Introdução: O diagnóstico etiológico da leishmaniose tegumentar baseia-se na detecção do parasito em amostras de lesão colhida por método invasivo. A detecção de DNA do parasito, através da PCR, poderia ser uma alternativa mais sensível, porém não está disponível na rotina diagnóstica e foi padronizada em amostras clínicas colhidas por métodos invasivos, tais como raspado, aspirado ou biópsia da lesão. Uma proposta para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar seria a obtenção de material de lesão (mucosa ou cutânea) através de métodos de coleta menos invasivos e que fosse possível detectar DNA do parasito a partir de pequenas quantidades de amostra clínica. Neste trabalho avaliamos a eficácia da PCR, em amostras colhidas por método não invasivo (swab de lesão) como ferramenta para ser utilizada no diagnóstico de leishmaniose (mucosa e cutânea localizada), bem como para detecção precoce de Leishmania em mucosa de pacientes com lesão cutânea ativa e como ferramenta de avaliação de resposta terapêutica na leishmaniose mucosa. Metodologia: Entre os meses de agosto de 2013 a julho de 2015 foram selecionados 57 pacientes no ambulatório de Leishmanioses do Instituto de Infectologia Emilio Ribas, dos quais foram coletadas amostras de lesão cutânea ou mucosa através de swab e de biópsia das lesões. Em paralelo, foi realizada rotina laboratorial para diagnóstico de leishmaniose nos pacientes que apresentavam lesão ativa (anatomopatológico, pesquisa e cultura de Leishmania, sorologia e teste de Montenegro). As amostras colhidas por biópsia ou swab foram avaliadas através da reação em cadeia da polimerase tendo como alvos o minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania para PCR convencional e o gene da proteína de choque térmico 70Kda (Hsp70) para PCR convencional e PCR em tempo real. Resultados: A detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab de lesões ativas foi semelhante as das amostras colhidas por biópsia das mesmas lesões. Quando comparado aos métodos comumente empregados no diagnóstico da leishmaniose tegumentar, a PCR em material colhido por swab apresentou desempenho superior. Foi demostrado que utilizando os iniciadores para o alvo kDNA obtivemos maior eficácia quando comparado com o alvo Hsp70, seja pela PCR convencional como pela PCR em tempo real (sensibilidade de 94.1%, 42.4% e 39.4%, respectivamente). Ao analisarmos amostras de pacientes já tratados para leishmaniose mucosa observamos positividade de 86% para kDNA e de 22% para Hsp70. Nas amostras de mucosa nasal íntegra e com leishmaniose cutânea ativa, coletadas com swab para detecção precoce da doença, obteve-se 92.9% de positividade com kDNA e 28.6% com Hsp70. Conclusões: Os resultados obtidos sugerem que o método de coleta de amostra biológica através do swab para o diagnóstico molecular da leishmaniose tegumentar apresenta eficácia comparada com o método de coleta por biópsia. A detecção de DNA em amostras colhidas por swab permite analisar a presença de DNA do parasito em tecido sem lesão, podendo detectar a presença de Leishmania mesmo antes de alterações clínicas estarem presentes. A monitorização da resposta terapêutica da leishmaniose mucosa pode ser feita através da detecção de DNA de Leishmania em amostras colhidas por swab / Introduction: Etiologic diagnosis of tegumentary leishmaniasis is based on the detection of the parasite in injury samples collected by invasive method. DNA detection of the parasite by PCR, could be a more sensible alternative, but is not available in routine practice and it was standardized in clinical samples by invasive methods such as scrapes, aspirate or biopsy of the lesion. A proposal for the diagnosis of tegumentary leishmaniasis lesions would obtaining material (cutaneous or mucosal) through less invasive collection methods, and it was possible to detect parasite DNA from small quantities of clinical specimen. In this study we evaluate the effectiveness of the PCR in samples collected by non-invasive method (swab injury) as a tool to be used in the diagnosis of leishmaniasis (mucosal and localized cutaneous), as well as for early detection of Leishmania in mucosa from patients with cutaneous lesions active and as an evaluation tool of therapeutic