Os insetos da subfamília Triatominae Jeannel, 1919 de Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera: Reduviidae), também conhecidos como barbeiros, constituem um grupo amplamente distribuído pela região Neotropical que comporta hoje, 142 espécies ocorrentes e uma fóssil, distribuídas em 18 gêneros, são insetos hematófagos estritos em todas as fases da vida e reconhecidos vetores da Doença de Chagas. Essa enfermidade é considerada um dos mais importantes problemas de saúde na América Latina, com cerca de 12 a 14 milhões de indivíduos chagásicos, 60 milhões vivendo em risco e cerca de 20.000 caso/ano em 18 países da América do Sul e Central. Neste estudo foram analisadas seqüências de nucleotídeos dos genes 16S e CitB mitocondrial em populações de triatomíneos, dos gêneros Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 e Triatoma Laporte, 1832, mantidos em colônias no insetário Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA) - SP, comparando-as com seqüências dos mesmos genes disponíveis no GenBank. Os fragmentos obtidos variaram de 311 a 317 pb (16S) e 393 pb (CitB). Observou-se baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas do gene 16S, enquanto o gene CitB mostrou-se mais polimórfico, podendo ser utilizado para estudos de populações geográficas. As seqüências geradas foram alinhadas com seqüências dos mesmos genes para outros triatomíneos e também de Arilus cristatus Linaeus, 1763 (Hemiptera: Reduviidae: Harpactorinae) (16S e CitB) e Oncerotrachelus sp. Stål, 1868 (Hemiptera: Reduviidae: Saicinae) (16S). As relações entre as espécies foram avaliadas pelos métodos de Distância (Neighbor Joining), Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança. As análises de fragmentos para os dois genes demonstraram a parafilia de Rhodniini e Triatomini, confirmando resultados anteriores. Evidenciou-se a possível origem dos "Triatomas" Neotropicais a partir de derivações de Triatomas Neárticos, verificada pela estreita relação genética de Panstrongylus e Triatoma vitticeps (Stål, 1859) com o ramo Norte-Centro Americano de Triatoma; por meio das relações com T. protracta (Uhler, 1894), Dipetalogaster maxima (Uhler, 1894) e T. dimidiata Latreille, 1811. É dada a conhecer a primeira seqüência de bases nitrogenadas de fragmentos do gene 16S para Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. Os resultados mostraram a utilidade de 16S e CitB como marcadores moleculares de espécies e de populações de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia, no entanto, exigem um alto grau de segurança e controle de contaminação. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores e o uso de caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento, indispensáveis para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle. As colônias de triatomíneos do SESA revelaram-se importante fonte de material para estudos sistemáticos de triatomíneos, pois compreendem amostras significativas de várias populações triatomínicas da América, principalmente de espécies consideradas vetores principais do mal de Chagas como Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 e Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Algumas questões sistemáticas relativas a origem e relacionamento filogenético dos triatomíneos continuam em aberto; novos reagrupamentos serão necessários para que a Subfamília continue válida; Análises mais completas, com a inclusão de representantes das tribos Alberproseniini, Bolboderini e Cavernicolini, são ainda necessárias. / The insects of the Triatominae subfamily Jeannel, 1919 of Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera), also known as triatomine bugs, constitute a widely distributed group in the Neotropical region and including 142 current species and a fossil one, distributed in 18 genera. They are strict hematophagic insects in all phases of their life cicle and recognized vectors of the Chagas disease. This disease is considered one of the most serious Health problem in Latin America, with about 12 the 14 million of chagasic individuals, 60 million people living at risk and about 20,000 cases/year in 18 Central and South American countries. In this study mitocondrial 16S and CytB nucleotide sequences were analyzed in populations of triatomine bugs of the genera Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 and Triatoma Laporte, 1832 from colonies maintained in the Insectary of Special Health Service of Araraquara - SESA (acronym in Portuguese), Araraquara- SP, comparing them with sequences of the same available genes deposited in the GenBank. The obtained fragments varied from 311 to 317 bp (16S gene) and 393 pb (CytB). Low intra-specific variation among the genetic distance of the 16S gene, while the CytB gene revealed a higher polymorphism, being able to be used in geographic population studies. The generated sequences were aligned with sequences of the same genes for other triatomine bugs and also with Arilus cristatus Linaeus, 1763 (16S and CytB) and Oncerotrachelus sp Stål, 1868 (16S). The relationships among the species had been evaluated by the methods of Distance (Neighbor Joining), Maximum Parsimony and Maximum Likelihood. The analyses of fragments for the two genes had demonstrated the paraphily of Rhodniini and Triatomini, confirming previous results. It was hypothesized the possible origin of the Neotropical "Triatomas" from derivations of Nearctic triatomes, verified for the narrow genetic relation of Panstrongylus and Triatoma vitticeps (Stål, 1859) with the North-Center American branch of Triatoma by the relationships with T. protracta (Uhler, 1894), D. maxima (Uhler, 1894) and T. dimidiata Latreille, 1811. It is known the first sequence of nitrogen bases of fragments of the 16S gene for Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. The results had shown the utility of 16S and CytB as markers of species and of triatomine populations and their importance in systematic and taxonomy questions. However, demands one high degree of security and control of contamination. There is a necessity of new studies involving other molecular markers and the use of classic systematic characters of morphology, ecology and behavior, indispensable for systematic decisions adjusted a time, that would have not only systematic impact but, for the control strategies. The colonies of triatomine of the SESA had shown important source of material for systematic studies of this kind of insect, since they include significant samples of triatomine populations of America, mainly of species considered the main vectors of the Chagas disease such as Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 and Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Some systematic questions related to the origin and phylogenetic relationship of the triatomine bugs have kept opened; new regroupings will be necessary so that the Subfamily continues valid; more complete analyses, with the inclusion of representative members of the Alberproseniini, Bolboderini and Cavernicolini tribes, are still necessary.

