O mutante redA de Dictyostelium discoideum, obtido por inativação gênica aleatória, tem crescimento aparentemente normal, porém seu ciclo de desenvolvimento não progride além do estágio de agregados compactos. Neste trabalho relatamos a caracterização deste mutante, cujo gene defeituoso codifica a enzima NADPH citocromo P450 redutase (NCPR). O principal papel desta enzima é transportar elétrons do NADPH para as várias isoformas do citocromo P450. Um cDNA de 2094 pb que codifica a NCPR de D. discoideum (DdNCPR) foi isolado através da varredura de uma biblioteca de cDNA com uma sonda derivada de um fragmento do gene inativado no mutante redA. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida do cDNA DdNCPR revelou que esta codifica uma proteína de 631 aminoácidos com 31% de identidade e 50% de similaridade com a NCPR humana. Verificamos o acúmulo do mRNA da DdNCPR durante fase de crescimento mas durante as fases iniciais do desenvolvimento ocorre significativa diminuição em seus níveis até a formação dos agregados compactos onde o mRNA da NCPR não é detectável. Demonstramos que o gene que codifica a NCPR aparentemente está presente em uma única cópia no genoma de Dictyostelium. Ademais, a análise de outras linhagens mutantes nocautes do gene da NCPR confirmaram que a inativação deste gene está diretamente relacionada ao fenótipo exibido pelo mutante redA-. Contudo, é provável que um ou mais produtos gênicos possam complementar a ausência desta enzima, uma vez que nem a linhagem redA nem as outras linhagens nocautes do gene da NCPR apresentaram alteração na taxa de crescimento e, em algumas circunstâncias experimentais, não exibiram qualquer alteração no ciclo de desenvolvimento. Nossos resultados sugerem, ainda que o bloqueio do desenvolvimento eventualmente observado no mutante redA pode ser devido a um provável papel da NCPR no metabolismo de DIF-1 (fator indutor de diferenciação-1), que parece desempenhar um papel primordial no controle da diferenciação de células pré-talo e células pré-esporo durante o desenvolvimento de D. discoideum. / The Dictyostelium discoideum redA mutant, obtained by random gene inactivation, exhibits normal growth but has its developmental cycle impaired at tight mound stage. In this study we describe the characterization of this mutant whose defective gene encodes the enzyme NADPH cytochrome P450 reductase (NCPR). NCPR is known to play an essential role in the transfer of reducing equivalents from NADPH to various cytochrome P450 isoforms. We isolated a 2094 bp cDNA that encodes D. discoideum NCPR (DdNCPR) by screening a cDNA library using as probe the mutated gene fragment rescued from redA cells. Analysis of the deduced aminoacid sequence of DdNCPR cDNA shows that it encodes a 631 aminoacid protein with 31% of identity and 50% of similarity with human NCPR. Northern blot analysis showed that DdNCPR mRNA levels is maximum during growth phase and decreases at early stages of the development. After slug stage this mRNA is not detectable. D. discoideum has a single copy of NCPR gene and, as shown by analysis of other NCPR knockout mutants, inactivation of this gene is strongly correlated to the redA phenotype. However, redA, as well as the other NCPR knockout strains, do have growth alterations and in some circumstances they do not show the described developmental defects. Thus, it is possible that one or more proteins be able to compensate for the lack of NCPR in these mutants. Our results also suggest that the redA developmental phenotype might play a role of NCPR on the metabolism of DIF-1, a prime candidate for controlling prestalk and prespore cell differentiation during D. discoideum development.

Verificou-se que microssomos de fígado apresentam uma atividade azo-redutásica completamente dependente de NADPH, usando DAB como substrato. Ao contrário de outros sistemas já descritos, a atividade azo-redutásica não pode ser identificada com a NADPH-citocromo c redutase, embora nossos resultados indiquem que esta enzima participa da reação. Não se pode excluir definitivamente a participação do citocromo b5 apesar de uma série de observações afastando essa possibilidade. Verificou-se que a atividade azo-redutásica pode ser induzida por tratamento com 3-MC, paralelamente à indução do citocromo P-450 tipo II. Isto sugere fortemente a participação desse citocromo na reação apesar desta não ser inibida por CO. O citocromo P-450 induzido por tratamento com 3-MC era funcionalmente ativo. A atividade azo-redutásica foi inibida especificamente pelo tratamento oral comoDAB, possibilitando a formulação de uma hipótese sobre a ação carcinogênica deste composto. Uma série de resultados mostra que a azo-redutase estudada é altamente específica podendo ser inibida por KCN e por mersalil. Face aos fatos expostos acima, as perspectivas do sistema parecem muito interessantes. A possibilidade do uso de novos métodos de fracionamento dos microssomos pode levar à resolução do sistema da azo-redutase. As semelhanças com a dessaturação de ácidos graxos, aliadas às indicações da existência de um novo tipo de citocromo P-450 que se combina com KCN, permitem descortinar maior amplitude para os limites do sistema da azo-redutase. Enfim, trata-se de uma reação de redução de um composto exógeno, com características até agora não relatadas, envolvendo processos biológicos de importância e cujo estudo terá prosseguimento. / Not available

