Depuis 2013, le traitement « universel » est recommandé en France. Le moment de l’initiation thérapeutique est une question qui reste cependant d’actualité pour les patients se présentant en primo-infection. Cette thèse s’attache à étudier la prise en charge thérapeutique du VIH au stade de la primo-infection (PIV) sous différents angles :1) le suivi par les cliniciens des recommandations d’initiation des traitements antirétroviraux depuis 1996 en fonction de l’évolution de ces recommandations; 2) l’impact d’un traitement ARV transitoire en PIV sur la réponse immuno-virologique lors de la reprise du traitement et 3) l’identification de nouveaux biomarqueurs comme facteurs pronostiques de progression de l’infection VIH. La majorité des travaux présentés dans cette thèse repose sur les données de la cohorte ANRS PRIMO qui comporte environ 1 500 patients infectés par le VIH inclus en PIV entre juin 1996 et décembre 2013, dans 94 hôpitaux français. Tous les patients étaient naïfs de traitement antirétroviral à l'inclusion.La première partie de la thèse analyse la mise en œuvre des recommandations d’initiation du traitement ARV entre 1996 et 2010 par les médecins en France, dans deux situations distinctes : au stade chronique et lors de la primo-infection par le VIH-1. Nous avons montré que les recommandations d’initiation du traitement ARV étaient largement suivies. Néanmoins, il existe un effet d’inertie dans leurs applications lors des changements de recommandation. Il reste à améliorer le délai de mise sous traitement lorsque le taux de CD4 atteint le seuil recommandé. Au stade chronique, le traitement était plus fréquemment initié chez les patients présentant un critère d’initiation dès le diagnostic d’infection par le VIH (96%), que chez les patients qui atteignaient un critère d’initiation au cours du suivi (78%, p<0.001). Nous avons identifié comme facteurs de risque de ne pas être traité en phase chronique malgré une indication de traitement : une charge virale < 5log (versus >5), un plus faible niveau d’éducation et des conditions de vie précaires.L’impact de l’interruption d’un traitement antirétroviral initié en PIV sur la restauration des CD4 après reprise du traitement a été exploré en modélisant l’évolution des CD4 avec des modèles linéaires à effets mixtes avec intercept et pente aléatoires. Les patients qui avaient initié un traitement ARV pendant la phase chronique avaient une meilleure réponse immunologique que les patients reprenant un 2ème traitement après un traitement transitoire en PIV : à 36 mois, les gains en √CD4 cellules/mm3 et en pourcentage de CD4 étaient significativement plus élevés. Cependant, il s’agissait de différences modestes en termes cliniques, qui ne conduisent pas à recommander d’arrêter la recherche clinique sur les arrêts de traitement cherchant à induire des contrôleurs post traitement. Après un état des lieux des mécanismes complexes d’activation/inflammation du système immunitaire pendant la primo-infection nous avons cherché à identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’évolution de l’infection. Le taux de sCD14 (marqueur d’activation monocyte/macrophage et marqueur indirect de translocation microbienne) au moment de la PIV a été identifié comme marqueur potentiel de prédiction du déclin des CD4 et du risque de mortalité d’origine cardio-vasculaire. En conclusion, bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la prise en charge du VIH, d'autres études sont nécessaires pour optimiser et adapter le traitement au profil du patient dès les premiers stades de l’infection VIH. / In France, since 2013, HIV treatment has been recommended for all HIV-infected patients independently of their CD4 count. However, when to start anti-retroviral (ARV) treatment is still an issue. This thesis aims to explore the therapeutic management of HIV at the stage of PHI in different aspects: 1) we explored how physicians in France have applied the evolving guidelines for ART initiation since 1996 2) the impact of a transient ARV treatment at PHI on immuno-virological response during 2nd treatment and 3) identification of new biomarkers prognostic of HIV progression.Most of the