O veado-mão-curta (Mazama nana) é uma espécie de cervídeo que ocupa a região Sul do Brasil, norte da Argentina e leste do Paraguai, tendo sido severamente afetada pela redução drástica das áreas florestadas. Trata-se, também, da espécie de cervídeo neotropical menos estudada pela ciência. Frente a essa situação, o presente projeto propôs-se a entender como essa espécie se distribui em sua área de ocorrência, propôs áreas prioritárias para sua conservação e estimou a densidade de duas populações. Dada a raridade e a alta elusividade da espécie, propôs-se o uso de metodologias indiretas para se atingir o objetivo proposto. Assim, foram usadas metodologias baseadas na coleta de amostras fecais, extração do DNA e posterior análises molecular e genética. Foram coletadas amostras fecais com o auxílio de um cão farejador em unidades de conservação distribuídas ao longo do Sul do Brasil. Após a identificação da espécie por meio da amplificação de um fragmento do citocromo B e corte com enzimas de restrição (PCR/RFLP) e com os dados de localização das amostras, foram feitas modelagens de distribuição com o software Maxent. Foram escolhidas duas unidades de conservação, onde foram realizadas coletas de amostras fecais, baseadas em faixas, para possibilitar a estimativa da densidade de animais nestas populações. Estabeleceu-se a distribuição geográfica potencial de M. nana no Brasil para os Estados do Paraná, Santa Catarina, norte e centro do Rio Grande do Sul, extremo sul de São Paulo e Mato Grosso do Sul. Porção leste do Paraguai e, na Argentina para a província de Missiones. A densidade da espécie para a região norte do Parque Nacional do Iguaçu foi de 1,9 ind/km2 e para o Parque Estadual Vila Rica do Espírito Santo foi de 5,5 ind/km2. A população potencial da espécie foi de 152.991 indivíduos, sendo 15.524 indivíduos a população dentro das áreas protegidas. Sugere-se a manutenção do estado de conservação da espécie como Vulnerável, tanto na lista Brasileira como na lista Internacional de fauna ameaçada de extinção. / The Brazilian dwarf brocket (Mazama nana) is a deer species that occupies the forests of southern Brazil, north of Argentina and east of Paraguay. It has been greatly affected by the drastic reduction of forested areas. It is also the less studied neotropical deer. Considering this situation, this project aimed to shed light on the species distribution along its range, to indicate conservation priority areas and estimate the density of two populations. Given the rarity and high elusiveness of the species, it is proposed the use of indirect methods to achieve this goal. Fecal samples collection based methodologies were used, followed by DNA extraction and subsequent molecular and genetic analysis. Fecal samples were tracked and collected in protected areas spread over south Brazil, with the help of a scat detection dog. After species identification by PCR/RFLP and samples spatialization, species distribution modeling was carried out using Maxent software suit. Two protected areas were chosen for a faecal sampling based on transects, in order to estimate the population density. Potential geographical distribution of M. nana in Brazil was stablished at states of Paraná, Santa Catarina, northern and center Rio Grande do Sul, extreme South of São Paulo and Mato Grosso do Sul. Also at Eastern Paraguay and Missiones province in Argentina. Species density at the northern area of Iguaçu National Park was 1.9 ind/km2 and at the State Park of Vila Rica do Espírito Santo was 5.5 ind/km2. The species potential population was 152,991 individuals, including 15,524 individuals inside protected areas. It is suggested to maintain species conservation status as vulnerable on the Brazilian and on the International red list of threatened species.