Estudos de citogenética comparativa são rotineiramente desenvolvidos a partir da comparação dos padrões de bandamentos cromossômicos. Contudo, quando se trata de espécies que apresentam genomas altamente rearranjados, como no caso das espécies de Akodon, ou que são muito divergentes, a comparação de cromossomos por padrões de bandas torna-se inadequada. Como consequência, a pintura cromossômica tem se tornado o método de escolha assertivo, já que permite comparação genômica no nível citogenético. Nessa tecnologia sondas de um cromossomo inteiro de uma determinada espécie são hibridadas in situ em cromossomos de outra espécie, detectando as regiões homólogas entre os genomas. No presente estudo comparamos os cariótipos altamente diferenciados de algumas espécies de Akodon por meio de pintura cromossômica recíproca com uso de sondas espécie-específicas, obtidas a partir de cromossomos separados por citometria de fluxo. Os resultados revelaram homologia completa entre os complementos de Akodon sp. n. (ASP), 2n=10, A. cursor (ACU), 2n=15, A. montensis (AMO), 2n=24 e A. paranaensis (APA), 2n=44 e evidenciaram com precisão muitos rearranjos cromossômicos entre os complementos das espécies. Rearranjos Robertsonianos e em tandem, inversões pericêntricas e/ou reposicionamento de centrômero, inversão paracêntrica, translocações, inserções e existência de sítios frágeis nos complementos foram observados. A pintura cromossômica empregando o conjunto de sondas de APA para 21 autossomos mais cromossomos X e Y evidenciou oito segmentos sintênicos compartilhados entre A. montensis, A. cursor e Akodon sp. n., cinco associações exclusivas para A. cursor e seis para Akodon sp. n. Foi também detectada homologia completa dos cromossomos X, com exceção da região heterocromática de ASP X, e até mesmo dos cromossomos Y que geralmente não apresenta sinal hibridação entre diferentes espécies de mamíferos. Esses dados indicam que essas espécies intimamente relacionadas passaram por um processo recente de intensa diferenciação autossômica, no qual se conservou a homologia total, por exceção de Akodon sp. n., entre os cromossomos sexuais. Pertencente a tribo Akodontini, Deltamys Thomas 1917 é um táxon pouco estudado e que é raramente capturado. Utilizando-se de caracteres morfológicos ou genéticos, alguns autores consideram Deltamys como um gênero pleno enquanto outros acreditaram que esse devesse ser referido como subgênero ou sinônimo de Akodon. A única espécie formalmente descrita é Deltamys kempi que apresenta cariótipo básico com 2n=37 nos machos e 2n=38 nas fêmeas, NF=38, com sistema de determinação de sexo do tipo X1X1X2X2: X1X2Y. Uma característica citogenética que distingue Deltamys de Akodon é a presença de um pequeno par metacêntrico marcador em Akodon. Um cariótipo com 2n=40 e NF=40; XX: XY foi relacionado ao gênero Akodon porém, como em Deltamys kempi , esse complemento não apresenta o pequeno par metacêntrico. As análises filogenéticas de máxima parcimônia e máxima verossimilhança baseadas em sequências do gene mitocondrial do citocromo b evidenciaram o monofiletismo dos espécimens de Akodon sp. 2n=40, e o monofiletismo de Deltamys kempi. Além disso, revelaram que Akodon sp. é grupo irmão de Deltamys kempi, estando mais relacionado a este último gênero do que às demais espécies de Akodon, sugerindo a inclusão dos espécimens portadores do cariótipo com 2n=40 em Deltamys. Dessa forma, o gênero Deltamys se mostrou mais diverso do que até então se tinha conhecimento, agrupando duas linhagens: Deltamys kempi , 2n=37-38 ; X1X1X2X2: X1X2Y e Deltamys sp. 2n=40, XX: XY, que apresentam entre sí uma marcante divergência genética que chega a 12, 1%. Um cariótipo com 2n=50, NF=48 foi descrito para espécimes de Thaptomys Thomas,1916, coletados em Una, estado da Bahia, Brasil, que são indistinguíveis morfologicamente dos Thaptomys nigrita que apresentam 2n=52, NF=52, encontrados em outras localidades brasileiras. Foi então proposto que esse novo cariótipo com 2n=50 pertencesse a uma espécie críptica de Thaptomys nigrita, uma vez que os rearranjos cromossômicos observados somados a distância geográfica pode representar uma barreira reprodutiva entre as duas formas. Com o intuito de se estabelecer as relações entre indivíduos de Thaptomys com os dois números diplóides, análises filogenéticas moleculares foram realizadas com o uso de dezoito sequências do gene mitocondrial do citocromo b provenientes de espécimes cariotipados coletados ao longo da distribuição geográfica do gênero. Dois clados principais, Nordeste (A) que agrupa espécimens com 2n=50 e Sudeste (B) que agrupa espécimes com 2n=52, foram recuperados por análises de máxima parcimônia e máxima verossimilhança. As relações filogenéticas intra-genéricas corroboram os distintos números diplóides, e mostram os cariótipos com 2n=50 e 2n=52 como clados irmãos entre si separados pela cladogênese basal de Thaptomys . No presente trabalho são apresentados estudos de filogenia molecular e citogenética para o gênero monotípico de roedor fossorial Blarinomys Thomas 1896. Foram realizadas análises de máxima parcimônia e máxima verossimilhança com base em sequências do gene mitocondrial citocromo b , para amostra de 11 exemplares de B. breviceps provenientes de nove localidades de quatro estados do território brasileiro. Todas as topologias recuperaram duas linhagens principais: um clado Nordeste (A) e outro Sudeste. O clado sudeste agrupou dois clados irmãos, B e C. A divergência de sequência entre os indivíduos variou de: 4,7- 8,0% entre os clados nordeste e sudeste; 4,3-5,7% entre os clados B e C; 6,1-8,0% entre os clados nordeste; e B, e 4,7-6,4% entres os clados nordeste e C. Dentro dos clados a divergência variou de 0- 4,2% no clado nordeste, foi de 0,7% no clado B, e variou de 0,1- 1,3% no clado C. Variação entre espécimes da mesma região geográfica foi de 0-1,3%. Os estudos de citogenética de cinco exemplares revelaram alta diversidade cariotípica com cinco números diplóides distintos: 2n=52 (48A+2Bs, XY), 2n=43 (37A+4Bs, XX), 2n=37 (34A+1B, XY), 2n=34 (32A, XX) e 2n=31 (27A+2Bs, XX) e mesmo número de braços autossômicos (NF=50), excluindo-se os cromossomos sexuais e os supernumerários. Foram observados polimorfismos decorrentes de rearranjos Robertsonianos, além de variação de 0 a 4 cromossomos Bs, que são heterogêneos quanto a morfologia, constituição de heterocromatina e presença de sinais teloméricos intersticiais (ITS). ITS também foram observados na região pericentromérica de alguns pares autossômicos com dois braços em três dos exemplares. Foi realizada pintura cromossômica com sonda do cromossomo X de Akodon cursor (ACU X). Nossos dados revelaram uma diversidade até então desconhecida para Blarinomys , mostrando duas linhagens distintas correspondentes a regiões na Mata Atlântica e um extraordinário polimorfismo cromossômico. / Traditionally comparative cytogenetic studies are based mainly on banding patterns. Nevertheless, when dealing with species