritos ao grupo DCS-Eve. A maior expressão de FOXP3 foi associada com o uso de Eve e a função tardia do enxerto com o aumento na expressão de MCP-1 e IL-10. Foram subtraídos das Bx T15 e T90, os valores de expressão gênica obtidos nas Bx T0, e dois tipos distintos de perfil molecular foram encontrados para DCS e DCE. Rins de DCS apresentaram maior expressão para todas as moléculas, exceto TGF-β1, independentemente do regime de ISS. Os rins de DCE mostraram menor expressão para as mesmas moléculas, exceto por aumento discreto na expressão de FOXP3 e RANTES. Conclusão: Bx pré-implantação de rins de DCE tiveram um perfil molecular inflamatório diferente de rins de DCS, com maior expressão de RANTES, MCP-1, TGF-β1 e IL-10. No pós-Tx, a ISS modificou o padrão inicial de expressão de citocinas nos tempos estudados.

Calcineurina (Cn), l'única serina treonina fosfatasa dependent de Ca2+ i calmodulina identificada fins al moment, és un enzim clau en la regulació de diverses vies de senyalització cel·lular, entre elles, l'activació limfocitària. Actualment, els protocols d'immunosupressió inclouen l'ús de fàrmacs anticalcineurínics, CsA i FK506, però la seva administració continuada comporta l'aparició de greus efectes secundaris. En els darrers anys s'han descrit diversos inhibidors endògens de Cn, entre ells la família de les calcipressines o regulators of calcineurin (RCAN), que en humans consta de tres membres RCAN1, RCAN2 i RCAN3. Fins al moment de realitzar aquest treball s'havia descrit que RCAN1 interacciona i inhibeix l'activitat fosfatasa de Cn respecte la família de factors de transcripció NFAT a diversos teixits, però no s'havia estudiat a limfòcits T humans. Per això, es va analitzar la interacció de les proteïnes RCAN1 i RCAN3 amb Cn a limfòcits T, així com avaluar el potencial immunosupressor de dites interaccions respecte a la via de senyalització Cn-NFAT.Els resultats obtinguts han mostrat que els transcrits RCAN1-1 i RCAN3-1,2,3,4,5 s'expressen a nivell basal en línies cel·lulars de limfòcits T humans, Jurkat i Hut78, mentre que el transcrit RCAN1-4, no. A més, l'expressió gènica de RCAN1-4 depén d'un senyal de Ca2+-Cn, mentre que l'expressió dels altres dos transcrits analitzats, no. Mitjançant experiments de co-immunoprecipitació s'ha demostrat que en cèl·lules Jurkat, la interacció RCAN1-1-Cn te lloc de manera endògena i mitjançant assaigs de pull down s'han identificat els dos motius de RCAN1-1 implicats, el motiu CIC i el motiu PxIxxT. En el cas de RCAN3-2, s'ha descrit per primer cop que aquesta proteïna sobreexpressada interacciona amb Cn i que ho fa únicament a través del seu corresponent motiu CIC. Assaigs funcionals in vivo han mostrat que únicament el motiu CIC de les RCAN és el responsable directe de la inhibició de la via de senyalització Cn-NFAT. Com a conseqüència, en cèl·lules Jurkat, s'ha demostrat el potencial immunosupressor del motiu CIC de les RCAN respecte l'expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT. L'acotament del motiu CIC de les RCAN ha permès identificar una seqüència de 21 aminoàcids, a la qual s'ha anomenat C18, i que correspon a la regió mínima de les RCAN capaç d'inhibir la via de senyalització Cn-NFAT. Les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn han estat posades a punt i caracteritzades in vitro mitjançant anisotropia de fluorescència. A més, s'ha demostrat que les proteïnes RCAN i NFAT s'interfereixen en la seva interacció amb Cn i que probablement les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn no impliquen la participació directa del centre actiu de Cn. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'efecte immunosupressor de les RCAN seria més específic que el que promouen els fàrmacs inhibidors de Cn, CsA i FK506, utilitzats actualment. Amb la finalitat d'identificar noves molècules amb potencial immunosupressor es van realitzar diversos cribratges utilitzant quimioteques combinatòries que disruptin la interacció C18-RCAN1-Cn. A partir d'aquests experiments s'han identificat quatre hexapèptids i un producte denominat IDI3A que desplacen de manera dosi-dependent la interacció analitzada. L'avaluació funcional del producte IDI3A ha demostrat que aquest inhibeix in vivo la via de senyalització Cn-NFAT i que per tant, te cert efecte immunosupressor. Aquestes dades indiquen que, tant els pèptids C18 de les RCAN com l'assaig in vitro que s'ha dissenyat, constitueixen dues noves eines útils en la cerca de molècules amb potencial immunosupressor. / Calcineurin (Cn), a calcium and calmodulin dependent serine-threonine protein phosphatase, is a key enzyme involved