Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-03-10T14:19:47Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-28T12:16:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T12:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Taís Campos.PDF: 1941952 bytes, checksum: c97f06b80eaaa998c41ad42a9d48dfc7 (MD5) / Introdução: Leishmaniose cutânea (LC) devido à infecção por L. braziliensis é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões cutâneas ulcerativas. Recentemente, atenção tem sido dada à participação das células T CD8+ para a resposta inflamatória deletéria observada em pacientes com LC. Foi demonstrado que estas células contribuem para a imunopatologia através da produção de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina. Em adição às células T CD8+ , células NK e NKT são também importantes fontes de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina, e o papel destas células na infecção por L. braziliensis ainda não foi investigado. Objetivo: Avaliar o papel das células NK na infecção por L. braziliensis. Métodos: As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas a partir de indivíduos saudáveis e de pacientes com LC para a marcação ex-vivo com CD56, CD8, CD3, e marcação intracelular para granzima e perforina. As células derivadas de biópsias foram obtidas para munofenotipagem por citometria de fluxo e imunohistoqímica. Resultados: Identificamos quatro sub-populações de células citotóxicas: células NK (CD8- CD3- ), células NK (CD8dimCD3- ), células NKT-like (CD8brigth CD3+ ) e células T CD8+ . Observamos que as frequências de sub-populações de células NK (CD8- e CD8+ ) estavam aumentadas no sangue periférico de pacientes com LC quando comparadas com IS, e estas duas populações expressam mais granzima e perforina do que as células T CD8+ em pacientes com LC. Observamos ainda que as células NK derivadas de lesões de pacientes com LC expressam mais CD107a, marcador de degranulação, do que as células T CD8+ . E que as células NK contribuem para destruição de parasitos na infecção por L. braziliensis Conclusão: Os nossos dados sugerem uma dicotomia funcional das células NK na leishmaniose cutânea, participando tanto na patogênese da doença quanto na destruição de parasitos. Palavras-chave: leishmaniose cutânea, células NK, infócitos citotóxicos, citotoxicidade.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-24T18:47:40Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T14:43:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T14:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_Taís Menezes Cerqueira Campos de Brito.pdf: 1736787 bytes, checksum: 003a13a8467c51581b7ceeef54973d9e (MD5) / CNPq;NIH;INCT-DT / Introdução: Leishmaniose cutânea (LC) devido à infecção por L. braziliensis é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões cutâneas ulcerativas. Recentemente, atenção tem sido dada à participação das células T CD8+ para a resposta inflamatória deletéria observada em pacientes com LC. Foi demonstrado que estas células contribuem para a imunopatologia através da produção de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina. Em adição às células T CD8+, células NK e NKT são também importantes fontes de citocinas pró-inflamatórias, granzima e perforina, e o papel destas células na infecção por L. braziliensis ainda não foi investigado. Objetivo: Avaliar o papel das células NK na infecção por L. braziliensis. Métodos: As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas a partir de indivíduos saudáveis e de pacientes com LC para a marcação ex-vivo com CD56, CD8, CD3, e marcação intracelular para granzima e perforina. As células derivadas de biópsias foram obtidas para imunofenotipagem por citometria de fluxo e imunohistoqímica. Resultados: Identificamos quatro sub-populações de células citotóxicas: células NK (CD8-CD3-), células NK (CD8dimCD3-), células NKT-like (CD8brigthCD3+) e células T CD8+. Observamos que as frequências de sub-populações de células NK (CD8- e CD8+) estavam aumentadas no sangue periférico de pacientes com LC quando comparadas com IS, e estas duas populações expressam mais granzima e perforina do que as células T CD8+ em pacientes com LC. Observamos ainda que as células NK derivadas de lesões de pacientes com LC expressam mais CD107a, marcador de degranulação, do que as células T CD8+. E que as células NK contribuem para destruição de parasitos na infecção por L. braziliensis Conclusão: Os nossos dados sugerem uma dicotomia funcional das células NK na leishmaniose cutânea, participando tanto na patogênese da doença quanto na destruição de parasitos.