response in mucosal leishmaniasis. Methodology: Between August 2013 to July 2015 were selected 57 patients from the Leishmaniasis out clinic from the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, which samples of cutaneous lesion or mucosa were collected by swab and biopsy of the lesions. In parallel, routine laboratory was carried out for the diagnosis of leishmaniasis in patients with active lesions (histopathology, search and Leishmania culture, serology and Montenegro skin test antigen). The samples taken by biopsy or swab were assessed by polymerase chain reaction having as targets the minicircle kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania for conventional PCR and gene heat shock protein 70kDa (Hsp70) for conventional PCR and real-time PCR. Results: Leishmania DNA detection in samples taken by swab of active lesions was similar to the samples taken by biopsy from the same lesion. When compared to the methods commonly used in the diagnosis of tegumentary leishmaniasis, PCR material collected by swab showed superior performance. It was shown that using the primers for the target kDNA obtained more effectively compared with the target Hsp70, or by conventional PCR and by real-time PCR (sensitivity 94.1%, 42.4% and 39.4%, respectively). When analyzing samples from patients already treated for mucosal leishmaniasis observed positivity of 86% to kDNA and 22% for Hsp70. Samples of nasal mucosa and active cutaneous leishmaniasis, collected by swab for early detection of disease, it obtained 92.9% positivity with kDNA and 28.6% with Hsp70. Conclusions: Our results suggest that the biological sample collection method using the swab for the molecular diagnosis of tegumentary leishmaniasis had compared efficacy with biopsy collection method. The DNA detection collected by swab samples allows to analyze the presence of DNA of the parasite in tissue without damage and can detect the presence of Leishmania even before clinical changes are present. The monitoring of therapeutic response mucosal leishmaniasis can be made by Leishmania DNA detection in samples per swab

A proteína Cpn60 faz parte de um grupo de proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em funções celulares essenciais. camundongos BALB\\c foram imunizados com 5 ou 10 µg da proteína recombinante (Cpn60r) sozinha ou adicionada à vacina DTP sem hidróxido de alumínio (NADTP). A vacina DTP do Instituto Butantan (DTP) foi usada como controle. Foi avaliada a produção de citocinas por células esplênicas após reestímulo in vitro com a Cpn60r. Os animais foram desafiados após o protocolo de imunização. A Cpn60r sozinha ou misturada à vacina NADTP foi capaz de induzir níveis de anticorpos contra pertussis mais altos do que os induzidos pela DTP. Os níveis de IgG1 e IgG2a foram similares para todos os grupos. Pôde-se observar a produção de de IL-6 e IFN-&#947 nos grupos imunizados com Cpn60r. Os grupos imunizados com Cpn60r+NADTP apresentaram um índice de proteção entre 60 e 80% contra o desafio pela bactéria virulenta, semelhante ao grupo imunizado com DTP. A proteína Cpn60r é bastante promissora não somente como imunógeno, mas também como adjuvante. / The Cpn60 protein is a member of a group of higly conserved proteins linked to essencial cell functions. The Cpn60 was cloned, expressed and its immune response has been evaluated. BALB\\c mice were immunized with 5 or 10 µg of the recombinant protein (Cpn60r) alone or mixed with DPT vaccine without aluminum hidroxyde (NADPT). The DPT vaccine from Instituto Butantan was used as control. We evaluated the cytokines production by spleen cells after they have been reestimulated in vitro with Cpn60r. The animals were challenged after the immunization protocol. The Cpn60r alone or mixed with NADPT vaccine was able to induce higher antibodies levels than DPT. IgG1 and IgG2a levels were similar in all groups. We could detect levels of IL-6 and IFN-&#947 on groups immunized with Cpn60r. The groups immunized with Cpn60r+NADTP showed a 60 and 80% protection rate against the challenge with the live bacteria, similar to the group immunized with DPT. These results show the immune response of the recombinant protein that could be included in immunization protocols for pertussis.