in many cellular processes, including T cell activation. Activated Cn dephosphorylates many substrates, among them the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factors, inducing their translocation to the nucleus. There, NFAT are key components of the cytokine gene expression stimulation that triggers T cell activation. Current immunosuppressive protocols include the administration of CsA and FK506, but their continuous use has been correlated with severe side effects. Recently, several Cn endogenous inhibitors have been described, including the protein family of Cn regulators (RCAN, previously known as calcipressins or DSCR1). In the present study it has been characterized the RCAN1 and RCAN3 interaction with Cn in human T lymphocytes. Moreover, it has been evaluated the functional consequence of these interactions towards the Cn-NFAT signalling pathway in vivo.It has been shown that RCAN1-1 interacts endogenously with Cn in T cells and such interaction takes place through two independent RCAN1-1 sequences, the CIC and the PxIxxT motifs. Moreover, it has been described for the first time that RCAN3-2 binds to Cn and this interaction occurs only through the RCAN3-2 CIC motif. In vivo functional assays have shown that the RCAN CIC motif is the unique direct responsible for the inhibition of the Cn-NFAT signalling pathway. In human T cells, the RCAN CIC motif inhibits NFAT-dependent cytokine gene expression confirming its immunosuppressive effect. Moreover, it has been identified the minimal RCAN-derived sequence spanning 21 amino acids, which is part of the RCAN CIC motif, that retains the ability of inhibiting the Cn-NFAT signaling in vivo. Peptides spanning this sequence from RCAN1 and RCAN3, have allowed to study the binding mechanism of RCAN proteins to Cn. In vitro, these RCAN-derived peptides bind to Cn with high affinity and selectively inhibit the interaction of Cn with NFAT. Indeed, by screening chemical and peptide libraries, four hexapeptides and a product called IDI3A that modulates the RCAN-Cn interaction in vitro have been identified. In addition, it has also been demonstrated that the IDI3A product inhibits the Cn-NFAT signaling pathway in vivo.

Orientador: Luís Gustavo Modelli de Andrade / Resumo: Introdução: O Brasil é o maior serviço público de transplantes do mundo sendo a quase totalidade do seu financiamento custeado pelo sistema único de saúde. Os regimes de imunossupressão também são inteiramente financiados pelo Estado através do Componente Especializado de Assistência Farmacêutica, mas são pouco estudados sob a perspectiva econômica. O objetivo primário foi realizar uma análise de custo efetividade do regime de imunossupressão de tacrolimo com micofenolato comparado a tacrolimo associado a imTOR pelo período de um ano após o transplante renal. O objetivo secundário foi avaliar a não inferioridade destes dois regimes. Materiais e Métodos: Tratou-se de um estudo retrospectivo de transplantados renais realizados no Hospital das Clínicas de Botucatu, comparando protocolos de imunossupressão em 12 meses após o transplante. O primeiro esquema de imunossupressão foi o utilizado até outubro de 2015 e o segundo esquema adotado após mudança do protocolo do serviço. Foram feitas comparações entre os dois regimes de imunossupressão para avaliar a não inferioridade sendo definida como: o somatório dos eventos de rejeição aguda, descontinuidade, perda do enxerto e óbito ao fim de um ano. Para as análises de custo foi construído um modelo de análise de decisão no software TreeAge Pro 2009. As probabilidades de ocorrência dos eventos foram calculadas em cada grupo na amostra histórica. Foram conduzidas análises de sensibilidade visando obter uma simulação realista dos custos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Brazil is the largest public transplant service in the world, with almost all of its costs funded by the public health system. The immunosuppressive regimens are also fully funded by the state. These regimes were studied in terms of effectiveness, but they were poorly studied from an economic perspective. The primary objective was to conduct a cost-effectiveness analysis of the immunosuppressive regimen of tacrolimus with mycophenolate compared to tacrolimus associated with imTOR for a period of one year after kidney transplantation. The secondary objective was to assess the non-inferiority of these two regimens. Materials and Methods: This was a retrospective study of kidney transplants carried out at UNESP, Univ Estadual Paulista, comparing immunosuppressive protocols at 12 months after transplantation. The first immunosuppressive regimen was the one used until October 2015 and the second regimen adopted after changing the service protocol. Comparisons were made between the two immunosuppressive regimens to evaluate non-inferiority, defined as a composite end-point of biopsy proven acute rejection, graft loss, death, and adverse events leading to drug discontinuation. A decision analysis model was constructed with TreeAge Pro 2009 software to perform the cost analyzes. The probability of occurrence of clinical events was calculated for each group in the historical sample. Sensitivity analyzes were conducted in order to obtain a realistic simulation of the fina... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Tacrolimus (TAC) é um fármaco imunossupressor muito utilizado na prevenção de rejeição aguda após o transplante de órgãos. Essa droga apresenta um índice terapêutico muito baixo e grande variabilidade intra e interindividual, sendo necessário programas de monitorização terapêutica para se otimizar a eficácia e limitar a toxicidade. O TAC é um fármaco substrato do CYP3A5 e transportado pela proteína de efluxo PGP e acredita-se que o polimorfismos genéticos (SNPs) destas proteínas estejam relacionados a alta variabilidade farmacocinética desta droga. Neste estudo, investigamos a influência dos polimorfismos destas proteínas sobre alguns parâmetros farmacocinéticos do TAC e também, na incidência de lesões renais e rejeição em receptores de transplante renal. Pacientes recebendo TAC a no mínimo 12 meses (n=108) foram genotipados (PCR real time) para os polimorfismos do CYP3A5*3 (rs776746) e do gene ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) e 3435C>T (rs1045642). Dados da concentração plasmática de vale (Co; ng/mL), dose diária normalizada (mg/dia por Kg do paciente) e a concentração plasmática do fármaco normalizada pela dose ingerida (Co/dose, ng/mL por mg/dia por kg do paciente) de TAC foram obtidos dos prontuários médicos ao longo de três anos após o transplante renal. O desfecho clínico foi analisado avaliando-se a curva de sobrevida o enxerto, a função renal obtida pelo clearance de creatinina (Equação de Cockroft-Gault), e desenvolvimento de lesões renais e rejeição aguda e crônica com diagnósticos estabelecidos mediante suspeita clínica e confirmados pela avaliação das biópsias quanto a presença de necrose tubular aguda (NTA) e nefropatia crônica do enxerto (NFC) de acordo com a classificação de BANFF 07. Os haplótipos do gene ABCB1 foram inferidos estatisticamente utilizando o software PHASE (version 2.1). Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Não observamos desvios em relação ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg em nossa população para nenhum dos genes estudados. Frequências alélicas destes polimorfismos (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 59% and 2677G 64%) e haplótipos (49% 2677G-3435C-1236C e 31% 2677T-3435T-1236T) foram consistentes com outros estudos realizados na população brasileira. Indivíduos portadores de ao menos um alelo *1 do gene CYP3A5 necessitavam de maiores doses de TAC para obter níveis plasmáticos semelhantes aos dos indivíduos homozigotos para o alelo *3 (0,09 ± 0,03 vs. 0,06 ± 0,03; mg/dia/kg; p<0,001). Ao final do primeiro ano de transplante pacientes CYP*3/*3 apresentavam praticamente o dobro da razão Co/dose quando comparados com os pacientes CYP*1/*1 (144,60 ± 67,29 vs. 70,44 ± 56,05 ng*mL-1 /mg*kg- 1 /dia; p<0,001). Observou-se semelhante em relação quando indivíduos portadores dos alelos e haplótipo variante da PGP foram avaliados. Não encontramos associações significativas entre os genótipos e a sobrevida do enxerto ou clearance de creatinina. No entanto, observamos que os pacientes portadores do haplótipo GCC apresentaram maior incidência de desenvolvimento de NFC. Este estudo confirma o efeito dos polimorfismos do CYP3A5 e, em menor grau da PGP na farmacocinética do TAC. No entanto, não encontramos associações entre esses polimorfismos e desfechos clínicos significantes, sugerindo que a genotipagem para o CYP3A5 ou ABCB1 ainda não deva ser incorporada na prática clínica como uma ferramenta para o manejo de transplante renal. / Tacrolimus (TAC) is widely used to prevent acute rejection following solid-organ transplantation. This drug is characterized by a narrow therapeutic index and drug monitoring programs are required both to optimize efficacy and to limit toxicity. TAC is known to be substrate of cytochrome P450 (CYP) 3A5 and P-glycoprotein (PGP/ABCB) and its been suggested that genetic polymorphisms (SNPs) of these proteins