Citrus tristeza virus (CTV) ocorre em quase todas as áreas produtoras de citros do mundo. O controle da doença se baseia, principalmente, no uso de porta-enxertos tolerantes e na premunização das copas. A obtenção de copas de laranjas doces ou de porta-enxerto de laranja azeda transgênicos resistentes ao CTV permitiria retornar a um uso mais intensivo deste excelente porta-enxerto. Com isso, esse trabalho buscou avaliar linhagens transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis) e obter plantas transgênicas de laranja azeda (Citrus aurantium) para a resistência ao CTV, a fim de oferecer uma outra alternativa para o controle desta doença em citros. Foram avaliadas plantas transgênicas de laranja doce cv. Valência e cv. Hamlin contendo três diferentes construções gênicas. Uma contendo uma sequência sense (684 pb) do gene da capa protéica do CTV (pCTV-CP), outra contendo uma sequência conservada (559 pb) do CTV (pCTV-SC) e uma do tipo hairpin, contendo sequências sense e antisense do gene da capa protéica separadas por um íntron (pCTV-dsCP). Dez linhagens transgênicas de cada construção gênica e de cada cultivar foram previamente confirmadas por análises de Southern blot e RT-PCR, totalizando 60 linhagens transgênicas. Tais linhagens foram clonadas e enxertadas sobre limão Cravo (C. limonia) e laranja azeda (C. aurantium), totalizando 360 plantas. Essas plantas, juntamente com plantas não transgênicas utilizadas como controle, foram inoculadas com o CTV por meio de Toxoptera citricida virulífero. As técnicas de ELISA indireto utilizando anticorpo monoclonal contra a capa protéica do CTV ou de Real-time PCR utilizando primers amplificadores dos genes p20 e p23 do genoma do CTV foram utilizadas para detectar o vírus nas plantas avaliadas, 4 semanas após as inoculações. Ocorreu variação na resistência ao vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Alguns clones não foram infectados com o vírus mesmo após a quarta inoculação, indicando uma possível resistência ao patógeno. Um total de 30 experimentos de transformação genética de laranja azeda foram realizados, utilizando como explantes segmentos internodal, de epicótilo e de cotilédone associado ao hipocótilo. O teste de GUS permitiu a identificação de duas gemas com reação positiva (0,13% de eficiência de transformação). Tais gemas foram enxertadas in vitro sobre citrange Carrizo, mas apenas uma gema se desenvolveu. A planta obtida foi aclimatizada em casa-de-vegetação. / Citrus tristeza virus (CTV) occurs in almost all citrus-growing areas of the world. Control of citrus tristeza relies mainly on the use of tolerant rootstocks and scion cross protection. Obtaining transgenic sweet oranges cultivars or sour orange resistant to CTV would allow a better use of this excellent rootstock. This way, the aim of this work was to evaluate transgenic sweet orange (Citrus sinensis) lines and to obtain transgenic sour orange (Citrus aurantium) for the resistance to CTV, in order to offer another alternative for the control of the disease in citrus. Transgenic sweet orange cv. Valencia and cv. Hamlin containing three different genetic constructs were evaluated. One gene construct contains a sense sequence (684 pb) of the coat protein gene of CTV (pCTV-CP), another contains a conserved sequence (559 pb) of CTV (pCTV-SC), and the last one a hairpin type, containing the sense and antisense sequences of the coat protein gene separated by an intron (pCTV-dsCP). Ten transgenic lines of each gene construct and each cultivar were previously confirmed by Southern blot and RT-PCR analysis, totalizing 60 transgenic lines. These lines were cloned and grafted into C. limonia and into C. aurantium, totaling 360 plants. The plants, along with non-transgenic plants used as control, were challenged four times with the CTV by means of viruliferous Toxoptera citricida. Indirect ELISA using monoclonal antibody against the CTV coat protein or the Real-time PCR using primers to amplify the CTV genes p20 and p23 were used to detect the virus in the tested plants, 4 weeks after inoculation. Variation in the virus resistance was observed among different transgenic constructs and different clones of the same plant. Some clones were not infected with the virus even after the fourth inoculation, indicating a possible resistance to the pathogen. A total of 30 genetic transformation experiments of sour orange were performed, using as explants internodal segments, epicotyl segments and cotyledon fragment with hypocotyl attached. GUS reaction detected two shoots positive (transformation efficiency of 0,13%). These shoots were in vitro grafted in Carrizo citrange, but only one shoot developed. The plant obtained was acclimatized in greenhouse.