Introdução: a ação antiestrogênica do tamoxifeno (TAM) é dependente da bioativação à endoxifeno (EDF) e 4-hidroxitamoxifeno (HTF). É bastante provável que sua eficácia terapêutica esteja relacionada ao alcance de um limiar nos níveis de EDF (>5,9 ng mL-1). Entretanto, as concentrações plasmáticas de EDF são altamente variáveis, em parte devido a polimorfismos no gene da CYP2D6 e ao uso de inibidores da enzima. A CYP3A4 também contribui para a formação do EDF e pode ser influenciada por interações medicamentosas e exposição solar. Recentemente, o polimorfismo CYP3A4*22 foi associado à redução da atividade da enzima. Entretanto, pouco se sabe sobre seu impacto na formação do EDF. Objetivo: Em virtude da alta variabilidade na resposta terapêutica e os múltiplos fatores associados ao metabolismo do TAM, o presente estudo objetivou avaliar o efeito dos polimorfismos da CYP2D6 e CYP3A4, interações medicamentosas e exposição à vitamina D na bioativação do TAM. Adicionalmente, dois métodos analíticos para a otimização do tratamento através da medida das razões metabólicas da CYP2D6 e quantificação do TAM e metabólitos em manchas de sangue seco (DBS) foram desenvolvidos. Patientes & métodos: Cento e dezesseis pacientes em tratamento adjuvante com o TAM forneceram amostras de plasma para dosagens do TAM, metabótilos e 25OHD3 no inverno e verão. As concentrações de TAM e metabólitos em plasma e DBS foram medidas por LCMS/ MS. Foram avaliados os genótipos da CYP2D6 e CYP3A4, bem como fenótipos obtidos pelas razões metabólicas determinadas após administração dos fármacos sonda dextrometorfano e omeprazol. As concentrações de vitamina D3 em plasma foram quantificadas por HPLC-UV. Foram obtidas informações sobre uso de inibidores ou indutores das enzimas e suplementação de vitamina D. Resultados: Cerca de 20% das pacientes apresentaram atividade metabólica reduzida para a CYP2D6 e 7% para a CYP3A4. Aproximadamente 30% das metabolizadoras lentas (ML), 56% das metabolizadoras intermediárias (MI) e 11.3% das metabolizadoras rápidas (MR) usavam fármaco inibidor da CYP2D6. As concentrações de EDF diminuiram proporcionalmente à redução da atividade metabólica da CYP2D6 (ML 2,79 ng mL-1, MI 5.36 ng mL-1 e MR 10,65 ng mL-1, P<0.01). A mediana das concentrações plasmáticas de TAM e HTF em pacientes CYP2D6 MI com metabolismo reduzido da CYP3A4 (161,50 ng mL-1 e 1,32 ng mL-1, respectivamente) foram superiores as encontradas nos pacientes CYP2D6 MI com metabolismo funcional da CYP3A4 (122,07 ng mL-1 e 0.61 ng mL-1, respectivamente, P<0.05). Adicionalmente, as concentrações de HTF e TAM foram aproximadamente 50% superiores em pacientes com genótipo CYP3A4*22 em comparação aos pacientes *1/*1. A sazonalidade também contribuiu para a variabilidade das concentrações dos metabólitos ativos, os níveis de EDF foram 24% e HTF 42% superiores no verão. Nas análises de DBS, foi possível identificar 96% dos pacientes com concentrações de EDF abaixo do limiar clínico, indicando seu potencial uso no monitoramento terapêutico do TAM. Conclusão: a CYP3A4 contribui para a bioativação do TAM através da formação de HTF, tornando-se mais importante em condições de atividade diminuída ou ausente da CYP2D6. Os níveis plasmáticos de EDF e HTF demonstraram ser influenciados pela sazonalidade, com aumento significativo no verão. Entretanto o mecanismo relacionado a associação da vitamina D, exposição solar e bioativação do TAM permanecem por ser elucidados. / Background: The therapeutic antiestrogenic effect of tamoxifen (TAM) requires metabolic activation to endoxifen (EDF) and 4-hydroxytamoxifen (HTF). Adequate therapeutic outcome seems to be dependent on the achievement of a threshold of EDF concentration (>5.9 ng mL-1). EDF plasma levels are highly variable among patients, which could be partly explained by polymorphisms in the CYP2D6 gene and the use of enzymes inhibitor drugs. In a lesser extent, CYP3A4 also contributes to EDF formation and can be influenced by drug interactions and sun exposure. From a genetic point of view, a recently described CYP3A4*22 polymorphism has been associated with reduced enzyme activity. However, there is little knowledge about the impact of CYP3A4 polymorphisms on EDF formation. Objective: In view of the large variability on therapeutic response and the multiple factors associated to TAM metabolic activation, the present study aimed to evaluate the effect of CYP2D6 and CYP3A4 polymorphisms, drug interactions and vitamin D exposure on TAM metabolic activation. Additionally, two analytical methods for optimization of TAM treatment by measurement of CYP2D6 metabolic ratios and quantification of TAM and metabolites in dried blood sopts (DBS) were developed. Patients & methods: One hundred and sixteen patients under TAM therapy provided blood samples for measurement of TAM, NDT, EDF, HTF and 25OHD3 at Winter and Summer. TAM and metabolites were measured in plasma and DBS by LC-MS/MS. CYP2D6 and CYP3A4 genotypes and phenotypes, given according to [DMT]/[DTP] and [OME]/[OMS] metabolic ratios after administration of probe drugs, were also evaluated. Vitamine D3 was measured in plasma by HPLC-UV. Data on use of CYP2D6 and CYP3A4 inhibitor or inducer drugs and vitamin D supplementation were recorded. Results: About 20% of patients had reduced CYP2D6 metabolic activity and 7% CYP3A4 impaired metabolism. Approximately 30% of CYP2D6 poor metabolizers (PM), 56% of intermediate metabolizers (IM) and 11.3% of extensive metabolizers (EM) were using CYP2D6 inhibitor drugs. EDF levels diminished proportionally to the reduction of CYP2D6 metabolic activity (PM 2.79 ng mL-1, IM 5.36 ng mL-1 and EM 10.65 ng mL-1, P<0.01). Median plasma levels of TAM (161.50 ng mL-1) and HTF (1.32 ng mL-1) in CYP2D6 IM patients with reduced CYP3A4 metabolism were higher (P<0.05) than those from CYP2D6 IM patients with functional CYP3A4 metabolism (122.07 ng mL-1 and 0.61 ng mL-1, respectively). Indeed, HTF and TAM plasma levels were approximately 50% higher in patients with CYP3A4*22 genotype compared to patients with alleles *1/*1. Seasonality also contributed to EDF and HTF variability, summer concentrations were 24% and 42% higher compared to winter. The DBS method was able to identify 96% of patients with plasma EDF concentrations below the clinical threshold and can be used in therapeutic monitoring of TAM. Conclusion: Our findings suggest that CYP3A4 contributes to the bioactivation of TAM through formation of HTF and becomes increasingly important in conditions of diminished or absent CYP2D6 activity. A significant variability on EDF and HTF exposure related to seasonality was identified, with considerable higher plasma concentrations during summer. The mechanism relating vitamin D status, seasonality and biotransformation of TAM still remains to be elucidated.

