Blood vessels are essential for the delivery of nutrients and oxygen to tissues, as well as for the removal of waste products. Patients with tumors, wounds or diabetes all have active angiogenesis, formation and remodeling of blood vessels, a process that is initiated and manipulated by gradients of secreted signaling proteins. This thesis describes the development of new microfluidic in vitro assays where directed migration of single endothelial cells and three dimensional vascular structures can be monitored in real time. Combining these assays with live imaging microscopy we have studied the behavior of endothelial cells in gradients of proangiogenic factors as well as directed sprouting in embryonic kidneys and stem cell cultures. With the 2D assay we have quantified endothelial cell chemotaxis towards FGF2, VEGFA165 and VEGFA121 and we also demonstrate that constant levels of VEGFA165, but not of FGF2, are able to reduce chemokinesis of endothelial cells. In the 3D migration chamber we have studied directed endothelial cell sprouting in mouse embryonic kidneys and embryoid bodies in response to VEGFA gradients. In both models directed angiogenesis is detected towards increasing levels of growth factor. Using the microarray technique on differentiating embryonic stem cells we have been able to identify the gene exoc3l2 as potentially involved in angiogenesis and endothelial cell migration and we present evidence that ExoC3l2 is associated with the exocyst complex; an important regulator of cell polarity. We have also shown that siRNA mediated gene silencing of exoc3l2 results in impaired VEGFR2 phosphorylation as well as loss of directionality in response to a VEGFA gradient. / (Faculty of Medicine)

Les lésions carieuses ou les traumatismes physiques profonds aboutissent souvent à une destruction des fibroblastes pulpaires (FP) et des odontoblastes, et provoquent l’activation du Complément. Le rôle du Complément dans la régénération pulpo-dentinaire a été montré avec le fragment C5a, connu pour induire la migration des cellules souches pulpaires (CS). Nous avons montré que le C3a participe à la régénération pulpo-dentinaire. Après un tri cellulaire, nous avons montré l’expression du C3aR sur les CS et les FP en culture, et aussi sur coupes de dents humaines. De plus, les deux types cellulaires prolifèrent en présence de concentrations croissantes de C3a. La migration cellulaire a été évaluée dans des chambres de migration microfluidiques. Les CS sont mobilisées, tandis que les FP sont spécifiquement recrutés par un gradient de C3a. Les complexes d’attaque membranaire (CAM) produits par les FP a été montrée. Nous avons démontré que les FP peuvent détruire les bactéries cariogènes S. mutans et S. sanguis. Les FP ont été incubés avec un milieu contenant du LTA pour simuler une infection bactérienne in vitro. Nous avons montré que les bactéries cariogènes étaient très sensibles aux surnageants des FP stimulés, soulignant un effet létal des CAM. Des co-cultures de fibroblastes pulpaires et de bactéries ont révélé la présence des CAM sur les bactéries. Ces résultats soulignent des rôles inattendus du Complément pendant les étapes précoces de la régénération pulpo-dentinaire et de la défense pulpaire. Ce travail suggère de nouvelles stratégies thérapeutiques, où des molécules du Complément pourront être délivrées localement pour favoriser la régénération pulpo-dentinaire / Deep pulp physical injuries or carious lesions often lead to fibroblast cell injury and destruction of the dentin-secreting odontoblasts, and lead to the Complement activation. Its involvement in dentin-pulp regeneration has been shown with C5a fragment, known to induce specific recruitment of DPSC. We show that C3a, is also involved in dentin-pulp regeneration. After cell sorting, we highlighted C3a Receptor expression on pulp fibroblasts and STRO-1-sorted DSPC as well as on human tooth sections in vivo. The effect of C3a on proliferation of DPSCs and pulp fibroblasts was shown with an increased proliferation for both cell types. Cell migration was evaluated using microfluidic chemotaxis chambers. We showed that DPSCs were mobilized but not specifically recruited, while pulp fibroblasts were specifically recruited following a C3a gradient. We demonstrated that pulp fibroblasts can synthesize functional membrane attack complex (MAC) and kill cariogenic bacteria S. mutans and S. sanguinis. To simulate bacterial infection in vitro, pulp fibroblasts were incubated with lipoteichoïc acid (LTA). Agar well diffusion assay showed that bacteria exposed to LTA-conditioned media were highly sensitive, showing lethal effect of MAC. Coculture of pulp fibroblasts and bacteria showed that MAC synthesized by pulp fibroblasts can be directly fixed on cariogenic bacteria, after direct contact with fibroblasts. These results underline unexpected roles of Complement system activation in early events of dentin-pulp regeneration and pulp defense. Our findings suggest new therapeutic strategies, where new agents can deliver specific Complement molecules to enhance dentin-pulp regeneration.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