Bacteriocinas são proteínas antimicrobianas produzidas por bactérias com importante papel na ecologia microbiana. Neste trabalho foram avaliados a produção e os efeitos destas proteínas numa fração da comunidade bacteriana de citros, pertencente aos gêneros Methylobacterium e Curtobacterium, isolada de Citrus sinensis (laranjeiras - plantas saudáveis, sintomáticas para CVC, assintomáticas para CVC) e Citrus reticulata (tangerina). Foi observada, para ambos os gêneros, uma alta freqüência de isolados produtores de bacteriocinas na comunidade endofíticas avaliada. Foi observado que esta freqüência foi maior em populações provenientes de plantas assintomáticas para CVC e em plantas de tangerina. Em Methylobacterium, as populações obtidas de plantas de tangerina e de plantas sintomáticas para CVC apresentaram uma maior freqüência de isolados produtores de bacteriocinas. Por outro lado, a população de Curtobacterium provenientes de plantas sintomáticas para CVC, apresentou a menor freqüência de isolados produtores bacteriocina. Proteínas de 3 isolados de C. flaccumfaciens foram parcialmente caracterizadas bioquimicamente, permitindo a sua classificação como bacteriocinas que foram denominadas de endoficinas. Uma destas bacteriocinas, a endoficina L foi escolhida para ser melhor caracterizada. A endoficina L parcialmente purificada apresentou um peso molecular estimado de 14 kDa e atividade in gel, e atingiu seu nível máximo de produção na fase estacionária e foi ativa contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo patógenos humanos e de plantas. Para a caracterização do gene envolvido na produção desta bacteriocina uma biblioteca, em cosmídeo, de fragmentos de DNA com 40 kb foi construída e um clone exibindo atividade bacteriocinogênica foi subclonado e parcialmente seqüenciado. Esta análise revelou um operon de 2,0 kb consistindo de pelo menos três genes preditos envolvidos na produção desta bacteriocina. Análises in silico sugeriram que a endoficina L deva ser uma bacteriocina do tipo toxina que pode ser uma candidata em potencial como agente no controle biológico de X. fastidiosa e outros fitopatógenos. Os resultados obtidos sugerem que, quando C. flaccumfaciens produtores de bacteriocinas estão presentes em plantas de citros podem inibir X. fastidiosa. Por outro lado, o crescimento de X. fastidiosa parece ser favorecido pela presença de Methylobacterium a qual produz bacteriocinas contra Curtobacterium. A primeira interação poderia ser mediada por bacteriocinas como a endoficina L. Sugere-se uma interação cíclica entre tais microrganismos. O conhecimento da interação entre tais bactérias endofíticas representa um avanço no entendimento dos aspectos ecológicos da interação planta-microrganismo. / Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by bacteria, which play a role in microbial ecology. In this work we examined the bacteriocin production and it effects under a citrus bacterial communities belonged to Curtobacterium and Methylobacterium genera isolated from Citrus sinensis (sweet orangeuninfected, symptomatic, CVC-asymptomatic) and Citrus reticulata (tangerine) . We found a high levels of bacteriocin production for both genera, these frequencies were higher in asymptomatic and tangerine plants. The highest production frequencies for Methylobacterium strains were from tangerine and symptomatic plants. C. flaccumfaciens strains from symptomatic plants presented the lowest bacteriocin frequency. Proteins from three strains of C. flaccumfaciens were partially biochemically characterized and further classified as bacteriocins termed endophycins. One of them the endophycin L, was picked for deep investigation. The endophycin L partially purified had a molecular weight estimated of 14 kDa and exhibited in gel activity. Endophycin L production started at the exponential phase and reached its highest point during the stationary phase. It was capable of inhibiting the growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria, incluiding several human and plant pathogens. In order to characterize the related to this bacteriocin production. One cosmid clone containing a 40-Kb fragment from a genomic library of C. flaccumfaciens was selected for its bacteriocinogenic ability The fragment was subcloned and DNA sequencing revealed a 2-kb operon consisting of at least three putative genes related to endophycin production. In silico analyses suggested that endophycin L is a toxin-like bacteriocin, this bacteriocin could be a potential candidate as biological control agent against X. fastidiosa and other plant pathogens. The data indicated that when C. flaccumfaciens producers are present it inhibits X. fastidiosa, conversely X. fastidiosa growth seems to be favored by Methylobacterium species and the first interaction could be mediated by endophycins, such as endophycin L. Thus, we suggest a cyclic interaction among these microorganisms. We demonstrated that knowledge of the interaction among those endophytic bacteria represent an advance about plantmicroorganism ecological aspects.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