Esta pesquisa teve por objetivo avaliar a suscetibilidade a ensaios de intemperismo acelerado de cinco rochas usadas no patrimônio histórico e cultural das cidades do Rio de Janeiro e São Paulo, para determinar suas resistências frente a: ambientes quimicamente agressivos por meio de exposições em câmaras saturadas de SO2 e NaCl; imersão parcial em soluções ácidas e alcalina (H2SO4, HCl, HNO3 e NaOH); e ciclagens de choque térmico. As rochas abordadas no estudo foram: Granito Itaquera, Granito Cinza Mauá e Monzonito Preto Piracaia, de São Paulo; Gnaisse Facoidal do Rio de Janeiro e um mármore branco do Espírito Santo. Com exceção do mármore, incluído no estudo devido aos diversos monumentos históricos feitos em mármores dos mais variados, todas as rochas tiveram larga utilização na construção de edifícios e monumentos das duas cidades. Nas rochas submetidas às alterações foram feitas determinações, previamente e posteriormente aos ensaios, de suas características físicas: densidade, porosidade, absorção de água, absorção de água por capilaridade, absorção de água por tubo de Karsten, índice de resistência ao carregamento pontual, velocidade de propagação de ondas ultrassônicas, resistência superficial por martelo de rebote (martelo de Schmidt) e cor por espectrofotometria. Foram efetuadas também análises petrográficas das rochas e difratometria de raios X em sais gerados nos corpos parcialmente imersos em soluções. A caracterização das rochas sãs foi catalogada com o intuito de contribuir com estudos de conservação-restauração futuros, considerando que o acesso a pedreiras e disponibilidade das mesmas tendem a diminuir, devido à urbanização e exaustão de pedreiras. Dentre as alterações impostas, a que mais impactou as rochas foi a do choque térmico. As alterações de caráter químico foram mais agressivas sobre o mármore, gerando alterações mais sutis nos outros litotipos, conforme era esperado. Os métodos de velocidade de propagação de ondas ultrassônicas e a resistência superficial por martelo de rebote permitiram inferir que as alterações ocorridas foram predominantemente superficiais, uma vez que ocorreu maior perda de resistência superficial do que redução de velocidade. A rocha que apresenta maior perda de resistência superficial é o Monzonito Preto Piracaia, que em contrapartida apresenta baixa alteração de velocidade ultrassônica. A alteração de cor foi expressiva em todas as rochas, sendo o procedimento de imersão parcial em soluções ácidas o mais agressivo. / The purpose of this research was to evaluate the susceptibility to accelerated weathering tests of five rocks used in the historical and cultural patrimony of the cities of Rio de Janeiro and São Paulo in order to determine their resistance to: chemically aggressive environments through exposure to SO2 and NaCl in saturated chambers; partial immersion in acidic and alkaline solutions (H2SO4, HCl, HNO3 and NaOH); and thermal shock cycling. The rocks covered in the study were: Itaquera Granite, Gray Mauá Granite and Black Piracaia Monzonite, from São Paulo; Augen Gneiss from Rio de Janeiro and a white marble from Espirito Santo. All the rocks have been widely used in the construction of buildings and monuments of the two cities, except for the marble, which was included in the study due to its use in various historical monuments. To the rocks subjected to the artificial weathering, determinations of their physical characteristics were made, before and after the tests: density, porosity, water absorption, water absorption by capillarity, water absorption by Karsten tube, point load strength index, ultrasound pulse velocity, surface resistance by rebound hammer (Schmidt\'s hammer) and color by spectrophotometry. Also, petrographic analyses of the rocks and X - ray diffraction in salts generated in the bodies partially immersed in solutions were carried out. The characterization of unaltered rocks was cataloged with the intention of contributing to future studies of conservation and restoration, considering that the access to quarries and their availability tend to decrease due to the urbanization and exhaustion of quarries. Among the alterations imposed, thermal shock was the one that most affected the rocks. While chemical alterations were more aggressive on the marble, more subtle alterations were observed in the other lithotypes, as expected. The ultrasonic wave propagation velocity methods and the surface resistance by rebound hammer allowed to infer that the alterations occurred were predominantly superficial, since there was a greater loss of surface resistance than reduction of velocity. The rock that presented the greatest loss of surface resistance is the Black Piracaia Monzonite, which in turn has a low ultrasonic velocity change. The color change was significant in all rocks, with the partial immersions in acidic solutions being the most forceful procedure for this characteristic.