with highly rearranged genomes, as in Akodon species, or with other highly divergent species, cytogenetic comparisons of banding patterns prove to be inadequate. Hence, comparative chromosome painting has become the method of choice for genome comparisons at the cytogenetic level, since it allows complete chromosome probes of a species to be hybridized in situ onto chromosomes of other species, detecting homologous genomic regions between them. In the present study, we have explored the highly rearranged complements of the Akodon species using reciprocal chromosome painting through species-specific chromosome probes obtained by chromosome sorting. The results revealed complete homology among the complements of Akodon sp. n. (ASP), 2n=10, A. cursor (ACU), 2n=15, A. montensis (AMO), 2n=24 and A. paranaensis (APA), 2n=44 and extensive chromosome rearrangements have been detected within the species with high precision. Robertsonian and tandem rearrangements, pericentric inversions and/or centromere repositioning, paracentric inversion, translocations, insertions and fragile sites were observed. The chromosome painting using the APA set of 21 autosomes plus X and Y exhibited eight syntenic segments that are shared with A. montensis, A. cursor and Akodon sp. n. plus five exclusive associations for A. cursor and six for Akodon sp. n. Chromosomes X, except for the heterochromatin region of ASP X, and even chromosome Y that often present no hybridization signal when hybridized between species of mammals, shared complete homology among the species. These data indicate that all those closely related species have experienced a recent intensive process of autosomic differentiation, in wich, there is still complete maintenance, except for chromosome X of Akodon sp. n., of the sex chromosomes homologies. Member of the tribe Akodontini, Deltamys Thomas 1917 is a poorly studied and rarely collected taxon. Based on morphological or genetic characters, some authors considered Deltamys as a full genus while others regarded it as subgenus or synonym of Akodon. The single described species, Deltamys kempi presents a basic karyotype with 2n=37 in males and 2n=38 in females, FN=38, and with sex determination system of the type X1X1X2X2: X1X2Y. A cytogenetic character that distinguishes Deltamys from Akodon is the presence of a small metacentric pair marker in Akodon. A karyotype with 2n=40 and FN=40; XX: XY was related to the genus Akodon, but as in Deltamys kempi, this complement does not present the small metacentric pair. Phylogenetic analyses of maximum parsimony and maximum likelihood based on sequences of the mitochondrial gene cytochrome b evidenced the monophyly of a clade grouping specimens of Akodon sp. 2n=40 and monophyly of a clade containing specimens of Deltamys kempi. Besides that, the analyses showed that Akodon sp. is the sistergroup of Deltamys kempi, thus more related to this genus than to other species of Akodon and suggesting the placement of specimens with 2n=40 Deltamys. The genus Deltamys is, thus, more diverse than previously thought, grouping two lineages: Deltamys kempi, 2n=37-38 ; X1X1X2X2: X1X2Y and Deltamys sp. 2n=40, XX: XY, with a marked genetic divergence of 12,1% between them. A karyotype with 2n=50, FN=48 has been described for specimens of Thaptomys Thomas, 1916 collected at Una, State of Bahia, Brazil, which are morphologically indistinguishable from Thaptomys nigrita with 2n=52, FN=52 found in other Brazilian localities. It has been hence proposed that this new karyotype with 2n=50 could belong to a distinct species, cryptic of Thaptomys nigrita, once chromosome rearrangements observed along with the geographic distance could represent a reproductive barrier between both forms. Molecular phylogenetic analyses using the cytochrome b sequences of eighteen karyotyped specimens of Thaptomys were performed attempting to establish the relationships among the individuals along the geographic distribution of the genus. Two major clades, Northeastern (A) with specimens with 2n=50 and Southeastern (B) with specimens with 2n=52, were reconstructed by maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML). The intra-generic relationships recovered by phylogenetic analyses corroborated the distinct diploid numbers. The 2n=50 and 2n=52 karyotypes appeared as monophyletic separated by the basal cladogenesis of the genus, sister-group to each other. We present molecular phylogenetic and cytogenetic data on the monotypic fossorial rodent genus Blarinomys . Maximum parsimony and maximum likelihood based on cytochrome b gene sequences were performed for a sample of 11 individuals from nine localities of four states of Eastern Brazil. All topologies recovered two main lineages: a Northeastern (A) and a Southeastern clade. The Southeastern grouped two sister-clades B and C. Sequence divergence between individuals ranged from 4.7-8.0% between northeastern and southeastern clades, from 4.3-5.7% between clades B and C, from 6.1-8.0% between clades northeastern and B, and from 4.7-6.4% between clades northeastern and C. Within the clades, divergence varied from 0- 4.2% in the northeastern clade, was 0.7% in the clade B, and varied from 0.1- 1.3% in clade C. Variation among specimens from the same geographic regions ranged from 0-1.3%. Cytogenetic studies of five individuals revealed high karyotypic diversity with five distinct diploid numbers: 2n=52 (48A+2Bs,XY) from state of Bahia, and 2n=43 (37A+4Bs,XX), 2n=37 (34A+1B,XY), 2n=34 (32A,XX), and 2n=31 (27A+2Bs,XX) from state of São Paulo; and same number of autosomic arms (FN=50) excluding sex chromosomes and supernumeraries. Polymorphisms are due to Robertsonian rearrangements, in addition to the variation from none to four B chromosomes, which are heterogeneous regarding morphology, heterochromatin constitution and presence of interstitial telomeric signals (ITS). ITSs were also observed in the pericentromeric regions of some biarmed autosomic pairs of three specimens. Our results revealed a high unknown diversity for Blarinomys , showing two distinct lineages corresponding to regions of the Atlantic Rainforest, besides an extraordinary chromosomal polymorphism.