A cultura dos citros é extremamente dependente de uma nutrição mineral adequada para atingir maiores patamares de produção a menores custos, especialmente sob condições adversas, como no caso da ocorrência da clorose variegada dos citros (CVC). Neste contexto, o boro influencia diretamente a produção por proporcionar maior desenvolvimento radicular, aumentando o volume de solo explorado pelas raízes, maximizando o aproveitamento da água e dos fertilizantes, bem como por estar diretamente envolvido na formação da parede celular, contribuindo para aumento da resistência geral da planta. O presente trabalho foi desenvolvido a partir de um experimento de campo, conduzido no período de setembro de 2001 a agosto de 2002, em área de campo comercial localizada no município de Comendador Gomes (MG). Utilizou-se a variedade Pêra Rio enxertada sobre Limão Cravo no oitavo ano de produção, cultivada em LATOSSOLO VERMELHO-AMARELO Distrófico psamítico. O objetivo do estudo foi avaliar o uso de fontes de boro aplicadas ao solo em diferentes dosagens e sua influência na produção e qualidade do citros afetado pela CVC. Foram avaliados o estado nutricional das plantas, atributos químicos do solo, produtividade, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. As fontes utilizadas foram: ulexita-pó, ulexita-granulada, colemanita-pó, ácido bórico e termofosfato com boro, nas dosagens de 1, 2, 3 e 4 kg ha-1 . O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com fatorial 5X4, além de dois tratamentos adicionais (testemunha e termofosfato magnesiano), em quatro repetições. A avaliação do estado nutricional foi feita pela análise química dos teores de nutrientes nas folhas amostradas seis meses após a aplicação dos tratamentos. Os atributos químicos do solo foram avaliados por meio de análises das amostras coletadas onze meses após a aplicação dos tratamentos, na profundidade de 0-20 cm. A produção foi avaliada por ocasião da colheita, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. Os resultados mostraram que todas as fontes de boro proporcionaram aumentos significativos nos teores foliares de boro, sendo o ácido bórico e a ulexita-pó as que promoveram os maiores aumentos, não havendo influência das fontes e doses nos teores foliares de P, Ca e Mg. Os teores de boro no solo permaneceram acima do nível considerado adequado, sendo observados maiores valores onde utilizou-se fontes menos solúveis como a colemanita e o termofosfato com boro. A produtividade e os atributos físicos dos frutos não tiveram influência da utilização de fontes e doses de boro no pomar com elevada CVC, sendo observado que o aumento da doses de boro aplicado no solo diminuiu a porcentagem de suco no fruto. / Citrus crop is extremely dependent on an adequate mineral nutrition to reach bigger levels of production to fewer costs, especially under adverse conditions, as in the case of occurrence of citrus variegated chlorosis (CVC). In this context, boron directly influences the production because it provides a bigger root growth, what increases the volume of the explored soil by the roots, maximizes the use of water and fertilizers, as well as because it is directly involved in the cell wall biosynthesis, what contributes to the increase of the general resistance of the plant. The current study was developed from a field experiment and conducted in the period of September/2001 to August/2002, in a commercial field area located in the city of Comendador Gomes (state of MG). Pêra Rio variety grafted on Limão Cravo was used in the eighth year of production, cultivated in Typic Haplustox. The aim of the study was to evaluate the use of boron sources applied to soil in different dosages and its influence in the production and quality of the citrus affected by CVC. Plant nutritional condition, soil chemical attribute evaluations, productivity, and technical and physical attributes of the fruits were evaluated. The sources used were: ulexite fine, ulexite granular, colemanite fine, boric acid and fused boron phosphate, in 1, 2, 3 and 4 kg ha-1 rates. The experimental design used was completely randomized, with 5X4 factorial, besides two additional treatments (control and fused magnesium phosphate), in four replications. The evaluation of the nutritional state was done by leaf chemical analysis sampled six months after the application of the treatments. The chemical attributes of the soil were evaluated through analysis of samples collected eleven months after the application of the treatments, at a depth of 0- 20cm. The production was evaluated on the occasion of the harvest, as well as the technological and physical attributes of the fruits. The results showed that all boron sources promoted significative increases on the leaf boron contents. The higher increase was promoted by boric acid and ulexite fine sources. However didn´t happen source and dose influences on leaf contents of P, Ca e Mg. The boron soil contents remained higher than the level considerate suitable. The higher soil boron content was observed when sources with low solubility like colemanite and fused boron phosphate were applied. Productivity and fruit physical attributes didn´t were influenced by boron sources and dosages in plants with higher incidence of CVC. With the boron doses increase diminish the fruit juice contents.