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs

A leishmaniose tegumentar é uma zoonose que ocorre endemicamente em 88 países, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Estima-se que o número de pessoas infectadas por Leishmania seja de cerca de 12 milhões e que ocorram entre 700 mil a 1,2 milhões de novos casos anualmente. O Brasil apresenta a maior prevalência de leishmaniose tegumentar na América, sendo que já foram identificadas seis espécies como causadoras de leishmanise tegumentar: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi. Apesar de termos diferentes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar no Brasil e com diferentes formas clínicas, a discriminação das espécies de Leishmania responsáveis por determinada lesão ainda é um desafio. Utilizando as técnicas qPCR, HRM e PCR multiplex, com pares de oligonucleotídeos contruídos e direcionados para o gene alvo hsp70, propomos uma alternativa para os ensaios utilizados atualmente para a identificação de Leishmania e diferenciação dos subgêneros Leishmania e Viannia em cultura de promastigota. A identificação do subgênero Leishmania obtida nos nossos resultados em amostras de cepas referência e em amostras de isolados de pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas, correspondem ao obtido por PCR-RFLP direcionada para o alvo kDNA com a enzima de restrição HaeIII realizada num estudo anterior. No entanto, este estudo permitiu a identificação do subgênero em apenas um passo, o que contribui para a redução do tempo, custo e manuseio de amostras. Diante desses resultados, sugere-se a validação da técnica em DNA de amostras de amastigotas de lesões tegumentares de pacientes diagnosticados com esta doença / The cutaneous leishmaniasis is a zoonotic disease that is endemic in 88 countries, characterized as a serious public health problem in tropical and subtropical countries. It is estimated that the number of people infected by Leishmania to be about 12 million, occurring between 700 thousand to 1.2 million new cases annually. Brazil has the highest prevalence of cutaneous leishmaniasis in America and six species have been identified as causes of cutaneous leishmaniasis: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi. Although we have different species that cause cutaneous leishmaniasis in Brazil and with different clinical forms, discrimination against Leishmania species responsible for certain injury is still a challenge. Using the techniques qPCR, HRM and multiplex PCR with oligonucleotide engineer to the target gene hsp70, propose an alternative to the currently used assays for Leishmania identification and Leishmania and Viannia subgenus differentiation in parasite promastigote culture. The identification of Leishmania subgenus obtained in our results with parasite promastigote culture of reference strains samples and isolates in patients with suspected tegumentary leishmaniasis attended at the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, corresponded to that obtained by PCR-RFLP directed to the target kDNA with HaeIII restriction enzyme carried out in a previous study. However, this review allowed the identification of the subgenus in just one step, contributing to the reduction of time, cost and handling of samples. Given these results, we suggest the validation of this technique in DNA of amastigote samples from tegumentary lesions of patients diagnosed with this disease

Orientador: Cristina Antoniali Silva / Banca: Fernando Silva Carneiro / Banca: Carlos Alan Candido Dias Junior / Banca: Graziela Scalianti Ceravolo / Banca: Angela de Castro Resende / Resumo: A redução da reatividade vascular à fenilefrina (PE) em aorta de ratas espontaneamente hipertensas (SHR) ao final da prenhez é dependente de maior produção e/ou maior biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), consequente do aumento da fosforilação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) via PI3K/Akt. A glicosilação do tipo N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional que compete com a fosforilação pelos mesmos sítios de ligação nas proteínas. A O-GlcNAcilação da eNOS em serina1177 leva a redução da sua atividade enquanto a fosforilação leva a sua ativação. Além destes mecanismos, a interação da eNOS com outras proteínas é capaz de regular positiva ou negativamente a sua atividade. O objetivo deste trabalho foi analisar possíveis alterações nos mecanismos de modificação pós-traducional que controlam a ativação da eNOS os quais poderiam contribuir para maior ativação e maior biodisponibilidade de NO observada em artérias de ratas prenhes. Foram avaliados o conteúdo proteico O-GlcNAc e também expressão das enzimas que participam desta modificação, O-GlcNAc transferase (OGT) e O-GlcNAcase (OGA) por Western Blotting e a atividade da OGA por ensaio bioquímico em aorta e em artéria mesentérica (2º ou 3º ramo) de ratas não prenhes (NP) e prenhes (P), normotensas (Wistar) e SHR. Ensaios de Western Blotting foram realizados também para análise da expressão das seguintes proteínas: Cav-1, p-Cav-1, CaM e Hsp90. Realizamos a contagem do número de cavéolas en... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Reduction of vascular reactivity to phenylephrine (PE) in aortaof spontaneously hypertensive rats (SHR) at the end of pregnancy is dependent on higherproduction and/or higerbioavailability of nitric oxide (NO), as a consequence of increased endothelial nitric oxide synthase enzyme (eNOS) phosphorylation,by PI3K/Akt.Glycosylation with O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)is a post-translational modification that competes with phosphorylation by the same binding sites in proteins. O-GlcNAcylation of eNOSon serine siteleads to a reduction in its activity while eNOS phosphorylation leads to its activation. In addition to these mechanisms, the interaction of eNOS with other proteins is able to regulate positively or negatively its activity. The objective of this studywas to analyze possible changes in the mechanisms of post-translational modification that control the eNOS activation, which could contribute to its the greater activation and greater bioavailability of NO observed in arteriesof pregnant rats. The O-GlcNAc-protein content and also the enzymesexpressionthat participate in this modification, O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA) was assessed by Western Blotting, and OGA activity were evaluated by biochemical assay in the aorta and in the artery mesenteric (2ndor 3rdbranch) of non-pregnant (NP) and pregnant (P), normotensiverats(Wistar) and SHR.Western Blotting assays were also performed for expression analysis of the following proteins: Cav-1, p-Cav-1, CaM and Hsp90. We performed the counting of the number of endothelial caveolaein the aorta and the mesenteric artery in the presence or absence of methyl-β-cyclodextrin (dextrin, 10 mmol/L) by electronicmicroscopy.In functional studies, we evaluated the participation of the OGA enzyme, by inhibition with PugNAc (100 μmol/L) and of the caveolae, using a caveolae disassembler, (Complete abstract electronic access below) / Doutor

Submitted by LUÍS FELIPE DAIBES DE ANDRADE null (luipedaibes@hotmail.com) on 2017-12-09T19:13:02Z No. of bitstreams: 1 TeseVersaoFinal_LFD.pdf: 4542971 bytes, checksum: dc820c668f873e34980831a5f5f98979 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2017-12-11T16:56:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andrade_lfd_dr_rcla.pdf: 4542971 bytes, checksum: dc820c668f873e34980831a5f5f98979 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-11T16:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrade_lfd_dr_rcla.pdf: 4542971 bytes, checksum: dc820c668f873e34980831a5f5f98979 (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Outra / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fogo é o principal distúrbio em diversas vegetações ao redor do mundo, denominadas ecossistemas inflamáveis. Neste contexto, muitas espécies possuem estratégias de regeneração e colonização do ambiente pós-fogo, o que tipicamente envolve a sobrevivência (tolerância) das sementes e/ou quebra da dormência. Em especial, muitas sementes de leguminosas possuem o tegumento impermeável (dormência física), que pode ser rompido por meio de choques térmicos relacionados ao fogo. Outro fator que pode auxiliar no processo de quebra da dormência física é a flutuação térmica no solo, cuja amplitude é aumentada nas clareiras formadas pela remoção da vegetação durante a queima. Ambos os fatores, fogo e flutuação térmica, são relativamente bem estudados nos ecossistemas inflamáveis da Austrália e em vegetações Mediterrâneas. Por outro lado, os padrões relacionados à quebra da dormência e germinação das sementes ainda são controversos e menos conhecidos nas savanas tropicais da África e da América do Sul. Assim, esta Tese de doutorado teve como objetivo avaliar o papel do fogo na germinação e sobrevivência das sementes de leguminosas do Cerrado. Para tanto, realizamos tratamentos em campo, incluindo queimas experimentais, e também aplicamos tratamentos no laboratório, simulando a flutuação térmica nas clareiras e a passagem do fogo (choques térmicos). Após os tratamentos, observamos a germinação em condições ótimas, fazendo contagens três vezes por