O gênero Maytenus, pertencente à família Celastraceae é um dos maiores da família, constituído por cerca de 225 espécies distribuídas nos trópicos. Espécies de Maytenus são utilizadas na medicina popular de diversos países. No Brasil, M. iliciflolia e M. aquifolium são amplamente usadas pela população como antiulcerogênicas, anti-inflamatórias e antitumorais. Desta forma, este trabalho propôs-se a estudar as folhas das espécies vegetais M. dasyclada Mart. e M. cassineformis Reiss., nativas do Rio Grande do Sul, caracterizando-as quanto a aspectos químicos e biológicos. Para isso, obteve-se extratos das folhas das espécies utilizando o aparelho de soxhlet e os seguintes solventes: hexano, acetato de etila e etanol, em ciclos de 12 horas consecutivas para cada solvente. Também foi obtido um extrato aquoso por decocção das folhas da espécie. Estes extratos foram analisados por técnicas cromatográficas (CLAE-UV e CLAE-UV-IES-MS) e quantificados através de espectroscopia no UV. Os extratos hexânico, acetato de etila e etanólico, de ambas as espécies, foram caracterizados quanto as atividades antioxidante (ensaios de TRAP, inibição de radicais hidroxil e óxido nítrico, e inibição da peroxidação lipídica e oxidação de proteínas) e anti-inflamatória (ensaio de quimiotaxia leucocitária), ambos in vitro. Através do ensaio cometa, in vitro, avaliouse o potencial genotóxico dos extratos. Por fim, os mesmos foram testados quanto a atividade antiulcerogênica in vivo, por meio de indução de úlceras agudas por etanol e anti-inflamatórios não esteróides (AINEs). Parâmetros de secreção gástrica também foram avaliados (volume, pH e acidez total) pelo modelo de ligadura de piloro, e a produção de muco no conteúdo gástrico foi determinado. No intuito de elucidar possíveis mecanismos de ação gastroprotetor os ensaios de L-NAME e NEM foram desenvolvidos. As análises químicas revelaram a presença dos flavonoides quercetina e canferol nos extratos acetato de etila e etanólico das espécies, bem como a presença de derivados da galocatequina e derivados 3-7-Odiglicosilados de canferol e 3-O-triglicosilado de quercetina. O extrato acetato de etila de ambas as espécies demonstraram o maior conteúdo de polifenóis totais (53,58 ± 0,43 e 43,65 ± 0,80 mg/g de ácido gálico equivalente) e o maior conteúdo de flavonoides totais (3,72 ± 0,27 e 3,19 ± 0,32 mg/g de quercetina equivalente), para extratos de M. cassineformis e M. dasyclada, respectivamente. Os extratos das duas espécies demonstraram ainda um efeito inibidor importante da migração de leucócitos, obtendo valores de IC50 de 0,2594 μg/mL, 0,6114 μg/mL e 0,7560 μg/mL, para os extratos etanólico, acetato de etila e hexânico de M. dasyclada, respectivamente. Para M. cassineformis os valores de IC50 foram de 0,3182 μg/mL, 0,3751 μg/mL e 0,2916 μg/mL, para os extratos etanólicos, acetato de etila e hexânico, respectivamente. A atividade antioxidante dos extratos acetato de etila e etanólico das duas espécies foi demonstrada nos ensaios de atividade antioxidante total (TRAP), em que houve inibição significativa da quimioluminescência formada pelo luminol; e atividade contra os radicais hidroxil demonstrando efeito significativo na prevenção da degradação da desoxirribose. Os extratos foram ainda capazes de inibir a peroxidação lipídica, pelo ensaio de formação de TBARS, e oxidação de proteínas, pelo método do carbonil. Nenhum dos extratos pesquisados evidenciou efeito genotóxico no ensaio cometa in vitro. Os extratos acetato de etila e etanólico de M. dasyclada exerceram atividade antiulcerogênica demonstrada nos ensaios de úlcera induzida por etanol e AINEs, interferindo na secreção de ácido, e, também, interferindo nos mecanismos citoprotetores, aumentando a secreção de muco. Os mecanismos gastroprotetores podem estar relacionados ao efeito antioxidante, demonstrados pela inibição de óxido nítrico e compostos sulfidrila. Os resultados obtidos neste trabalho representam as primeiras contribuições para elucidar compostos químicos e potenciais atividades biológicas das espécies M. cassineformis e M. dasyclada. Os extratos demonstraram atividades biológicas promissoras, relacionadas ao alto conteúdo de compostos fenólicos presentes nas espécies. / The genus Maytenus, belonging to the Celastraceae family is one of the largest family, comprising about 225 species distributed in the tropics. Maytenus species are used in folk medicine in many countries. In Brazil, M. iliciflolia and M. aquifolium are widely used by the population as antiulcer, anti-inflammatory and antitumor. Thus, this project aimed to study the leaves of the plant species M. dasyclada Mart. and M. cassineformis Reiss., natives from Rio Grande do Sul, characterizing them as the chemical and biological aspects. Therefore, was held the extraction of the leaves of species using soxhlet and the following solvents: hexane, ethyl acetate and ethanol, in cycles of 12 hours consecutives for each solvent. Also an aqueous extract was obtained by decoction of the leaves of the species. These extracts were analyzed by chromatographic techniques (HPLC-DAD and HPLC-DAD-ESI-MS) and quantified by UV spectroscopy. The extracts hexane, ethyl acetate and ethanolic of both species were characterized for antioxidant activity (TRAP assay, inhibition of hydroxyl and nitric oxide radicals, and inhibition of lipid peroxidation and protein oxidation) and anti-inflammatory (chemotaxis assay), both in vitro. Through the comet assay in vitro, we evaluated the genotoxic potential of the extracts. Finally, they were tested for antiulcer