Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

Orientadores: José Camilo Novello, Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fontanesi_KarinaKleinfelder_M.pdf: 2853236 bytes, checksum: 30ce9c486d1739927e3bd38f96e22015 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O sistema citrícola no Brasil representa um setor de grande importância econômica. O Estado de São Paulo é o principal produtor de citros, fazendo do país o maior exportador de suco de laranja concentrado congelado. Apesar do Brasil ocupar uma posição de destaque no cenário mundial de citricultura, o país não consegue aumentar a sua produtividade devido à ocorrência simultânea de pragas e doenças, sendo que a clorose variegada dos citros (CVC) se mostra como uma das mais limitantes sobre esta produção. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, que é capaz de infectar todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), embora a tangerina Poncan (Citrus reticulata Blanco) seja considerada tolerante à sua infecção. Apesar de muitos estudos já tenham sidos realizados a fim de se compreender melhor os mecanismos da sua patogenicidade, questões ainda permanecem em aberto acerca dos mecanismos que controlam o seu processo de infecção e o desenvolvimento da doença. Desse modo, foi realizado um estudo comparativo do proteoma das folhas de laranja Pêra e de tangerina Poncan após 30 dias da inoculação com a X. fastidiosa e o dos obtidos de folhas não infectadas, empregando a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MS). Foram confeccionados mapas 2DE com o intuito de se verificar proteínas diferencialmente expressas que por ventura poderiam estar relacionadas aos mecanismos de defesa e resistência da planta. Entre as proteínas (spots) de laranja Pêra, separadas por eletroforese bidimensional, 60 spots foram considerados como estatisticamente relevantes, apresentando alteração de intensidade. Entre as proteínas de tangerina Poncan analisadas na mesma condição, 38 foram consideradas como estatisticamente relevantes. Confeccionou-se para a planta tangerina Poncan géis de poliacrilamida utilizando IPG com gradiente de pH linear de 4-7, visto que houve um grande número de proteína diferencialmente expressas nesta faixa. Como resultado, foram obtidos 45 spots com diferença de expressão. A identificação dessas proteínas foi feita por meio do seqüenciamento por espectrometria de massas através do sistema LC ESI-MS/MS ou MALDI-Q-TOF. O seqüenciamento por MS possibilitou a aquisição da seqüência de aminoácidos de 49,7% dos spots. Dentre eles, 76% dos spots foram identificados, enquanto que 24% não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas quatro foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência de eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducionais, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. As proteínas identificadas foram relacionadas com a produção de energia, com o metabolismo primário, com mecanismo de defesa, proteínas de microrganismos e proteínas desconhecidas. Laranja Pêra apresentou uma diminuição da expressão de proteínas relacionadas à fotossíntese, o que coincide com os primeiros efeitos sentidos pelas plantas colonizadas pela bactéria. Em contrapartida, tangerina Poncan apresentou um aumento de expressão de proteínas relacionadas à resposta de defesa contra esse patógeno. / Abstract: The citrus system in Brazil represents one of the most important economic sectors. The State of São Paulo is the main producer of citrus, settling the country as the biggest exporter of concentrated freezing orange juice. Besides holding the outstanding position in the worldwide citrus culture scene, the country cannot raise its productivity due to simultaneous occurrence of plagues and diseases, being the citrus variegated chlorosis (CVC) one of the most limiting diseases affecting the citrus production. This disease is caused by bacterium Xylella fastidiosa, that which is able to infect all sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) varieties, however ponkan (Citrus reticulate Blanco) was considered resistant to it. Although, many studies have already been done in order to understand, in a better way, the mechanism of its pathogenicity, there are still queries about the mechanisms which control the process of its infection and the development of the disease. In this manner, we did a comparative proteomics study of leaves from sweet orange and ponkan after 30 days of the inoculation with X. fastidiosa versus leaves not infected with this bacterium (healthy plants), using two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and mass spectrometry techniques. Comparative 2DE maps were done with the aim to verify differentially expressed proteins related with defense mechanism and the plant resistance. Among the proteins (spots) extracted from sweet orange, separated by two-dimensional gel electrophoresis, 60 spots were considered with statistical significance, showing intensity alteration. On the other hand, among the proteins (spots) extracted from ponkan and analyzed in the same condition, 38 spots were considered with statistical significance. Gels using linear pH gradient ranging from 4 to 7 were prepared for ponkan gels using, because there were a larger number of differentially expressed