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-20T13:42:38Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71854.pdf: 3870328 bytes, checksum: e6d51ee1222bd1369079ed339e270c1b (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-24T19:10:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71854.pdf: 3870328 bytes, checksum: e6d51ee1222bd1369079ed339e270c1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T19:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71854.pdf: 3870328 bytes, checksum: e6d51ee1222bd1369079ed339e270c1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo HIV se caracteriza pela existência de um período de latência clínica (ou período assintomático) entre a infecção aguda e a fase de AIDS, cuja duração é extremamente variável, gerando distintos perfis de progressão entre os indivíduos infectados pelo HIV. Uma pequena fração de indivíduos infectados (5-10%), denominados não progressores de longo termo (LTNP), permanece clinicamente assintomática e com altos valores de TCD4+ (>500 cells/\F06Dl) durante mais de 8 anos de infecção na ausência de tratamento. Alguns desses indivíduos conseguem ainda bloquear quase totalmente a replicação e a evolução viral, gerando uma verdadeira latência evolutiva. O objetivo do presente estudo foi analisar o perfil mutacional do HIV-1 e a dinâmica de emergência e manutenção de mutantes virais de escape da resposta imune em pacientes HIV-1 positivos classificados como LTNPs com diferentes níveis de controle da replicação viral. Para tal, utilizou-se uma casuística de 12 indivíduos LTNPs, classificados como controladores virêmicos (VC) e controladores de elite com (ECB) e sem Blips (EC) de acordo com os seus níveis de controle da infecção. Para cada indivíduo, foram extraídas amostras de DNA a partir de PBMCs obtidos durante a visita mais antiga (V1) e mais recente (VX) disponíveis. O DNA extraído foi utilizado para amplificação e sequenciamento, através de uma metodologia de NGS, dos genes Gag e Nef. As sequências obtidas permitiram o mapeamento do gene nef inteiro (cobertura média de 212.674 seqs/pb) e dos primeiros 1000pbs de Gag (cobertura média de 286.463 seqs/pb) Os consensos de cada mapeamento foram utilizados para as análises de divergência entre V1 e VX e variantes com frequências maior que 0,5% em cada pb mapeado foram consideradas verdadeiras. As análises de evolução evidenciaram o baixo nível de diversidade e divergência dos genes Gag e Nef entre os indivíduos controladores. Indivíduos ECs apresentaram menor perfil mutacional em ambos os genes analisados quando comparados com indivíduos ECB e VC. Enquanto Gag apresentou maior conservação que Nef em VCs, ambos os genes apresentaram semelhante variabilidade in ECs, indicando que o maior controle da viremia limita a evolução em nas duas regiões. Em alguns indivíduos ECBs, evidências de superinfecção e hipermutação mediada por APOBEC3G foi observada. As análises das mutações em regiões de epítopos restritos por CTL demonstraram a presença de mutações indicativas de escape da resposta imune surgidas entre V1 e VX na maioria dos indivíduos. Mutações não sinônimas foram encontradas em baixas frequências para todos os indivíduos, incluindo ECs, indicando que tais variantes surgem, mas a grande maioria não obtém sucesso evolutivo / The HIV infection is characterized by the existence of a clinical latency period (os asymptomatic period) between the acute infection and the AIDS phase, whose duration is extremely variable, generating distinct progression profiles between Hiv infected individuals. A small fraction of infected individuals (5-10%), named long term non progressors (LTNP), remains clinically asymptomatic and with high TCD4+ levels (>500cells/ul) during more than 8 years of infection in absence of treatment. Some of these individuals can even block almost all the viral replication and evolution, generating an evolutionary latency. The objective of this study was to analyze the mutational profile of HIV-1 and the emergency and maintenance dynamic of immune response escape mutants in HIV-1 positive patients classified as LTNPs and with different levels of viral replication control. For this end, a group of 12 LTNP patients, classified as viremic controllers (VC) and Elite Controllers with (ECB) and without Blips (EC) according to their level of viremia control, was used. For each individual, DNA samples were extracted from PBMCs obtained during the earliest (V1) and most recent visits (VX) available. The extracted DNA