semana, e realizamos testes de viabilidade ao final de 30 dias dos experimentos. As análises estatísticas consistiram basicamente em GLMMs com distribuição binomial, considerando as réplicas como efeitos aleatórios. Os resultados apontam que as sementes morrem quando diretamente expostas ao fogo na superfície do solo. Por outro lado, há uma maior probabilidade de sobrevivência quando as sementes estão localizadas em clareiras (gaps) da vegetação. Nos gaps, a maior porcentagem de solo nu proporciona temperaturas do fogo mais amenas, queimando por menos tempo. Quando enterradas 1-cm sob o solo, as sementes sempre sobrevivem e pode haver quebra de dormência. A flutuação térmica também pode quebrar uma proporção significativa da dormência em condições de campo, especialmente em Mimosa leiocephala. Em laboratório, ao contrário do esperado, não há quebra da dormência, indicando que a flutuação térmica em si não consiste um mecanismo para quebra da dormência física em espécies do Cerrado. Nos choques térmicos, poucas espécies (seis de 46) apresentaram quebra da dormência. Observamos também que a mortalidade das sementes está relacionada a um trade-off entre forma de crescimento, tamanho das sementes e presença de dormência. Isso se deve ao tamanho pequeno das sementes de arbustos, que a despeito de tipicamente ocorrerem em savana aberta, podem morrer sob condições severas dos choques térmicos, mais do que as espécies arbóreas. Dentre as espécies arbóreas, a filogenia influencia no tamanho e, consequentemente, na mortalidade das sementes frente ao fogo. Concluímos que a germinação das sementes não está diretamente ligada à presença do fogo no mosaico Cerrado-floresta, contrastando com os padrões reconhecidos para outros ecossistemas inflamáveis. / Fire is the principal disturbance in several vegetation types around the world, being called flammable ecosystems. In this context, many species have strategies to regenerate and colonize the post-fire environment, which typically involve seed survival (tolerance) and/or breaking of dormancy. In special, legume seeds usually have an impermeable seed coat (physical dormancy), which may be disrupted by fire-related heat shocks. Another factor that can help in the process of dormancy-breaking is the temperature fluctuation in the soil, which amplitude is increased in gaps formed by the removal of vegetation as a result of the passage of fire. Both factors, fire and temperature fluctuation, are relatively well studied in flammable ecosystems from Australia and Mediterranean vegetation. On the other hand, the patterns related to dormancy-breaking and seed germination are still controversial and less known in tropical savannas from Africa and South America. Therefore, this doctoral Thesis has aimed to evaluate the role of fire on germination and survival of legume seeds from Cerrado. Therefore, we conducted experiments in the field, including experimental burning, and also applied treatments in the laboratory, simulating temperature fluctuation in the gaps and fire passage (heat shocks). After the treatments, we observed germination under optimal conditions, making counting three times a week, and accomplishing viability tests by the end of 30 days of the experiment. The statistical analyses basically consisted on GLMMS with binomial distribution, considering replicates as random effects. Results pointed that seeds die when directly exposed to fire in the soil surface. On the other hand, there is a higher probability of survival when seeds are placed in vegetation gaps. In the gaps, the higher percentage of bare soil provides milder fire temperatures, lasting for less time. When buried at 1-cm belowground, seeds always survive and dormancy-breaking may occur. Temperature fluctuation can also break a significant proportion of dormancy under field conditions, especially for Mimosa leiocephala. In the laboratory, there is no dormancy-breaking, showing that temperature fluctuation itself might not be a mechanism for physical dormancy-breaking in Cerrado species. When heat shocks were applied, six out of 46 species showed dormancy-breaking. We also observed that seed mortality is related to a trade-off between growth-form, seed size and the presence of dormancy. This is due to the small size of seeds from shrubs, that although typically occurring in the open savannas, they might die under severe conditions of temperatures. Among the tree species, phylogeny influences on size and, consequently, mortality of seeds in face to fire. We concluded that seed germination is not directly linked to the presence of fire in the Cerrado-forest mosaic, contrasting to the patterns recognized for other flammable ecosystems. / Fundação Grupo Boticário 0153_2011_PR / FAPESP 2015/06743-0 / CAPES/PDSE 88881.131702/2016-01 / CNPq 455183/2014-7