proteins in this area. As a result, we obtained 45 spots with difference in its expression. The identification of these proteins was done by sequencing using mass spectrometry like LC ESI-MS/MS or MALDI-Q-TOF. 143 spots were analyzed by mass spectrometry and were obtained amino acid sequence from 71 (49,7%) of the spots. Between them, 54 (76%) were identified, while 17 (24%) presented no homology in the database used. Overall, 4 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the protein found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. The identified proteins play a role in energy, primary metabolism, defense mechanism, unknown proteins and microorganism proteins. The sweet orange presented a decrease in expression of photosynthesis related protein, indicating a possible lower photosynthetic activity resulting from early effects of the bacterial colonization in affected plants. On the other hand, ponkan showed an increase in defense-related proteins response against this pathogen. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio Takita / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:21:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Muranaka_LigiaSegatto_M.pdf: 4670725 bytes, checksum: f903ecd21649fe431b36cd1ea62d804b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa que causa várias doenças em diferentes espécies de plantas, como a clorose variegada dos citros (CVC) em Citrus sinensis, cujos danos econômicos são da ordem de milhões de dólares anuais. O desenvolvimento dos sintomas tem sido associado ao bloqueio dos vasos do xilema causado pela formação de um biofilme pela bactéria. Recentemente foi verificado que o biofilme de X. fastidiosa é mais resistente a compostos antimicrobianos que a forma planctônica. Essa resistência tem se mostrado um fenômeno complexo que não pode ser explicado por um único mecanismo, e sim por multifatores. Nesse sentido, a proposta desse trabalho foi identificar, por microarranjos de DNA, genes possivelmente associados à adaptação do biofilme na presença de compostos antimicrobianos, em concentrações letais para células em crescimento planctônico, mas que não inibiram o crescimento do biofilme. Foram encontrados 223 (7,87%) CDS induzidas na presença de cobre e 150 (5,29%) reprimidas. Com tetraciclina foram 450 (15,89%) induzidas e 449 (15,85%) reprimidas. Muitas sequências codificadoras envolvidas com funções da síntese proteica, metabolismo energético, divisão celular e movimentação foram moduladas negativamente em ambas as situações, sugerindo que tais modificações contribuiriam para um provável estado de resistência. Com a adição da dose subinibitória de cobre também foi observada a indução de genes relacionados à adesão e produção de toxinas, que estão envolvidos com a virulência da bactéria em planta, o que sugere esta seria aumentada possivelmente induzindo maior severidade de sintomas. Já com tetraciclina o oposto foi observado, repressão de genes relacionados à formação do biofilme e produção de toxinas. No entanto, identificamos a indução de um possível mecanismo de resposta SOS, pela qual genes relacionados ao sistema toxina-antitoxina seriam superexpressos. Esse sistema provavelmente está envolvido com a morte celular programada e formação de células persistentes. Assim é possível concluir que doses subinibitórias de compostos antimicrobianos poderiam ao invés de matar, induzir a virulência da bactéria, como ocorrido com o cobre, ou a formação de células persistentes, como observado com a tetraciclina. Outra abordagem desse trabalho foi à realização de experimentos in vitro e in vivo com um análogo de cisteína, o N-acetyl-L-cysteina (NAC), que já vem sendo utilizado na medicina para desestruturação de biofilmes de bactériaspatógenas de humanos. Resultados da quantificação da massa celular, número de célulasviáveis e exopolissacarídeos totais revelaram que todas as doses de NAC (1, 2 e 6 mg/mL) testadas nos experimentos in vitro diminuiram a formação do biofilme e inibiram o crescimento de X. fastidiosa, o que indica um possível efeito tóxico dessa substância. Nos experimentos in vivo foi observada uma grande redução dos sintomas de CVC em plantas de C. sinensis infectadas e tratadas com diferentes doses de NAC. Esses estudos abrem uma real perspectiva ao uso dessa substância para o manejo da CVC. / Abstract: Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium that causes several diseases in different plant species, including citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), whose economic damage is of millions of dollars annually. The symptoms development has been associated with the blockage of xylem vessels caused by bacterial biofilm formation. Recently it was found that the biofilm of X. fastidiosa is more resistant to antimicrobial compounds than the planktonic cells. This resistance has been considered as a complex phenomenon that cannot be explained by a single mechanism, but by multi-factors. Accordingly, the intent of this study was to identify through DNA microarray technology, genes possibly involved in adaptation of biofilm cells to the presence of antimicrobial compounds in concentrations that are lethal to cells in planktonic growth, but do not inhibit the cell growth in biofilm. We found 223 (7.87%) genes induced in presence of copper