O Cancro Cítrico (CC), causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Xac) é uns dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura paulista. A partir da introdução da Lagarta Minadora dos Citros (LMC), Phyllocnistis citrella, o comportamento do CC mudou drasticamente, tornando-se mais severo. Para compreender a interação de Xac e da LMC em Limão Tahiti foram conduzidos, em condições controladas, três experimentos: (A) influência da via de penetração de Xac (estômato, ferimento mecânico e injúria de LMC das fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa) e das concentrações de inóculo de 10 1 , 10 2 , 10 4 e 10 6 UFC/mL na infecção de Xac; (B) efeito da idade do ferimento mecânico, da injúria de LMC e da folha intacta no progresso do CC; (C) influência da temperatura e do período de molhamento no desenvolvimento do CC. No experimento A, a concentração mínima de inóculo para causar CC via penetração de Xac por estômato foi de 10 4 UFC/mL; 10 2 UFC/mL para via ferimento mecânico e injúria de LMC na fase ovo e 1º ínstar; e 10 1 UFC/mL para via injúria fase 3º ínstar e pupa. A injúria da fase 3º ínstar e pupa proporcionaram maior severidade em relação às outras vias de penetração nas concentrações testadas (aproximadamente 6 vezes maior que a severidade em folha intacta a 10 6 UFC/mL). As severidades em folha com ferimento mecânico e com injúria da fase ovo e 1º ínstar não diferiram da folha intacta. No experimento B, o ferimento mecânico entre 0 e 6 dias após o ferimento da folha (0 a 6 dias de idade), injúria de LMC entre 0 e 32 dias após a ovoposição de P. citrella na folha (0 a 32 dias de idade) e folha intacta entre 0 e 35 dias após a emissão da folha (0 a 35 dias de idade) foram suscetíveis a Xac. A severidade decresceu linearmente com o aumento da idade do ferimento e da folha intacta. A severidade, em relação à idade de injúria, variou em função do modelo Beta generalizado, com ponto de inflexão aos 18 dias. A máxima severidade estimada em folha com injúria foi 10 vezes maior que em folha intacta. No experimento C, observou-se que para os menores intervalos de aparecimento de lesões e 100% de incidência de CC, as condições ótimas foram de 25 a 35ºC com período mínimo de molhamento de 4 horas. O modelo Beta-monomolecular ajustou-se bem à variação da severidade em função da temperatura e da duração do molhamento foliar. As temperaturas mínima e máxima estimadas foram de 14,9 e 42ºC. A máxima severidade estimada foi determinada para o molhamento de 24 horas a 31,7ºC. Em geral, a injúria de LMC nas fases acima de 3º ínstar influenciou na infecção de Xac possibilitando infecções mesmo em baixas concentrações de inóculo (10 células/mL) e durante um longo período (32 dias). Em folhas com injúria de LMC, a severidade de CC pode ser 10 vezes maior que em folha intacta. As condições favoráveis para a infecção de Xac são de 25 a 35ºC e a bactéria não demanda longos períodos de molhamento foliar (acima de 4 horas). Por esses resultados, conclui-se que a LMC tem papel relevante na epidemiologia do CC. / The Asiatic Citrus Canker (ACC), caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Xac) is one of the most serious problems of citrus in São Paulo State, Brazil. After the introduction of Citrus Leafminer (CLM), Phyllocnistis citrella, the behavior of ACC changed drastically, becoming more severe. To understand the interaction of Xac and CLM on Tahiti Lime, it were, under controlled conditions, carried three experiments: (A) influence of the way of Xac penetration (stomata, mechanical wound and CLM injury of the stage: egg, 1st instar, 3rd instar and pupa) and of the inoculum concentrations of 10 1 , 10 2 , 10 4 and 10 6 CFU/mL in the Xac infection; (B) effect of the age of mechanical wound, of CLM injury and of unwounded leaf in the progress of the ACC; (C) influence of the temperature and of the period of leaf wetness in the development of the ACC. In the experiment A, the minimum inoculum concentration to cause ACC by penetration of Xac through stomata was of 10 4 CFU/mL; 10 2 CFU /mL by mechanical wound and CLM injury of egg stage and 1st instar; and 10 1 CFU /mL by injury of 3rd instar and pupa stage. The injury of 3rd instar and pupa stage have generated higher severity in relation to other ways of penetration on all concentrations (about 6 times more than the severity in unwounded leaf on 10 6 CFU /mL). The severities in leaf with mechanical wound and with injury of egg stage and 1st instar have not differed from the unwounded leaf. In the experiment B, the mechanical wound between 0 and 6 days (0-6 days of age), the CLM injury between 0 and 32 days after eggs laying of P. citrella (0-32 days of age) and unwounded leaf between 5 and 35 days (5-35 days of age) have