was used to amplification and sequencing, through a NGS methodology, of the Gag and Nef genes. The sequences obtained allowed to map the whole Nef gene (medium coverage of 286.463 reads/pb) and the first 1000bps of Gag (medium coverage of 212.674 reads/pb) The consensus sequences of each mapping were used to divergence analyses between V1 and VX and variants with frequencies higher than 0,5% in each mapped bp were considered real. The evolution analyses showed a lower degree of diversity and divergence of Gag and Nef genes between controllers. EC individuals presented lower mutational profile in both genes when compared with ECB and VC patients. While Gag presented higher conservation than Nef in VCs, both genes had showed similar variability in ECs, indicating that a higher viremia control limit the evolution in both regions. In some ECB individuals, evidence of superinfection and APOBEC3g mediated Hypermutation was observed. The analyses of mutation along regions of CTL-restricted epitopes had showed the presence of mutations arised between V1 and VX, which were indicative of imune response escape, in most individuals. Non synonymous mutations had been found in lower frequencies in all individuals, including ECs, indicating that those escape variantes arise, but most don\2019t manage to obtain evolutionary success

Tese de mestrado. Engenhariade Segurança e Higiene Ocupacionais. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers (NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC), una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ) formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43 en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10, durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10 utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43 en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB). Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the “Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity. Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10 during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process. Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B (GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition, when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-23T18:08:27Z No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-23T18:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o agente causador da doença de Chagas, que afeta entre 8 e 9 milhões de pessoas em todo mundo. Este protozoário é responsável por uma variedade de manifestações clínicas em humanos, possui uma ampla gama de hospedeiros e apresenta grande diversidade genética e biológica. As pequenas regiões codificantes (uORFs) presentes na região 5’não traduzida (5’UTR) de mRNAs maduros são conhecidas por afetar a eficiência da tradução de muitos genes eucariotos. Pouco é conhecido sobre a existência e conservação de uORFs em genes de Tripanossomatídeos. Este trabalho se propôs avaliar o grau de conservação das uORFs e seu potencial como marcador molecular das populações de T. cruzi, através da análise de sete genes contendo uORFs previamente selecionados. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados e fragmentos das 5’UTRs contendo uORFs foram amplificados, através de PCR, de cepas representativas de cada um dos três grupos populacionais do parasito, TcI, TcII e ZIII. Após clonagem e sequenciamento, alto grau de conservação das uORFs foi observado de um ponto de vista populacional e a ruptura de uma uORF foi observada em apenas um gene. Isto é um forte indicativo de que em T. cruzi essas uORFs são funcionalmente ativas, pois do contrário teriam sido extintas das 5’UTRs durante o processo evolutivo sofrido pelos grupos populacionais de T. cruzi. A observação de mutações grupo-específicas nas sequências nucleotídicas das 5’UTRs de alguns genes, motivou a realização de testes para a utilização desses fragmentos como possíveis marcadores moleculares para as populações do parasito. A obtenção dos fragmentos dos genes codificantes de ATPase e Ferredoxina foi realizada em mais de 15 cepas e isolados. Verificou-se a existência de mutações grupo-específicas na 5’UTR do gene ATPase, que corroboram com a classificação filogenética proposta deste parasito. Na 5’UTR do gene Ferredoxina, notou-se a presença de uma sequência repetitiva simples, composta por dinucleotídeos CA (citosina e adenina) seguidos de mononucleotídeos A. As variações desta repetição puderam ser utilizadas para agrupar todos os isolados/cepas de T. cruzi do estudo em nove