O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos. Uma combinação de terapia padrão com outras terapias baseadas no conhecimento de sua biologia é necessária para melhorar a sobrevida de pacientes com GBM. Muitos estudos foram desenvolvidos em busca de proteínas de membrana expressas em GBM, pois são potenciais alvos para imunoterapia. A proteína transmembrânica CD99 foi descrita como altamente expressa em astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Embora seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente compreendido, CD99 está envolvido na adesão e migração celular em diferentes tipos de tumores. O gene CD99 codifica duas proteínas distintas, denominadas isoforma 1, maior, de 32 kDa, e isoforma 2, gerada por splicing alternativo e menor, de 28 kDa. No presente estudo, foi demonstrada a expressão predominante da isoforma 1 em astrocitomas de diferentes graus de malignidade em comparação com o cérebro normal, bem como na linhagem celular de GBM humano U87MG. O transcriptoma das células U87MG transfectadas com siRNA para CD99 foi analisado em relação ao controle. Um total de 2.670 genes diferencialmente expressos foi identificado. Uma análise de enriquecimento no banco de dados DAVID revelou os seguintes processos como os mais significativos: junções aderentes célula-célula; adesão célula-célula envolvendo ligação de caderina e adesão celular. Ensaios funcionais baseados nestes achados (migração, invasão e adesão) foram realizados com células U87MG após o silenciamento de CD99 com dois shRNAs diferentes. A eficiência de silenciamento foi de 80 e 97%, para o shCD991 e 2, respectivamente, confirmada a nível de expressão do gene e da proteína. O silenciamento de CD99 reduziu a migração e invasão para ambos os shRNAs, com diminuição mais acentuada da migração para o shCD99 2, com maior nível de silenciamento de CD99. No ensaio de adesão, a linhagem U87MG shCD99 1 apresentou propriedades adesivas mais baixas que o controle, enquanto o shCD99 2 apresentou resultado oposto, com maior adesão celular do que seu controle. Provavelmente o silenciamento de CD99 afetou a redução da adesão celular em um padrão distinto, sugerindo que o resultado pode ser dependente do nível de expressão remanescente de CD99. Além disso, o CD99 e a faloidina colocalizaram nos lamelipódios e filopódios, sugerindo um papel importante no rearranjo do citoesqueleto. Foi demostrado, ainda, que o silenciamento de CD99 levou à redução da proliferação celular in vitro e diminuição do tumor in vivo. Camundongos imunodeficientes nos quais foram implantadas células silenciadas no cérebro apresentaram uma maior sobrevida que os animais que receberam células controle. A via de sinalização pela qual CD99 modula a proliferação no GBM ainda precisa ser elucidada. Migração, invasão e proliferação são as principais características do GBM que limitam uma ressecção cirúrgica completa e, consequentemente, levam frequentemente à recorrência. Portanto, análises posteriores das vias ativadoras do CD99 no contexto da migração, invasão, proliferação celular e apoptose são válidas para revelar novas estratégias terapêuticas para limitar a progressão do GBM / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults. A combination of standard therapy with other biologically based therapies is necessary to improve the survival of patients with GBM. Many studies have been developed in pursuit of expressed membrane proteins in GBM, which are potential targets for immunotherapy. The transmembrane protein CD99 is highly expressed in different malignant grades of astrocytomas. Although its mechanism of action is not still fully understood, CD99 is involved in cell adhesion and migration in different type of tumors. The CD99 gene encodes two distinct transmembrane proteins, named isoform 1, longer with 32 kDa, and isoform 2, generated by alternative splicing, shorter with 28 kDa. In the present study, we demonstrated predominant expression of isoform 1 in astrocytomas of different malignant grades compared to normal brain, and in the human GBM cell line U87MG. The transcriptome of U87MG cell line transfected with siRNA for CD99 was analyzed in relation to control. A total of 2.670 differentially expressed genes were identified. An enrichment analysis by DAVID Bioinformatics Database revealed the following processes as the most significant: cell-cell adherens junction; cadherin binding involved in cell-cell adhesion and cell-cell adhesion. Functional assays based on these findings (migration, invasion and adhesion) were performed with U87MG cells after knocking down CD99 with two different shRNAs. The CD99 silencing efficiency was 80 and 97%, for shCD99 1 and 2, respectively, confirmed at gene and protein level. The CD99 knockdown reduced migration and invasion for both shRNA, with the highest decrease of migration observed in the higher CD99 knocked down cells. In adhesion assay, shCD99 1 U87MG showed lower