As metaloporfirinas (MeP) cloreto de 5,10,15,20-tetra(pentafluorofenill)porfirina de manganês (III) e ferro (III) (MnIIIP e FeIIIP) foram imobilizadas em matriz de sílica híbrida mesoporosa do tipo SBA-15. Os grupos silanóis da SBA-15 foram modificados com (3-aminopropil)trietoxissilano (APTES) e (3-aminopropil)dietoximetilsilano (APDES), que após a imobilização das metaloporfirinas geraram os catalisadores FeP-APSBA, FeP-APMSBA, MnP-APSBA e MnP-APMSBA. Um terceiro tipo de material foi preparado a partir da ligação de grupos trimetilsilil (TMS) nos catalisadores FeP-APSBA e MnP-APSBA, gerando outros dois catalisadores que foram denominados FeP-APSBA-TMS e MnP-APSBA-TMS. Os materiais foram caracterizados por FTIR, RD UV-Vis, TG/TGA MEV, MET e isotermas de adsorção e dessorção de N2 (BET/BJH). Para analisar a natureza da interação solvente-superfície nos materiais, foram determinadas medidas goniométricas de energia livre de superfície. Os catalisadores foram estudados na oxidação dos substratos (Z)-ciclo-octeno e ciclo-hexano, utilizando iodosilbenzeno (PhIO) como espécie doadora de oxigênio a fim de avalia-los como biomiméticos do citocromo P450. Os parâmetros estruturais foram comparados aos resultados catalíticos frente à formação da gaiola de solvente e das espécies intermediárias de alta valência, FeIV(O)P+. e MnV(O)P e estudar como esses fatores afetam o rendimento e a seletividade das reações catalisadas. As MeP-SBAs apresentaram uma faixa de rendimento de 88 a 47 % para epoxidação de (Z)-ciclo-octeno. Já na oxidação de ciclo-hexano houve formação de 2 a 8 % de ciclo-hexanol e 2 % de ciclo-hexanona. Observou-se maior seletividade para o álcool com as FeP-SBAs. / Manganese (III) and iron (III) 5,10,15,20- tetra(pentafluorophenyl) porphyrin (MnIIIP and FeIIIP ) chloride were immobilized in mesoporous silica hybrid matrix SBA-15. Silanol groups were modified with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and (3-aminopropyl)diethoxymethylsilane (APDES), generating catalysts called FeP-APSBA, FeP-APMSBA, MnP-APSBA and MnP-APMSBA. A third type of material was prepared from the binding trimethylsilyl groups (TMS) in FeP-APSBA and MnP- APSBA catalysts generating the other two catalysts named FeP-APSBA-TMS and MnP-APSBA-TMS. The materials were characterized by FTIR , DR UV-Vis , TG/TGA SEM , TEM and adsorption and desorption isotherms of N2 (BET/BJH) and to analyze the materials solvent - surface interaction nature the were determined goniometric measurements of surface free energy. Catalysts were evaluated for (Z)- cyclooctene and cyclohexane oxidation mediated by iodosylbenzene (PhIO) as the oxygen donor species to evaluate their catalytic activity as cytochrome P450 biomimetics. Structural parameters were compared to catalytic results related to cage solvent formation and the intermediate species high valence FeIV(O)P+. and MnV(O) P and how these factors affect the yield and selectivity of catalysts. MeP-SBA\'s reactions showed a range of 88-47 % for epoxidation (Z)-cyclooctene and cyclohexane oxidation yielding 2 to 8 % of cyclohexanol and 2 % of cyclohexanone. In the latter case was observed a higher selectivity for alcohol with FeP-SBA\'s.