A astaxantina (AST) é um carotenóide derivado do β-caroteno produzido por algas e cianobactérias, mas que também pode ser encontrada em animais marinhos. Em animais, é reportada como interceptadora de radicais de oxigênio mais eficiente que o β-caroteno. O objetivo central dessa dissertação foi avaliar a capacidade antioxidante da AST em lipossomos enriquecidos com citocromo c (cit c) desafiados com 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), um doador de óxido nítrico, em diferentes microambientes (pH e composição das vesículas). Diferenças na interação destas vesículas com o cit c periférico, com reflexos na atividade antioxidante da AST também foram avaliadas. O SIN-1 gera, por termólise, quantidades equimolares de radical superóxido e óxido nítrico, quando há oxigênio no meio. Vesículas unilamelares de fosfatidilcolina (PC), PC contendo 5% ou 10% de fosfatidilglicerol (PG), com ou sem AST, foram incubadas com SIN-1 e/ou cit c. Medidas do índice de lipoperoxidação pelo teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) revelaram que SIN-1 não causa aumento de TBARS, enquanto o cit c foi capaz de aumentar significativamente este índice. Este fato pode ser explicado pela atividade peroxidásica do cit c. Apenas em vesículas de PCPG10%, ao realizar a incubação do cit c concomitantemente com SIN-1, o índice de TBARS foi maior ao observado em vesículas incubadas apenas com cit c. É conhecido que a interação entre cit c e membranas aniônicas pode alterar a conformação da proteína, aumentando sua atividade peroxidásica. A presença da AST fez com que os índices de lipoperoxidação chegassem a valores próximos aos do controle. A alteração no pH do meio revelou que a AST possui ação antioxidante mais pronunciada em pHs 7,4 e 8,0, em comparação com pHs levemente ácidos. A presença de PG evidenciou ainda mais esta tendência e em pH 6,2, a AST apresentou inclusive pequena atividade próoxidante. Estes resultados podem ser discutidos à luz de alterações da permeabilidade da membrana e da reatividade de espécies reativas induzidas por mudanças da fluidez e de pH. O efeito dos produtos gerados por SIN-1 sobre o cit c foi estudado em condições de normóxia e hipóxia. Resultados de EPR e de fluorescência demonstram que a presença do radical superóxido previne lesões oxidativas causada por peróxido orgânico (t-butOOH) tanto no cit c quanto nas membranas, pois é capaz de reduzir o ferro hemínico do cit c. Através de CD e espectrofotometria UV-Vis e EPR, foi observado que a incubação com SIN-1 promove alterações estruturais no cit c causando ruptura na sexta coordenação do ferro hemínico, levando à geração de uma espécie de cit c com rombicidade menor em comparação ao cit c nativo e que apresenta maior atividade peroxidásica. Este trabalho contribui com informações para entendimento do mecanismo antioxidante da AST em diferentes microambientes, além de demonstrar o efeito paradoxal do superóxido que é capaz de proteger o cit c, através da redução do ferro hemínico, mas também pode expor a proteína à oxidação promovida por peroxinitrito. / Astaxanthin (AST) is a β-carotene derived carotenoid, produced by algae and cyanobacteria, but can also be found in marine animals. In phytoplankton it has the function to absorb light radiation for photosinthesys occurence. In animals AST acts as a scavenger of oxygen free radicals, even more efficiently than β-carotene itself. The main objective of this work is to evaluate the antioxidant capacity of AST over cytochrome c (cyt c) incorporated in liposomes and challenged with 3-morpholinosidnonimine (SIN-1), a nitric oxide donor, under different experimental conditions, namely vesicles composition and pH. Distinct interactions between cyt c and vesicles affecting the AST antioxidant activity were also evaluated. SIN-1 spontaneously generates equal amount of nitric oxide and superoxide anion when oxygen is present. Unilamellar vesicles made from phosphatidylcholine (PC) or PC with 5% or 10% of phosphatidylglycerol (PG), with or without AST, were incubated with SIN-1 and/or cyt c. The extent of lipid peroxidation was evaluated by the classical method of thiobarbituric reactive substances (TBARS). Control experiments with SIN-1 alone showed no increase in TBARS content, whereas cyt c significantly increased TBARS. Concomitant addition of cyt c, SIN-1 to PCPG10% vesicles led to lipid peroxidation indices even higher than those found when cyt c was incubated with PCPG10% vesicles. A peroxidase activity of cyt c resulting from the interaction between this protein and anionic membranes can explain this result. In this system, the presence of AST inhibited formation of TBARS, whose levels were near the control values. Astaxanthin was found to exhibit a more effective antioxidant capacity under basic pH (7.4 and 8.0), in comparison with pH 6.2 and 6.8. In the presence of PG, this trend became more evident. Interestingly, at pH 6.2, AST showed a slight pro-oxidant activity. These results can be explained by differences in membrane permeability and reactivity of reactive species, caused by pH and membrane fluidity alterations. The effects of products of SIN-1 decomposition on cyt c structure and its peroxidase activity were investigated under hypoxia and normoxia. EPR and fluorescence experiments revealed that superoxide anion radical, due to its ability to reduce heme iron, prevents oxidative damage of cyt c and membrane lipids by peroxide-derived free radicals. By means of CD and UV-Visible spectroscopy, we have found that concomitant incubation of SIN-1 and cyt c promoted structural alterations in the protein which changes the irons sixth axial coordination, leading to generation of a less rhombic cyt c, which is reportedly a better peroxidase than native cyt c. This work contributes with information aiming to better understand the antioxidant mechanism of AST under different membrane microenvironments and unveil a paradoxal effect of superoxide ion, which can protect cyt c from oxidative lesions by transferring electron to ferricyt c, but can also expose cyt c to oxidation by peroxynitrite.