genótipos distintos, os quais são relativamente independentes da classificação atualmente proposta de três grandes grupos populacionais. O uso desta pequena repetição na 5’UTR do gene Ferredoxina permite uma nova forma de classificar os isolados e cepas de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease in humans, and affects about nine million of people around the world. It induces a variety of clinical presentations in patients, have a wide range of vertebrate hosts and exhibits great diversity of genetic and biological characteristics. Upstream Open Reading Frames (uORFs) are small open reading frames located in the 5’ UTR of a mature mRNA. They have been shown to affect the translation efficiency of many eukaryotic genes. Scarce information is available about the existence and conservation of uORFs in Trypanosomatids genes. This study aims to evaluate both the degree of sequence conservation in uORFs and its potential as molecular marker of populations of T. cruzi. To this end, upon a PCR amplification and cloning of 5'UTR fragments, sequence analysis of seven genes that presents uORFs were carried out in four strains that are typical representative of three main population groups in T. cruzi. A remarkable degree of conservation of uORFs was observed in all isolates. Out of several mutational events observed in these uORFs, a disruption of a uORF was observed in only one gene. This indicates that in T. cruzi these uORFs are functionally active, otherwise it would have changed during the evolutionary process. The observation of group-specific mutations in the 5'UTRs of some genes suggested that they could be used in an PCR amplification assay as molecular markers for T. cruzi populations. The fragments of genes ATPase and Ferredoxin were amplified from 15 strains and isolates. After sequencing, the group-specific mutations observed in the 5'UTR of the gene ATPase corroborate the current classification of T. cruzi populations in three main groups: TcI, TcII and ZIII. In the 5'UTR of the Ferredoxin gene, the sequence alignment revealed the presence of a small repetitive sequence composed of dinucleotides CA and mononucleotides Adenine. The variations in length and composition of this simple repetitive sequence allowed the clustering of all 15 isolates into nine distinct genotypes, which were not correlated to main population groups. Thus, a new approach to strain typing in T. cruzi can be envisaged by using this SSR (simple sequence repeat).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-15Bitstream added on 2014-06-13T20:31:49Z : No. of bitstreams: 1 silva_go_me_sjc.pdf: 1111622 bytes, checksum: e539d76b4d826d8bae2e60a44de64ea5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cimentos endodônticos podem liberar componentes tóxicos que interagem com os tecidos periapicais. A proposta deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade de quatro cimentos endodônticos (EndoREZ, RoekoSeal, AHPlus e cimento experimental à base de óleo-resina da Copaifera multijuga) utilizando ensaios biológicos. Os cimentos foram mixados e incubados em estufa de umidade relativa a 37°C com 5% CO2 por 24 h. A exposição do meio de cultura aos cimentos ocorreu após 12 h do endurecimento dos cimentos. Células V79 foram expostas às diluições dos extratos por 24 h e a sobrevivência celular foi mensurada fotometricamente. A viabilidade celular foi mensurada pelo teste de MTT em espectrofotômetro e a genotoxicidade, indicada pela formação de micronúcleos, foi determinada após 24h do período de exposição. Os resultados da taxa de sobrevivência celular e a quantidade de danos ao DNA foram estatisticamente analisados pelo teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). A citotoxicidade em relação ao grupo controle decresceu na seguinte ordem EndoREZ > Copaíba ≥ AH Plus > RoekoSeal. A formação de micronúcleos (MN) para indicar a genotoxicidade foi induzida somente pelos extratos do EndoREZ, sendo mais genotóxico que o EMS (controle positivo) / Endodontic sealers could release toxic components that may interact with periapical tissues. The purpose of this study was to evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of four endodontic sealers (EndoREZ, RoekoSeal, AHPlus and experimental root canal sealer- based on Copaifera multijuga oil-resin) using routine cell biology techniques. The sealers were mixed and incubated in a humidified incubator at 37°C with 5% CO2 in air for 24 h. The exposure of the culture medium to the sealers occurred after 12 h of cure. V79 cells were exposed to dilutions of this extracts for 24 h and cell survival was measured photometrically. The cell viability was measured by MTT test in a spectrophotometer and the genotoxicity as indicated by the formation of micronuclei was determined after a 24 h exposure period The results of the cell survival rates and the amount of DNA damage was statistically analyzed for Kruskal-Wallis (p<0.05) test. The ranking of cell survival from the most to the least toxic material was: EndoREZ> Copaíba ≥ AH Plus > RoekoSeal. The formation of micronuclei (MN) to indicate genotoxicity was induced only by extracts of EndoREZ, being more genotoxic than EMS (positive control)