adhesive properties than the control, whereas shCD99 2 cells presented opposite results, with higher cell adhesion than control. Probably CD99 knockdown affected in the reduction of cell adhesion in a distinct pattern, suggesting that the result is dependent on CD99 remaining expression level. Additionally, CD99 and phalloidin colocalized at lamellipodia and filopodia, sugesting that CD99 plays an important role to cytoskeleton rearrangement. It has also been demonstrated that CD99 silencing caused reduction of cell proliferation in vitro and decreased tumor in vivo. Immunodeficient mice in which knocked down cells were implanted in the brain had a longer survival than animals that received control cells. The signaling pathway by which CD99 modulates proliferation in GBM still needs to be elucidated. Migration, invasion and proliferation are major characteristics of GBM, which limits the complete surgical tumor resection, and consequently leads to tumor recurrence. Therefore, further analysis of CD99 activating pathways in the context of cell migration, invasion, proliferation and apoptosis is worthwhile to unveil new therapeutic strategies to halt GBM progression

A endometriose, caracterizada por crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina, é responsável por sintomas álgicos com grande impacto na qualidade de vida da paciente. Várias linhas de medicações têm sido estudadas para essa o tratamento da endometriose, já que a cirurgia não é o tratamento de escolha sempre e, quando realizado, não é um tratamento definitivo. O conhecimento da patogenia da endometriose é fundamental para o estudo de novas classes de medicações. Uma delas, os fatores inibitórios da angiogênese, tem papel fundamental no estabelecimento e crescimento de lesões de endometriose. Neste estudo, buscamos a influência da Bevacizumab, droga anti-fator de crescimento endotelial (anti-VEGF), utilizada em duas dosagens diferentes, em endometriose peritoneal induzida em ratas, modelo animal já bem estabelecido para o estudo de endometriose. As ratas permaneceram sob tratamento durante 4 semanas, após as quais foram sacrificadas, sendo as lesões e o corno uterino remanescente retirados para posterior avaliação. Foi realizada avaliação da área das lesões de cada rata, da presença de tecido endometrial à microscopia, da positividade para o anticorpo antiVEGF na imunohistoquímica e da expressão gênica de PCNA, MMP9, Tp63 e VEGFA. O bevacizumab atuou reduzindo a área das lesões nos grupos que receberam medicação (p=0,002) e reduzindo a expressão gênica para Tp63 nas lesões (p=0,04). Não houve resultado significativo nas outras avaliações / Endometriosis, characterized by growth of endometrial tissue outside the uterine cavity, is responsible for painful symptoms with great impact on the quality of life of women. Several lines of medications have been studied for endometriosis\'s treatment, since surgery is not always the treatment of choice and, when done, it is not a definitive treatment. Knowing the pathogenesis of this disease is fundamental for the study of new classes of medications. One of them, the inhibitory factors of angiogenesis, plays a fundamental role in the establishment and growth of endometriosis lesions. In this study, we sought the influence of Bevacizumab, an anti-endothelial growth factor (anti-VEGF) drug, used in two different dosages, in peritoneal endometriosis induced in rats, an animal model well established for the study of endometriosis. The rats remained under treatment for 4 weeks, after which they were sacrificed, with the remaining lesions and uterine horn being removed for further evaluation. An evaluation of the lesion area of each rat, the presence of endometrial tissue under microscopy, the positivity of the anti-VEGF antibody in immunohistochemistry and the gene expression of PCNA, MMP9, Tp63 and VEGFA were performed. Bevacizumab worked by reducing the area of the lesions in the groups receiving medication (p = 0.002) and reducing the gene expression for Tp63 in the lesions (p = 0.04). There was no significant result in the other evaluations

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-07-19T14:11:29Z No. of bitstreams: 1 marilhotadeudornelas.pdf: 12344431 bytes, checksum: 54c1201792fc2e6934f063da77401a72 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-09T12:10:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marilhotadeudornelas.pdf: 12344431 bytes, checksum: 54c1201792fc2e6934f063da77401a72 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-09T12:10:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marilhotadeudornelas.pdf: 12344431 bytes, checksum: 54c1201792fc2e6934f063da77401a72 (MD5) Previous issue date: 2009-03-26 / O câncer de pele é o mais frequente tipo de câncer humano e mostra aumento de sua incidência nos últimos anos, o que o torna um crescente problema para a saúde pública mundial. Em muitos casos, antes do surgimento do carcinoma, instala-se uma lesão precursora, - a Ceratose Actínica, que pode evoluir para Carcinoma Espinocelular. Considerando o aumento de novos casos e recidivas frequentes, estudos tem sido intensificados no sentido de determinar os parâmetros com significado prognóstico na predição daqueles tumores que terão comportamento mais agressivo, que poderão recorrer e evoluir com metástases. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão dos marcadores de proliferação celular (PCNA, Ki-67) e apoptose (p53, Bcl-2), em portadores de Carcinoma Espinocelular e Ceratose Actínica. Foram estudadas amostras de 30 pacientes, submetidos à cirurgia reparadora, sendo dez portadores do Carcinoma Espinocelular, dez de Ceratose Actínica e dez indivíduos livres de lesões submetidos à blefaroplastia. A proteína p53 foi expressa em todos os casos estudados, com padrões quantitativos diferentes. O Bcl-2 foi expresso em baixa intensidade em seis casos de Ceratose Actínica, também baixa nas peles de blefaroplastia e negativo nos casos de Carcinoma Espinocelular. O PCNA exibiu expressão intensa em todas as amostras estudadas. O Ki-67 apresentou expressão variável nos casos de carcinoma e de ceratose e negativo na pele de pálpebra. A intensidade da expressão de PCNA, Ki-67, p53 e Bcl-2, associada a outros indicadores, tais como a análise histopatológica e a apresentação clínica, fornece informações sobre a provável progressão, levando a um diagnóstico mais seguro da neoplasia. / The skin cancer is the most frequent type of human cancer and shows an increase in its incidence in recent years, making it an important public health problem worldwide. In many cases before the onset of carcinoma install a precursor lesion, actinic keratosis, which can develop into squamous cell carcinoma. Considering the increase of new cases and relapses frequent, studies have been intensified in order to determine the parameters with prognostic significance in predicting those tumors which have more aggressive behavior, and can develop metastases. The objective was to evaluate the expression of markers of cell proliferation (PCNA, Ki-67) and apoptosis (p53,Bc1-2) in patients with squamous cell carcinoma and actinic keratosis. We studied samples from 30 patients, ten patients of squamous cell carcinoma, ten with actinic keratosis and ten samples free of lesions underwent blepharoplasty. The p53 protein was expressed in all cases with different quantitative patterns. The Bcl-2 was expressed at low intensity in six cases of actinic keratosis in the skins of blepharoplasty and negative in cases of squamous cell carcinoma. The PCNA showed intense expression in all samples. The Ki-67 showed variable expression in cases of keratosis and carcinoma and negative in the skin of eyelid. In conclusion the intensity of expression of PCNA, Ki-67, P53 and Bcl-2, associated with other indicators such as histopathological analysis and clinical presentation, provides information on the likely progression, leading to a more secure diagnosis of malignancy.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-09-05T13:24:06Z No. of bitstreams: 1 melissamarianagomezvaca.pdf: 1124332 bytes, checksum: 9d1ed8c3594d14657c1d6bae1ec257a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-06T11:31:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 melissamarianagomezvaca.pdf: 1124332 bytes, checksum: 9d1ed8c3594d14657c1d6bae1ec257a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T11:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 melissamarianagomezvaca.pdf: 1124332 bytes, checksum: 9d1ed8c3594d14657c1d6bae1ec257a2 (MD5) Previous issue date: 2017-06-07 / O tecido da polpa do dente é uma fonte promissora para a obtenção de células tronco, as Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) e seu posterior uso em terapias regenerativas, por isso torna-se importante saber a melhor idade do doador para seu armazenamento. Desta forma, o presente estudo buscou avaliar a eficiência na obtenção, proliferação, senescência e plasticidade das DPSCs em diferentes faixas etárias. Foram obtidas polpas dentarias de dentes molares extraídos, que compuseram três grupos: GI (18 – 33 anos), GII (34 – 49 anos) e GIII (50 – 67 anos). O isolamento celular foi avaliado através da observação microscópica diária do tecido pulpar e das células provenientes da polpa, por 15 dias. A proliferação celular foi analisada pelo ensaio de MTT nos dias 3, 5 e 7. A senescência das DPSCs foi feita em triplicata com contagem celular a cada 2 dias. A plasticidade celular foi realizada através da indução a diferenciação osteogênica, odontogênica e adipogênica. Os resultados apontaram que a eficiência da obtenção das DPSCs foi maior no GI, com decrescimento progressivo para GII e GIII. Não houve diferença estatística entre os grupos testados na avaliação da proliferação celular e na senescência. Amostras dos 3 grupos avaliados demostraram ter capacidade de