A atividade biológica de aldeídos α,Β-insaturados tem sido associada a diversos processos incluindo regulação gênica, envelhecimento Alzheimer e disfunções mitocondriais. Neste trabalho investigamos a formação de adutos do trans,trans-2,4-decadienal (DDE), um aldeído produzido endogenamente e presente como contaminante em alimentos e água, em lisina, histidina e citocromo c. Avaliamos também alterações na função de mitocôndrias de fígado de rato expostas ao aldeído. As análises por espectrometria de massas, LC-ESI/MS, indicaram a formação de diversos tipos de adutos de DDE nos aminoácidos lisina e histidina, entre eles bases de Schiff e enaminas. Os resultados obtidos por espectrometria de massas, MALDI-Tof, indicaram a formação de adutos de DDE formados via base de Schiff de maneira concentração do aldeído, tempo e pH dependentes. As análises da proteína digerida por ESI-Q-ToF, indicaram que os adutos foram formados nos resíduos H-33, K-39, 72 e 100, localizados em regiões ricas em resíduos básicos, cuja interação com membranas e citocromo e oxidase tem sido postulada. Observamos também o deslocamento da banda Soret (λ = 409 nm) e o desaparecimento da banda em λ = 695 nm, relativa a coordenação do sexto ligante do grupo heme (M-80). Este fenômeno está associado a abertura da cavidade do grupo heme e o deslocamento do ligante, indicando alterações nas estruturas secundária e terciária da proteína. Os experimentos realizados com mitocôndrias isoladas indicaram que DDE promove danos à membrana interna mitocondrial, demonstrando i pelo aumento no consumo de O2 em mitocôndrias em estado 4. Em decorrência destas lesões observamos também o intenso inchamento mitocondrial, indicado por experimentos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica de transmissão. O inchamento não foi bloqueado por ciclosporina A, um inibidor do poro de transição mitocondrial. DDE também induziu a perda do potencial de membrana da organela, demonstrado pelo monitoramento do indicador fluorescente safranina O e aumento da peroxidação lipídica atestado pela quantificação de malondialdeido (MDA). Estes resultados indicam que DDE promove alterações estruturais no citocromo e podendo levar ao comprometimento da atividade da proteína, além de promover alterações em parâmetros mitocondriais, indicando um possível envolvimento na disfunção mitocondrial promovida por estresse oxidativo. / Lipid hydroperoxide-derived α,β-unsaturated aldehydes are involved in several cellular processes such as gene expression, aging, Alzheimer disease and mitochondrial dysfunction. In this work we have investigated adduct formation in lysine, histidine and cytochrome c by trans,trans-2,4-decadienal (DDE), an endogenously lipoperoxidation product. DDE is also a widespread environment aldehyde found, for example, in food and as a contaminant in water. Alterations in rat liver mitochondrial parameters such as oxygen consumption, membrane potentials, swelling and lipoperoxidation were also investigated. LC-ESI/MS experiments indicated that DDE react with aminoacids lysine and histidine producing adducts. In addition, MALDI-TOF experiments indicated increases in the molecular weight of cytochrome c consistent with the formation of DDE adducts via the Schiff base mechanism. Our data shows that the protein modification was time, pH and DDE-concentration dependent, leading to the formation of at least six adducts after 2 h incubation at pH 7.4. ESI-Q-TOF MS analysis of tryptic digests indicated that H-33, K-39, K-72 and K-100 were modified by DDE. These adducts are present in clusters of basic amino acid residues, which are believed to participate in the interaction of cytochrome c with mitochondrial membrane and cytochrome c oxidase. A blue shift in the Soret band from 409 to 406 nm was also observed, indicating heme crevice opening and displacement of heme sixth ligand (Met-80) coordination in modified protein. DDE (180 µM) treatment increases the rate of mitochondrial oxygen consumption, suggesting a partial mitochondrial uncoupling. Moreover, extensive mitochondrial swelling upon treatment with DDE (900 nM-162 &#181M) was observed by light scattering and transmission electron microscopy experiments. These effects were not prevented by the mitochondrial permeability transition inhibitor cyclosporin A. A DDE concentration-dependent loss in the inner mitocondrial membrane potential, monitored by safranin O fluorescence and an increase in lipoperoxidation were also observed. All together, these results suggest that reactive aldehydes can induce inner mitochondrial membrane damage playing a role in mitochondrial dysfunction associated with oxidative stress.

A planta Casearia sylvestris é catalogada como planta medicinal de interesse ao SUS, indicada para o tratamento de gastrite e como cicatrizante, para ser utilizada na forma de infusão ou compressas. Assim, foi objetivo deste estudo avaliar o potencial terapêutico antiulcerogênico do extrato fluido (EF), extrato metanólico (EM) e fração diclorometano (FDM), pelo modelo de indução de úlcera por etanol-acidificado. Realizou-se também a análise fitoquímica objetivando identificar os compostos ativos presentes nos extratos, através de técnicas de cromatografia, espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear. Os resultados obtidos mostraram que tanto o EF, quanto o EM e FDM foram eficazes na prevenção de úlceras gástricas. Além disso, foram avaliados os possíveis efeitos do EF no estresse oxidativo hepático e na indução ou inibição do complexo enzimático citocromo P450. Os resultados obtidos mostraram alteração apenas do ciclo-redox da glutationa com a razão GHS/GSSG diminuída nos animais tratados, sugerindo que deve ser ter cautela ao utilizá-lo concomitantemente a medicamentos pelo risco de interações medicamentosas. Adicionalmente, foi realizado um estudo preliminar do potencial antitumoral do EM e frações através de ensaio bioguiado de citoxicidade (ensaio sulforrodamina B), no qual foi observado pronunciada atividade citotóxica (IC50 ≤ 5µ/ml) em diferentes linhagens tumorais. A análise fitoquímica identificou flavonóides (quercetina, rutina, kaempferol) e terpenos (espatulenol, diterpeno clerodânico). Portanto, pode-se sugerir que os efeitos terapêuticos ocorrem da sinergia destes princípios ativos / The Casearia sylvestris plant is cataloged as a medicinal plant of interest to the Unified Health System in Brazil indicated for the treatment of gastritis and healing, to be used in the form of infusion or compresses. Thus, the aim of this study was to evaluate the antiulcerogenic therapeutic potential of fluid extract (EF), methanol extract (EM) and dichloromethane fraction (FDM) on ethanol/HCl induced gastric model ulcer. The results obtained showed that EF, as EM and FDM, have been effective in preventing gastric ulcers. Also, a phytochemical analysis by chromatographic techniques, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance was carried out to identify the active constituents present in the extracts. Moreover the possible effects of EF on hepatic oxidative stress and on induction or inhibition of cytochrome P450 enzime complex were evaluated. The results obtained showed only an alteration on the redox-cycle of glutathione with the GHS/GSSG ratio decreased in treated animals, suggesting caution in the use of EF concomitantly with other drugs as there might be a risk of drug interactions. In addition, a preliminary study was carried out to evaluate through bio-guided citotocixity assay (sulforhodamine B) the antitumor potential of the EM and fractions, in which pronounced cytotoxic activity was observed (IC50 ≤ 5µg/ml) in different tumor cell lines. Therefore, it can be suggested that the therapeutic effects occur in consequence of the synergy of these active ingredients