work presented in this thesis is based on data from the ongoing ANRS PRIMO cohort that enrolled more than 1 500 HIV infected patients enrolled at PHI since June 1996 in 94 French hospitals. All patients were antiretroviral therapy naive at baseline.The first part of the thesis analyzes the implementation of the recommendations of ARV treatment initiation between 1996 and 2010 by physicians in France, in two distinct situations: in the chronic HIV-1 infection and during primary HIV-1 infection. We have shown that the recommendations of ARV treatment initiation were widely followed. Nevertheless, there was inertia in guidelines application when changes in the recommendations took place. The time to treatment when CD4 cell counts reach the threshold to treat can be improved. 96% of the patients initiated ART when they had a CD4 cell count below the threshold to treat at entry, while treatment was less timely initiated when the CD4 threshold was reached during active follow-up (78%, p <0.001).We identified as risk factors for not being timely treated in chronic phase despite an indication for treatment: a viral load <5log (versus> 5), a lower education level and poor living conditions.The impact of ARV interruption after a first treatment initiated at PHI on the CD4 count restoration after resumption was explored by modeling the evolution of CD4 cells with linear mixed effects models with random intercept and slope. Patients who initiated ARV treatment during the chronic phase had a better immune response than patients who initiated a second course treatment after a transient ART at PHI: at 36 months, the gains in √CD4 cells / mm3 and CD4 percentage were significantly higher. However, this difference was clinically modest and further research on treatment interruptions seeking to induce post-treatment controllers is still an issue but only in research settings and under close medical surveillance. After an overview of the complex mechanisms of activation / inflammation of the immune system during primary infection we sought to identify new predictive biomarkers of disease progression. The level of sCD14 (marker of monocyte/macrophage activation and an indirect marker of microbial translocation) at the time of PHI was identified as predictive marker of CD4 decline and of risk of cardio-vascular mortality. In conclusion, although considerable progress has been made in the management of HIV, further studies are needed to optimize and adapt the treatment to the patient profile in the early stages of HIV infection.

Hintergrund: Die Funktion von Immunzellen hängt von einer konstanten und ausreichenden Energieversorgung ab, die über die OXPHOS in den Mitochondrien und die Glykolyse im Zytosol realisiert wird. Die wichtigsten Substrate dafür sind Sauerstoff und Glukose. Fragestellung: Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten ist die zelluläre Energieversorgung stark beeinträchtigt, weil in der Mikroumgebung der Zelle Sauerstoff und Nährstoffe inadäquat bereitgestellt werden. Ziel war herauszufinden, ob und wie humane Immunzellen ihre Lebensfähigkeit und funktionellen Aktivitäten unter solchen Umständen aufrechterhalten. Methoden: Humane CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten wurden durch MACS aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Die Sauerstoffverbrauchsmessung mittels Clark-Elektrode war Maß der oxidativen Energiebildung, die mit Myxothiazol und Glukoseentzug gehemmt wurde. Die CD3/CD28-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde durchflußzytometrisch mittels CFDA SE analysiert. Basierend auf dem Paraformaldehyd-Saponin-Prozedere wurde die Zytokinsynthese ebenfalls am FACS bewertet, nachdem die T-Zellen in Anwesenheit von Brefeldin A mit PMA/Ionomycin stimuliert wurden. Mit einem käuflichen Testsystem (FACS-Technik) wurde die monozytäre Phagozytose untersucht. Die HIF-1alpha-Expression wurde nach PMA-Ionomycin-Stimulation von Myxothiazol-behandelten T-Zellen auf mRNA- und Proteinebene gemessen. Ergebnisse: Bei Glukoseanwesenheit waren alle untersuchten Immunfunktionen trotz vollständig gehemmter OXPHOS unbeeinträchtigt. Erst bei gleichzeitigem Glukoseentzug, der