Os insetos da subfamília Triatominae Jeannel, 1919 de Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera: Reduviidae), também conhecidos como barbeiros, constituem um grupo amplamente distribuído pela região Neotropical que comporta hoje, 142 espécies ocorrentes e uma fóssil, distribuídas em 18 gêneros, são insetos hematófagos estritos em todas as fases da vida e reconhecidos vetores da Doença de Chagas. Essa enfermidade é considerada um dos mais importantes problemas de saúde na América Latina, com cerca de 12 a 14 milhões de indivíduos chagásicos, 60 milhões vivendo em risco e cerca de 20.000 caso/ano em 18 países da América do Sul e Central. Neste estudo foram analisadas seqüências de nucleotídeos dos genes 16S e CitB mitocondrial em populações de triatomíneos, dos gêneros Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 e Triatoma Laporte, 1832, mantidos em colônias no insetário Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA) - SP, comparando-as com seqüências dos mesmos genes disponíveis no GenBank. Os fragmentos obtidos variaram de 311 a 317 pb (16S) e 393 pb (CitB). Observou-se baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas do gene 16S, enquanto o gene CitB mostrou-se mais polimórfico, podendo ser utilizado para estudos de populações geográficas. As seqüências geradas foram alinhadas com seqüências dos mesmos genes para outros triatomíneos e também de Arilus cristatus Linaeus, 1763 (Hemiptera: Reduviidae: Harpactorinae) (16S e CitB) e Oncerotrachelus sp. Stål, 1868 (Hemiptera: Reduviidae: Saicinae) (16S). As relações entre as espécies foram avaliadas pelos métodos de Distância (Neighbor Joining), Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança. As análises de fragmentos para os dois genes demonstraram a parafilia de Rhodniini e Triatomini, confirmando resultados anteriores. Evidenciou-se a possível origem dos "Triatomas" Neotropicais a partir de derivações de Triatomas Neárticos, verificada pela estreita relação genética de Panstrongylus e Triatoma vitticeps (Stål, 1859) com o ramo Norte-Centro Americano de Triatoma; por meio das relações com T. protracta (Uhler, 1894), Dipetalogaster maxima (Uhler, 1894) e T. dimidiata Latreille, 1811. É dada a conhecer a primeira seqüência de bases nitrogenadas de fragmentos do gene 16S para Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. Os resultados mostraram a utilidade de 16S e CitB como marcadores moleculares de espécies e de populações de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia, no entanto, exigem um alto grau de segurança e controle de contaminação. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores e o uso de caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento, indispensáveis para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle. As colônias de triatomíneos do SESA revelaram-se importante fonte de material para estudos sistemáticos de triatomíneos, pois compreendem amostras significativas de várias populações triatomínicas da América, principalmente de espécies consideradas vetores principais do mal de Chagas como Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 e Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Algumas questões sistemáticas relativas a origem e relacionamento filogenético dos triatomíneos continuam em aberto; novos reagrupamentos serão necessários para que a Subfamília continue válida; Análises mais completas, com a inclusão de representantes das tribos Alberproseniini, Bolboderini e Cavernicolini, são ainda necessárias. / The insects of the Triatominae subfamily Jeannel, 1919 of Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera), also known as triatomine bugs, constitute a widely distributed group in the Neotropical region and including 142 current species and a fossil one, distributed in 18 genera. They are strict hematophagic insects in all phases of their life cicle and recognized vectors of the Chagas disease. This disease is considered one of the most serious Health problem in Latin America, with about 12 the 14 million of chagasic individuals, 60 million people living at risk and about 20,000 cases/year in 18 Central and South American countries. In this study mitocondrial 16S and CytB nucleotide sequences were analyzed in populations of triatomine bugs of the genera Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 and Triatoma Laporte, 1832 from colonies maintained in the Insectary of Special Health Service of Araraquara - SESA (acronym in Portuguese), Araraquara- SP, comparing them with sequences of the same available genes deposited in the GenBank. The obtained fragments varied from 311 to 317 bp (16S gene) and 393 pb (CytB). Low intra-specific variation among the genetic distance of the 16S gene, while the CytB gene revealed a higher polymorphism, being able to be used in geographic population studies. The generated sequences were aligned with sequences of the same genes for other triatomine bugs and also with Arilus cristatus Linaeus, 1763 (16S and CytB) and Oncerotrachelus sp Stål, 1868 (16S). The relationships among the species had been evaluated by the methods of Distance (Neighbor Joining), Maximum Parsimony and Maximum Likelihood. The analyses of fragments for the two genes had demonstrated the paraphily of Rhodniini and Triatomini, confirming previous results. It was hypothesized the possible origin of the Neotropical "Triatomas" from derivations of Nearctic triatomes, verified for the narrow genetic relation of Panstrongylus and Triatoma vitticeps (Stål, 1859) with the North-Center American branch of Triatoma by the relationships with T. protracta (Uhler, 1894), D. maxima (Uhler, 1894) and T. dimidiata Latreille, 1811. It is known the first sequence of nitrogen bases of fragments of the 16S gene for Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. The results had shown the utility of 16S and CytB as markers of species and of triatomine populations and their importance in systematic and taxonomy questions. However, demands one high degree of security and control of contamination. There is a necessity of new studies involving other molecular markers and the use of classic systematic characters of morphology, ecology and behavior, indispensable for systematic decisions adjusted a time, that would have not only systematic impact but, for the control strategies. The colonies of triatomine of the SESA had shown important source of material for systematic studies of this kind of insect, since they include significant samples of triatomine populations of America, mainly of species considered the main vectors of the Chagas disease such as Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 and Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Some systematic questions related to the origin and phylogenetic relationship of the triatomine bugs have kept opened; new regroupings will be necessary so that the Subfamily continues valid; more complete analyses, with the inclusion of representative members of the Alberproseniini, Bolboderini and Cavernicolini tribes, are still necessary.