Resumo indisponível

Submitted by Warne Pedro de Andrade (warne800@hotmail.com) on 2018-06-27T16:37:27Z No. of bitstreams: 1 Mestrado Warne.pdf: 2077163 bytes, checksum: 68e5205b57ffe2680fcdd40ebea34554 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-06-28T16:07:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andrade_wp_me_bot.pdf: 2077163 bytes, checksum: 68e5205b57ffe2680fcdd40ebea34554 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-28T16:07:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrade_wp_me_bot.pdf: 2077163 bytes, checksum: 68e5205b57ffe2680fcdd40ebea34554 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Introdução: As proteínas de choque térmico (“Heat Shock Proteins”) são produzidas em resposta ao estresse patofisiológico nas células animais e não só fazem parte de várias etapas da carcinogênese, atuando principalmente como agentes antiapoptóticos, como também estão implicadas em mecanismos de resistência à quimioterapia em vários tipos de tumores. Objetivo: O presente estudo visa comparar a expressão dos genes TRAP1, HSPB1, HSPD1, HSPA1L e HSPA1A nas amostras de CEO (no tumor primário ou na metástase) com a expressão dos mesmos em amostras de tumores ovarianos benignos e tecido ovariano normal e correlacionar a expressão gênica com o prognóstico das pacientes e com a resistência ao tratamento com platina. Métodos: Foram avaliadas amostras de 51 pacientes operadas no Hospital Vera Cruz, entre os anos de 2008 a 2011, divididas em quatro grupos: CEO primário (n = 14), CEO metastático (n = 11), cistoadenoma seroso ovariano (n = 07) e ovário normal (n = 19). Utilizou-se a técnica de qRT-PCR para determinar o perfil de expressão dos genes. Resultados: As pacientes incluídas neste estudo apresentavam idade média de 56,75 anos. Não houve diferença significativa (valor-P> 0,050) na comparação entre a expressão dos genes e os grupos estudados. Os genes HSPA1A, HSPA1L e TRAP1 foram subexpressos e se diferiram significativamente dos genes em indivíduos com ovário normal. A expressão dos genes analisados não correlacionou se com as variáveis quantitativas, como idade, menarca, e tempo após menopausa bem como em relação as dosagens séricas do CA125, presença de ascite e citorredução. Em relação ao estadiamento, observou que mulheres com CEO no estadio I e II apresentaram a expressão do gene TRAP1 significativamente maior que as pacientes no estadio III e IV (p=0,040). Ao analisar a expressão dos genes em relação a sobrevida global observou se que houve influência significativa do nível de expressão dos gene HSPA1A sobre o risco de morte das mulheres afetadas por CEO. Conclusão: Apesar das limitações em relação ao tamanho da amostra, os resultados obtidos sinalizam para um melhor entendimento da relação entre a expressão destes genes e o câncer de ovário, evidenciando algumas implicações no prognóstico. / Heat Shock Proteins are produced in response to pathophysiological stress and take part in several stages of carcinogenesis, acting primarily as anti-apoptotic agents. They are also implicated in resistance to chemotherapy in several types of tumors. Herein we correlated the expression of genes encoding these proteins and the clinical and pathological aspects of patients with ovarian cancer (OC). METHODS: 51 patients included in the study were divided into four groups: those with primary EOC (n = 14), metastatic EOC (n = 11), ovarian serous cystadenoma (n = 7), with no evidence of ovarian malignancy or control (n = 11). The 57 tumor samples obtained were submitted to RNA extraction and reverse transcription. qRT-PCR was performed to compare the expression of TRAP1, HSPB1, HSPD1, HSPA1A and HSPA1L in primary and HSP60, HSP70, HSPA1L genes did not differ among the groups (p-value> 0.050) .HSPA1A, HSPA1L and TRAP1 we underexpressed in the primary and metastatic EOC groups with HSPA1L showing the lowest expression with compare with normal ovary tissue. TRAP1 expression was higher in tumors at stage I/II than at stages III/IV. Grade II subjects showed higher HSPB1 expression. There was no correlation between HSPs expression and age, menarche, parity, period after menopause initiation and CA-125. HSPA1A gene was negatively correlated with the risk of dying of OC. There was no differences between HSP expression gene evaluated and overall and disease-free survival. In conclusion, we suggest that downregulation of HSPA1A, HSPA1L e TRAP1 could help to clinical evaluated of prognostic in women with EOC.