Neste trabalho foram investigados sistemas modelos do citocromo P450 para o estudo do metabolismo da monensina A empregando três estratégias de abordagem: a) utilização de metaloporfirinas e complexos salen como catalisadores para a oxidação da monensina A por diferentes oxidantes e meios reacionais; b) utilização de fungos de diferentes cepas para estudos de biotransformação deste antibiótico e c) emprego de microssomas de fígado de ratos e humanos para o estudo do metabolismo in vitro da monensina A. Os produtos obtidos nestes três sistemas foram comparados com os metabólitos formados em estudos in vivo relatados na literatura. Os resultados obtidos com os sistemas envolvendo os catalisadores mostraram que a formação dos produtos é dependente da escolha do meio reacional e do oxidante empregado. Os estudos de biotransformação da monensina A empregando microssomas de fígado e os fungos Aspergillus awamori, Beauveria bassianna, Cunninghamella echinulata, Cunninghamella elegans, Fusarium oxysporum, M61, Mucor rouxii e Penicillium brevicompactum mostraram que estes sistemas são viáveis nos processos de biotransformação deste fármaco nas condições empregadas. Os produtos obtidos nas reações e/ou meios de cultura com os diferentes sistemas foram identificados por espectrometria de massas sequencial e também por comparação com padrões obtidos anteriormente. Foram obtidos três principais metabólitos: (i) 3-O-desmetil-monensina A, (ii) 12-hidroxi-monensina A e (iii) 12-hidroxi-3-O-desmetil-monensina A, os quais coincidem com os principais metabólitos obtidos em estudos in vivo. Assim, os resultados mostraram que os modelos estudados podem ser usados para predizer o metabolismo da monensina A. Os metabólitos 3-O-desmetil-monensina A e 12-hidroxi-monensina A puderam ser produzidos e isolados dos sistemas catalíticos envolvendo a metaloporfirina e o catalisador de Jacobsen. Os ensaios biológicos de atividade tóxica em mitocôndrias, bem como a atividade antimicrobiana da monensina A e de seus metabólitos 3-O-desmetil-monensina A e 12-hidroxi-monensina A mostraram que estes metabólitos possuem menor ou nenhuma atividade nos parâmetros biológicos testados quando comparados à monensina A. Assim, pode-se inferir que o metabolismo da monensina A corresponde a uma via de detoxicação clássica, através da qual as moléculas produzidas são mais polares, dificultando o transporte de complexos catiônicos através das membranas, diminuindo suas propriedades biológicas e facilitando a sua eliminação. / This study used model systems to investigate monensin A metabolism. More specifically, this work employed three strategies: (i) use of biomimetic systems, involving metalloporphyrins and salen complexes, to catalyze monensin A oxidation by different oxidants in distinct reaction media; (ii) application of different fungal strains to conduct biotransformation studies of this antibiotic; and (iii) use of rat and human liver microsomes as a cytochrome P450 model to monitor the in vitro metabolism of monensin A and compare the products with the metabolites generated in in vivo studies reported in the literature. Studies involving chemical catalysts showed that product formation depended on the choice of reaction medium and oxidant. Monensin A biotransformation studies employing fungi revealed that Aspergillus awamori, Beauveria bassianna, Cunninghamella echinulata, Cunninghamella elegans, Fusarium oxysporum, Marine M61, Mucor rouxii, and Penicillium brevicompactum successfully biotransformed the drug under the employed conditions. Liver microsomes also effectively transformed the target compound. Spectrometric analysis of the evaluated models attested to the formation of three main metabolites: (i) 3-O-demethyl monensin A, (ii) 12-hydroxy monensin A, and (iii) 12-hydroxy-3-O-demethyl-monensin A as the main monensin A derivatives. The products were identified by tandem mass spectrometry as well as by comparison with standards obtained in other studies. Taken together, the results demonstrated that the models studied herein could help to predict monensin A metabolismthey produced the main metabolites obtained in in vivo studies. Toxicity tests performed on mitochondria and antimicrobial assays revealed that the metabolites 3-O-demethyl-monensin A and 12-hydroxy-monensin A isolated from the reactions that employed chemical catalysts were less active or inactive as compared with monensin A. Therefore, it was possible to infer that monensin A metabolism is a classical detoxification pathway that generates polar molecules. The transport of such cationic molecules through the membrane is more difficult, decreasing their biological properties and facilitating their elimination.

Reações de O-desmetilação oxidativa estão entre as várias oxidações realizadas pelas enzimas do citocromo P-450. Entretanto, poucos estudos de O-desmetilação catalisadas por enzimas do citocromo P-450 ou modelos químicos baseados em metaloporfirinas sintéticas têm resultado em dúvidas acerca do mecanismo da O-desmetilação destes compostos orgânicos. Neste trabalho, foi estudada a O-desmetilação oxidativa, com PhIO, do benzil metil éter e alguns de seus derivados para substituídos (com os grupos doadores de elétrons -OCH3 e -CH3 e os grupos retiradores -NO2 e -Cl) catalisada pelas Mn(III)P [Mn(TPP)]Cl, [Mn{T(4-N-MePy)P}](PF6)5, [Mn(TMP)]Cl, [Mn(TDCSPP)]Cl e [Mn(TFPP)]Cl para verificar o efeito destes diferentes catalisadores na conversão e seletividade de produtos da O-desmetilação oxidativa e avaliar o efeito dos diversos substituintes citados no mecanismo de O-desalquilação. Inicialmente, realizou-se o estudo das oxidações catalíticas do metil benzil éter. Todas as reações catalisadas pelas MnP se mostram seletivas, sendo que o benzaldeído foi o produto comum a todas as oxidações. A melhor condição encontrada foi 1:50:1224 (catalisador/oxidante/substrato). Em relação às reações com os substratos contendo os substituintes na posição -para, as reações de oxidações catalíticas do p-metóxibenzil metil éter por PhIO não se mostraram tão seletivas quanto as do metil benzil éter, mostrando claramente que o grupo metóxi alterou a reatividade do aril éter original. Mesmo assim, o p-metoxibenzaldeído ainda foi o produto