per sé Proliferation und Phagozytose signifikant beeinträchtigte, waren sie signifikant vermindert. Es wird vermutet, daß T-Zellen die Energieverluste mit einem überschießenden Effekt ihres Sauerstoffverbrauchs und stark angetriebener Glykolyse kompensieren. HIF-1alpha ist dabei nicht entscheidend für die Umschaltung auf anaerobe Energiesynthese. Schlußfolgerung: Die Daten quantifizieren die Energieanforderungen der funktionellen Aktivität in hochgereinigten humanen Immunzellfraktionen. Es wurde nachgewiesen, daß sich Immunzellen unerwartet lange an eine massiv beeinträchtigte Energetik adaptieren können und ihre spezifischen Funktionen aufrechterhalten. / Background: The function of immune cells is dependent upon a constant and adequate supply of energy. Energy is formed via OXPHOS in the mitochondria and via cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose are the main substrates for energy synthesis. Objective: In severe diseases or in inflamed areas cellular energy supply is significantly impaired due to inadequate supply of cellular microenvironment with oxygen and nutrients. The aim of this study was to answer the question, whether and how human immune cells maintain viability and functional activity under these circumstances. Methods: Human CD4+ T cells and CD14+ monocytes were isolated by MACS from peripheral blood of healthy donors. The extent of oxidative energy formation was determined via measurement of oxygen consumption using a Clark type electrode. Energy production was restricted in glucose-free cell culture medium and by gradually inhibited OXPHOS using myxothiazol. T cell proliferation was flow-cytometrically analysed using CFDA SE after stimulation with CD3 and CD28 antibodies. Cytokine synthesis was assessed by flow-cytometrical immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure after stimulation of T cells with PMA/ionomycin in the presence of brefeldin A. Phagocytosis of monocytes was measured using a commercial test system (FACS technique). HIF-1alpha expression was assessed by semiquantitative PCR and immunoblot after the stimulation of myxothiazol treated T cells with PMA/ionomycin. Results: In glucose-containing medium all investigated immune functions were unaffected even under complete suppression of OXPHOS. Only when OXPHOS and glycolysis were simultaneously and almost completely suppressed a significant decrease was found. Glucose deprivation per se caused both a significantly reduced proliferation and phagocytosis. It is supposed, that T cells are able to compensate for an energy deficit by an excess of oxygen consumption and strongly induced glycolysis. However, HIF-1alpha was found to be not crucial for switching to anaerobic energy synthesis. Conclusion: These data quantify the energy requirement of functional activity in highly purified human immune cell fractions. An unexpectedly high adaptive potential of immune cells to maintain specific functions even under massively impaired energetic conditions could be demonstrated.

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Etwa 3% der Weltbevölkerung sind von dem Hepatitis-C-Virus-Infektion betroffen. Phänotyp der HCV-induzierten Lebererkrankung variiert stark von einem Patienten zum anderen. Die Wahrnehmung der viralen doppelsträngigen RNA (dsRNA) und einzelsträngigen RNA (ssRNA) durch den Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3) bzw. TLR7 scheinen an der Früherkennung der Pathogene und an der Wirtsantwort auf viraler Infektion beteiligt zu sein. Darüber hinaus ist die membran-assoziierte Form des Endotoxin-Rezeptor-Bestandteils CD14 (mCD14) mit TLR3 in Intrazellulärräumen kolokalisiert und erweitert die dsRNA-Erkennung und TLR3-Signalleitung. Die vorliegende Arbeit analysiert epidemiologische und klinische Daten von Patienten kaukasischer Abstammung mit einer chronischen Hepatitis C in Bezug auf bestimmte Einzellnukleotidpolymorphismen (SNPs) mit relevanten minor allele frequencies (MAFs) in Genen, die für obengenannte Rezeptoren kodieren. Es wurde keine Assoziation von dem TLR3-Promotor-Polymorphism rs5743305 (T/A) mit TLR3-Genexpression gefunden, weder in peripheren mononukleären Zellen des Blutes (PBMCs) noch in der Leber; keine weitere Korrelation mit epidemiologischen und klinischen Parametern der chronischen Erkrankung waren zu beobachten. Andererseits, T-homozygote Patienten am rs3775291-(C/T)-Polymorphismus (der in Exon 4 lokalisierter nicht-synonymer SNP) zeigen Tendenz zu einer höheren TLR3-Genexpression in der Leber. Außerdem, unter HCV-subtyp-1a-infizierten Patienten sind keine T-Homozygoten zu finden. Im Unterschied zur Lage bei alkoholischer Lebererkrankung wurde in chronischen Hepatitis-C-Patienten keine Assoziation zwischen den Fibrosegrad und CD14-Gen-C-159T-Polymorphismus gefunden. Bei T-homozygoten Patienten wurden jedoch häufiger portale lymphoide Aggregaten gefunden als bei C-Allele-Trägern. Außerdem das Vorhandensein von portalen lymphoiden Aggregaten korrelierte eng mit der Leberentzündung und mit Gallengangsläsionen. Am Ende wurde der funktionelle nicht-synonyme SNP in Exon 3 des X-gekoppelten TLR7 Gens, rs179008/Gln11Leu, untersucht. Die Analyse war auf homo- und hemizygoten Personen, die mittels Allelspezifischentranskriptquantifizierung (ASTQ) in heterozygoten weiblichen Personen eingeordnet wurden, eingeschränkt. Es zeigte sich dabei ein individueller verzerrter Mosaizismus in PBMCs. Das variante T-Allel war nur mit der Anwesenheit der portalen lymphoiden Aggregaten assoziiert. Hepatische Viruslast und Expression der Gene, die bekannterweise bei einer chronischer HCV-Infektion induziert sind, unterschieden sich zwischen Wildtyp- und Variantallelträger nicht. Jedoch eine signifikant niedrigere Expression der interleukin-29 (IL-29)/lambda1 interferon (IFN-λ1) und beider Untereinheiten seines Rezeptors (IL-10 Rβ and IL-28Rα) war bei T-homo- und hemizygoten Patienten zu beobachten. Diese Tatsache könnte eher eine Auswirkung auf die Ansprechbarkeit auf zukünftige IFN- λ-basierte Therapie haben, als auf eine Vorhersage des Ausgangs der gängigen IFN-α-basierten Therapie.

Once seen as a disease of wealthy nations, type 2 diabetes mellitus is now showing unprecedented growth throughout the world, fueling increases in microvascular and macrovascular complications. A compelling and growing body of evidence suggests that glucose intolerance and insulin resistance, hallmarks of the diabetic patient, may be driven by chronic inflammation. In particular, a predominance of visceral fat has been associated with enhanced inflammatory cytokine secretion that may contribute to enhanced risk of diabetes and comorbid cardiovascular disease in these individuals. As a function of its potency and wide environmental and biological distribution, we hypothesized that bacterial lipopolysaccharide (LPS, also known as endotoxin) may promote adipose inflammation and concomitant metabolic dysfunction. Indeed, expression of the LPS receptor CD14 is enhanced on visceral adipocytes of ob/ob mice, paralleling enhanced IL-6 secretion ex vivo. Furthermore, rosiglitazonefed ob/obmice demonstrated a reduction in CD14 that coordinated with diminished IL-6 secretion, suggesting a basis for the touted anti-inflammatory effects of this commonly employed type 2 diabetes medication. Mice deficient in components of the LPS signaling cascade, namely CD14, TLR4, and MyD88, yielded adipocytes with markedly attenuated IL-6 secretion, corroborating the central importance of LPS in adipocyte inflammation and supporting the role of this signaling pathway in depot-specific inflammation. Despite the prominent role of LPS signaling in adipocyte inflammation, CD14-, TLR4-, and MyD88-deficient mice failed to show resistance to diet induced obesity. Surprisingly, cd14-/- and tlr4-/- mice had marked glucose intolerance without alteration in total weight or adipose accumulation. In contrast, myd88-/- mice revealed minor glucose intolerance only with high fat diet challenge at an advanced age despite being overtly obese. In cd14-/- and tlr4-/-, but not myd88-/-, mice, an exaggerated rebound to hypoglycemia was associated with enhanced norepinephrine secretion, which could be abrogated by the adrenergic β-blocker propranolol. The overlay of these mouse models reveals a divergence of phenotypes that demonstrate LPS signaling disruption may lead to glucose intolerance and insulin resistance in part due to enhanced sympathoadrenal tone, uncovering an essential role of innate immunity in physiological stress and its impact upon glucose homeostasis.