Neste trabalho estão apresentadas novas estratégias para funcionalizar superfícies de ouro baseadas na sustentação de bicamadas lipídicas em superfícies de sensores de imagem por Ressonância de Plasmons de Superfície (SPRi) e a construção de um biosensor para detecção de citocromo c. SPRi é uma técnica ótica de gravimetria em tempo real. Por meio de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface, a adsorção e desorção de moléculas podem ser mensuradas. Inicialmente testamos várias estratégias para encontrar um suporte adequado que se ligasse na superfície de ouro e que oferecesse sustentação e estabilidade para a bicamada de fosfolipídeo biotinilado. Estudos de FT-IR e MEV mostraram que a quitosana facilita a formação de uma bicamada íntegra de fosfolipídeos, de tal modo, que a mesma alcança valores de espessura próximos àqueles previstos, ~ 34,5 Å. Além disso, mostramos que esse sistema apresenta vantagens perante outros modelos, tais como, (poli-lisina/fosfolipídeos) e (tiol hidrofóbico/fosfolipídeo). Utilizando-se o complexo químico biotina/estreptoavidina conseguimos imobilizar o anticorpo anti cit c na bicamada, mantendo-o afastado da superfície de ouro. A construção do biosensor foi acompanhada com experimentos de SPRi. O limite de detecção de citocromo c atingido foi de 10-11mol/L. Um sensor construído somente com BSA e anticorpo anti cit c apresentou sensibilidade semelhante. Esta sensibilidade é em torno de três ordens de grandeza superior aos experimentos de imunoblotting usualmente utilizados para detecção de cit c. A principal limitação deste biosensor, tal como de outros imunoensaios, está intimamente ligada às vantagens e desvantagens dos anticorpos como ferramentas analíticas. / In this work we developed new strategies to functionalize gold surfaces based on the support of lipid bilayers on the surfaces of surface plasmon resonance imaging sensors (SPRi) and the construction of a biosensor for detection of cytochrome c. SPRi is an optical gravimetric real time technique. Through measurements of changes in refractive index (n) in close proximity to an interface, the adsorption and desorption of molecules can be measured. Initially we tested several strategies for finding a suitable medium that would adsorb on the gold surface and also support and stabilize a biotinylated phospholipid bilayer. Studies of FT-IR and SEM showed that chitosan induces the formation of an intact phospholipid bilayer, so that it reaches thickness values close to those expected, ~ 34.5 Å. Furthermore, we showed that this system has advantages in relation to other models, such as (poli-lisine/phospholipids) and (thiol hydrophobic / phospholipid). Using the chemical complex biotin/streptavidin anti cyt c antibody could be immobilized in the bilayer, keeping it away from the gold surface. The construction of the biosensor was accompanied with SPRi experiments. The limit of detection of cytochrome c was achieved from 10-11mol / L. A sensor built only with BSA and anti cyt c showed similar sensitivity. This sensitivity is about three orders of magnitude higher than the immunoblotting experiments commonly used for detection of cyt c. The main limitation of this biosensor, like in other immunoassays, is linked to the advantages and disadvantages of antibodies as analytical tools.