activity in vivo, by induction of acute ulcers by ethanol and anti-inflammatory drugs. Gastric secretion parameters were also evaluated (volume, total acidity and pH) at pylorus ligature model, and the production of mucus in the gastric contents was determined. In order to elucidate possible mechanisms of gastroprotective action assays of L-NAME and NEM were developed. Chemical analysis revealed the presence of flavonoids quercetin and kaempferol in ethyl acetate and ethanolic extracts of species and the presence of gallocatechin derivatives and kaempferol 3- 7-O-diglicosidic and quercetin 3-O-triglicosidic. The ethyl acetate extracts of both species showed the highest amount of total polyphenols (53.58 ± 0.43 and 43.65 ± 0.80 mg gallic acid equivalent/g) and highest content of flavonoids (3.72 ± 0.27 and 3.19 ± 0.32 mg quercetin equivalents/g), for M. cassineformis and M. dasyclada extracts, respectively. The extracts of both species also showed an inhibitory effect on leukocyte migration importantly, getting IC50 values of 0.2594 μg/mL, 0.6114 μg/mL and 0.7560 μg/mL for ethanolic, ethyl acetate hexane and M. dasyclada respectively. For M. cassineformis the IC50 values were 0.3182 μg/mL, 0.3751 μg/mL and 0.2916 μg/mL, the ethanol extracts, ethyl acetate and hexane, respectively. The antioxidant activity of the ethyl acetate and ethanol extracts from both species was demonstrated in tests of total antioxidant activity (TRAP), in which there was significant inhibition of luminol chemiluminescence, and activity against hydroxyl radicals demonstrating significant effect in preventing the degradation of deoxyribose. The extracts were still able to inhibit lipid peroxidation by TBARS formation assay, and protein oxidation as measured by the carbonyl. Extract showed no genotoxic effects in the comet assay in vitro. The ethyl acetate and ethanolic M. dasyclada extracts exerted antiulcer activity demonstrated in the experimental ulcer induced by ethanol and NSAIDs, interfering in acid secretion, and also interfering with the cytoprotective mechanisms, increasing mucus secretion. Gastroprotector mechanisms may be related to antioxidant effects, demonstrated by the inhibition of nitric oxide and sulfhydryl compounds. The results obtained in this study represent the first contributions to elucidate chemical compounds and biological activities potential of the species M. cassineformis and M. dasyclada. The extracts showed promising biological activities, related to the high content of phenolic compounds present in the species.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

O gênero Maytenus, pertencente à família Celastraceae é um dos maiores da família, constituído por cerca de 225 espécies distribuídas nos trópicos. Espécies de Maytenus são utilizadas na medicina popular de diversos países. No Brasil, M. iliciflolia e M. aquifolium são amplamente usadas pela população como antiulcerogênicas, anti-inflamatórias e antitumorais. Desta forma, este trabalho propôs-se a estudar as folhas das espécies vegetais M. dasyclada Mart. e M. cassineformis Reiss., nativas do Rio Grande do Sul, caracterizando-as quanto a aspectos químicos e biológicos. Para isso, obteve-se extratos das folhas das espécies utilizando o aparelho de soxhlet e os seguintes solventes: hexano, acetato de etila e etanol, em ciclos de 12 horas consecutivas para cada solvente. Também foi obtido um extrato aquoso por decocção das folhas da espécie. Estes extratos foram analisados por técnicas cromatográficas (CLAE-UV e CLAE-UV-IES-MS) e quantificados através de espectroscopia no UV. Os extratos hexânico, acetato de etila e etanólico, de ambas as espécies, foram caracterizados quanto as atividades antioxidante (ensaios de TRAP, inibição de radicais hidroxil e óxido nítrico, e inibição da peroxidação lipídica e oxidação de proteínas) e anti-inflamatória (ensaio de quimiotaxia leucocitária), ambos in vitro. Através do ensaio cometa, in vitro, avaliouse o potencial genotóxico dos extratos. Por fim, os mesmos foram testados quanto a atividade antiulcerogênica in vivo, por meio de indução de úlceras agudas por etanol e anti-inflamatórios não esteróides (AINEs). Parâmetros de secreção gástrica também foram avaliados (volume, pH e acidez total) pelo modelo de ligadura de piloro, e a produção de muco no conteúdo gástrico foi determinado. No intuito de elucidar possíveis mecanismos de ação gastroprotetor os ensaios de L-NAME e NEM foram desenvolvidos. As análises químicas revelaram a presença dos flavonoides quercetina e canferol nos extratos acetato de etila e etanólico das espécies, bem como a presença de derivados da galocatequina e derivados 3-7-Odiglicosilados de canferol e 3-O-triglicosilado de quercetina. O extrato acetato de etila de ambas as espécies demonstraram o maior conteúdo de polifenóis totais (53,58 ± 0,43 e 43,65 ± 0,80 mg/g de ácido gálico equivalente) e o maior conteúdo de flavonoides totais (3,72 ± 0,27 e 3,19 ± 0,32 mg/g de quercetina equivalente), para extratos de M. cassineformis e M. dasyclada, respectivamente. Os extratos das duas espécies demonstraram ainda um efeito inibidor importante da migração de leucócitos, obtendo valores de IC50 de 0,2594 μg/mL, 0,6114 μg/mL e 0,7560 μg/mL, para os extratos etanólico, acetato de etila e hexânico de M. dasyclada, respectivamente. Para M. cassineformis os valores de IC50 