are highly associated with variations in TAC pharmacokinetics. We investigated the influence of polymorphisms of CYP3A5 and ABCB1 gene on the pharmacokinetic parameters (PK) of TAC and on the incidence of kidney injuries and allograft rejection (AR) in renal transplant recipients. Patients receiving TAC for at least 12 months (n=108) were genotyped (real-time PCR) for CYP3A5*3 (rs776746) and for ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) and 3435C>T (rs1045642) polymorphisms. TAC predose concentration (Co; ng/mL), TAC daily dose (mg/day per kg body weight) and dose-normalized predose concentrations (Co/dose; ng/mL per mg/day per kg body weight) were retrieved from medical records up to 03 years after transplantation. Clinical outcomes were analyzed evaluating renal function in terms of creatinine clearance ( Cockroft-Gault equation) and allograft survival. Kidney injuries and AR diagnostics were established by clinical suspicion and in presence of histological findings in renal biopsies according to the 2007 Banff classification. ABCB1 gene haplotypes were statistically inferred using PHASE software (version 2.1). No deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was observed in our study population for the polymorphic loci examined in CYP3A5 and ABCB1. Allelic frequencies of these polymorphisms (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 60% and 2677G 65%) and haplotypes (49% 2677G-3435C-1236C and 30% 2677T- 3435T-1236T) were consistent with other studies in the Brazilian population. Individuals carrying at least one CYP3A5*1 allele required higher TAC dose to achieve similar TAC blood levels as the homozygous individuals for the *3 allele (0.09 ± 0.03 vs.0.06 ± 0.03, mg/day per kg body weight, p<0.001). The presence of the CYP3A5*1 allele was also associated with lower TAC Co/dose compared to CYP*3 homozygous (84.9 ± 43.2 vs. 144.6 ± 66.7 ng/mL per mg/day per kg body weight, p<0.001). Regarding ABCB1 polymorphisms, individuals homozygous for the variant allele of each individual SNP and for the haplotype (TTT) showed higher Co/dose ratio. No associations were found between SNPs or haplotypes and allograft survival or creatinine clearance. We did find, though, that patients carrying GCC haplotype had a higher incidence of chronic rejection. Our findings confirm the effect of CYP3A5 and, less pronounced of ABCB1 polymorphisms, on the TAC pharmacokinetic. On the other hand, we did not find any association between these polymorphisms and relevant clinical outcomes, suggesting that CYP3A5 and ABCB1 genotyping must not be incorporated as a useful clinical tool on the management of kidney transplantation.

Tacrolimus (TAC) é um fármaco imunossupressor muito utilizado na prevenção de rejeição aguda após o transplante de órgãos. Essa droga apresenta um índice terapêutico muito baixo e grande variabilidade intra e interindividual, sendo necessário programas de monitorização terapêutica para se otimizar a eficácia e limitar a toxicidade. O TAC é um fármaco substrato do CYP3A5 e transportado pela proteína de efluxo PGP e acredita-se que o polimorfismos genéticos (SNPs) destas proteínas estejam relacionados a alta variabilidade farmacocinética desta droga. Neste estudo, investigamos a influência dos polimorfismos destas proteínas sobre alguns parâmetros farmacocinéticos do TAC e também, na incidência de lesões renais e rejeição em receptores de transplante renal. Pacientes recebendo TAC a no mínimo 12 meses (n=108) foram genotipados (PCR real time) para os polimorfismos do CYP3A5*3 (rs776746) e do gene ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) e 3435C>T (rs1045642). Dados da concentração plasmática de vale (Co; ng/mL), dose diária normalizada (mg/dia por Kg do paciente) e a concentração plasmática do fármaco normalizada pela dose ingerida (Co/dose, ng/mL por mg/dia por kg do paciente) de TAC foram obtidos dos prontuários médicos ao longo de três anos após o transplante renal. O desfecho clínico foi analisado avaliando-se a curva de sobrevida o enxerto, a função renal obtida pelo clearance de creatinina (Equação de Cockroft-Gault), e desenvolvimento de lesões renais e rejeição aguda e crônica com diagnósticos estabelecidos mediante suspeita clínica e confirmados pela avaliação das biópsias quanto a presença de necrose tubular aguda (NTA) e nefropatia crônica do enxerto (NFC) de acordo com a classificação de BANFF 07. Os haplótipos do gene ABCB1 foram inferidos estatisticamente utilizando o software PHASE (version 2.1). Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Não observamos desvios em relação ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg em nossa população para nenhum dos genes estudados. Frequências alélicas destes polimorfismos (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 59% and 2677G 64%) e haplótipos (49% 2677G-3435C-1236C e 31% 2677T-3435T-1236T) foram consistentes com outros estudos realizados na população brasileira. Indivíduos portadores de ao menos um alelo *1 do gene CYP3A5 necessitavam de maiores doses de TAC para obter níveis plasmáticos semelhantes aos dos indivíduos homozigotos para o alelo *3 (0,09 ± 0,03 vs. 0,06 ± 0,03; mg/dia/kg; p<0,001). Ao final do primeiro ano de transplante pacientes CYP*3/*3 apresentavam praticamente o dobro da razão Co/dose quando comparados com os pacientes CYP*1/*1 (144,60 ± 67,29 vs. 70,44 ± 56,05 ng*mL-1 /mg*kg- 1 /dia; p<0,001). Observou-se semelhante em relação quando indivíduos portadores dos alelos e haplótipo variante da PGP foram avaliados. Não encontramos associações significativas entre os genótipos e a sobrevida do enxerto ou clearance de creatinina. No entanto, observamos que os pacientes portadores do haplótipo GCC apresentaram maior incidência de desenvolvimento de NFC. Este estudo confirma o efeito dos polimorfismos do CYP3A5 e, em menor grau da PGP na farmacocinética do TAC. No entanto, não encontramos associações entre esses polimorfismos e desfechos clínicos significantes, sugerindo que a genotipagem para o CYP3A5 ou ABCB1 ainda não deva ser incorporada na prática clínica como uma ferramenta para o manejo de transplante renal. / Tacrolimus (TAC) is widely used to prevent acute rejection following solid-organ transplantation. This drug is characterized by a narrow therapeutic index and drug monitoring programs are required both to optimize efficacy and to limit toxicity. TAC is known to be substrate of cytochrome P450 (CYP) 3A5 and P-glycoprotein (PGP/ABCB) and its been suggested that genetic polymorphisms (SNPs) of these proteins are highly associated with variations in TAC pharmacokinetics. We investigated the influence of polymorphisms of CYP3A5 and ABCB1 gene on the pharmacokinetic parameters (PK) of TAC and on the incidence of kidney injuries and allograft rejection (AR) in renal transplant recipients. Patients receiving TAC for at least 12 months (n=108) were genotyped (real-time PCR) for CYP3A5*3 (rs776746) and for ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) and 3435C>T (rs1045642) polymorphisms. TAC predose concentration (Co; ng/mL), TAC daily dose (mg/day per kg body weight) and dose-normalized predose concentrations (Co/dose; ng/mL per mg/day per kg body weight) were retrieved from medical records up to 03 years after transplantation. Clinical outcomes were analyzed evaluating renal function in terms of creatinine clearance ( Cockroft-Gault equation) and allograft survival. Kidney injuries and AR diagnostics were established by clinical suspicion and in presence of histological findings in renal biopsies according to the 2007 Banff classification. ABCB1 gene haplotypes were statistically inferred using PHASE software (version 2.1). No deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was observed in our study population for the polymorphic loci examined in CYP3A5 and ABCB1. Allelic frequencies of these polymorphisms (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 60% and 2677G 65%) and haplotypes (49% 2677G-3435C-1236C and 30% 2677T- 3435T-1236T) were consistent with other studies in the Brazilian population. Individuals carrying at least one CYP3A5*1 allele required higher TAC dose to achieve similar TAC blood levels as the homozygous individuals for the *3 allele (0.09 ± 0.03 vs.0.06 ± 0.03, mg/day per kg body weight, p<0.001). The presence of the CYP3A5*1 allele was also associated with lower TAC Co/dose compared to CYP*3 homozygous (84.9 ± 43.2 vs. 144.6 ± 66.7 ng/mL per mg/day per kg body weight, p<0.001). Regarding ABCB1 polymorphisms, individuals homozygous for the variant allele of each individual SNP and for the haplotype (TTT) showed higher Co/dose ratio. No associations were found between SNPs or haplotypes and allograft survival or creatinine clearance. We did find, though, that patients carrying GCC haplotype had a higher incidence of chronic rejection. Our findings confirm the effect of CYP3A5 and, less pronounced of ABCB1 polymorphisms, on the TAC pharmacokinetic. On the other hand, we did not find any association between these polymorphisms and relevant clinical outcomes, suggesting that CYP3A5 and ABCB1 genotyping must not be incorporated as a useful clinical tool on the management of kidney transplantation.