Em face das recentes exigências das agências regulatórias quanto à aprovação de novos fármacos, os estudos de biotransformação têm-se tornado uma etapa indispensável para a identificação e otimização de compostos bioativos. O objetivo desses estudos é identificar, já nas fases iniciais da descoberta de fármacos, candidatos que apresentam propriedades indesejáveis como a (i) presença de metabólitos ativos ou tóxicos; (ii) inibição de enzimas metabolizadoras; (iii) depuração metabólica inadequada, entre outras. Neste estudo, foi realizada a caracterização metabólica e a identificação de possíveis inibidores das enzimas do citocromo P450 de oito promissores candidatos a fármacos, identificados através de ensaios virtuais como inibidores da TcGAPDH, Cruzaina e TcDHODH, todas do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. Esses compostos foram testados contra as três principais isoformas do citrocromo P450: CYP 3A4, CYP 2D6 e CYP2C9. Os valores de IC50 de 1,4 µM e 1,3 µM contra a CYP2C9 foram encontrados para os compostos Nequimed53 e Nequimed125, enquanto o Nequimed42 inibiu a CYP 3A4 com um valor de IC50 de 7,12 µM. Posteriormente foi conduzida a caracterização metabólica dos compostos Nequimed53 e 125 com foco na identificação dos principais metabólitos, sítios de metabolismo e vias de biotransformação através da técnica de LC-ESI-QqTOF-MS. Para ambos os compostos, a biotransformação por microssomas extraídos de fígado de ratos deu-se preferencialmente por uma única via dependente de NADPH. No caso do Nequimed54, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de +16, indicando a ocorrência da hidroxilação do composto parental, enquanto que para o composto Nequimed125, o metabólito formado apresentou uma variação da razão m/z de -28, condizente com a perda de um fragmento etila do composto parental. / In the light of recent demands from regulatory agencies for the acceptance of new drugs, the biotransformation studies have become an essential step for the identification and optimization of bioactive compounds. The objective of these studies is to identify compounds that have undesirable properties such as (i) the presence of toxic or active metabolites, (ii) inhibition of metabolizing enzymes, (iii) excessive metabolic clearance, inter alia. In this study we characterized the metabolism and cytochrome P450 inhibition of eight compounds identified by virtual screening as inhibitors of TcGAPDH, Cruzain and TcDHODH which are of interest as targets for intervention in treatment of Chagas Disease. These compounds were tested against cytochrome P450 isoforms 3A4, 2D6 and 2C9. IC50 values of 1.4 µM and 1.3 µM against CYP 2C9 were observed for Nequimed53 and Nequimed125.while Nequimed42 inhibited CYP 3A4 with an IC50 of 7.1 µM. Subsequently, we characterized the in vitro metabolism of Nequimed53 and 125 with a focus on metabolite identification and biotransformation pathways using the LC-ESI-MS-QqTOF technique. For each, the biotransformation by rat liver microsomes occurred by a single NADPH-dependent pathway. For Nequimed54, the observed metabolite [M+16]+ indicated hydroxylation of parent compound. The metabolite [M-28]+ observed for Nequimed125 indicated desethylation of the parent compound.

Orientador: Frank Nelson Crespilho / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2014

Urophycis Gill, 1863 é um gênero de peixes marinhos demersais de médio porte, popularmente conhecidos como abróteas, distribuídos ao longo da costa do Atlântico Ocidental, do Canadá à Argentina. Atualmente são reconhecidas sete espécies válidas dentro deste gênero. Apesar de sua importância comercial, até então poucos estudos taxonômicos e biogeográficos haviam sido realizados com estas espécies. Três espécies foram descritas do Atlântico Sul ocidental: U. brasiliensis (Kaup, 1858), descrita de Motevideo, Uruguai, U. latus Miranda Ribeiro, 1903 e Urophycis mystacea Miranda Ribeiro, 1903, ambas descritas do Rio de Janeiro, Brasil. Urophycis mystacea é morfologicamente semelhante à U. cirrata (Goode & Bean, 1896), descrita do Golfo do México nos Estados Unidos, sendo frequentemente confundidas. Os objetivos desta contribuição foram (1) redescrever U. brasiliensis, e alocar U. latus como um sinônimo júnior ; (2) redescrever U. cirrata e alocar U. mystacea como um sinônimo júnior; (3) estabelecer diagnoses e mapas de distribuição atualizados para ambas espécies. Tecidos e exemplares foram obtidos com pescadores e em coleções científicas. Foram utilizados métodos tradicionais de morfologia para comparação dos exemplares, além de técnicas de identificação molecular utilizando o gene mitocondrial citocromo oxidase I (COI). Testes para a amplificação da região controle do DNA mitocondrial de U. brasiliensis foram realizados e discutidos. / Urophycis Gill, 1863 is a genus of marine, demersal, mid-sized fish, popularly known as codlings or hakes, and distributed along the the Western Atlantic coast, from Canada to Argentina. Seven species are currently recognized as valid within this genus. Despite its economical importance, a few taxomomic an biogeographic studies had been carried out with those species. Three species were described from western South Atlantic: U. brasiliensis (Kaup, 1858), described from Montevideo, Uruguay, U. latus Miranda Ribeiro, 1903 and Urophycis mystacea Miranda Ribeiro, 1903, both described from Rio de Janeiro, Brazil. Urophycis mystacea is morfologically similar to U. cirrata (Goode & Bean, 1896), described from Gulf of Mexico, USA, and these species are repeteadly confused. The objectives of this contributions were (1) redescribe U. brasilienis, placing U. latus as a junior synonym; (2) redescribe U. cirrata, placing U. mystacea as a junior synonym; (3) provide updated diagnosis and maps of distributions for both species. Tissues and specimens were obtained from fisherman and scientific collections. Traditional morphological methods were used to compare the specimens, besides molecular identification techniques using the mithocondrial gene citochrome c oxidadse I (COI). Testst for amplification of the DNA mitochondrial control region in U. brasiliensis were performed and discussed.