foram de 0,3182 μg/mL, 0,3751 μg/mL e 0,2916 μg/mL, para os extratos etanólicos, acetato de etila e hexânico, respectivamente. A atividade antioxidante dos extratos acetato de etila e etanólico das duas espécies foi demonstrada nos ensaios de atividade antioxidante total (TRAP), em que houve inibição significativa da quimioluminescência formada pelo luminol; e atividade contra os radicais hidroxil demonstrando efeito significativo na prevenção da degradação da desoxirribose. Os extratos foram ainda capazes de inibir a peroxidação lipídica, pelo ensaio de formação de TBARS, e oxidação de proteínas, pelo método do carbonil. Nenhum dos extratos pesquisados evidenciou efeito genotóxico no ensaio cometa in vitro. Os extratos acetato de etila e etanólico de M. dasyclada exerceram atividade antiulcerogênica demonstrada nos ensaios de úlcera induzida por etanol e AINEs, interferindo na secreção de ácido, e, também, interferindo nos mecanismos citoprotetores, aumentando a secreção de muco. Os mecanismos gastroprotetores podem estar relacionados ao efeito antioxidante, demonstrados pela inibição de óxido nítrico e compostos sulfidrila. Os resultados obtidos neste trabalho representam as primeiras contribuições para elucidar compostos químicos e potenciais atividades biológicas das espécies M. cassineformis e M. dasyclada. Os extratos demonstraram atividades biológicas promissoras, relacionadas ao alto conteúdo de compostos fenólicos presentes nas espécies. / The genus Maytenus, belonging to the Celastraceae family is one of the largest family, comprising about 225 species distributed in the tropics. Maytenus species are used in folk medicine in many countries. In Brazil, M. iliciflolia and M. aquifolium are widely used by the population as antiulcer, anti-inflammatory and antitumor. Thus, this project aimed to study the leaves of the plant species M. dasyclada Mart. and M. cassineformis Reiss., natives from Rio Grande do Sul, characterizing them as the chemical and biological aspects. Therefore, was held the extraction of the leaves of species using soxhlet and the following solvents: hexane, ethyl acetate and ethanol, in cycles of 12 hours consecutives for each solvent. Also an aqueous extract was obtained by decoction of the leaves of the species. These extracts were analyzed by chromatographic techniques (HPLC-DAD and HPLC-DAD-ESI-MS) and quantified by UV spectroscopy. The extracts hexane, ethyl acetate and ethanolic of both species were characterized for antioxidant activity (TRAP assay, inhibition of hydroxyl and nitric oxide radicals, and inhibition of lipid peroxidation and protein oxidation) and anti-inflammatory (chemotaxis assay), both in vitro. Through the comet assay in vitro, we evaluated the genotoxic potential of the extracts. Finally, they were tested for antiulcer activity in vivo, by induction of acute ulcers by ethanol and anti-inflammatory drugs. Gastric secretion parameters were also evaluated (volume, total acidity and pH) at pylorus ligature model, and the production of mucus in the gastric contents was determined. In order to elucidate possible mechanisms of gastroprotective action assays of L-NAME and NEM were developed. Chemical analysis revealed the presence of flavonoids quercetin and kaempferol in ethyl acetate and ethanolic extracts of species and the presence of gallocatechin derivatives and kaempferol 3- 7-O-diglicosidic and quercetin 3-O-triglicosidic. The ethyl acetate extracts of both species showed the highest amount of total polyphenols (53.58 ± 0.43 and 43.65 ± 0.80 mg gallic acid equivalent/g) and highest content of flavonoids (3.72 ± 0.27 and 3.19 ± 0.32 mg quercetin equivalents/g), for M. cassineformis and M. dasyclada extracts, respectively. The extracts of both species also showed an inhibitory effect on leukocyte migration importantly, getting IC50 values of 0.2594 μg/mL, 0.6114 μg/mL and 0.7560 μg/mL for ethanolic, ethyl acetate hexane and M. dasyclada respectively. For M. cassineformis the IC50 values were 0.3182 μg/mL, 0.3751 μg/mL and 0.2916 μg/mL, the ethanol extracts, ethyl acetate and hexane, respectively. The antioxidant activity of the ethyl acetate and ethanol extracts from both species was demonstrated in tests of total antioxidant activity (TRAP), in which there was significant inhibition of luminol chemiluminescence, and activity against hydroxyl radicals demonstrating significant effect in preventing the degradation of deoxyribose. The extracts were still able to inhibit lipid peroxidation by TBARS formation assay, and protein oxidation as measured by the carbonyl. Extract showed no genotoxic effects in the comet assay in vitro. The ethyl acetate and ethanolic M. dasyclada extracts exerted antiulcer activity demonstrated in the experimental ulcer induced by ethanol and NSAIDs, interfering in acid secretion, and also interfering with the cytoprotective mechanisms, increasing mucus secretion. Gastroprotector mechanisms may be related to antioxidant effects, demonstrated by the inhibition of nitric oxide and sulfhydryl compounds. The results obtained in this study represent the first contributions to elucidate chemical compounds and biological activities potential of the species M. cassineformis and M. dasyclada. The extracts showed promising biological activities, related to the high content of phenolic compounds present in the species.