diferenciação celular. Pode-se concluir que a idade foi capaz de influenciar a obtenção de DPSCs, apontando a faixa etária de 18 a 33 anos de idade (GI), como o grupo mais eficiente, já que o 100% das polpas dentarias deram células. Entretanto, ao avaliar a proliferação, senescência e plasticidade celular, todos os grupos se comportaram dentro de um mesmo padrão, sem a interferência da idade do doador. / The pulp tissue of the tooth is a promising source for obtaining stem cells, the Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) and their subsequent use in regenerative therapies, so it becomes important to know the best age of the donor for its storage. In this way, the present study sought to evaluate the efficiency in obtaining, proliferating, senescence and plasticity of DPSCs in different age groups. Dental pulps of extracted molar teeth were obtained, which comprised three groups: GI (18 - 33 years), GII (34 - 49 years) and GIII (50 - 67 years). Cellular isolation was evaluated by daily microscopic observation of pulp tissue and pulp cells for 15 days. Cell proliferation was analyzed by the MTT assay on days 3, 5 and 7. Senescence of the DPSCs was done in triplicate with cell counts every 2 days. Cellular plasticity was achieved through the induction of osteogenic, odontogenic and adipogenic differentiation. The results showed that the efficiency of obtaining DPSCs was higher in the GI, with progressive decrease for GII and GIII. There was no statistical difference between the groups tested in the evaluation of cell proliferation and senescence. Samples of the 3 groups evaluated showed to be cell differentiation capacity. It can be concluded that age was able to influence the achievement of DPSCs, pointing to the age group of 18 to 33 years of age (GI), as the most efficient group, since 100% of the pulps gave cells. However, when evaluating cell proliferation, senescence and plasticity, all groups behaved within the same pattern, without interference from donor age.

Orientador: Carla Beatriz Collares Buzato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maschio_DanielaAparecida_M.pdf: 3472469 bytes, checksum: c4faacd3683560adfb7bc1ddb9464f73 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias envolvidas na proliferação das células beta pancreáticas e a aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares da diabetes. Em especial, a via de sinalização da Wnt/beta-catenina (ou via Wnt canônica) tem sido pouco investigada no pâncreas endócrino. Em determinados tecidos/órgãos, é sabido que a proteína beta-catenina constitui não somente um componente estrutural das junções de adesão, mas também é uma molécula sinalizadora juntamente com a Wnt, participando de vários processos celulares, tais como diferenciação e proliferação. Hiperplasia da célula beta parece ocorrer em certas condições experimentais e in vivo, como no estado de resistência periférica à insulina. Entretanto, as vias intracelulares envolvidas nesse processo ainda permanecem desconhecidas. Os objetivos desta Dissertação de Mestrado foram: 1) verificar se as alterações metabólicas induzidas pela exposição à dieta hiperlipídica (DHL) por um curto período de tempo (60 dias) são acompanhadas por alterações morfométricas compensatórias do pâncreas endócrino de camundongos C57BL/6; 2) investigar o possível envolvimento da via de sinalização da Wnt/beta-catenina no processo de proliferação da célula beta neste modelo, analisando-se a localização celular (por imunofluorescência indireta), o conteúdo proteico (por immunoblotting) e a expressão gênica (por PCR de Tempo Real ou qPCR) de proteínas associadas à via Wnt/beta-catenina (a saber, beta-catenina, Ciclina D1/2, c-Myc, GSK-3? e Axina2 e, 3) analisar a expressão da proteína beta-catenina não fosforilada (forma ativa da via) em ilhotas não hiperplásicas de animais tratados com a DHL por apenas 30 dias. Nossos resultados demonstraram que, após 60 dias de tratamento com DHL, os animais se tornaram obesos e apresentaram acentuadas alterações metabólicas, tais como hiperglicemia em jejum e pós prandial, hiperinsulinemia em jejum e pós-prandial e, ainda, uma significativa resistência periférica à insulina (administrada intraperitonealmente), sendo esses animais, portanto, caracterizados como pré-diabéticos. Este quadro foi acompanhado por um aumento significativo da massa relativa de células beta e do seu número por ilhota, o que indica hiperplasia deste tipo celular no pâncreas endócrino, provavelmente compensatória ao quadro de resistência periférica à insulina apresentado pelos animais do grupo tratado. Como mostrado por immunoblotting, houve um aumento significativo na expressão de proteínas ativadoras ou alvo da via, como beta-catenina ativada (não fosforilada) e Ciclina D1/2 em ilhotas dos animais pré-diabéticos. Quanto às proteínas Axina2 e GSK-3? (inibidoras da via), não foi observada alteração significativa na expressão de Axina2, mas supreendemente houve aumento do conteúdo celular de GSK-3? nas ilhotas do grupo pré-diabético. A imunofluorescência para beta-catenina ativada mostrou a presença desta proteína tanto na região de contato intercelular como no citoplasma e núcleo das células beta para ambos os grupos. As outras três proteínas relacionadas à via, Ciclina D1/2, GSK-3? e Axina2, por sua vez, apresentaram uma distribuição exclusivamente citoplasmática nas células endócrinas das ilhotas pancreáticas, o que está de acordo com as suas respectivas funções. A análise por qPCR não revelou alteração significativa no conteúdo celular de RNAm de ?