principal, sendo a conversão ao álcool p-metoxibenzílico observada em escala menor. Já com o substrato p-nitrobenzil metil éter, novamente o efeito provocado pelo substituinte na posição para no anel benzênico pôde ser percebida na distribuição final dos produtos, sendo que houve seletividade total para a formação de p-nitrobenzaldeído em detrimento ao álcool p-nitrobenzóico. Em relação aos dois últimos substratos da série proposta, metil p-metilbenzil éter e metil p-clorobenzil éter, de um modo geral, as reações realizadas com o p-clorobenzil metil éter não se mostraram tão seletivas quanto as do metil p-nitrobenzil éter, mostrando que o grupo cloro aumentou a reatividade do cloroéter em relação ao éter com o substituinte nitro- original. Mesmo assim, o p-clorobenzaldeído foi o produto principal, sendo a conversão ao álcool p-clorobenzílico observada em menor escala. Em relação às reações de oxidação do p-metilbenzil metil éter, observou-se que os resultados experimentais são semelhantes aos encontrados para o metil benzil éter. Esses resultados corroboram o principal mecanismo proposto para os sistemas modelo do citocromo P-450 que envolve abstração inicial do átomo de hidrogênio, o mecanismo por recombinação de oxigênio. / O-dealkylation oxidative reactions are among the several oxidations accomplished by the cytochrome P-450 enzymes. However, few studies on O-dealkylation catalyzed by such enzymes or chemical models based on synthetic metalloporphyrins have resulted in doubts concerning the mechanism of these reactions involving organic compounds. In this work, we studied the oxidative O-dealkylation by PhIO of benzyl methyl ether and some of its para-substituted derivatives (with the electron donor groups -OCH3 and -CH3 and the electronwithdrawing groups -NO2 and -Cl) catalyzed by the following Mn(III)P: [Mn(TPP)]Cl, [Mn{T(4-N-MePy)P}] (PF6)5, [Mn(TMP)]Cl, [Mn(TDCSPP)] Cl, and [Mn(TFPP)]Cl. Our aim was to verify the effect of these different catalysts on the conversion yields and product selectivity, as well as evaluate the effect of the several substituents on the ether on the O-dealkylation mechanism. We initially studied the catalytic oxidation of methyl benzyl ether. All the reactions catalyzed by the various MnPs were selective, and benzaldehyde was the product common to all oxidations. The best reaction condition was catalyst/oxidant/substrate molar ration = 1:50:1224. As for the reactions with the substituted substrates, the catalytic oxidation of p-methoxybenzyl methyl ether by PhIO was not as selective as the ones of methyl benzyl ether, clearly showing that the methoxy group affects the reactivity of the original aryl ether. Nevertheless, p-methoxybenzaldehyde was still the main product, being the conversion to p-methoxybenzylic alcohol observed in minor amount. With the substrate p-nitrobenzyl methyl ether, the effect of the electronwithdrawing substituent in the para- position of the aromatic ring could be observed in the final product distribution once again, and total selectivity toward the formation of p-nitrobenzaldehyde to the detriment of p-nitrobenzoic alcohol was observed. In relation to the two last substrates of the proposed series, the methyl p-methylbenzyl and methyl p-chlorobenzyl ethers, the reactions accomplished with p-chlorobenzyl methyl ether were not as selective as the ones carried out with methyl p-nitrobenzyl ether, showing that the chloro group increased the reactivity of the chloro-ether in relation to the ether with the original nitro- substituent. Even so, p-chlorobenzaldehyde was the main product, being the conversion to the p-chlorobenzylic alcohol observed in smaller amount. Concerning the oxidation reactions of p-methylbenzyl methyl ether, the experimental results were similar to those obtained in the case of methyl benzyl ether. These results corroborate the main mechanism proposed for the cytochrome P-450 model systems, which involves initial hydrogen atom abstraction, followed by oxygen rebound.

As enzimas CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9 são responsáveis pelo metabolismo de aproximadamente metade dos 200 medicamentos mais prescritos nos EUA. Padronizamos ensaios de genotipagem baseados na discriminação alélica com o sistema TaqMan® em 198 indivíduos. Para o gene CYP2D6, os alelos *1 e *2 foram os mais freqüentes, seguidos pelos alelos *4, *41, *35, *17, *5, *10, *6, *29 e *9. Desenvolvemos também uma nova metodologia para a determinação do número de cópias do gene CYP2D6. Para o gene CYP2C19, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *17, *2 e *3. Nosso estudo foi o primeiro a determinar a freqüência alélica do gene CYP2C19 no Brasil. Para o gene CYP2C9, o alelo *1 foi o mais frequente, seguido pelos alelos *2 e *3. Desenvolvemos uma metodologia reprodutível e acessível para a genotipagem dos polimorfismos principais dos genes CYP2D6, CYP2C19 e CYP2C9. A identificação precoce de indivíduos suscetíveis a efeitos adversos, bem como de metabolizadores rápidos pode trazer grandes benefícios aos pacientes possibilitando assim uma medicina personalizada. / The enzymes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 metabolize approximately half of the 200 most prescribed drugs in the USA. We standardized genotyping tests based on allelic discrimination, using TaqMan® genotyping system in 198 samples. For the CYP2D6 gene, allele *1 and *2 were the most frequent, followed by alleles *4, *4, *35, *17, *5, *10, *6, *29 and *9. We have also developed a new methodology for determining the copy number variations of the CYP2D6 gene. For the CYP2C19 gene, the allele *1 was the most common, followed by the alleles *17, *2 and *3. In our concern, our study was the first to determine the allele frequency of the CYP2C19 gene in Brazil. For CYP2C9 gene, the allele *1 was the most common followed by the alleles *2 and *3. We developed a methodology reproducible and accessible for genotyping the most important polymorphisms of the genes CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9. The previous identification of individuals at risk to develop adverse drug reactions as well as ultrarapid-metabolizers may bring benefits to the patients, leading to a personalized therapy.