A varfarina é o anticoagulante oral mais prescrito no mundo todo. Algoritmos farmacogenéticos têm sido desenvolvidos para estimar a dose de varfarina. Os principais objetivos deste estudo foram desenvolver um algoritmo farmacogenético estimador de dose de varfarina e comparar o algoritmo desenvolvido neste trabalho com algoritmos disponíveis na literatura. Para atingir os objetivos foram incluídos dois grupos de pacientes tratados com varfarina (primeira coorte, n = 832; e segunda coorte, n = 133). Foram realizadas as genotipagens dos polimorfismos CYP2C9*2, CYP2C9*3 e VKORC1 (c.G1639A). A derivação do algoritmo foi realizada utilizando os dados dos pacientes da primeira coorte com dose estável (n=368) e foi replicado utilizando os dados dos pacientes provenientes da segunda coorte (n=133). Como resultado o algoritmo desenvolvido neste trabalho alcançou um coeficiente de determinação de 40%, incluindo as variáveis: idade, sexo, peso, altura, raça autodeclarada, uso de amiodarona, uso de indutores enzimáticos, os genótipos na VKORC1 (c.G1639A) e os fenótipos de acordo com polimorfismos CYP2C9. Os dados sugerem que o nosso algoritmo desenvolvido é mais acurado do que o algoritmo IWPC (The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium) quando a aplicação é focada em pacientes brasileiros. Os algoritmos farmacogenéticos estimadores de dose de varfarina desenvolvidos para uma população específica podem ser mais efetivos para a terapia com varfarina em comparação com o uso de algoritmos estimadores de dose atualmente disponíveis / Warfarin is the most prescribed oral anticoagulant in the world. Pharmacogenetic algorithms have been developed to estimate the dose of warfarin. The main aims of the present study were to develop a pharmacogenetic-based warfarin dosing algorithm and compare algorithm developed in this study with others algorithms available in the literature. We included two patient cohorts treated with warfarin (first cohort, n = 832; and second cohort, n = 133). Polymorphisms were genotyped in the CYP2C9 * 2, CYP2C9 * 3 and VKORC1 (c.G1639A). The derivation of the algorithm was performed using the data from the patients in the first cohort with a stable dose (n = 368) and was replicated using data from patients from the second cohort (n = 133). Our algorithm achieved a determination of coefficient of 40%, including variables: age, sex, weight, height, self-declared race, use of amiodarone, use of enzymatic inducers, genotypes in VKORC1 (c.G1639A) and phenotypes according to CYP2C9 polymorphisms. Our data suggest that the developed algorithm is more accurate than the IWPC algorithm when the application is focused on patients from the Brazilian population. Pharmacogenetics- based warfarin dosing algorithms developed for a specific population may lead to improved performance compared use dosing algorithms currently available

A (-)- grandisina (GRA) é um produto natural da classe das lignanas e é encontrada em muitas espécies de plantas das regiões Norte e Nordeste do Brasil. Por apresentar diversas propriedades biológicas, como atividade tripanocida, anti-inflamatória, antinociceptiva, e principalmente atividade antileucêmica e antitumoral contra tumores de Ehrlich, a GRA pode ser considerada um potencial candidato a fármaco. Porém, para que a GRA se torne um fármaco são necessárias diversas etapas de estudos, incluindo estudos pré-clínicos de interações medicamentosas (DDI). As DDI ocorrem principalmente devido a inibições diretas e tempo-dependentes das enzimas do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de enzimas responsável por metabolizar cerca de 75% dos fármacos em uso. Os estudos pré-clínicos de DDI envolvem o conhecimento do potencial inibitório do candidato a fármaco sobre essas enzimas e esses estudos podem ser realizados empregando diversos modelos in vitro, como, por exemplo, microssomas hepáticos de humanos (HLM). Assim, nesse estudo foi avaliado o efeito inibitório da GRA sobre a atividade das principais isoformas do CYP450 e também foram determinadas as isoformas que contribuem para a formação dos metabólitos da GRA. Os resultados demonstraram que múltiplas isoformas participam da formação dos metabólitos da GRA, com destaque para a CYP2C9, que participa da formação de todos os metabólitos. Em relação aos estudos de inibição, foi possível concluir que a GRA é um inibidor fraco da CYP1A2 e CYP2D6, com valores de IC50 maiores do que 200 µM e 100 µM, respectivamente, e um inibidor moderado e competitivo da CYP2C9, com IC50 igual a 40,85 µM e Ki igual a 50,60 µM. Para a CYP3A4 o potencial inibitório da GRA foi avaliado utilizando dois substratos distintos. A GRA demonstrou ser tanto um inibidor dose-dependente moderado e competitivo dessa isoforma, quanto um inibidor tempo-dependente baseado em mecanismo com potencial de inativação equiparável ao do irinotecano, inibidor baseado em mecanismo clinicamente significativo. Utilizando a nifedipina como substrato os valores de IC50 e Ki foram 78,09 µM e 48,71 µM, respectivamente. Já os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 6,40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5,78 mL min-1 µmol-1. Para os ensaios empregando o midazolam os valores de IC50 e Ki foram 48,87 µM e 31,25 µM, respectivamente, e os valores dos parâmetros cinéticos de inativação foram KI= 31,53 µM, kinact= 0,049 min-1 e Clinact= 1,55 mL min-1 µmol-1. Com relação a CYP2E1, por sua vez, foi possível observar que a GRA tem capacidade de aumentar a atividade dessa isoforma significativamente a partir da concentração de 4 µM. Portanto, conclui-se que não há risco da GRA apresentar interações medicamentosas com fármacos metabolizados pela CYP1A2 e CYP2D6, enquanto que para a CYP2C9, apesar da GRA ser um inibidor moderado dessa isoforma, o risco é baixo. Já para medicamentos metabolizados pela CYP2E1 e CYP3A4 o risco de DDI existe e isso deve ser cuidadosamente monitorado in vivo, principalmente porque a CYP3A4 é a isoforma responsável por catalisar o metabolismo da maioria dos fármacos. / (-)-grandisin (GRA) is a lignanic natural product found in many species of plants from North and Northeast of Brazil. This compound has several biological properties, such as trypanocide, anti-inflammatory, antinociceptive, antileukemia activity and antitumor activity against Ehrlich tumor. Because of these biological properties, GRA is considered a potential drug candidate, however, before becoming a new drug, GRA has to undergo various tests, including preclinical drug-drug interactions (DDI) studies. Most of the times, DDI occur because of direct and time-dependent inhibitions of cytochrome P450 (CYP450) enzymes, an enzyme superfamily responsible for metabolizing the vast majority of drugs administered. Preclinical drug-drug interactions studies involve the evaluation of the potential of a drug candidate to inhibit this superfamily of enzymes and these studies can be conducted using in vitro models, such as human liver microsomes (HLM). Therefore, in this project, the inhibitory effect of GRA on the activity of some CYP450 isoforms was evaluated and the isoforms that catalyze the formation of GRA\'s metabolites were also determined. Results showed that multiple CYP450 isoforms participate in the GRA\'s metabolites formation, highlighting CYP2C9, which catalyzes the formation of all metabolites. The inhibition studies showed that GRA is a weak inhibitor of CYP1A2 and CYP2D6, with IC50 values greater than 200 µM and 100 µM, respectively, and a moderate and competitive inhibitor of CYP2C9, with IC50 value equal to 40.85 µM and Ki value equal to 50.60 µM. The capability of GRA to inhibit CYP3A4 was evaluated using two different substrates. GRA showed to be a moderate and competitive dose- dependent inhibitor of this isoform and also a mechanism-based time-dependent inhibitor with potential of inactivation comparable to irinotecan, a clinically significant mechanism-based inhibitor. IC50 and Ki values obtained using nifedipine as substrate were 78.09 µM and 48.71 µM, respectively, and inactivation kinetics parameters were KI= 6.40 µM, kinact= 0,037 min-1 e Clinact= 5.78 mL min-1 µmol-1. On the other hand, IC50 and Ki values using midazolam as substrate were 48.87 µM and 31.25 µM, respectively, and the values of inactivation kinetics parameters were KI= 31.53 µM, kinact= 0,049 min-1 and Clinact= 1.55 mL min-1 µmol-1. With respect to CYP2E1, it was observed that GRA increases its activity significantly from a concentration of 4 µM. Therefore, it is possible to conclude that there is no risk of DDI between GRA and drugs metabolized by CYP1A2 and CYP2D6, while for CYP2C9, although GRA is a moderate inhibitor of this isoform, the risk is low. Finally, for drugs metabolized by CYP3A4 and CYP2E1 there is risk of DDI and this should be carefully monitored in humans, mainly because CYP3A4 is an isoform responsible for catalyzing the metabolism of most drugs in use.