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos. / In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

O método de imobilização de uma biomolécula é um dos principais fatores que melhoram o desempenho eletroquímico de um biossensor e o emprego de materiais como solução de quitosana, nanotubos de carbono e líquidos iônicos na preparação de eletrodos modificados tem sido cada vez maior devido as suas propriedades que facilitam a reação de transferência de elétrons entre a biomolécula e a superfície do eletrodo. Baseado neste conceito, o presente trabalho apresenta o estudo do comportamento eletroquímico da heme-proteína citocromo c quando imobilizado nos eletrodos de carbono vítreo e num novo substrato tridimensional de feltros de microfibras de carbono recobertos por nanotubos de carbono do tipo \"cup stacked\" (FCSNTc). Para imobilizar o citocromo c, compósitos contendo quitosana e o líquido iônico tetrafluoroborato de 1-butil-2,3-dimetilimidazólio (BMMIBF4) foram formulados, indicando que a otimização das quantidades destes componentes podem influenciar na atividade redox do biomaterial. A partir da caracterização eletroquímica do citocromo c em carbono vítreo foi observado que a presença do líquido iônico BMMIBF4 no compósito manteve a sua eletroatividade devido a reação de oxidação e redução do átomo de ferro do grupo heme, e ao utilizar os feltros FCSNTc o citocromo c apresentou o desempenho eletroquímico superior aos obsevados em carbono vítreo, e a incorporação do líquido iônico no compósito de imobilização, resultou em biossensores com sensibilidade superiores durante os experimentos de detecção eletrocatalítica de peróxido de hidrogênio, quando comparados com outros FCSNTc modificados sem presença do material totalmente iônico. Os experimentos espectroscópicos na região da luz visível, foram fundamentais para mostrar que o novo microambiente causado pelos compósitos não modificam a integridade do citocromo c, e que a permanência da bioeletroatividade obtida durante os experimentos eletroquímicos sugerem a aplicação dos eletrodos de FCSNTc para o desenvolvimentos de novos biossensores com o citocromo c. / The immobilization method of biomolecules have been considered the major reason in order to improve a biosensor electrochemical performance and chitosan solution, carbon nanotubes and room temperature ionic liquids have been extensively used as a material for electrode preparation due to their properties of facilitating the direct electron transfer reaction between protein and electrode surface. In this context, the present work shows the electrochemical behavior of the heme-protein cytochrome c when it is immobilized onto a glassy carbon and in a new tridimensional substrate of carbon microfibers recovered by cup staked type carbon nanotubes (FCSNTc) electrodes. The cytochrome c immobilization was carried by the formulation of different composites based on chitosan solution and the ionic liquid 1-butyl-2,3-dimethylimidazolium tetrafluoroborate (BMMIBF4), and it will be shown that a volume optimization ratio between these compounds can influence in the biomaterial redox activity. During the electrochemistry characterization of cytochrome c onto glassy carbon electrode, it was observed that composites with BMMIBF4 kept its electroactivity due the iron heme group redox process. When FCSNTc felt were used the electrochemical performance was enhanced, giving better biosensors due the increase on sensitivity during the electrocatalytic activity towards hydrogen peroxide reduction when it was compared with another modified FCSNTc without ionic liquid. In addition, the spectroscopic data in the visible region were essential to show that the new microenvironment promoted by the composite did not change the cytochrome c conformational structure. Finally, the bioelectroactivity obtained during electrochemical studies suggest the use of FCSNTc modified electrode as a new platforms to develop new cytochrome c biosensors.