and 150 (5.29%) genes repressed. For tetracycline, there were 450 (15.89%) induced genes and 449 (15.85%) repressed ones. Many genes encoding proteins related to protein synthesis, energy metabolism and cell division were negatively modulated in both, copper and tetracycline treatments, suggesting that these changes could contribute to a state of resistance. When a subinhibitory dose of copper was applied we could also observe the induction of genes related to adhesion and thus biofilm formation and toxin production, suggesting that the bacterial virulence should be increased. The opposite was found for tetracycline. However, we observed the induction of a possible SOS response mechanism in which genes related to a toxin-antitoxin system was overexpressed. This system is probably involved with programmed cell death and formation of persistent cells. We then concluded that subinhibitory doses of antimicrobial compounds could induce bacterial virulence as occurred for copper, or the formation of persistent cells, as observed for tetracycline rather than kill the cells. Another approach of this work was to carry out experiments in vitro and in vivo with an analogue of cysteine, N-acetyl-L-cysteine (NAC), which has been already used in medicine as a drug for disruption of biofilms formed by human pathogenic bacteria. Results of cellular mass quantification, number of viable cells and total exopolysaccharide content revealed that all doses (1.0, 2.0 and 6.0 mg / mL) of NAC tested in in vitro experiments decreased the biofilm formation and inhibited growth of X. fastidiosa, which indicated that this substance could also be toxic for the bacteria. In vivo experiments showed a strong reduction in CVC symptoms in C. sinensis plants infected and treated with different doses of NAC. These studies open a real prospect for the use of this compound in CVC management. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:55:46Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T19:56:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Fernanda Bueno Sampaio - 2013.pdf: 855102 bytes, checksum: 072ad37c90c900b69a5b7d188b872f7c (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Citrus Black Spot (CBS) caused by Guignardia citricarpa is classified as quarantine disease, imposing restrictions to fresh fruits shipping to the European Union countries. In the state of Goiás, despite systematic phytosanitary surveys, its distribution and occurrence are unknown due to lack of available technologies for diagnosis. The occurrence of latent infections, the presence of an endophytic species morphologically similar to G. citricarpa, as well as time consuming for diagnosis through conventional methods require the validation of fast, efficient, reproducible, safe and sensitive methods of diagnosis to provide reliability of diagnosis and disease surveys for its detection and delimitation. Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia Reis Pena.pdf: 12445938 bytes, checksum: b868fb90c9a26e2e3e48ab91d6b70a66 (MD5) Previous issue date: 2007-05-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The citrus blackfly (Aleurocanthus woglumi) an important pest of the citrus of Asian origin, was detected in Brazil in 2001. The aim of this research was to evaluate the biology and infestation levels of A. woglumi in three host plants (orange Pêra, C. sinensis, acid lime Tahiti, Citrus latifolia and mango, M. indica) and biometry evaluations. For this, experiments were assembled in the period of January to June of 2006 at laboratory conditions. It was verified that acid lime Tahiti had been shown as the most suitable host for A. woglumi. Orange Pêra and mango are similar, being the citrus genus the most favorable to the complete development of A. woglumi. Mango is an appropriate host for A. woglumi. The duration of embrionary development was 15 days on average for the three hosts. The fourth nymph stadium was the longest when compared to the other stages of evolutive cycle. The higher viabilities were on third nymph stages, eggs and second nymph stages. The duration of egg-adult cycle was 70 days on average (2 months and 10 days) for the three hosts evaluated. / A mosca-negra-dos-citros (Aleurocanthus woglumi Ashby) uma importante praga dos citros de origem asiática, foi detectada no Brasil em 2001. O objetivo deste estudo foi avaliar a biologia e os níveis de infestação de A. woglumi em três plantas hospedeiras (laranja Pêra, C. sinensis; lima ácida Tahiti, Citrus latifolia e manga, M. indica) e avaliações de biometria. Para isto, foram montados experimentos no período de janeiro a junho de 2006 em condições de laboratório. Foi verificado que lima ácida Tahiti se mostrou o hospedeiro mais favorável para A. woglumi. Laranja Pêra e manga assemelham-se; sendo que o gênero Citrus se mostrou mais favorável ao desenvolvimento completo de A. woglumi. Manga é um hospedeiro adequado para A. woglumi. A duração do desenvolvimento embrionário foi de 15 dias em média para os três hospedeiros. O estádio de ninfa 4 (pupário) foi o mais longo quando comparado com as outras fases do período desenvolvimento. As maiores viabilidades foram nas fases de ninfa 3, ovos e ninfa 2. A duração do ciclo ovo-adulto foi de 70 dias em média (2 meses e 10 dias) para os três hospedeiros avaliados.