O presente estudo teve por objetivo estudar a participação da apoptose na carcinogênese hepatocelular, quantificando os corpos apoptóticos imunomarcados por caspase-3 clivada em amostras de carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com ou sem cirrose, comparando também estes achados com amostras correspondentes de fígado não tumoral. Visou também à análise semi-quantitativa da imuno-expressão da proteína p53, Bax e Citocromo-C, relacionadas à via mitocondrial da apoptose em busca de eventuais relações com as variáveis clínicopatológicas dos carcinomas hepatocelulares. A análise comparativa da distribuição das diversas proteínas aqui estudadas foi ainda efetuada, com vistas à possível demonstração de sua interação no processo de apoptose em CHC. Amostras selecionadas de 79 casos de CHC foram distribuídas em micromatriz tecidual e submetidas a pesquisa imuno-histoquímica com amplificação por polímeros curtos de dextran ligados a peroxidase. IA foi maior nos CHC que nas amostras não-neoplásicas, mostrando ainda tendência a associação com o grau histológico do CHC .A imuno-expressão de p53 foi maior nos CHC em fígado cirrótico (CHC-C), em casos com invasão vascular, e nos graus histológicos altos. Houve maior imunoexpressão de citocromo c em CHC-C, sendo importante sua associação com p53. Bax mostrou apenas tendência a associação com o tamanho do CHC. Essas evidências contribuem para a compreensão da importância da via mitocondrial da apoptose mediada pela proteína p53 no CHC, destacando também prováveis diferenças do mecanismo carcinogenético na presença ou não de cirrose / This study aimed at the assesment of aspects of the role of apoptosis in hepatocellular carcinogenesis, quantifying apoptotic bodies immunomarked by cleaved caspase-3 in samples of hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with or without cirrhosis, further comparing these findings to those from samples in non-tumoral areas of these livers. We also aimed herein to semiquantitate the immunoexpression of p53, Bax, Cytochrome-C, participants of the mitochondrial pathway of apoptosis, searching for possible relations with clinico-pathological variables in HCC. Samples from 79 cases of HCC were arranged in tissue microarrays were and submitted to immunohistochemical reaction with signal amplification achieved by the short-polymer-peroxidase system. Apoptotic index measured by immunoexpression of cleaved-caspase 3 was higher in HCC than in samples from non-neoplastic areas. p53 immunoexpression was higher in HCC occurring in cirrhotic livers, (HCC-C), in cases with vascular invasion and in higher histological grades. Cytochrome-c immunoexpression was also higher in HCC-C and, interestingly, was directly related to p53. Bax immunoreactivity showed only a trend for a relation with the size of HCC. The evidences from the present study further demonstrate the importance of p53-mediated pathway of apoptosis in HCC, and also point for possible differences in carcinogenesis in cirrhotic versus non-cirrhotic livers

A heme oxigenase (HEOX) é uma enzima que converte o anel heme em quantidades equimolares de biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Fe3+. Esta enzima tem um importante papel fisiológico, regulando os níveis de hemeproteínas e protegendo as células da agressão oxidativa do heme livre. A biliverdina é, subseqüentemente, transformada em bilirrubina que apresenta propriedades antioxidativas e o Fe3+ é seqüestrado pela ferritina. O CO ativa a guanilil ciclase, com resultante produção de 3?,5?-monofosfato de guanosina cíclico provocando relaxamento da musculatura lisa vascular. Em trabalho anterior, nós verificamos o efeito da inibição aguda da heme oxigenase com zinco protoporfirina (ZnPP IX) sobre a pressão arterial de ratos Wistar machos recebendo dietas hipossódica (0,15% de NaCl), normossódica (1,3% de NaCl) ou hipersódica (8% de NaCl) desde o desmame. Nos animais sob dieta hipersódica houve diminuição nos níveis pressóricos, enquanto que nos animais que recebiam dieta hipo e normossódica, ocorreu um aumento dos níveis pressóricos. A análise destes resultados mostrou a existência de uma correlação negativa entre a pressão arterial basal medida antes da injeção de ZnPP IX e o efeito deste tratamento sobre os níveis pressóricos. Esta correlação independeu do conteúdo de sal na dieta consumida pelos animais. Concluímos assim, que a resposta à inibição da HEOX é modulada pela pressão arterial basal. Recentemente, foi mostrado que a heme oxigenase é induzida por incrementos da pressão obtidos de maneiras diversas e que ao retornar os níveis pressóricos a valores basais esta indução da enzima é revertida. A estimulação da HEOX promove consumo de anel heme. O heme integra a estrutura molecular de enzimas importantes na regulação da pressão arterial, como por exemplo, guanilato ciclase, óxido nítrico sintase, hidroxilase e epóxigenase (enzimas pertencentes à família do citocromo P-450). Permitimo-nos conjecturar que a falta de heme repercute sobre a atuação destas enzimas, uma vez que o turnover destas enzimas é dependente de heme. O objetivo deste estudo foi confirmar em outros modelos de hipertensão arterial os achados anteriores e verificar se a enzima epoxigenase que metaboliza o ácido araquidônico formando compostos vasodilatadores, tais como EET e DiHTE, está envolvida na queda da pressão arterial dos animais sob dieta hipersódica. Neste estudo foi induzida hipertensão arterial crônica com angiotensina II (AII - 0,7 mg.kg-1.d-1, via minibomba osmótica durante 7 dias) ou com L?-nitro L-arginina metil ester (L-NAME ? 