-catenina, mas uma tendência de aumento na expressão gênica de Ciclina D1 e c-Myc, genes alvo da via, em ilhotas hiperplásicas dos animais pré-diabéticos. Ainda, por immunoblotting para beta-catenina ativada, não observamos aumento significativo da expressão proteica dessa proteína em ilhotas do grupo tratado com DHL por apenas 30 dias, os quais não desenvolveram hiperplasia do pâncreas endócrino. Em conclusão, nossos dados sugerem que a via Wnt/beta-catenina parece estar ativada na pré-diabetes experimental, e provavelmente participa do processo de hiperplasia compensatória das células beta pancreática neste estado metabólico / Abstract: The role of the Wnt/beta-catenin signaling pathway (as known as the canonical Wnt pathway) in the endocrine pancreas physiology has not been thoroughly explored. In certain tissues/organs, it is known that beta-catenin, besides being a structural component of adhesion junctions, participates as a key protein in the Wnt signaling pathway, therefore being involved in crucial cellular processes such as differentiation and proliferation. Beta cell hyperplasia appears to occur under certain experimental conditions, and in vivo during the peripheral insulin resistance state. However, the intracellular pathways involved in this process are still unknown. The objectives of this Master's Dissertation were as follows: 1) to investigate whether the metabolic changes induced by exposure of adult male C57BL/6 mice to a high-fat diet (HFD) for a relatively short period of time (30 or 60 days) are accompanied by compensatory morphometric changes of the endocrine pancreas indicative of beta cell hyperplasia; and 2) to study the possible involvement of the pathway Wnt/?-catenin signaling in the process of beta cell proliferation in this animal model. For this, we carried out the analysis of the cellular localization (by indirect immunofluorescence), the protein cell content (by immunoblotting) and the gene expression (by PCR or Real-Time qPCR) of proteins associated to the Wnt/beta-catenin pathway (i.e., ?-catenin, Cyclin D1/2, c-Myc, Axin2 and GSK-3?). Our results showed that, after 60 days of treatment with HFD, the animals became obese, as well as, hyperglycemic, hyperinsulinemic (both at fast and fed states) and resistant to intraperitoneally injected insulin, being therefore characterized as prediabetic. This metabolic condition was accompanied by a significant increase in the relative mass of beta cells and the number of beta cells per islet, which indicates hyperplasia of this pancreatic endocrine cell, probably compensatory to the relatively higher insulin demand presented by the HFD-treated animals. As shown by immunoblotting, there was a significant increase in islet expression of the activator and target proteins, such as the active (unphosphorylated) beta-catenin and Cyclin D1/2 in prediabetic animals. Regarding Axina2 and GSK- 3? proteins (antagonists of the pathway), no changes were observed concerning Axin2 islet content between the experimental groups, but surprisingly there was a significant increase in cellular content of GSK-3? in islet homogenates from the prediabetic group. The immunofluorescence for active beta-catenin showed the presence of this protein at the intercellular contact region as well as within the cytoplasm and nucleus of beta cells in both groups. Meanwhile, Cyclin D1/2, GSK-3? and Axin2 displayed an exclusively cytoplasmic distribution in pancreatic endocrine cells, which is in accordance with their respective functions. The qPCR analysis revealed no significant change in mRNA expression of ?