Tacrolimus (TAC) é um fármaco imunossupressor muito utilizado na prevenção de rejeição aguda após o transplante de órgãos. Essa droga apresenta um índice terapêutico muito baixo e grande variabilidade intra e interindividual, sendo necessário programas de monitorização terapêutica para se otimizar a eficácia e limitar a toxicidade. O TAC é um fármaco substrato do CYP3A5 e transportado pela proteína de efluxo PGP e acredita-se que o polimorfismos genéticos (SNPs) destas proteínas estejam relacionados a alta variabilidade farmacocinética desta droga. Neste estudo, investigamos a influência dos polimorfismos destas proteínas sobre alguns parâmetros farmacocinéticos do TAC e também, na incidência de lesões renais e rejeição em receptores de transplante renal. Pacientes recebendo TAC a no mínimo 12 meses (n=108) foram genotipados (PCR real time) para os polimorfismos do CYP3A5*3 (rs776746) e do gene ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) e 3435C>T (rs1045642). Dados da concentração plasmática de vale (Co; ng/mL), dose diária normalizada (mg/dia por Kg do paciente) e a concentração plasmática do fármaco normalizada pela dose ingerida (Co/dose, ng/mL por mg/dia por kg do paciente) de TAC foram obtidos dos prontuários médicos ao longo de três anos após o transplante renal. O desfecho clínico foi analisado avaliando-se a curva de sobrevida o enxerto, a função renal obtida pelo clearance de creatinina (Equação de Cockroft-Gault), e desenvolvimento de lesões renais e rejeição aguda e crônica com diagnósticos estabelecidos mediante suspeita clínica e confirmados pela avaliação das biópsias quanto a presença de necrose tubular aguda (NTA) e nefropatia crônica do enxerto (NFC) de acordo com a classificação de BANFF 07. Os haplótipos do gene ABCB1 foram inferidos estatisticamente utilizando o software PHASE (version 2.1). Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Não observamos desvios em relação ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg em nossa população para nenhum dos genes estudados. Frequências alélicas destes polimorfismos (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 59% and 2677G 64%) e haplótipos (49% 2677G-3435C-1236C e 31% 2677T-3435T-1236T) foram consistentes com outros estudos realizados na população brasileira. Indivíduos portadores de ao menos um alelo *1 do gene CYP3A5 necessitavam de maiores doses de TAC para obter níveis plasmáticos semelhantes aos dos indivíduos homozigotos para o alelo *3 (0,09 ± 0,03 vs. 0,06 ± 0,03; mg/dia/kg; p<0,001). Ao final do primeiro ano de transplante pacientes CYP*3/*3 apresentavam praticamente o dobro da razão Co/dose quando comparados com os pacientes CYP*1/*1 (144,60 ± 67,29 vs. 70,44 ± 56,05 ng*mL-1 /mg*kg- 1 /dia; p<0,001). Observou-se semelhante em relação quando indivíduos portadores dos alelos e haplótipo variante da PGP foram avaliados. Não encontramos associações significativas entre os genótipos e a sobrevida do enxerto ou clearance de creatinina. No entanto, observamos que os pacientes portadores do haplótipo GCC apresentaram maior incidência de desenvolvimento de NFC. Este estudo confirma o efeito dos polimorfismos do CYP3A5 e, em menor grau da PGP na farmacocinética do TAC. No entanto, não encontramos associações entre esses polimorfismos e desfechos clínicos significantes, sugerindo que a genotipagem para o CYP3A5 ou ABCB1 ainda não deva ser incorporada na prática clínica como uma ferramenta para o manejo de transplante renal. / Tacrolimus (TAC) is widely used to prevent acute rejection following solid-organ transplantation. This drug is characterized by a narrow therapeutic index and drug monitoring programs are required both to optimize efficacy and to limit toxicity. TAC is known to be substrate of cytochrome P450 (CYP) 3A5 and P-glycoprotein (PGP/ABCB) and its been suggested that genetic polymorphisms (SNPs) of these proteins are highly associated with variations in TAC pharmacokinetics. We investigated the influence of polymorphisms of CYP3A5 and ABCB1 gene on the pharmacokinetic parameters (PK) of TAC and on the incidence of kidney injuries and allograft rejection (AR) in renal transplant recipients. Patients receiving TAC for at least 12 months (n=108) were genotyped (real-time PCR) for CYP3A5*3 (rs776746) and for ABCB1 1236C>T (rs1128503), 2677G>T/A (rs2032582) and 3435C>T (rs1045642) polymorphisms. TAC predose concentration (Co; ng/mL), TAC daily dose (mg/day per kg body weight) and dose-normalized predose concentrations (Co/dose; ng/mL per mg/day per kg body weight) were retrieved from medical records up to 03 years after transplantation. Clinical outcomes were analyzed evaluating renal function in terms of creatinine clearance ( Cockroft-Gault equation) and allograft survival. Kidney injuries and AR diagnostics were established by clinical suspicion and in presence of histological findings in renal biopsies according to the 2007 Banff classification. ABCB1 gene haplotypes were statistically inferred using PHASE software (version 2.1). No deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was observed in our study population for the polymorphic loci examined in CYP3A5 and ABCB1. Allelic frequencies of these polymorphisms (6986G 74%; 1236C 60%; 3435C 60% and 2677G 65%) and haplotypes (49% 2677G-3435C-1236C and 30% 2677T- 3435T-1236T) were consistent with other studies in the Brazilian population. Individuals carrying at least one CYP3A5*1 allele required higher TAC dose to achieve similar TAC blood levels as the homozygous individuals for the *3 allele (0.09 ± 0.03 vs.0.06 ± 0.03, mg/day per kg body weight, p<0.001). The presence of the CYP3A5*1 allele was also associated with lower TAC Co/dose compared to CYP*3 homozygous (84.9 ± 43.2 vs. 144.6 ± 66.7 ng/mL per mg/day per kg body weight, p<0.001). Regarding ABCB1 polymorphisms, individuals homozygous for the variant allele of each individual SNP and for the haplotype (TTT) showed higher Co/dose ratio. No associations were found between SNPs or haplotypes and allograft survival or creatinine clearance. We did find, though, that patients carrying GCC haplotype had a higher incidence of chronic rejection. Our findings confirm the effect of CYP3A5 and, less pronounced of ABCB1 polymorphisms, on the TAC pharmacokinetic. On the other hand, we did not find any association between these polymorphisms and relevant clinical outcomes, suggesting that CYP3A5 and ABCB1 genotyping must not be incorporated as a useful clinical tool on the management of kidney transplantation.

Esta tese aborda a utilização de um filme fino nanoestruturado de dendrímero-Pt, eletroquimicamente ativado, no estudo da eletroquímica do citocromo C. O objetivo do estudo de proteínas redox em eletrodos é elucidar os mecanismos de transferência de elétrons das proteínas que estão envolvidas em processos redox biológicos, como a fotossíntese e a cadeia respiratória, e a exploração de enzimas redox para o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos, células de biocombustíveis e aplicações em nanotecnologia. Antecedendo o processo de imobilização de biomoléculas, é preciso desenvolver eletrodos que facilitem transferências eletrônicas e não interfiram nas propriedades biológicas das biomoléculas a serem imobilizadas. Esta meta tem guiado pesquisadores na busca de um sistema ideal. Nesta busca, sistemas baseados em eletrodos modificados com materiais nanoestruturados (MNEs) têm sido aplicados. Nesta tese, para a obtenção dos eletrodos modificados com o hibrido dendrímero-Pt, primeiramente, foram sintetizadas as nanopartículas de Pt (NPsPt) encapsuladas no dendrímero poli(amidoamina) (PAMAM) pela redução química dos íons Pt encapsulados nas cavidades do PAMAM. A reação de complexação foi acompanhada por espectroscopia de absorção na região do UV-Vis (UV-Vis) e o encapsulamento foi investigado por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. As NPsPt encapsuladas em PAMAM (PAMAM-Pt) foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão. O híbrido PAMAM-Pt foi utilizado na obtenção de filmes automontados layer-by-layer sobre substrato de ITO. O tempo que o eletrodo deve ficar imerso na suspensão de PAMAM-Pt para que se forme uma camada e o número de camadas de PAMAM-Pt, intercaladas com camadas do poliânion poli(ácidovinilsulfônico), imobilizadas sobre o eletrodo de ITO, foram monitorados e determinados por voltametria cíclica (CV) e UV-Vis. Pela observação dos dados experimentais obtidos durante o processo de determinação do tempo de imersão e número de camadas, e levando-se em conta a importancia da obtenção de NPsPt com sítios eletrocatalíticos disponíveis para estudos e aplicações eletroquímicas, foi realizado um estudo sobre a ativação do eletrodo ITO/PAMAM-Pt por tratamento eletroquímico. A influencia deste tratamento