A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga. / Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.

O gênero Maytenus, pertencente à família Celastraceae é um dos maiores da família, constituído por cerca de 225 espécies distribuídas nos trópicos. Espécies de Maytenus são utilizadas na medicina popular de diversos países. No Brasil, M. iliciflolia e M. aquifolium são amplamente usadas pela população como antiulcerogênicas, anti-inflamatórias e antitumorais. Desta forma, este trabalho propôs-se a estudar as folhas das espécies vegetais M. dasyclada Mart. e M. cassineformis Reiss., nativas do Rio Grande do Sul, caracterizando-as quanto a aspectos químicos e biológicos. Para isso, obteve-se extratos das folhas das espécies utilizando o aparelho de soxhlet e os seguintes solventes: hexano, acetato de etila e etanol, em ciclos de 12 horas consecutivas para cada solvente. Também foi obtido um extrato aquoso por decocção das folhas da espécie. Estes extratos foram analisados por técnicas cromatográficas (CLAE-UV e CLAE-UV-IES-MS) e quantificados através de espectroscopia no UV. Os extratos hexânico, acetato de etila e etanólico, de ambas as espécies, foram caracterizados quanto as atividades antioxidante (ensaios de TRAP, inibição de radicais hidroxil e óxido nítrico, e inibição da peroxidação lipídica e oxidação de proteínas) e anti-inflamatória (ensaio de quimiotaxia leucocitária), ambos in vitro. Através do ensaio cometa, in vitro, avaliouse o potencial genotóxico dos extratos. Por fim, os mesmos foram testados quanto a atividade antiulcerogênica in vivo, por meio de indução de úlceras agudas por etanol e anti-inflamatórios não esteróides (AINEs). Parâmetros de secreção gástrica também foram avaliados (volume, pH e acidez total) pelo modelo de ligadura de piloro, e a produção de muco no conteúdo gástrico foi determinado. No intuito de elucidar possíveis mecanismos de ação gastroprotetor os ensaios de L-NAME e NEM foram desenvolvidos. As análises químicas revelaram a presença dos flavonoides quercetina e canferol nos extratos acetato de etila e etanólico das espécies, bem como a presença de derivados da galocatequina e derivados 3-7-Odiglicosilados de canferol e 3-O-triglicosilado de quercetina. O extrato acetato de etila de ambas as espécies demonstraram o maior conteúdo de polifenóis totais (53,58 ± 0,43 e 43,65 ± 0,80 mg/g de ácido gálico equivalente) e o maior conteúdo de flavonoides totais (3,72 ± 0,27 e 3,19 ± 0,32 mg/g de quercetina equivalente), para extratos de M. cassineformis e M. dasyclada, respectivamente. Os extratos das duas espécies demonstraram ainda um efeito inibidor importante da migração de leucócitos, obtendo valores de IC50 de 0,2594 μg/mL, 0,6114 μg/mL e 0,7560 μg/mL, para os extratos etanólico, acetato de etila e hexânico de M. dasyclada, respectivamente. Para M. cassineformis os valores de IC50 foram de 0,3182 μg/mL, 0,3751 μg/mL e 0,2916 μg/mL, para os extratos etanólicos, acetato de etila e hexânico, respectivamente. A atividade antioxidante dos extratos acetato de etila e etanólico das duas espécies foi demonstrada nos ensaios de atividade antioxidante total (TRAP), em que houve inibição significativa da quimioluminescência formada pelo luminol; e atividade contra os radicais hidroxil demonstrando efeito significativo na prevenção da degradação da desoxirribose. Os extratos foram ainda capazes de inibir a peroxidação lipídica, pelo ensaio de formação de TBARS, e oxidação de proteínas, pelo método do carbonil. Nenhum dos extratos pesquisados evidenciou efeito genotóxico no ensaio cometa in vitro. Os extratos acetato de etila e etanólico de M. dasyclada exerceram atividade antiulcerogênica demonstrada nos ensaios de úlcera induzida por etanol e AINEs, interferindo na secreção de ácido, e, também, interferindo nos mecanismos citoprotetores, aumentando a secreção de muco. Os mecanismos gastroprotetores podem estar relacionados ao efeito antioxidante, demonstrados pela inibição de óxido nítrico e compostos sulfidrila. Os resultados obtidos neste trabalho representam as primeiras contribuições para elucidar compostos químicos