-catenin, but a tendency of increase in gene expression of Cyclin D1 and c-Myc, target genes of the pathway, in hyperplastic islets of the prediabetic animals. Additionally, the immunoblotting of active beta-catenin in homogenates of non-hyperplastic islets, isolated from mice fed a HFD for only 30 days, showed no significant change in expression this protein as compared to the control group. In conclusion, our data suggest that the Wnt/beta-catenin pathway may be activated during the process of compensatory hyperplasia of the beta cells seen in our animal model of obesity-associated prediabetes / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Marta Helena Krieger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:25:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MarianaGoncalvesde_M.pdf: 2027053 bytes, checksum: c424b2043397f6d28d8adebb3fc72bd3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um multifuncional agente biológico que nas últimas décadas tem sido alvo de uma infinidade de estudos e constitui hoje um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Diversos estudos demonstram sua capacidade de prevenção da ativação e adesão plaquetária ou leucocitária e inibição da proliferação e migração de células musculares lisas vasculares (VSMCs), entretanto, em condições de baixa disponibilidade do NO esses processos são prejudicados. Atualmente há o grande interesse no desenvolvimento de compostos capazes de liberar NO de forma modulada e estável, e, nesse sentido, os complexos nitrosilos de rutênio têm se destacado por suas características excepcionais. É amplamente reconhecido que a modulação fenotípica de VSMCs tem papel crítico na progressão de diversas doenças vasculares proeminentes. Sabe-se que o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) é um dos principais estimulantes desse processo. Este estudo se propôs a caracterizar os efeitos inibitórios do complexo de rutênio trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, nomeado Ru(cyclam)NO, na modulação fenotípica, resposta proliferativa e migratória de VSMCs induzidas por PDGF-BB. VSMCs foram obtidas por técnica de cultura primária. A citotoxicidade do complexo, na faixa de concentração de 100 ?M a 1500 ?M, foi determinada em ensaios de redução do MTT e incorporação neutral red (NR), e comparadas a do nitroprussiato de sódio (SNP). A concentração 100 ?M foi definida para os demais protocolos experimentais. Western blotting, ensaios transwell e wound healing, e incorporação de timidina triciada foram utilizados para determinação da modulação fenotípica, migração e proliferação celular, respectivamente, e níveis de nitrato no meio foram determinados por quimiluminescência para avaliação do perfil de liberação de NO. O complexo demonstrou baixa citotoxicidade, mesmo na maior concentração e após 48 horas de exposição, reduzindo ao máximo em 30% a porcentagem de células viáveis em ambos os ensaios, demonstrando ser menos tóxico que o SNP. Níveis de nitrato no meio atigiram a concentração máxima após 30 minutos (11 ?M ± 4,8), de maneira mais lenta em relação ao SNP, cuja concentração máxima foi após 5 minutos (13 ?M ± 3,7). A proliferação das VSMCs induzida por PDGF-BB foi inibida, reduzindo à metade a radioatividade incorporada, bem como a expressão do marcador de proliferação PCNA. Observou-se redução de 45% na migração induzida por PDGF-BB nos ensaios transwell, e no wound-healing, embora qualitativo, a redução é notável. A modulação fenotípica da VSMC foi observada pela redução em 60% da expressão da proteína alfa-actina, característica do fenótipo maduro, e foi quase totalmente prevenida pelo tratamento com o complexo. Tal prevenção pode ser mediada pelo fator de transcrição ELK-1, que favorece a expressão de genes de diferenciação, e cuja fosforilação foi estimulada pelo PDGF-BB, porém inibida em quase 50% pelo pré-tratamento com Ru(cyclam)NO. As respostas observadas nos tratamentos com Ru(cyclam)NO foram promissoras, e, embora seu mecanismo de ação x ainda não esteja completamente esclarecido, este complexo demonstrou atividade biológica singular, e sua aplicação em condições clínicas onde há descontrole de processos de proliferação e migração de VSMCs, como a reestenose, apresenta-se como uma proposta interessante / Abstract: Nitric oxide (NO) is a multifuctional biological agent that in the recent decades has been the subject of a plethora of studies and today is one of the most important intracellular and extracellular processes mediators. Several studies have demonstrated its ability to prevent leukocyte or platelet adhesion and activation, and inhibition of vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and migration. However, low availability of NO conditions determines impairement of these processes. There is a keen interest in the development of compounds capable of releasing NO modulated so stable, and the nitrosyl ruthenium complexes have gained prominence for its exceptional features. It is widely recognized that the phenotypic modulation of VSMCs, and its uncontrolled proliferation and migration, plays a critical role in the progression of several prominent vascular diseases. It is known that the platelet-derived growth factor (PDGF) is a primary stimulant of the process. This study aimed to determine the inhibitory effects of the ruthenium complex NO donor trans-[Ru(NO)Cl(cyclam)](PF6)2, named Ru(cyclam)NO, in the phenotypic switching, on migratory and proliferative responses of VSMCs induced by PDGF-BB, and its biological response. VSMCs were obtained from primary culture methodology. The complex cytotoxicity were determined by MTT reduction and incorporation