na resposta eletroquímica dos eletrodos ITO/(PAMAM-Pt)n, para a reação de oxidação do hidrogênio adsorvido, foi investigada por CV e espectroscopia de impedância eletroquímica. O eletrodo ITO/PAMAM-Pt ativado eletroquimicamente foi utilizado nos estudos da eletroquímica do citocromo C (CytC) e o valor da constante de transferência de carga (ks) obtida pelo método de Laviron, foi 5,7 s-1, indicando que este eletrodo atua como um excelente dispositivo para a imobilização do CytC com excelente transferência de elétrons. A principal contribuição desta tese foi mostrar que, mediante tratamento eletroquímico, pode-se ativar e melhorar o desempenho de eletrodos modificados com membranas eletroativas de NPsPt encapsuladas em PAMAM. Também é possível obter eletrodos modificados com um filme nanoestruturado de PAMAM-Pt eletroquimicamente ativado, com excelente desempenho, economia de materiais, sem a necessidade de se produzir membranas com várias camadas e sem o uso de polieletrólitos que possam aumentar a resistência à transferência de elétrons e diminuir a eficiência do eletrodo. / This thesis discusses the use of a nanostructured thin film of dendrimer-Pt electrochemically activated, in the electrochemical study of cytochrome C. The objective of studying redox proteins at electrodes is to elucidate the mechanisms of electron transfer from the proteins that are involved in biological redox processes, such as photosynthesis and the respiratory chain, and the use of redox enzymes for the development of electrochemical biosensors, biofuel cells and applications in nanotechnology. Preceding the process of immobilization of biomolecules, it is necessary to develop electrodes that facilitate electronic transfers and which do not interfere with the biological properties of biomolecules to be immobilized. This goal has guided researchers in the search for an ideal system. In this quest, systems based on modified electrodes with nanostructured materials (MNEs) have been applied. In this thesis, platinum nanoparticles (NPsPt) encapsulated in the dendrimer poly(amidoamine) (PAMAM) by chemical reduction of ions Pt encapsulated in the cavities of PAMAM were synthesized to obtain the electrodes modified with hybrid dendrimer-Pt. The complexation reaction was monitored by absorption spectroscopy in the UV visible region (UV-Vis) and the encapsulation was investigated by Fourier transform infrared spectroscopy. The NPsPt encapsulated in PAMAM (PAMAM-Pt) were characterized by transmission electron microscopy. The hybrid PAMAM-Pt was used to obtain self-assembled films by layer-by-layer on ITO substrate. The time that the electrode must be immersed in the suspension of PAMAM-Pt for a layer to be formed, and the number of layers of PAMAM-Pt interspersed with layers of polyanion poly(vinylsulfoniacid) immobilized on the ITO electrode were monitored and determined by cyclic voltammetry (CV) and UV-Vis. By observing the experimental data obtained during the process of determining the immersion time and number of layers, and taking into account the importance of obtaining NPsPt with electrocatalytic sites available for studies and electrochemical applications, a study was conducted on the activation of the electrode ITO/PAMAM-Pt by electrochemical treatment. The influence of this treatment on the electrochemical response of electrodes ITO/(Pt-PAMAM)n, for the oxidation of adsorbed hydrogen, was investigated by CV and electrochemical impedance spectroscopy. The electrode ITO/PAMAM-Pt electrochemically activated was used in the electrochemical studies of cytochrome C (CytC) and the value of the electron transfer constant (ks), obtained by the method of Laviron, was 5.7 s-1, indicating that this electrode acts as an excellent device for immobilizing the CytC with excellent electron transfer. The main contribution of this thesis was to show that, upon electrochemical treatment, it is possible to activate and improve the performance of electrodes modified with electroactive membranes of NPsPt encapsulated in PAMAM. It is also possible to obtain modified electrodes with a nanostructured film PAMAM-Pt electrochemically activated with excellent performance, economy of materials, without the need to produce membranes with several layers and without the use of polyelectrolytes that may increase resistance to electron transfer and decrease the efficiency of the electrode.