e potenciais atividades biológicas das espécies M. cassineformis e M. dasyclada. Os extratos demonstraram atividades biológicas promissoras, relacionadas ao alto conteúdo de compostos fenólicos presentes nas espécies. / The genus Maytenus, belonging to the Celastraceae family is one of the largest family, comprising about 225 species distributed in the tropics. Maytenus species are used in folk medicine in many countries. In Brazil, M. iliciflolia and M. aquifolium are widely used by the population as antiulcer, anti-inflammatory and antitumor. Thus, this project aimed to study the leaves of the plant species M. dasyclada Mart. and M. cassineformis Reiss., natives from Rio Grande do Sul, characterizing them as the chemical and biological aspects. Therefore, was held the extraction of the leaves of species using soxhlet and the following solvents: hexane, ethyl acetate and ethanol, in cycles of 12 hours consecutives for each solvent. Also an aqueous extract was obtained by decoction of the leaves of the species. These extracts were analyzed by chromatographic techniques (HPLC-DAD and HPLC-DAD-ESI-MS) and quantified by UV spectroscopy. The extracts hexane, ethyl acetate and ethanolic of both species were characterized for antioxidant activity (TRAP assay, inhibition of hydroxyl and nitric oxide radicals, and inhibition of lipid peroxidation and protein oxidation) and anti-inflammatory (chemotaxis assay), both in vitro. Through the comet assay in vitro, we evaluated the genotoxic potential of the extracts. Finally, they were tested for antiulcer activity in vivo, by induction of acute ulcers by ethanol and anti-inflammatory drugs. Gastric secretion parameters were also evaluated (volume, total acidity and pH) at pylorus ligature model, and the production of mucus in the gastric contents was determined. In order to elucidate possible mechanisms of gastroprotective action assays of L-NAME and NEM were developed. Chemical analysis revealed the presence of flavonoids quercetin and kaempferol in ethyl acetate and ethanolic extracts of species and the presence of gallocatechin derivatives and kaempferol 3- 7-O-diglicosidic and quercetin 3-O-triglicosidic. The ethyl acetate extracts of both species showed the highest amount of total polyphenols (53.58 ± 0.43 and 43.65 ± 0.80 mg gallic acid equivalent/g) and highest content of flavonoids (3.72 ± 0.27 and 3.19 ± 0.32 mg quercetin equivalents/g), for M. cassineformis and M. dasyclada extracts, respectively. The extracts of both species also showed an inhibitory effect on leukocyte migration importantly, getting IC50 values of 0.2594 μg/mL, 0.6114 μg/mL and 0.7560 μg/mL for ethanolic, ethyl acetate hexane and M. dasyclada respectively. For M. cassineformis the IC50 values were 0.3182 μg/mL, 0.3751 μg/mL and 0.2916 μg/mL, the ethanol extracts, ethyl acetate and hexane, respectively. The antioxidant activity of the ethyl acetate and ethanol extracts from both species was demonstrated in tests of total antioxidant activity (TRAP), in which there was significant inhibition of luminol chemiluminescence, and activity against hydroxyl radicals demonstrating significant effect in preventing the degradation of deoxyribose. The extracts were still able to inhibit lipid peroxidation by TBARS formation assay, and protein oxidation as measured by the carbonyl. Extract showed no genotoxic effects in the comet assay in vitro. The ethyl acetate and ethanolic M. dasyclada extracts exerted antiulcer activity demonstrated in the experimental ulcer induced by ethanol and NSAIDs, interfering in acid secretion, and also interfering with the cytoprotective mechanisms, increasing mucus secretion. Gastroprotector mechanisms may be related to antioxidant effects, demonstrated by the inhibition of nitric oxide and sulfhydryl compounds. The results obtained in this study represent the first contributions to elucidate chemical compounds and biological activities potential of the species M. cassineformis and M. dasyclada. The extracts showed promising biological activities, related to the high content of phenolic compounds present in the species.

Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil) e outros nitróxidos cíclicos reduzem a injúria tecidual em modelos animais de inflamação por mecanismos que não são completamente entendidos. A mieloperoxidase (MPO) tem um papel fundamental na produção de oxidantes por neutrófilos e, portanto, é um importante alvo para anti-inflamatórios. Ao amplificar o potencial oxidativo do H2O2, a MPO produz HOCl e radicais livres através de seus intermediários oxidantes MPO-I [MPO-porfirina•+-Fe(IV)=O] e MPO-II [MPO-porfirina-Fe(IV)=O]. Esses fatos nos levaram a sintetizar e avaliar a capacidade inibitória sobre a atividade clorinante da MPO in vitro e in vivo do tempol e de três derivados hidrofóbicos substituídos na posição 4 do anel piperidina [(4-azido, 4-benzenosulfonil e 4-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)]. In vitro, todos os nitróxidos inibiram a clorinação da taurina mediada pela MPO a pH 7,4 com valores similares de IC50 (1,5-1,8 µM). As constantes cinéticas das reações do tempol com MPO-I (k = 3,5 x 105 M-1 s-1) e MPO-II, cuja cinética indicou um comportamento de saturação (K= 2,0 x 10-5 M; k = 3,6 x 10-2 s-1), foram determinadas. Modelagens cinéticas indicaram que, em presença de taurina, MPO não produz HOCl livre. Tomados conjuntamente, os resultados indicaram que o tempol age principalmente como um inibidor reversível da MPO por levar ao acúmulo de MPO-II e de complexo [MPO-II-tempol] que não participam do ciclo clorinante. Para examinar se nitróxidos inibem a atividade da MPO in vivo selecionamos como modelo a inflamação aguda induzida pela carragenina na pata de ratos. A atenuação da inflamação na pata mostrou correlação com a lipofilicidade do nitróxido em tempos iniciais, mas as diferenças nos efeitos foram pequenas (menor que 2 vezes) quando comparadas com as diferenças de lipofilicidade (maior que 200 vezes). Nenhuma inibição da atividade da MPO foi evidente in vivo porque os níveis de atividade nas patas dos ratos correlacionaram com os níveis de MPO. Do mesmo modo, em animais não-tratados ou tratados com nitróxidos, todos os parâmetros empregados para monitorar a inflamação (edema, níveis de proteínas oxidadas e nitradas e exsudação plasmática) correlacionaram com os níveis de MPO. Os efeitos dos nitróxidos in vivo foram também comparados com aqueles da hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (ABAH) e da colchicina. Tomados conjuntamente, os estudos in vivo indicaram que os nitróxidos atenuam a inflamação induzida pela carragenina principalmente por inibirem a migração celular. De acordo com essa conclusão, estudos in vivo, mostraram que tempol diminuiu a migração de neutrófilos humanos e de cultura (HL-60 diferenciadas em neutrófilos) ativados com PMA ou fMLP com IC50 25 µM. Nesse caso, a polimerização da actina é inibida apenas quando as células são pré-incubadas com tempol por 30 min. Nesse intervalo de tempo, o tratamento com tempol promove a formação de O2•- via flavoenzimas de maneira dependente da concentração. Subsequente ativação dos neutrófilos de cultura com PMA resulta também em produção intracelular de O2•- e H2O2 que é inibida pelo pré-tratamento com tempol (IC50 = 38 µM). Esses estudos preliminares sugerem que o tempol interfere na migração celular de neutrófilos por atenuar a formação intracelular de ROS. A importância da atividade peroxidásica da superóxido dismutase (hSOD1) in vivo é certamente muito mais restrita do que a da MPO em processos inflamatórios no geral. Todavia, essa atividade peroxidásica da hSOD1 pode ter um papel na na patogenia da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Por essa razão, os efeitos do tempol sobre as consequências da atividade peroxidásica da hSOD1 (oxidação, dimerização, desenovelamento e agregação da enzima) também foram examinadas. Foi demonstrado que o tempol não interfere no ciclo catalítico da hSOD1, porém, inibe a dimerização da enzima, protegendo-a de desenovelamento e agregação. O nitróxido foi consumido no processo reagindo com o radical triptofanila no peptídeo 31VWGSIK36 como comprovado por MS. No conjunto, nossos estudos contribuem para esclarecer os múltiplos mecanismos pelos quais nitróxidos podem inibir processos oxidativos e inflamatórios. / Tempol (4-hydroxy-2 ,2,6,6-tetramethyl piperidine-1-oxyl) and other cyclic nitroxides reduce tissue injury in animal models of inflammation by mechanisms that are not fully understood. Myeloperoxidase (MPO) plays a key role in the production of oxidants by neutrophils and therefore is an important target for anti-inflammatory drugs. By amplifying the oxidative potential of H2O2, MPO produces HOCl and free radicals through its oxidizing intermediates MPO-I [MPO-porphyrin•+-Fe (IV)=O] and MPO-II [MPO-porphyrin-Fe (IV)=O]. In this context, we synthesized tempol and three more hydrophobic derivatives substituted in position 4 of the piperidine ring [(4-azido-4 benzenesulfonyl and 4-(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)] and evaluated their ability to inhibit the chlorinating activity of MPO in vitro and in vivo. In vitro, all the nitroxides inhibited the chlorination of taurine mediated by MPO at pH 7.4 with similar IC50 values (1.5 to 1.8 µM). The kinetic constants of the reactions of tempol with MPO-I (k = 3.5 x 105 M-1 s-1) and MPO-II, whose kinetic indicated a saturation behavior (K = 2.0 x 10-5 M; k = 3.6 x 10-2 s-1), were determined. Kinetic modeling indicated that in the presence of taurine, MPO does not produce free HOCl. Taken together, the results indicated that tempol acts primarily as a reversible inhibitor