O vínculo entre papilomavírus humano de alto risco e câncer cervical está bem estabelecido. Apesar da existência de vacinas profiláticas contra infecções pelos tipos mais comuns de HPV, para infecções e tumores causados por esses vírus as alternativas terapêuticas são restritas. Encontramos alguns motivos com homologias para proteínas do HPV de alto risco durante o imunoscreening de uma biblioteca de phage display com soros de participantes HPV-16-soropositivos da coorte Ludwig-McGill. Após enriquecimento das sequências, os bacteriófagos recombinantes foram purificados e amplificados para uso como imunógenos.Usando uma abordagem profilática, nós vacinamos experimentalmente camundongos imunocompetentes com um dos nossos bacteriófagos recombinantes, usando o bacteriófago sem inserto como controle. Estes camundongos foram então desafiados com células tumorais TC-1 (HPV-16 positivas), tendo-se avaliado as respostas imunes disparadas durante a progressão tumoral. Também usamos uma abordagem terapêutica, aonde os camundongos foram primeiro injetados com as células tumorais e imunizados com o bacteriófago após o estabelecimento do tumor. O crescimento tumoral foi monitorado e os tumores, baço e linfonodos foram avaliados quanto à quantidade e qualidade da resposta imunológica. Os testes de ELISA revelaram que todos os camundongos vacinados responderam à imunização com os diferentes bacteriófagos. O crescimento tumoral foi significativamente reduzido nas imunizações profiláticas e terapêuticas, embora a redução do tumor fosse mínima quando os camundongos foram tratados 9 dias após o enxerto. A redução no crescimento tumoral também se traduziu em uma sobrevivência significativamente maior para os camundongos imunizados. Estudos de infiltração celular não revelaram alterações em diversas sub-populações imunes, mas uma tendência de aumento de linfócitos T citotóxicos foi observada nos camundongos imunizados com PEP1 (bacteriófago contendo inserto). A importância deste aumento de CD8 na redução observada do crescimento tumoral foi confirmada utilizando camundongos CD8-knockout, onde a redução do crescimento tumoral previamente observada foi anulada. Foi observado um aumento de taxa CD8:CD4 nos camundongos imunizados e isto é uma indicação de ambiente tumoral citotóxico. Os ensaios de proliferação celular para testar a especificidade do antígeno dos linfócitos dos camundongos imunizados foram, no entanto, inconclusivos; da mesma forma, não pudemos alterar o padrão observado com o uso de adjuvante CpG. A utilidade da técnica de phage display também foi observada neste trabalho experimental. Trabalhos adicionais para entender o mecanismo de ação desses fagos recombinantes no controle do crescimento de tumores causados por HPV e seu potencial imuno-estimulador são necessários / The link between high-risk human papillomavirus and cervical cancer is well established. Despite the existence of prophylactic vaccines against infections by the most common types of HPV, therapeutic alternatives are limited for infections and tumors caused by these viruses. We found some homology motifs for high-risk HPV proteins during the immune-panning of a phage display library with sera from HPV-16- seropositive participants of the Ludwig-McGill cohort. After enrichment of the sequences, the recombinant bacteriophages were purified and amplified for use as immunogens. Using a prophylactic approach, we vaccinated experimentally immunocompetent mice with one of our recombinant bacteriophages using the insertless bacteriophage as a control. These mice were then challenged with TC-1 tumor cells (HPV-16 positive), and the immune responses triggered during tumor progression were evaluated. We also used a therapeutic approach where mice were first injected with tumor cells and immunized with the bacteriophage after tumor establishment. Tumor growth was monitored and tumors, spleen and lymph nodes