Visando contribuir para o conhecimento da dinâmica do estresse celular por agentes químicos e físicos e suas possíveis implicações sobre a mobilização de elementos transponíveis presentes em Drosophila, foram realizadas diferentes abordagens experimentais utilizando a espécie cosmopolita Drosophila melanogaster, e as espécies neotropicais do subgrupo willistoni, D. willistoni (três linhagens) D. equinoxialis, D. paulistorum, D. insularis e D. tropicalis. Foi verificado o efeito tóxico de disseleneto de difenila ((PhSe)2) durante diferentes estágios do ciclo de vida da Drosophila melanogaster e das espécies do subgrupo willistoni. Em D. melanogaster, as moscas adultas foram mais resistentes a intoxicação por (PhSe)2 do que larvas e pupas. De uma maneira geral as espécies do subgrupo willistoni são mais sensíveis à intoxicação por selênio do que a D. melanogaster, possivelmente explicado e de acordo com a recentemente demonstrada ausência de homologia de genes para selenoproteínas no genoma de D. willistoni com todas as onze outras espécies sequenciadas. O potencial do selênio para promover estresse celular em D. melanogaster foi evidenciado através da transcrição do gene hsp83 por Northern blot. Nas espécies do subgrupo willistoni a expressão deste gene e do hsp70 foi abordada através de Real Time PCR em resposta ao selênio e ao paraquat, que igualmente foi mais tóxico nos estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados da expressão dos genes de estresse, entretanto, não foram conclusivos, bem como a procura da transposase do elemento P em resposta aos tratamentos. Apesar disso foram estabelecidas às condições experimentais para a realização de experimentos futuros. / Aiming to contribute to the knowledge of the dynamics of cell stress caused by chemical and physical agents and the likely implications thereof in the mobilization of transposable elements present in Drosophila, different experimental approaches were adopted using the cosmopolitan species Drosophila melanogaster and the Neotropical species of the willistoni subgroup, D. willistoni (three strains), D. equinoxialis, D. willistoni, D. paulistorum, D. insularis and D. tropicalis. The toxic effect of diphenyl diselenide [(PhSe)2] was observed in the different life cycles of Drosophila melanogaster and of the species of the willistoni subgroup. D. melanogaster adult flies were more resistant to intoxication by (PhSe)2 as compared to larvae and pupae. Generally speaking the species belonging to the willistoni subgroup are more sensitive to intoxication by selenium as compared to D. melanogaster, which is possibly explained and in accordance to the recently demonstrated absence of gene homology of selenoproteins in the D. willistoni genome with all that of the other eleven species sequenced. The evidence of the potential exhibited by selenium to promote cell stress in D. melanogaster is shown by the hsp83 gene transcription analyzed by Northern blot. In the species of the willistoni subgroup, the expression of the hsp83 and of the hsp70 genes was analyzed by Real Time PCR in response to selenium and paraquat, which was equally more toxic in the early development stages. Nevertheless, the results of the stress gene expression were inconclusive, as well as the search for P element transposase in response to treatments. In spite of that, the experimental conditions required for future research have been established.