50 mg/L fornecido na água de beber ao longo de duas semanas) e hipertensão arterial aguda com fenilefrina (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazina (15 mg.kg-1.dia-1 fornecido na água de beber durante 9 dias) e nitroprussiato de sódio (SNP - 7,7?g.kg-1.min-1 iv) foram utilizados para induzir diminuição crônica e aguda, respectivamente, da pressão arterial. A participação da via do citocromo P-450 no mecanismo de queda pressórica em resposta ao ZnPP IX nos animais sob dieta hipersódica (descrita no trabalho anterior), foi avaliada através da inibição desta via com clotrimazole (80 mg/kg/24 horas) em animais na vigência de sobrecarga de sal ou consumindo dieta normossódica. Grupos de ratos submetidos ao tratamento com AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazina e clotrimazole foram submetidos ao teste de inibição da HEOX. A pressão arterial direta (artéria carótida) foi avaliada antes e após a administração de zinco protoporfirina IX (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) ou veículo (carbonato de sódio ? 0,15mmol/kg ip). Nós verificamos nos modelos de hipertensão arterial crônicos ou no modelo agudo um resultado similar ao encontrado no estudo anterior, ou seja, em resposta à inibição da heme oxigenase houve uma queda importante da pressão arterial. Nos animais submetidos a hipotensão arterial não houve modificação da pressão arterial em resposta à administração de ZnPP IX. Nos grupos de animais submetidos ao tratamento com clotrimazole não houve modificação da pressão arterial após administração de ZnPP IX. Em conclusão, pressão basal elevada modifica o efeito da inibição da heme oxigenase sobre os níveis pressóricos em comparação com pressão arterial basal normal ou reduzida. A via do citocromo P-450 parece estar envolvida na queda pressórica após inibição da heme oxigenase nos animais submetidos a tratamento crônico com dieta hipersódica, uma vez que nos animais tratados com clotrimazole não houve modificação pressórica após a inibição da heme oxigenase. / Heme oxygenase (HEOX) is the rate-limiting enzyme that opens the heme ring, resulting in equimolar quantities of biliverdin, carbon monoxide (CO) and Fe3+. HEOX plays an important physiological role in the degradation of heme, regulating hemoprotein levels and therefore protecting cells from the deleterious effects of free heme. Biliverdin is subsequently reduced by biliverdin reductase to bilirubin that has antioxidant properties. Iron is sequestered by ferritin. CO activates soluble guanylate cyclase with resultant production of 3?,5?-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) which produces relaxation of the vascular smooth muscle cells. Previously we demonstrated the effect of acute HEOX inhibition by zinc protoporphyrin IX (ZnPP IX) on blood pressure in male Wistar rats that were fed with low (LSD ? 0.15% NaCl), normal (NSD ? 1.3%) or high salt diet (HSD - 8% NaCl) from weaning (21 days-old animals). The blood pressure decreased in rats on HSD, and increased in the animals on NSD and LSD after ZnPP IX administration. A negative correlation was obtained between blood pressure measured before ZnPP IX and the area under the curve of the percentage of blood pressure changes induced by ZnPP IX. This correlation seems to be independent of the salt content in the diet. Our conclusion is that the response to heme oxygenase inhibition is modulated by basal arterial blood pressure. Recently it was showed that heme oxygenase is induced by high blood pressure and the levels of the enzyme returns to normal with blood pressure control. It is known that heme oxygenase stimulation provokes breakdown of heme ring. The heme integrates the molecular structure of several important enzymes that are involved in the regulation of blood pressure, such as, soluble guanylate cyclase, nitric oxide synthase, hydroxylase and epoxygenase (cytochrome P-450 family). We postulate that the deficiency in heme rings due to heme oxigenase induction might lead to disturbances in the activities of some of these enzymes and hence hypertension. The objective of this study was 1) to confirm the results observed previously in others models f hypertension and 2) to the role of epoxygenase in the regulation of blood pressure in response to HEOX inhibition in hypertensive animals. The chronic hypertension was induced by angiotensin II (AII - 0.7 mg.kg-1.d-1, by osmotic mini pumps during 7 days) or with L?-nitro L-arginine metyl ester (L-NAME ? 50 mg/L in the tap water was given during two weeks ) and acute hypertension with phenylephrine (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazine (15 mg.kg-1.d-1 in the tap water was given during 9 days) and sodium nitropruside (SNP - 7.7?g.kg-1.min-1 iv) were used, respectively, to induce chronic and acute decreases of the blood pressure. The participation of the cytochrome P-450 pathway in the mechanism of blood pressure reduction in response to ZnPP IX was evaluated through the inhibition of this pathway by clorimazole (80 mg/kg/24 hours) in animals on high salt diet or nornal salt diet. Groups of rats treated with AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazine and clotrimazole were submitted to HEOX inhibition. Direct blood pressure (carotid artery) measurements were undertaken before and after zinc protoprphyrin IX administration (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) or vehicle (sodium carbonate ? 0,15mmol/kg ip). In the chronic or acute hypertension models heme oxygenase inhibition induced a decrease of blood pressure. In the hypotension group there was no modification on blood pressure of these animals in response to ZnPP IX. Animals on high salt diet submitted to the clotrimazole treatment did not modify the blood pressure after ZnPP IX administration. Thus; the cytochrome P-450 pathway seems to be involved in the blood pressure decreases after HEOX inhibition in the animals under long term of high salt diet since there was no change in blood pressure in the clotrimazole-treated groups after heme oxygenase inhibition.