of neutral red (NR) assays, in the range of concentration from 100 ?M to 1500 ?M, and compared to sodium nitroprusside (SNP). For the following experimental protocols the concentration of the 100 ?M was set. Western blotting, transwell and wound healing assays, and incorporation of tritiated thymidine were used for determination of phenotypic switching, cell migration and proliferation, respectively. Evaluation of the NO profile release was determined as nitrate levels in the culture medium by chemiluminescence. The complex Ru(cyclam)NO showed low cytotoxicity even at the highest concentration evaluated and after 48 hours of exposition, reducing only 30% the percentage of viable cells in both trials, showing be less toxic than the SNP. Medium nitrate levels exibhited the highest concentration after 30 min (11 ?M ± 4.8), slower when compared to SNP, which reached the maximum concentration after 5 minutes (13 ?M ± 3.7). The proliferation of VSMCs induced by PDGF-BB was inhibited by half of the radioactivity incorporated counting, as well as the reduction on the expression of the proliferation marker PCNA. Observed a reduction by 45% in the migration induced by PDGF-BB determined in transwell assays, and on the wound-healing, although a qualitative result, the reduction of migration induced by PDGF-BB. The 60% reduction by PDGF-BB treatment of the contractile protein expression ?-SMA, characteristic of mature phenotype, revealed the modulation of VSMCs phenotype, and it was almost completely prevented by treatment with the complex. Such prevention was associated with inhibition by almost 50% of phosphorylation of the transcription factor ELK-1 stimulated by PDGF-BB. The responses determined with complex treatments revealed promising for future development of cardiovascular devices. Although its xii mechanism of action is not completely understood, this complex showed singular biological activity, and its application in some clinical conditions where there is uncontrolled proliferation and migration of VSMCs presents as a substancial proposal / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

O osteossarcoma é um tumor ósseo maligno, de maior ocorrência em cães, possui rápido crescimento e alto potencial metastático. Assim, o cão é um modelo útil para o estudo da doença em humanos, tendo em vista as semelhanças clínicas e histopatológicas que ocorrem em ambas às espécies. Atualmente, os estudos a respeito de células-tronco são promissores considerando seu alto potencial terapêutico. Entretanto, ainda prevalecem muitas dúvidas referentes ao tratamento de tumores utilizando a terapia celular. Este tema é pouco conhecido e estudado, por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre células-tronco obtidas da polpa dentária canina com as células derivadas osteossarcoma canino. Foram realizados cocultivos celulares das células derivadas de polpa dentária canina, osteossarcoma canino e derivadas de osso normal canino. Analisou-se os aspectos morfológicos das células cocultivadas e controle, assim como a atividade proliferativa, a morte celular, o potencial elétrico mitocondrial e a expressão gênica. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a interação entre a célula-tronco da polpa dentária canina imatura e as células de osteosarcoma canino não apresentam alterações morfológicas. Entretanto, as células-tronco derivadas da polpa dentária canina e de osso fetal canino sadio parecem servir de suporte para o crescimento tumoral. Além disso, a cocultura celular, em todos os grupos testados, promove alterações na expressão gênica e proteica. / Osteosarcoma is a malignant bone tumor most frequent in dogs. It has fast growth and high metastatic potential. Thus, the dog is an useful model for the study of human disease, due to the clinical and histological similarities found in both species. Currently, studies about stem cells are promising considering its high therapeutic potential. However, many doubts still exist regarding the treatment of tumors using cell therapy. This theme is little known and studied. Therefore, the aim of this study was to evaluate the interaction between stem cells obtained from canine immature dental pulpstem cells with osteosarcoma cells derived from dogs. Cellular coculture were performed using cells derived from canine dental pulp, canine osteosarcoma and canine normal bone. The morphological aspects of cocultured cells and control were analyzed, as well as proliferative activity, cell death, the mitochondrial membrane electric potential and gene expression. In summary, it was concluded that the interaction between stem cells from canine immature dental pulp and canine osteosarcoma cells did not show morphological changes. However, stem cells derived from canine dental pulp and healthy canine fetal bone serve to support tumor growth. Furthermore, the cell coculture in all groups tested, causes changes in gene and protein expression.