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a widespread human herpesvirus pathogen and prototypical member of the β-herpesvirus subfamily. Like all herpesviruses, the virus establishes a lifelong latent infection following host exposure, which has the potential to reactivate periodically and contribute to recurrent disease processes. In individuals with weak or compromised immune systems, such reactivation can lead to profound pathology. Understanding how latent infections are maintained is important for uncovering how HCMV causes disease. The study of viral genes that are expressed during latent infection grants insight into how latency is regulated and how it could be therapeutically targeted. To that end, this project has sought to evaluate the functional significance of one such viral gene termed LUNA in the context of latency. In models of experimental latent infection based on primary myeloid cells, levels of viral gene transcription were found to be significantly reduced following infection with LUNA deletion mutant viruses, consistent with corresponding observable changes in post-translational histone modifications over the viral promoters of latency-associated genes. Additionally, using luciferase reporter systems, latency-associated viral gene promoters became activated in response to the expression of wild-type LUNA. Together, these findings argue for a role of LUNA in regulating viral gene expression during latent HCMV infection. One possible mechanism by which LUNA may fulfil its role is by targeting cellular ND10 structures, known intrinsic inhibitors of herpesvirus gene expression, for disruption. In support of this, latently infected cells were found to be devoid of ND10, a phenotype that was recapitulated by the direct expression of wild-type LUNA. Furthermore, mutation studies confirmed the identification of a novel deSUMOylase activity encoded by LUNA that was responsible for mediating ND10 disruption. Use of a catalytically inactive LUNA mutant in transcriptional analyses of latent infection also generated similar results as with the LUNA deletion viruses. Overall, these data support the hypothesis that LUNA serves as an important regulator of viral gene expression during latency, which is likely linked to its ability to target ND10 structures for disruption, thus raising the possibility that inhibition of deSUMOylation may serve as a novel therapeutic strategy to target latent HCMV infection.

SUMMARY:<p>The bacterial lipopolysaccharide (LPS)-sensing machinery with the innate immune system receptor Toll-like receptor 4 (TLR4) at its centre has been the subject of extensive research but while TLR4 and myeloid differentiation factor 2 (MD2) were both shown to be essential, the role of other, so-called "accessory", molecules is much less clear. The co-receptor cluster of differentiation 14 (CD14) has been widely perceived as being a mere facilitator for the capture and transfer of LPS to TLR4, until recent studies suggested it might have a determining influence on which TLR4-dependent signaling cascades are triggered in response to LPS. The TLR4 receptor complex was shown to be specifically activated by diC14 amidine, a cationic lipid originally synthesized for its carrier properties. The lipid's immunostimulatory activity extends to both TLR4-dependent signaling cascades, the MyD88 and TRIF pathways.<p>The aim of this work was to gain more insight into how diC14 amidine is able to trigger these cascades and to contribute to the general understanding of the TLR4 machinery and its activation by non-LPS ligands. More precisely we were interested in the role of CD14 in the activation of both MyD88 and TRIF pathways by diC14-amidine and in potential consequences of possible divergent requirements of diC14 amidine and LPS for this co receptor.