A Morte Súbita dos Cítros (MSC) é uma doença que afeta plantas de laranjeira-doce enxertadas em limão Cravo ou Volkameriano e ainda não tem o agente causal determinado. Para entender quais são as principais mudanças fisiológicas causadas pela MSC, analisou-se as alterações nos metabolitos primários, tanto da casca da copa quanto do cavalo. Fez-se análises dos extratos hexânico e alcoólico com RMN em alta resolução e do extrato hexânico com cromatografia gasosa. Também analisou-se os metabolitos diretamente nas cascas com técnicas de RMN em alta e baixa resolução. Com essas análises foi possível observar que a MSC altera a deposição de triacilglicerídeos e sacarose nas cascas. A MSC também modifica o perfil de ácidos graxos, com o decréscimo dos teores de ácido oléico e linolênico e aumento dos ácidos cáprico, láurico, mirístico, plamítico, esteárico e linoléico, com a evolução da doença. Com esses resultados foi possível entender as principais alterações bioquímicas causadas pela MSC, como também demonstrar que elas podem ser usadas de forma complementar no diagnóstico da doença. Dentre todos os métodos avaliados, as análises das cascas com RMN em baixa resolução, com as técnicas CPMG e de precessão livre em onda contínua (CWFP), foram as mais rápidas (em alguns segundos) e eficientes para discriminar as plantas assintomáticas das sintomáticas. A discriminação das plantas pelos dados de RMN foi realizada com métodos quimiométricos como análise de componentes principais (PCA), análises de agrupamentos hierárquicos (HCA) e regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). / Citrus Sudden Death (CSD) is a new graft-transmissible disease of sweet orange grafted on Rangpur lime and Citrus volkameriana rootstocks. The causal agent is unknown. To understand the main physiological changes caused by the CSD, we analyzed the variations in the primary metabolites content in the bark of scion and rootstock. The hexanic and hydroalcoholic extracts were analyzed by high resolution NMR. The hexanic extracts were also analyzed by gas chromatography. The metabolites were also analyzed directly in the barks with high and low resolution NMR techniques. With these analyses it was possible to observe that CSD modifies the content of triglycerides and sucrose in the barks. The disease also changes the fatty acids profile, with a decrease in the oleic and linolenic and an increase in the capric, lauric, miristic, palmitic, stearic and linoleic content. With these results it was possible to understand the main biochemical disorders caused for the CSD, as well as to demonstrate that they can be used as complementary information in the disease diagnosis. The analysis of the barks with low resolution NMR techniques CPMG and continuous wave free precession (CWFP), had been the fastest (few seconds) and the most efficient one to discriminate between the symptomless and symptomatic plants. The discrimination of the plants by NMR data had been carried with chemometric methods such as principal component analysis (PCA), hierarchic cluster analysis (HCA) and partial least square regression (PLS).

O Cancro Cítrico (CC), causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Xac) é uns dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura paulista. A partir da introdução da Lagarta Minadora dos Citros (LMC), Phyllocnistis citrella, o comportamento do CC mudou drasticamente, tornando-se mais severo. Para compreender a interação de Xac e da LMC em Limão Tahiti foram conduzidos, em condições controladas, três experimentos: (A) influência da via de penetração de Xac (estômato, ferimento mecânico e injúria de LMC das fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa) e das concentrações de inóculo de 10 1 , 10 2 , 10 4 e 10 6 UFC/mL na infecção de Xac; (B) efeito da idade do ferimento mecânico, da injúria de LMC e da folha intacta no progresso do CC; (C) influência da temperatura e do período de molhamento no desenvolvimento do CC. No experimento A, a concentração mínima de inóculo para causar CC via penetração de Xac por estômato foi de 10 4 UFC/mL; 10 2 UFC/mL para via ferimento mecânico e injúria de LMC na fase ovo e 1º ínstar; e 10 1 UFC/mL para via injúria fase 3º ínstar e pupa. A injúria da fase 3º ínstar e pupa proporcionaram maior severidade em relação às outras vias de penetração nas concentrações testadas (aproximadamente 6 vezes maior que a severidade em folha intacta a 10 6 UFC/mL). As severidades em folha com ferimento mecânico e com injúria da fase ovo e 1º ínstar não diferiram da