O epitélio gástrico de ratos passa por modificações morfofisiológicas importantes durante o primeiro mês de vida pós-natal e a dieta é um dos principais fatores que influenciam esse desenvolvimento. Ratos receberam dieta com 20% (C) ou 8% (RP) de proteína, durante o período pré e pós-natal. Avaliamos em ratos de 14, 30 e 50 dias os efeitos da restrição protéica sobre proliferação celular no epitélio gástrico, massa do estômago e corpórea, comprimento do intestino e, expressão de ghrelina no estômago e no plasma. O grupo RP apresentou proliferação celular, massa do estômago e corpórea e comprimento do intestino reduzidos em relação ao grupo C. E maior imunomarcação para ghrelina em animais RP com 30 e 50d em comparação ao grupo C. Não houve diferença na imunomarcação entre animais de 14d. Os níveis plasmáticos de ghrelina apresentaram a mesma tendência observada na imunomarcação. O consumo de quantidade adequada de proteína é importante durante o desenvolvimento gástrico de ratos e a ghrelina apresenta resposta hormonal diferente de acordo com a idade do animal. / The gastric epithelium of rats undergoes morphophysiological changes throughout the first month of life and diet is one of the main factors influencing the development. Rats were fed a 20% (NP) or 8% (RP) protein diet throughout the pre- and post-natal life. We analyzed the cell proliferation and observed the body and stomach weight and small intestine length at 14, 30 and 50 days rats. Additionally, we evaluated ghrelin in gastric epithelium and its plasma levels. Cell proliferation in the gastric epithelium, body and stomach weight and small intestine length were reduced in RP animals when compared to NP animals. We observed an increase in the number of labeled cells for ghrelin in 30- and 50-d-old RP rats when compared to the NP group and no difference was found in 14-d-old animals. Plasma ghrelin levels showed the same results observed in immunohistochemical reactions. These results emphasize the importance of diet protein on the development of gastric mucosa and protein restriction seems to differently modulate ghrelin response at different ages.

A Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima que apresenta um importante papel na prevenção da rejeição fetal. A IDO demonstra efeitos na supressão da ativação de células T por catabolizar o aminoácido essencial Triptofano. Nós estudamos a expressão da IDO em cultura celulares de placenta com a adição individual de Estradiol, Progesterona, Interferon , Triptofano e 1-Metil-Triptofano com o uso de citometria de fluxo, imunocitoquímica e quantificação celular, imunofluorescência, peroxidação lipídica, análise das fases do ciclo celular, imunoblotting e PCR em placentas bovinas nos três trimestres gestacionais. A quantificação celular revelou que em bovinos a atividade da IDO aumenta com o avanço do período gestacional e, sua expressão varia de acordo com os fatores, sendo o mesmo padrão observado pela imunofluorescência. O Imunoblotting mostrou a presença de possíveis isoformas desta proteína na espécie bovina que ainda não foram identificadas. A investigação pela lipoperoxidação revelou que os hormônios modularam diferencialmente a produção de radicais peroxidados nos três terços de gestação e, possivelmente atuam como fatores indutores de proliferação. As células placentárias apresentaram padrões diferenciados de proliferação e apoptose ao longo da gestação, principalmente nos tratamentos com Estradiol e Progesterona, sendo também variantes com outros fatores em todos os grupos. Observou-se que a Progesterona atua na maturação das células placentárias independente da concentração utilizada. Em todos os grupos uma grande proporção de células apresentava-se em estado de quiescência (G1). No terceiro trimestre foi detectado um aumento no número de células em G2/M, indicando a parada da capacidade proliferativa ou de progressão no ciclo celular (\"arrest\"). Maior taxa de apoptose foi observada nos animais de segundo trimestre gestacional. Baseados nisso, podemos concluir que a IDO é suscetível ao controle pelos mecanismos testados, o que nos leva a formular hipóteses de implantação de possíveis mecanismos terapêuticos para a reprodução com a participação da IDO. / Indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) is an enzyme that plays an important role in preventing fetal rejection. IDO is related to the suppression of the T-cells activation due to the catabolism of essential amino acid Triptophan. We studied the expression of IDO in bovine placenta cell culture with individual supplementation of factors as Estrogen, Progesterone, Interferon , Triptophan and 1-Methyl-Triptophan. Evaluations were made by flow cytometry, immunocitochemistry and cellular quantification, lipidic peroxidation, cell cycle phases, imunoblotting, PCR and immunofluorescency in the three trimesters of pregnancy. Cellular quantification demonstrated that in bovines the activity of the IDO increases during pregnancy, and its expression is factor-dependent, which was also observed in immunofluorescency. Imunoblotting demonstrated the presence of possible unknown protein isoforms in bovine. Lipoperoxidation evaluation demonstrated that hormones distinguishingly modulated the production of peroxide radicals in the three trimesters of pregnancy and, possibly acting as inductive factors of proliferation. Placental cells demonstrated differentiated patterns of proliferation and apoptosis during the gestation, mainly in the presence of Estrogen and Progesterone, besides variant rates were also observed under other factors. Independent of the concentration, Progesterone influenced placental cells maturation. All groups presented great ratio of cells in quiescence state (G1). In third trimester, G2/M high rates indicated a pause in proliferative capacity or in cell cycle progression (arrest). High apoptosis rates were observed in animals at second pregnancy trimester. Based on the presented, we concluded that IDO is susceptible to be controlled by the applied-factors, what lead us to think about hypothetical therapeuthic mechnism for reproduction with the participation of IDO.