of MPO leading to accumulation of MPO-II and of the complex [MPO-II-tempol], which do not participate within chlorinating cycle. To examine whether nitroxides inhibit the activity of MPO in vivo, the acute inflammation induced by carrageenan in the rat paw was selected as model. The attenuation of inflammation in paws was correlated with the lipophilicity of the nitroxide in early times, but the differences in effects were small (less than 2-fold) when compared to the differences in lipophilicity (higher than 200 times). No inhibition of MPO activity was evident because the levels of activity in rat paws correlated with the levels of MPO. Similarly, in animals not treated or treated with nitroxides, all parameters used to monitor inflammation (swelling, levels of oxidized and nitrated proteins and plasma exudation) correlated with the levels of MPO. The effects of nitroxides in vitro were also compared with those of 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) and colchicine. Taken together, the in vivo studies indicated that nitroxides attenuate carrageenan-induced inflammation mainly by inhibiting cell migration. According to this conclusion, in vitro studies showed that tempol decreased migration of human and culture neutrophils (HL-60 differentiation to neutrophils) activated with PMA or fMLP with IC50 = 25 µM. In this case, actin polymerization is inhibited only when cells are preincubated with tempol for 30 min. During this time interval, treatment with tempol promotes the formation of O2•- via flavoenzymes in a concentration-dependent manner. Subsequent activation of culture neutrophils with PMA also results in intracellular production of O2•- and H2O2, which is inhibited by pretreatment with tempol (IC50 = 38 µM). These preliminary studies suggest that tempol interfere in neutrophil chemotaxis by attenuating the formation of intracellular ROS. The relevance of the peroxidase activity of superoxide dismutase (hSOD1) in vitro is certainly much narrower than that of MPO. Nevertheless, this peroxidase activity may have a role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, the effects of tempol on the consequences of the hSOD1 peroxidase activity (oxidation, dimerization, unfolding and aggregation of the enzyme) were also examined. Tempol inhibited the dimerization of hSOD1, protecting it from unfolding and aggregation, but not interfered in its catalytic cycle. The nitroxide was consumed in the process by reacting with the tryptophanyl radical of the segment 31VWGSIK36 as evidenced by MS. Overall, our studies contribute to clarify the multiple mechanisms by which nitroxides can inhibit oxidative and inflammatory processes.

Cette thèse concerne l'étude des propriétés de migration et de détachement de lignées cancéreuses du cancer du sein de type mésenchyme, très métastatique et invasif (MDA-MB-231), ou au contraire de type épithélial et peu invasif (MCF-7). Des techniques de vidéomicroscopie et d'analyse d'images automatisées ont été utilisées afin de tirer des informations sur la dynamique cellulaire sur de grandes populations. Nos expériences sur la migration aléatoire des cellules MDA-MB-231 montrent que les propriétés de déplacement de celles-ci sont liées à la fois à la composition de leur milieu environnant, mais aussi à la nature et la quantité de protéines d'adhésion. Nous avons notamment mis en évidence un comportement biphasique de la distance migrée au cours du temps en fonction de la densité de protéines adsorbées sur des surfaces pour deux types de protéines d'adhésion (collagène type IV et fibronectine). Selon le type de protéines d'adhésion, nous avons également mis en évidence un phénotype cellulaire très différent en termes de forme, d'adhésion et de mode de déplacement. Nous avons ensuite utilisé ces résultats pour mettre en place un protocole de migration dirigée de cellules cancéreuses dans un gradient chimiotactique généré par un système microfluidique. Ainsi, en faisant varier les paramètres du système (protéines de surface, concentration maximale en chimioattractants, …), nous avons pu caractériser les bonnes conditions d'obtention de la migration dirigée. Pour finir, nous avons montré la faisabilité d'un tri cellulaire entre cellules de type mésenchyme et épithéliales en utilisant la chimiotaxie à partir de ces systèmes / This thesis investigates migration and detachement properties of different types of breast cancer cell lines : metastatic, invasive MDA-MB-231 and epithelial, low-invasive MCF-7 celles. Videomicroscopy and image analysis techniques were used to obtain dynamic information for large cell populations. Random migration assays performed on MDA-MB-231 cells reveal that their migration properties are related to both medium and surface (substrate adhesion protein type and quantity) conditions. A biphasic behavior for the migrated distance through time was observed to be dependent on the density of adsorbed protein (collagen type IV or fibronectin) on the substrate. Cell shape, detachement and moving properties were also computed as a function of the surface protein characteristics. These results were then used to perform directed migration assays in a chemotactic gradient generated in a microfluidic chamber. Optimal conditions for directed migration of cells were determined by varying the parameters of the system such as gradient maximum concentration, substrate adhesion protein… Lastly, it was experimentally proved that it is possible to separate cancer epithelial cell lines from mesenchymal ones by using chemotactic microfluidic chambers