folha intacta. No experimento B, o ferimento mecânico entre 0 e 6 dias após o ferimento da folha (0 a 6 dias de idade), injúria de LMC entre 0 e 32 dias após a ovoposição de P. citrella na folha (0 a 32 dias de idade) e folha intacta entre 0 e 35 dias após a emissão da folha (0 a 35 dias de idade) foram suscetíveis a Xac. A severidade decresceu linearmente com o aumento da idade do ferimento e da folha intacta. A severidade, em relação à idade de injúria, variou em função do modelo Beta generalizado, com ponto de inflexão aos 18 dias. A máxima severidade estimada em folha com injúria foi 10 vezes maior que em folha intacta. No experimento C, observou-se que para os menores intervalos de aparecimento de lesões e 100% de incidência de CC, as condições ótimas foram de 25 a 35ºC com período mínimo de molhamento de 4 horas. O modelo Beta-monomolecular ajustou-se bem à variação da severidade em função da temperatura e da duração do molhamento foliar. As temperaturas mínima e máxima estimadas foram de 14,9 e 42ºC. A máxima severidade estimada foi determinada para o molhamento de 24 horas a 31,7ºC. Em geral, a injúria de LMC nas fases acima de 3º ínstar influenciou na infecção de Xac possibilitando infecções mesmo em baixas concentrações de inóculo (10 células/mL) e durante um longo período (32 dias). Em folhas com injúria de LMC, a severidade de CC pode ser 10 vezes maior que em folha intacta. As condições favoráveis para a infecção de Xac são de 25 a 35ºC e a bactéria não demanda longos períodos de molhamento foliar (acima de 4 horas). Por esses resultados, conclui-se que a LMC tem papel relevante na epidemiologia do CC. / The Asiatic Citrus Canker (ACC), caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Xac) is one of the most serious problems of citrus in São Paulo State, Brazil. After the introduction of Citrus Leafminer (CLM), Phyllocnistis citrella, the behavior of ACC changed drastically, becoming more severe. To understand the interaction of Xac and CLM on Tahiti Lime, it were, under controlled conditions, carried three experiments: (A) influence of the way of Xac penetration (stomata, mechanical wound and CLM injury of the stage: egg, 1st instar, 3rd instar and pupa) and of the inoculum concentrations of 10 1 , 10 2 , 10 4 and 10 6 CFU/mL in the Xac infection; (B) effect of the age of mechanical wound, of CLM injury and of unwounded leaf in the progress of the ACC; (C) influence of the temperature and of the period of leaf wetness in the development of the ACC. In the experiment A, the minimum inoculum concentration to cause ACC by penetration of Xac through stomata was of 10 4 CFU/mL; 10 2 CFU /mL by mechanical wound and CLM injury of egg stage and 1st instar; and 10 1 CFU /mL by injury of 3rd instar and pupa stage. The injury of 3rd instar and pupa stage have generated higher severity in relation to other ways of penetration on all concentrations (about 6 times more than the severity in unwounded leaf on 10 6 CFU /mL). The severities in leaf with mechanical wound and with injury of egg stage and 1st instar have not differed from the unwounded leaf. In the experiment B, the mechanical wound between 0 and 6 days (0-6 days of age), the CLM injury between 0 and 32 days after eggs laying of P. citrella (0-32 days of age) and unwounded leaf between 5 and 35 days (5-35 days of age) have shown susceptibility to Xac. The severity decreased linearly with increasing age of the wound and age of unwounded leaf. In relation to age of injury, the severity varied in function of generalized Beta model and the inflection point was 18 days. The maximum severity in leaf with injury was 10 times bigger than in unwounded leaf. In the experiment C, the optimum conditions appearance of lesions and 100% of incidence were 25-35ºC under minimum wetness duration of 4 hours. The Beta-monomolecular function provided a good description of severity variation in relation to the temperature and duration of leaf wetness. The estimated minimum and maximum temperatures were 14.9 and 42ºC. The estimated maximum severity was determined under wetness of 24 hours and 31.7ºC. In general, the LMC injury (up to 3rd instar stage) has influenced in the Xac infection, it has increased the efficiency of bacterium penetration still on low inoculum concentration and it has allowed Xac infection for long period (32 days). In leaf with CLM injury, the severity can be 10 times bigger than in unwounded leaf. The Xac infection is favored under 25-35ºC and the Xac does not demand long periods of leaf wetness (more than 4 hours).