<p>Our study of the role of the membrane-associated and the soluble form of CD14 in the activation of the TLR4-dependent pathways by diC14 amidine revealed that – unlike LPS – the cationic lipid does not require CD14 to exercise its immunostimulatory activity, although the presence of the co receptor modulates the TLR4 activation and infrared spectroscopy experiments suggest a direct interaction.<p>In the case of sensing LPS, CD14 is required for the endocytosis of TLR4 and the subsequent activation of the TRIF pathway. By blocking the endocytosis mechanism at different stages we found that diC14-amidine generally enters the cell via endocytosis and that it activates – unlike LPS – both signaling cascades from inside endosomal vesicles, albeit at different stages of the endocytosis process.<p>Although the eventual immunological responses caused by diC14 amidine and LPS resemble each other or are even identical, our research revealed differences in the actual mechanism of activating TLR4, the receptor responsible for the corresponding innate immune response. These findings illustrate the uniqueness of diC14 amidine and the potential of further exploring its intriguing properties and mechanisms as a tool to decipher the TLR4 signaling machinery and with the perspective of designing new immunomodulators for vaccination and therapy.<p><p><p>RÉSUMÉ:<p>Le mécanisme de reconnaissance des lipopolysaccharides bactériens (LPS) par le récepteur de l'immunité innée Toll-like receptor 4 (TLR4) a fait l'objet d'une recherche intensive ces dernières années. Alors que TLR4 et son co-récepteur myeloid differentiation factor 2 (MD2) ont été démontrés comme étant essentiels pour la détection du LPS, le rôle des molécules dites "accessoires" est beaucoup moins évident. Le co-récepteur cluster of differentiation 14 (CD14) a largement été considéré comme un simple facilitateur pour la capture et le transfert des LPS à TLR4, mais des études récentes suggèrent qu'il pourrait avoir une influence déterminante sur les cascades de signalisation dépendantes de TLR4 induites en réponse au LPS. La diC14-amidine, un lipide cationique synthétisé initialement pour ses qualités en tant que vecteur de transfection, a révélé récemment une activité immunostimulatrice dépendante du récepteur TLR4, impliquant les deux cascades de signalisation dépendantes de TLR4, les voies MyD88 et TRIF.<p>Le but de ce travail était de mieux comprendre le mécanisme par lequel la diC14¬ amidine induit ces cascades et de contribuer à la compréhension générale du fonctionnement du complexe récepteur TLR4 et son activation par des ligands non-LPS. Plus précisément nous nous sommes intéressés au rôle de CD14 dans l'activation des voies MyD88 et TRIF par la diC14-amidine et des conséquences potentielles d’éventuelles divergences en termes d’exigence pour ce co-récepteur entre la diC14-amidine et le LPS. <p>Notre étude sur le rôle de la forme membranaire ou soluble de CD14 dans l'activation des voies dépendantes de TLR4 par la diC14-amidine a révélé que - contrairement au LPS - le lipide cationique ne nécessite pas de CD14 pour exercer son activité immunostimulatrice. Cependant, la présence du co-récepteur module l'activation de TLR4 et des expériences de spectroscopie infrarouge suggèrent une interaction directe entre le lipide et le CD14. <p>Dans le cas de la détection de LPS, le CD14 est nécessaire pour l'endocytose de TLR4 et l'activation subséquente de la voie TRIF. En bloquant le mécanisme d'endocytose à différents stades, nous avons montré que la diC14-amidine active - contrairement au LPS - les deux cascades de signalisation depuis l'intérieur des vésicules endosomiales, mais à des stades différents du processus d'endocytose.<p>En conclusion, bien que les réponses immunologiques causées par la diC14-amidine et le LPS se ressemblent, notre recherche a mis en évidence des différences substantielles dans leurs modes d'action. Ces différences illustrent le caractère unique de la diC14-amidine et son potentiel comme outil pour explorer la complexité du système de signalisation du TLR4 et en tirer des enseignements qui permettront de contribuer à la conception de nouveaux immunomodulateurs pour la vaccination et la thérapie. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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