were evaluated for the quantity and quality of the immune response. ELISA tests revealed that all vaccinated mice responded to immunization with the different bacteriophages. Tumor growth was significantly reduced in prophylactic and therapeutic immunizations, although tumor reduction was minimal when mice were treated 9 days after TC-1 cells grafting. The reduction in tumor growth also translated into a significantly greater survival for the immunized mice. Cell infiltration studies did not reveal changes in several immune subpopulations, but an upward trend in cytotoxic T lymphocytes was observed in mice immunized with PEP1 (insert-containing bacteriophage). The importance of this increase in CD8 in the observed reduction of tumor growth was confirmed using CD8-knockout mice, where the previously observed reduction of tumor growth was abolished. An increase in CD8:CD4 rate was observed in the immunized mice and this is an indication of a cytotoxic tumor environment. Cell proliferation assays to test the antigen specificity of lymphocytes from immunized mice were, however, inconclusive; likewise, we could not change the pattern observed with the use of CpG adjuvant. The usefulness of the phage display technique was also observed in this experimental work. Additional studies to understand the mechanism of action of these recombinant phages in the control of HPV tumor growth and its immunostimulatory potential are warranted

Em diversos tipos de neoplasias já foi demonstrado que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Esta relação aparece intimamente correlacionada ao perfil de expressão imunoistoquímica do tumor. A presença de linfócitos T citotóxicos(CTLs) no microambiente do tumor sugere uma característica biológica crucial para a modulação da resposta imunológica antitumoral. Por outro lado, as células T regulatórias (Tregs) são importantes na manutenção da homeostase imune, em virtude da sua capacidade em inibir a resposta imunológica. Defeitos na função ou uma diminuição do número das Tregs tem sido documentado em doenças auto-imunes, ao passo que no câncer esta população ainda pode ser mais bem estudada. Sendo estabelecido que o câncer pode ser promovido e / ou agravado pela inflamação e infecções e considerando que a superexpressão de componentes do controle da resposta inflamatória específicos de Tregs e CTLs podem representar um potente mecanismo para o processo de progressão e/ou regressão de carcinoma papilífero de tireoide (CPT), o objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar as Tregs e CTLs , bem como avaliar e investigar a relação e o papel dessas células implicado na patogênese da resposta imune em pacientes acometidos com CPT associado ou não com a presença de Tireoidite de Hashimoto (TH), relacionando-as com fatores prognósticos clínico-patológicos. Foram selecionados 36 casos estratificados em 3 grupos (12 casos em cada grupo): CPTS correspondeu aos casos de CPT sem associação com quadro de tireoidite, CPTL aos casos de CPT associados á tireoidite linfocitica (CPTL) e CPTH, casos aonde o CPT estava associado á tireoidite de Hashimoto (CPTH) os quais foram submetidos á técnica de imunoistoquímica para os marcadores CD4, CD8, CD25, CD56, FOXP3 e Gran B e os resultados avaliados pelo método quantitativo. Os dados clínicos foram obtidos dos prontuários médicos. As leituras das células marcadas foram feitas nas regiões de carcinoma papilífero (denominadas intratumorais), nas áreas de parênquima tireoidiano de interface ao tecido neoplásico (denominadas peritumorais) e em áreas subsequentes de tecido tireoidiano normal (denominadas distantes). O número de células T do infiltrado 9 inflamatório foi expresso pela média aritmética da contagem das células dos cinco campos distintos em cada área. Foram feitas análise de variância de Medidas Repetidas Modelo Mixto e calculado o coeficiente de correlação de Pearson para as variáveis CD4 com CD8 e FOXP3 com GranB. Adicionalmente, apesar da avaliação dos CPT divididos segundo seus parâmetros clínico-patológicos não ter se apresentado significante, verificamos que em CPTH as imunovariáveis CD4 e FOXP3 (marcadores para Tregs) apresentaram maior marcação em tumores > 4,1 cm. Nesse mesmo grupo CD8 e Gran B (marcadores para CTLs) se apresentaram com maior imunomarcação em tumores não metastáticos, de estádio menor e sem recorrência. No geral, o infiltrado de células imunes entre os grupos CPTH, CPTL e CPTS, apresentou-se com diferentes densidades entre as áreas estudadas (intratumoral, peritumoral e distante). Linfócitos