A partir do sequenciamento do genoma da bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), estudos sobre os mecanismos de patogenicidade expressos durante a doença foram iniciados em projetos de genômica funcional, com o objetivo de confirmar a função das sequências gênicas identificadas no projeto Genoma de X. fastidiosa. Dentre esses mecanismos destacam-se as enzimas envolvidas no processo de ataque da bactéria. O presente trabalho teve como alvo de estudo a seqüência gênica denominada Xf-0818, clonada em Escherichia coli através da inserção em plasmídeo pET 28b(+), que presumivelmente codifica uma celulase de cerca de 60 kDa, possivelmente envolvida na degradação de fibras de celulose presentes nas membranas dos vasos pontuados do xilema de plantas de citros. A degradação desta membrana permitiria a movimentação de células bacterianas entre os vasos do xilema, o que é determinante para o desenvolvimento dos sintomas da CVC. A proteína foi superexpressada em E. coli por meio de indução com lactose e purificada através de ultrafiltração associada à cromatografia de afinidade a metal. A enzima apresentou alta atividade sobre a celulose carboximetilada 1%, avaliada através da quantificação de açúcares redutores. A obtenção de anticorpos foi realizada mediante injeção da enzima purificada em camundongos, os quais foram avaliados através de ELISA. A atividade da enzima sobre celulose carboximetilada foi reduzida após prévia incubação com os anticorpos. Esses anticorpos representam uma poderosa ferramenta em pesquisas visando à identificação das condições que favoreçam a expressão desta enzima “in vivo”. A presença de partículas de ouro coloidal em seções de tecido provenientes de plantas infectadas com X. fastidiosa indica a atuação da celulase durante a infecção, porém fazse necessária a confirmação do papel da proteína Xf-0818, através de novas análises com imunolocalização, além de estudos utilizando linhagens mutantes de X. fastidiosa para o gene que codifica esta celulase. / From the genome sequencing of the bacteria Xylella fastidiosa, the agent responsible for the citrus variegated chlorosis (CVC), studies on the pathogenicity mechanisms expressed during the occurrence of the disease were started in genomic function projects, aiming to confirm the function of the genic sequences identified in the project X. fastidiosa Genome. Among these mechanisms, the enzymes involved in the bacterium attaching process are highlighted. The present study had, as a goal, the orf denominated Xf-0818, cloned in Escherichia coli by means of the insertion into pET 28b(+) plasmid, which codifies a cellulase of a size nearly 60 kDa, possibly involved in the degradation of cellulose fibers present in the membranes of the xylem vessels of citrus plants. The degradation of this membrane would allow for the movement of bacterial cells among the xylem vessels, which would be important for the development of CVC symptoms. The enzyme was over expressed into E. coli by means of their induction using lactose and purified using ultra-filtration associated to metal affinity chromatography. The enzyme presented high activity over 1%-carboximethyl cellulose (CMC), which was evaluated through quantification of released reduced sugars. The antibodies were obtained by injection of the purified enzyme into mice, which were evaluated by using the ELISA. The enzyme activity over CMC was reduced after previous incubation with the antibodies. These antibodies represent a tool for the researches aiming the identification of conditions that favor the expression of this enzyme in vivo. The presence of gold particles on the citrus diseased tissue samples indicate the participation of this cellulase on the disease, but other studies using immunocytochemistry and mutants of X. fastidiosa are necessary to confirm this hypothesis.

A leprose dos citros é considerada uma das doenças mais destrutivas da indústria citrícola. O patossistema dessa doença envolve o agente causal o Citrus leprosis virus C, o vetor Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae) e as plantas hospedeiras. Este vírus com genoma conhecido é membro tipo do gênero Cilevirus. Causa sintomas localizados nas folhas, frutos e caules e está restrito ao continente Americano. Apesar de muitos esforços para se conhecer o patossistema, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações. O presente trabalho teve como objetivo obter informações detalhadas sobre as relações vetorvírus- hospedeiro da leprose citoplasmática, estando dividido em três objetivos: 1. Procurou-se uma planta indicadora padrão que fosse de facil obtenção, manejo e baixo custo, e que expressase em curto tempo os sintomas de CiLV-C e outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTBr); 2. Determinar parâmetros como o período de acesso para aquisição e inoculação do CiLV-C pelo ácaro vetor, o período de retenção do vírus pelo ácaro, avaliação da capacidade das diferentes fases do ácaro de transmitir o vírus e a % de indivíduos de uma população de ácaros colonizando plantas afetadas pela leprose capazes de transmitir o vírus; 3. Avaliar um grande número de espécies de plantas, de diferentes famílias botânicas, quanto