Em face das recentes exigências das agências regulatórias quanto à aprovação de novos fármacos, os estudos de biotransformação têm-se tornado uma etapa indispensável para a identificação e otimização de compostos bioativos. O objetivo desses estudos é identificar, já nas fases iniciais da descoberta de fármacos, candidatos que apresentam propriedades indesejáveis como a (i) presença de metabólitos ativos ou tóxicos; (ii) inibição de enzimas metabolizadoras; (iii) depuração metabólica inadequada, entre outras. Neste estudo, foi realizada a caracterização metabólica e a identificação de possíveis inibidores das enzimas do citocromo P450 de oito promissores candidatos a fármacos, identificados através de ensaios virtuais como inibidores da TcGAPDH, Cruzaina e TcDHODH, todas do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Esses compostos foram testados contra as três principais isoformas do citrocromo P450: CYP 3A4, CYP 2D6 e CYP2C9. Os valores de IC50 de 1,4 &micro;M e 1,3 &micro;M contra a CYP2C9 foram encontrados para os compostos Nequimed53 e Nequimed125, enquanto o Nequimed42 inibiu a CYP 3A4 com um valor de IC50 de 7,12 &micro;M. Posteriormente foi conduzida a caracterização metabólica dos compostos Nequimed53 e 125 com foco na identificação dos principais metabólitos, sítios de metabolismo e vias de biotransformação através da técnica de LC-ESI-QqTOF-MS. Para ambos os compostos, a biotransformação por microssomas extraídos de fígado de ratos deu-se preferencialmente por uma única via dependente de NADPH. No caso do Nequimed54, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de +16, indicando a ocorrência da hidroxilação do composto parental, enquanto que para o composto Nequimed125, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de -28, condizente com a perda de um fragmento etila do composto parental. / In the light of recent demands from regulatory agencies for the acceptance of new drugs, the biotransformation studies have become an essential step for the identification and optimization of bioactive compounds. The objective of these studies is to identify compounds that have undesirable properties such as (i) the presence of toxic or active metabolites, (ii) inhibition of metabolizing enzymes, (iii) excessive metabolic clearance, inter alia. In this study we characterized the metabolism and cytochrome P450 inhibition of eight compounds identified by virtual screening as inhibitors of TcGAPDH, Cruzain and TcDHODH which are of interest as targets for intervention in treatment of Chagas Disease. These compounds were tested against cytochrome P450 isoforms 3A4, 2D6 and 2C9. IC50 values of 1.4 &micro;M and 1.3 &micro;M against CYP 2C9 were observed for Nequimed53 and Nequimed125.while Nequimed42 inhibited CYP 3A4 with an IC50 of 7.1 &micro;M. Subsequently, we characterized the in vitro metabolism of Nequimed53 and 125 with a focus on metabolite identification and biotransformation pathways using the LC-ESI-MS-QqTOF technique. For each, the biotransformation by rat liver microsomes occurred by a single NADPH-dependent pathway. For Nequimed54, the observed metabolite [M+16]+ indicated hydroxylation of parent compound. The metabolite [M-28]+ observed for Nequimed125 indicated desethylation of the parent compound.

Orientadores: Luis Otavio Zanatta Sarian, Maria Salete Costa Gurgel, Carmem Silvia Passos Lima / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CardosoFilho_Cassio_D.pdf: 1685855 bytes, checksum: 341644d7cc011e51bf31d1f4881e8878 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: A terapêutica sistêmica para o câncer de mama envolve o uso do agente antiestrogênico tamoxifeno, fármaco metabolizado pelo fígado no sistema do citocromo P-450 (CYP). Este, por sua vez, é parcialmente codificado pelo gene CYP1A1, e alguns polimorfismos deste gene têm sido associados com interferências na sua eficácia metabólica. Além disso, diferenças interindividuais no CYP explicam parte das variações na resistência ao tamoxifeno e metabolismo dos estrogênios. Dentre esses polimorfismos, o A4889G (M2) e o T6235C (M1) são conhecidos por afetar a ativação da estrona e do estradiol, e por provocar a redução da concentração de metabólitos altamente ativos do tamoxifeno, reduzindo teoricamente o efeito antiestrogênico desta modalidade de hormonioterapia no tecido mamário. Embora plausíveis do ponto de vista biológico, as implicações clínicas dos polimorfismos do CYP1A1, ou seja, as características patológicas dos tumores e um pior prognóstico decorrente do aumento dos estrógenos circulantes e redução dos metabólitos ativos do tamoxifeno, não foram ainda avaliadas. Objetivo: Avaliar a associação entre os polimorfismos M1 e M2 do gene CYP1A1 e as características patológicas e clínicas de mulheres com câncer de mama esporádico, em duas abordagens: 1) determinar as associações entre estes polimorfismos e as características patológicas, clínicas e o padrão de sobrevida global em mulheres com câncer de mama esporádico e 2) determinar as associações entre estespolimorfismos e as caracteríasticas patológicas e o comportamento clínico de tumores de mama com receptores hormonais positivos na vigência do uso de tamoxifeno. Métodos: foram incluídas 741 mulheres com câncer de mama esporádico, 405 das quais com tumores positivos para receptores esteroides e que usaram tamoxifeno como terapia antiestrogênica primária, para as quais os dados referentes a cinco anos de seguimento estavam disponíveis. Foram avaliadas as associações de informações-chave patológicas e clínicas, incluindo a sobrevida geral em cinco anos, com as diferentes combinações de polimorfismos do gene CYP1A1. Resultados: Em mulheres portadoras de ambos os polimorfismos M1 e M2 do CYP1A1, a proporção de tumores grau histológico III (80,3%) foi significativamente menor que nas não-portadoras (89,6%); p ajustado <0,01. O mesmo ocorreu na análise restrita às mulheres com tumores RE+ usando tamoxifeno (76,1% vs. 85,9%; p ajustado= 0,02). Após 60 meses de seguimento, cerca de 75% das mulheres