infiltrando o tecido de forma difusa (CPTS e CPTL) ou em agregados linfoides (CPTH) foram mais abundantes em áreas peritumorais e distantes e a proporção das células CD4+ e CD8+ variou substancialmente entre os grupos, de maneira que todos apresentaram correlação positiva (CPTH r=0,67; CPTL r=0,7 e CPTS r=0,35) crescente entre as variáveis. Em conclusão, estes resultados indicam que nos CPTs o microambiente imune parece ter uma relação com carcterísticas patológicas de progressão do tumor. Nosso estudo mostrou que em CPTH a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos Tregs e T citotóxicos está inversamente relacionada. Corroborando com a importância do microambiente imune na evolução dos CPTs, os Tregs exerceram atividade pró-tumoral, favorecendo tumores mais agressivos e os CTLs, atividade antitumoral, favorecendo características de menor agressividade. / It has already been shown that differences in tumoral immune infiltrate profile are related to prognosis and response to treatment in several types of neoplasias. This relationship is closely correlated to the tumor immunohistochemical expression profile. The presence of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) in the tumor microenvironment suggests a crucial biological feature for the modulation of the antitumor immune response. On the other hand, regulatory T cells (Tregs) are important in maintaining immune homeostasis, because of their ability to inhibit the immune response. Defects in function or a decrease in the number of Tregs has been documented in autoimmune diseases, nevertheless in cancer this population may still be better studied. With the establishment that cancer can be promoted and / or aggravated by inflammation and infections and considering that overexpression of components of the inflammatory response specific for Tregs and CTLs may represent a potent mechanism for the progression and / or regression of thyroid papilary carcinoma (CPT). The objective of this study was to identify and characterize the Tregs and CTLs, as well as to evaluate and investigate the relationship and the role of these cells involved in the pathogenesis of the immune response in patients with CPT associated or not with the presence of Hashimoto\'s thyroiditis (HT) besides relating them to clinical-pathological prognostic factors. Thirty-six stratified cases were selected in 3 groups (12 cases per group): CPTS corresponded to TLC without thyroiditis association, CPTL to cases of TLC with lymphocytic thyroiditis associated (CPTL) and CPTH was considered cases which CPT was associated to Hashimoto thyroiditis (CPTH). These three groups were submitted to the immunohistochemical technique for the CD4, CD8, CD25, CD56, FOXP3 and Gran B markers and the results was evaluated by the quantitative method. Clinical data were obtained from medical records. Stained cells readings were made in the regions of papillary carcinoma (termed intratumoral area), in the areas of the thyroid parenchyma interface to the neoplastic tissue (termed peritumoral) and in subsequent areas of normal (distal) thyroid tissue. The number of T cells of the inflammatory infiltrate was expressed by the arithmetic mean of cells counted in five distinct fields. The variance analysis of Mixed Model Repeated 11 Measurements and the Pearson correlation coefficient for the CD4 and CD8 and FOXP3 variables with GranB were calculated. In addition, although the CPT divided according to clinical-pathological parameters did not present a significant difference, we found that the CD4 and FOXP3 immunoglobulins (Tregs markers) showed higher marking in tumors> 4.1cm. In this same group, CD8 and Gran B (markers for CTLs) presented a higher immunolabeling in nonmetastatic tumors, in smaller stage and in cases without recurrence. In general, the infiltrate of immune cells between the CPTH, CPTL and CPTS groups, presented different densities between the studied areas (intratumoral, peritumoral and distant). Lymphocytes infiltrating diffuse tissue (CPTS and CPTL) or lymphoid aggregates (CPTH) were more abundant in peritumoral and distal areas and the proportion of CD4 + and CD8 + cells varied substantially between groups, so that all groups presented positive correlation (CPTH r = 0.67, CPTL r = 0.7 and CPTS r = 0.35), increasing among the variables. In conclusion, these results indicate that in the CPTs the immune microenvironment seems to have a relation with pathological characteristics of tumor progression. Our study showed that in CPTH the density of tumor and peritumoral infiltrate by Tregs and T cells is inversely related. Corroborating with the importance of the immune microenvironment in the evolution of CPTs, Tregs exerted pro-tumor activity, favoring more aggressive tumors. While CTLs exerted an antitumor activity, favoring characteristics of lower aggressiveness.