à suscetibilidade experimental à infecção pelo CiLV-C, pelo ácaro vetor. A presença de CiLV-C nestes ensaios foi confirmada por testes de ELISA, RT-PCR, microscopia eletrônica de transmissão e imunofluorescência. O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) reage com lesões necróticas locais em apenas cinco dias à inoculação com ácaros virulíferos, podendo-se reduzir para dois dias se as plantas forem incubadas a 28ºC. O cv. ,,Una\" foi selecionado como planta-teste padrão dentre 113 cvs. avaliados. Outros vírus transmitidos por Brevipalpus do tipo citoplasmático (VTBr) como vírus da pinta verde do maracujá (Passion fruit green spot virus PFGSV), vírus da mancha anular de Ligustrum (Ligustrum ringspot virus LigRSV) e mancha verde do hibisco (Hibiscus green spot vírus HGSV) também causaram lesões locais necróticas em feijoeiro. Usando feijão como planta teste e ácaros virulíferos, se determinou o período de acesso à aquisição do vírus-4 h; período de acesso à inoculação do vírus-4h; período de retenção do vírus no ácaro de 12 dias, porcentagem de ácaros virulíferos, colonizando tecidos infectados, transmitirem CiLV-C em até 45%. Os experimentos também confirmaram que todas as etapas de desenvolvimento do ácaro (larvas, proto-deutoninfa e adultos) são capazes de transmitir CiLV-C, inclusive confirmou-se que o macho tem a capacidade de transmissão e que o vírus pode ser adquirido a partir de lesões de folhas, frutos e caules. Não se constatou transmissão transovariana do CiLV-C. Foram testadas 140 espécies, de 45 famílias, dentro das quais 62 espécies de 26 famílias apresentaram lesões localizadas nas folhas. Destas, 46 espécies sintomáticas, o CiLV-C foi detectado em pelo menos um dos testes para sua detecção, confirmando a transmissão. O conhecimento de parâmetros de alimentação, retenção do vírus e porcentagem de ácaros viruliferos na população, além do genoma de hospedeiras suscetíveis ao vírus tem importantes implicações no entendimento da epidemiologia, na quarentena e podem oferecer indícios da origem do CiLV-C. / Citrus leprosis (CL), caused by the Citrus leprosis virus C (CiLV-C), is reported only in the American continent. The pathosystem of the CL involves the causal agent, the main vector Brevipalpus phoenicis Geijeskes (Acari: Tenuipalpidae) and the susceptible hosts. For long time only Citrus spp. were considered the sole susceptible host. The entire genome of the CiLV-C was sequenced and a new genus, Cilevirus, was assigned for this virus. CL is characterized by the induction of localized symptoms on the leaves, fruits and stems. Important advances were made recently for the understanding of CL pathosystem, but despite these efforts little is known about details of the virus/vector/host relationship. The present work aimed to cover such deficiencies. In the first place a search of suitable indicator plant was made and the common bean (Phaseolus vulgaris L.) was found to respond with localized necrotic lesions after infestation with viruliferous B. phoenicis in five days and when infested leaves are incubated at 28°C. Furthermore, bean plants are easy and cheap to produce and handle. The black bean cv. ,,IAC Una\" was adopted as a standard test variety, among 113 assayed cultivars of various genetic backgrounds. Common bean plants mite-inoculated with other cytoplasmic-type Brevipalpus-transmitted viruses (BrTVs) [Passion fruit green spot virus (PFGSV), Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), Ligustrum ringspot virus (LigRSV) and Hibiscus green spot virus (HGSV)] also responded with necrotic local lesions and could serve as test plants for these viruses. Detecion of these viruses were made by RTPCR and/or transmission electron microscopy. Using common bean as test plant, some parameters of the vector/virus relationship were determined: virus acquisition feeding period- 4 h; virus inoculation feeding period- 4h; period of retention of the virus by a single viruliferous mite- at least 12 days; percentage of viruliferous mites from a mites colonizing infected tissues- 45%. The experiments also confirmed that all the developmental stages of the mite (larvae, proto- and deutonymph, adult) as well as males are able to transmit CiLV-C. No transovarial passage of the CiLV-C was registered. The virus can be acquired from lesions of leaves, fruits and stems. To assess the experimental host range of CiLV-C, a large number of plant species were inoculated with B. phoenicis, viruliferous to CiLV-C, under experimental conditions. Of the140 species tested, belonging to 45 families, 62 (of 26 families) produced localized lesions on inoculated leaves. Of these 62 plants producing local lesions, 45 had the presence of CiLV-C confirmed by at least one of the assays to detect the virus (RT-PCR, ELISA, transmission electron microscopy and immunofluorescence). These assays were also used to confirm the presence of CiLV-C in transmission experiments. Although only few non Citrus species were found naturally infected by CiLV-C, present results show that a large number of plant species are susceptible to the virus with implications on the epidemiology, quarantine and the evolution of the citrus leprosis pathosystem.

A Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, é atualmente a doença de maior incidência no Estado de São Paulo. A incidência e a severidade da doença são maiores nas regiões Norte e Noroeste do Estado, onde o clima é predominantemente quente e com déficit hídrico, principalmente no inverno. Embora não haja nada comprovado, alguns estudos indicam que o déficit hídrico aumenta a severidade dos sintomas nas plantas afetadas pela CVC. Além disso, até hoje não foi estabelecida uma função que relacione doença e dano. Dessa forma, o estudo presente objetivou avaliar o efeito de diferentes níveis de irrigação no progresso poliético da CVC, avaliar métodos de avaliação da doença e determinar uma função de dano para a CVC. Para isso, um experimento foi instalado no município de Bebedouro, região Norte do Estado de São Paulo sob o delineamento blocos ao acaso no esquema fatorial 3 x 2, com os seguintes tratamentos: sem irrigação, irrigado com 50% e 100% da evapotranspiração da cultura (ETc), combinados com inoculação natural e artificial de X. fastidiosa. Cada parcela foi constituída de 6 plantas úteis, havendo 4 repetições de cada tratamento, totalizando 144 plantas úteis. As variáveis quantificadas em cada árvore do experimento foram: (a) produção, considerando frutos assintomáticos e sintomáticos, no período de 2006 a 2008 e produção total referente às safras 2001 a 2005; (b) intensidade da doença, através da incidência de ramos com sintomas da CVC e utilizando uma escala descritiva; (c) vigor da planta, estimado pela medida da altura da planta, diâmetro da copa, diâmetro do tronco, volume de copa e do índice de área foliar (IAF). O modelo monomolecular foi utilizado para descrever o progresso poliético da incidência da CVC, no período de 2006 a 2008, para todos os tratamentos. A partir desse modelo foi possível observar que plantas sem irrigação apresentam maior incidência de ramos com sintomas que plantas irrigadas a 100% da ETc, principalmente quando inoculadas de forma artificial. Esse resultado ficou ainda mais evidenciado quando se avalia o número de frutos com sintomas (ø < 50mm) da CVC por tratamento. Também foi possível observar que os sintomas nas plantas são distribuídos de forma irregular, apresentando um gradiente decrescente significativo da parte superior para inferior. As variáveis relacionadas ao vigor da planta, na sua maioria, não apresentaram relação alguma com a produção em todos os tratamentos. De modo geral, as plantas do tratamento irrigado a 100% da ETc combinado com inoculação natural apresentaram maior produção total, considerando as safras de 2001 a 2008. A relação entre CVC e dano pode ser descrita pela equação (y=114,067*exp(-0,017555)*x) onde y é a produção da planta em Kg e x a incidência de ramos com CVC em porcentagem. A escala descritiva não permitiu avaliação precisa e apresentou baixa correlação entre os avaliadores, o contrário foi observado realizando a avaliação da CVC através da incidência de ramos com sintomas. / The Citrus Variegated Chlorosis (CVC) caused by the bacteria Xylella fastidiosa is nowadays the disease with the most incidence in the state of São Paulo. The incidence and severity of the disease are greater in the Northern and Northwestern regions of the state where the climate is predominately warm and presents a water deficits especially in the winter. Although there is no definite proof, some studies indicate that the water deficits increases the severity of the symptoms in plants affected by the CVC. Besides, up to the present there has not been a function which relates the damage to an intensity of the disease. In that manner, the present study has been conducted in order to evaluate the effect of different irrigation levels on the polyetic progress of the CVC as well as to study methods of assessment of the disease and determine the relationship between disease intensity and yield. In order to carry out this study, an experiment was conducted in the city of Bebedouro north of São Paulo state. The experimental design was in randomized blocks in a 3 x 2 factorial scheme with the following treatments: no irrigation, irrigated with 50% and 100% of the evapotranspiration of the crop (ETc), combined with natural and artificial inoculation of X. fastidiosa. Each group was made of 6 useful plants, with 4 repetitions for each treatment, totalizing 144 useful plants. The variables quantified in each tree of the experiment were: (a) (a) yield, considering asymptomatic and symptomatic fruit in the period 2006 to 2008 and total yield on the crops from 2001 to 2005; (b) intensity of the disease through incidence of branches with symptoms of CVC and using a descriptive scale; (c) plant vigor, estimated through measure of height, crown diameter, trunk diameter, canopy volume and of the leaf area index (LAI). The monomolecular model was used to describe the polyetic progress of CVC incidence between 2006 and 2008 for all treatments. From this model it was possible to observe that plants without irrigation present greater incidence of branches with symptoms than the ones irrigated at 100% of ETc, especially when inoculated in an artificial manner. This result was even more evident when the number of fruit with symptoms is evaluated (ø < 50mm) of CVC per treatment. It was also possible to observe that the symptoms in the plants are scattered in an irregular way, presenting a significant decreasing rate from the upper to the lower part. Most of the variables related to the plant vigor did not present any relation to the production in all treatments. In general, the plants from the irrigated treatment at 100%of ETc combined with natural inoculation presented more total yield considering the harvests from 2001 to 2008. The relationship between CVC and damage can be described by the equation (y=114,067*exp(-0,017555)*x) where y is the plant yield in Kg and x is the incidence in percentage of branches with CVC. The descriptive scale did not allow accurate assessment and showed a low correlation between the raters, the opposite was observed performing the assessment of CVC through the incidence of branches with symptoms.