O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica autoimune que apresenta uma ampla variedade de manifestações clínicas e anormalidades imunológicas, afetando principalmente mulheres. É caracterizado pela perturbação da homeostase imunológica, que envolve a indução e produção de autoanticorpos, bem como pela formação e deposição de complexos imunes, que conduzem a uma intensa resposta inflamatória e dano tecidual. Há evidências de que fatores imunológicos, ambientais, hormonais e genéticos estão implicados na patogênese da doença. Genes e proteínas envolvidas na metabolização/detoxificação de xenobióticos são frequentemente utilizados como marcadores de susceptibilidade para o desenvolvimento de doenças, cuja etiologia está relacionada à exposição a fatores de risco ambientais. Enzimas do Citocromo P450 (CYP) são as principais responsáveis pela fase I de detoxificação, na qual ativam o xenobiótico, tornando-o mais eletrofílico e, desta forma, mais reativo. As Glutationa S-transferases (GST) são enzimas detoxificantes de fase II e normalmente conjugam a glutationa reduzida com uma variedade de compostos eletrofílicos, como espécies reativas de oxigênio, facilitando a excreção de produtos tóxicos. Polimorfismos nos genes CYP e GST são capazes de alterar a expressão e a atividade catalítica das enzimas, sendo responsáveis por diferenças interindividuais quanto à capacidade de biotransformação de xenobióticos. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a influência de três polimorfismos GST (GSTM1 nulo, GSTT1 nulo, e GSTP1*Val) e dois polimorfismos CYP (CYP1A1*2C e CYP2E1*5B) na predisposição ao LES em uma amostra de 370 pacientes com LES e 329 doadores de sangue saudáveis provenientes da região sul do Brasil. Os polimorfismos CYP foram genotipados por PCR-RFLP, enquanto que os polimorfismos GST foram genotipados por PCR multiplex (GSTM1 nulo, GSTT1 nulo) e PCR-RFLP para GSTP1. As freqüências alélicas e genotípicas foram comparadas entre pacientes e controles usando o teste de Qui-Quadrado ou o teste Exato de Fisher. As análises foram realizadas subdividindo os indivíduos de acordo com sua origem étnica. Entre os indivíduos Euro-descendentes, observou-se uma menor freqüência de genótipos heterozigotos GSTP1*Val em pacientes com LES em comparação aos controles (p=0,0047; OR 0,63 CI 95% 0,43 – 0,93 em relação a GSTP1*Ile/Ile e OR 0,49 CI 95% 0,26 – 0,92 em relação a GSTP1*Val/Val). No grupo Afro-descendente, houve tendência a uma maior freqüência do alelo GSTP1*Val em pacientes quando comparados aos controles (p=0,061). O alelo CYP2E1*5B foi significativamente mais freqüente nos pacientes do que em controles (p=0,038; OR 2,69 CI 95% 1,00 – 8,42). Não foi observada qualquer implicação clínica dos polimorfismos CYP e GST nos pacientes com LES. Nossos dados sugerem um papel protetor do genótipo heterozigoto GSTP1*105Ile/Val em Euro-descendentes e uma possível influência do alelo CYP2E1*5B na susceptibilidade ao LES entre Afro-descendentes. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune chronic inflammatory disease that presents a variety of clinical manifestations and immunological abnormalities, particularly affecting women. It is characterized by disruption of immunologic homeostasis, which results in the induction and production of autoantibodies, as well as the formation and deposition of immune complexes, leading to an intense inflammatory response and tissue damage. There is evidence that immunological, environmental, hormonal and genetic factors are involved in the pathogenesis of the disease. Genes and proteins involved in metabolism/detoxification of xenobiotics are often used as markers of susceptibility to the development of diseases whose etiology is related to exposure to environmental risk factors. Cytochrome P450 (CYP) enzymes are primarily responsible for phase I detoxification, in which activate the xenobiotic, making it more electrophilic and thus more reactive. The Glutathione S-transferases (GST) are phase II detoxifying enzymes and usually conjugate reduced glutathione with a variety of electrophilic compounds, such as reactive oxygen species, facilitating the excretion of toxic products. Polymorphisms in the CYP and GST genes can alter the expression and catalytic activity of enzymes, being responsible for interindividual differences regarding the capacity of xenobiotics biotransformation. The aim of our study was to evaluate the influence of three GST polymorphisms (GSTM1 null, GSTT1 null and GSTP1*Val) and two CYP polymorphisms (CYP1A1*2C and CYP2E1*5B) in SLE predisposition in a sample of 370 SLE patients and 329 healthy blood donors, both from southern Brazil. The CYP polymorphisms were genotyped by PCR-RFLP, while the GST polymorphisms were genotyped by multiplex PCR and PCR-RFLP for GSTP1. Allelic and genotypic frequencies were compared between patients and controls using the Chi-square test or Fisher´s exact test. Analyses were performed subdividing the individuals according to their ethnic origin. Among European-derived individuals, it was observed a lower frequency of GSTP1*Val heterozygous genotypes in SLE patients compared to controls (p = 0.0047; OR 0.63 CI 95% 0.43 - 0.93 in relation to GSTP1*Ile/Ile) and (OR 0.49 95% CI 0.26 - 0.92 in relation to GSTP1*Val/Val). In African-derived group, there was a trend to a higher frequency of GSTP1*Val allele in patients when compared to controls (p=0.061). The CYP2E1*5B allele was significantly more frequent in patients than controls (p=0.038, OR 2.69 95% CI 1.00 - 8.42). We did not observe any clinical implication of the CYP and GST polymorphisms in patients with SLE. Our data suggest a protective role of the GSTP1*105Ile/Val heterozygous genotype in European-derived and a possible influence of the CYP2E1*5B allele in SLE susceptibility among African-derived.