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão e o padrão de distribuição de linfócitos citotóxicos (LCs) e linfócitos T regulatórios (LTregs) no tecido gengival de pacientes com doença periodontal através de análise imunoistoquímica. Foram selecionados 30 pacientes (10 por grupo) com diagnóstico de periodontite agressiva (PA), periodontite crônica (PC) e gengiva clinicamente saudável (controle); dos quais foi colhida uma amostra de tecido gengival. A distribuição das células (epitélio e córion) foi identificada usando os imunomarcadores CD56, CD57, Granzima B e Perforina (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). A imunoexpressão foi avaliada, utilizando representação de imagem por meio de um sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz, adaptado a uma câmera de alta resolução. Contagens independentes de 10 campos separados para cada caso foram feitas. Two-way ANOVA e posterior teste de Fisher foram utilizados para observar diferenças entre os diagnósticos e os marcadores; e teste t de Student para observar diferenças entre epitélio e córion (p<0.05). Os resultados indicaram que pacientes com PA e PC apresentaram um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+, em relação ao grupo controle, porém sem diferenças entre si; um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+ foi observado em relação às células Granzima B+ e Perforina+ em todos os pacientes. Em relação aos LTregs, o número de células CD25+ e FOXP3+, foi significativamente diferente entre PA, PC e controle, aparecendo em maior número na PC. Células CD4+ foram observadas em número similar em pacientes com PA e PC, diferindo significantemente do grupo controle; em pacientes com PA e PC, foi observado um número significantemente maior de CD4+, em relação às células CD25+ e FOXP3+. Pacientes com PA e PC tem maior número de LCs no tecido gengival em relação ao grupo controle sugerindo a participação destas células na patogênese da PA e PC. Pacientes com PA apresentaram menor número de LTregs no tecido gengival em comparação aos pacientes com PC, sugerindo que estas células podem estar envolvidas no mecanismo de regulação do processo inflamatório e reabsorção óssea. / This project aims to observe the expression and distribution of cytotoxic lymphocytes (LCs) and regulatory T lymphocytes (LTregs) in gingival tissue from periodontal disease affected patients through immunohistochemical analysis. 30 patients (10 per group) diagnosed with aggressive periodontitis (PA), chronic periodontitis (PC) and clinically healthy gingiva (control) were selected; from which a sample of gingival tissue was collected. The distribution of cells (epithelium and chorion) was identified using the immunomarkers CD56, CD57, Granzyme B, Perforin (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). The immunoexpression was assessed using image representation by a computer system, comprising a light microscope adapted to a high resolution camera. Independent counts of 10 separate fields for each case were done. Two-way ANOVA and posterior Fisher´s Test were used to observe differences between diagnostics and immunomarkers; and unpaired Student t test to observe differences between epithelium and chorium (p<0.05). The results indicates that patients with PA and PC presented a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells, in relation to control, but without differences between each other; a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells was observed in relation to Granzyme B and Perforine cells in all patients. Related to the LTregs, the number of CD25+ and FOXP3+ cells was significantly different between PA, PC and control, appearing in greater number in PC. CD4+ cells were observed in similar number in patients with PA and PC, it was observed a significantly higher number of CD4+, in relation to CD25+ and FOXP3+ cells. Patients with PA and PC have a greater number of LCs in gingival tissue in relation to control group - suggesting the participation of this cells in the pathogenesis of PA and PC. Patients with PA presented less LTregs in gingival tissue when compared to PC patients, suggesting that this cells may be involved in the regulatory mechanism of the inflammatory process and bone resorption.