estavam vivas. Não houve diferença significativa na sobrevivência relacionada com o estado do gene CYP1A1. Conclusões: embora associados a tumores de menor grau histológico, não há nenhuma evidência da associação dos polimorfismos do CYP1A1 com prognóstico do câncer da mama / Abstract: Introduction: systemic therapy for breast cancer involves the use of the anti-estrogen agent tamoxifen, which is metabolized by the liver cytochrome P-450 (CYP). This, in turn, is partially encoded by CYP1A1, and some polymorphisms of this gene have been associated with metabolic disturbance at their effectiveness. Moreover, interindividual differences in efficiency of CYP explain part of the variations in resistance to tamoxifen and estrogen metabolism. Among these polymorphisms, the A4889G (M2) and T6235C (M1) are known to affect the activation of estrone and estradiol, and cause the reduction of the concentration of highly active metabolites of tamoxifen, theoretically reducing the anti-estrogenic effect of this form of endocrine therapy in breast tissue. Although plausible from the biological point of view, the clinical implications of polymorphisms of CYP1A1, ie, the pathologic features of tumors and a worse prognosis due to increased circulating estrogens and reduction of active metabolites of tamoxifen have not yet been evaluated. Objectives: To evaluate the association between CYP1A1 A4889G and T6235C gene polymorphisms and clinical and pathological characteristics of women with sporadic breast cancer in two approaches: 1) determine the associations between CYP1A1 A4889G and T6235C gene polymorphisms and the pathological characteristics of the tumors, and the clinical features, including overall survival, of women with sporadic breast cancer and 2) determine the associations between CYP1A1 A4889G and T6235C gene polymorphisms and the pathological characteristics and clinical behavior of estrogen receptor-positive breast tumors in patients using tamoxifen. Methods: We included 741 women with sporadic breast cancer, 405 of whom had tumors positive for steroid receptors and using tamoxifen as primary antiestrogen therapy, for which data on five years of follow-up were available. We evaluated the associations of key pathological and clinical features, including overall survival at five years, with different combinations of the CYP1A1 gene polymorphisms. Results: In women with both polymorphisms of the CYP1A1 gene, the proportion of grade III tumors (80.3%) was significantly lower than in non-carriers (89.6%), adjusted p <0.01. The same was true for women with ER + tumors using tamoxifen (76.1% vs. 85.9%; adjusted p = 0.02). After 60 months of follow up, 75% of the women were alive. There was no significant difference in survival related to the state of the CYP1A1 gene. Conclusions: Although associated with tumors of lower grade, there is no evidence of an association of CYP1A1 polymorphisms with breast cancer prognosis / Doutorado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Doutor em Ciências Médicas

O desenvolvimento testicular e a manutenção da espermatogênese são controlados por gonadotrofinas e testosterona, cujos efeitos são modulados por uma rede complexa de fatores produzidos localmente e, entre eles, os estrógenos estão em causa. Uma compreensão da dinâmica dos hormônios esteroides sexuais mostra-se importante para revelar as funções durante o desenvolvimento testicular. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo aprofundar os conhecimentos sobre a espermatogênese do Galea spixii, associando a atuação das enzimas do complexo citocromo P450: P450 aromatase e P450c17 (17-&#945;-hidroxilase/17,20-liase) importantes para a biossíntese de hormônios ligados à reprodução durante o desenvolvimento sexual pós-natal. Fragmentos de testículos de preás machos nas fases impúbere, pré-púbere, púbere e pós-púbere foram coletados no Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semiárido, Mossoró, RN, fixados em Paraformoaldeido 4% e RNAlater, e processados para Imunohistoquímica e PCR em tempo real. A expressão gênica das enzimas esteroidogênicas foram cruciais da prépuberdade para a puberdade. Durante as fases do desenvolvimento sexual a enzima P450c17 apresentou imunomarcação positiva apenas nas células de Leydig. A imunomarcação da enzima P450 aromatase foi positiva em diferentes tipos celulares ao longo do desenvolvimento sexual. A síntese de estrógenos no parênquima testicular não ficou restrita às células somáticas, as células germinativas também mostraram capacidade de converter andrógenos em estrógenos / The testis development and maintenance of spermatogenesis are controlled by gonadotropins and testosterone, whose effects are modulated by a complex factor locally produced, and the estrogens are involved. An understanding of the dynamics of sex steroid hormones shown to be important to reveal the functions during testicular development. Thus, the aimed was study the spermatogenesis of Galea spixii, associating the performance of cytochrome P450 complex: P450 aromatase and P450c17 (17-&#945;-hydroxylase / 17,20-lyase) important for the biosynthesis of hormones related to reproduction during postnatal sexual development. Fragments of testes of immature, prepubertal, pubertal and post-pubertal were collected at Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semiárido, Mossoró, RN, fixed in Paraformaldehyde 4% and RNAlater, processed for immunohistochemistry and real time PCR. The steroidogenic enzymes gene expression were significant from prepubertal to pubertal stage. Cytochrome P450c17 expression in testicular parenchyma showed a positive reaction only in Leydig cell clusters. The expression of cytochrome P450 aromatase in testicular parenchyma were different during the sexual development of Galea spixii. During sexual development was observed that estrogen synthesis was not restricted to somatic cells (Leydig cells / Sertoli cells), the germ cells have also shown to be capable to convert androgens into estrogens via aromatase