shown susceptibility to Xac. The severity decreased linearly with increasing age of the wound and age of unwounded leaf. In relation to age of injury, the severity varied in function of generalized Beta model and the inflection point was 18 days. The maximum severity in leaf with injury was 10 times bigger than in unwounded leaf. In the experiment C, the optimum conditions appearance of lesions and 100% of incidence were 25-35ºC under minimum wetness duration of 4 hours. The Beta-monomolecular function provided a good description of severity variation in relation to the temperature and duration of leaf wetness. The estimated minimum and maximum temperatures were 14.9 and 42ºC. The estimated maximum severity was determined under wetness of 24 hours and 31.7ºC. In general, the LMC injury (up to 3rd instar stage) has influenced in the Xac infection, it has increased the efficiency of bacterium penetration still on low inoculum concentration and it has allowed Xac infection for long period (32 days). In leaf with CLM injury, the severity can be 10 times bigger than in unwounded leaf. The Xac infection is favored under 25-35ºC and the Xac does not demand long periods of leaf wetness (more than 4 hours).

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T12:01:04Z No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brevipalpus mites are vectors of several plant viruses called Brevipalpus transmitted virus –BrTV. Among these, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) are important due to the damages caused in Citrus spp. and Coffea spp., respectively. The symptoms occur as localized infection on both leaves and fruits. The interactions between vector and virus are of particular interest both from the scientific perspective and on the development of control measures. However, for these and other BrTV, the mode interactions are still unknown. Preliminary study suggests that CoRSV replicates in the vector tissue, while CiLV-C is mode circulates manner. The aim of this study was to investigate the interactions established between CiLV-C and CoRSV with B. phoenicis. Adult females aviruliferous of B. phoenicis were submitted to acquisition access period of respective virus during five days. After this time they were transferred to hosts (treatments): mungbean (Canavalia ensiformis, non-host of the virus), symptomatic and healthy (citrus and coffee plants) and collected after four different periods of time: 0; 7; 14 and 21 days. The interactions were investigated by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transmission electron microscopy (TEM) and transmission assays. The qPCR revealed that there was no increase in viral load over time in all treatments for any of the virus in question. The TEM, it was not possible to detect particles of CiLV-C or CoRSV. CiLV-C transmission rate was 83, 75% and 58% for the treatments symptomatic citrus, mungbean and healthy citrus, respectively. The first symptoms of the leprosis were observed after 30±5 days after mites infestation. In the CoRSV transmission assays no symptoms of coffee ringspot were observed during a period of six months. These results suggest that a long incubation period was be necessary before CoRSV transmission by the vector. By the CiLV-C the results indicate that interaction type virus-vector is of the circulative mode. / Ácaros Brevipalpus são vetores de inúmeros vírus, comumente chamados de vírus transmitidos por Brevipalpus- VTB. Dentre esses, o vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) e o vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) são importantes devido aos danos que causam em Citrus spp. e Coffea spp., respectivamente. Os sintomas ocorrem de maneira localizada em folhas e frutos. As interações entre os vírus e seus vetores apresentam particular interesse, tanto do ponto de vista científico quanto no desenvolvimento de novas abordagens para o controle das doenças por eles causadas. Entretanto, para esses e outros VTB, as interações são ainda pouco conhecidas. Estudos preliminares sugerem que o CoRSV se replica no interior do ácaro vetor, enquanto o CiLV-C apenas circula. O objetivo deste trabalho foi investigar os tipos de interações estabelecidas entre o CiLV-C e o CoRSV com B. phoenicis. Fêmeas adultas de B. phoenicis avirulíferas foram submetidas a um período de acesso para aquisição dos respectivos vírus durante cinco dias. Após esse tempo foram transferidas para hospedeiros (tratamentos): feijão-de-porco (não hospedeira dos vírus), plantas suscetíveis, sintomáticas e/ou sadias (laranja doce e cafeeiro) e coletadas após quatro diferentes períodos de tempo: 0; 7; 14 e 21 dias. As interações foram investigadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e testes de transmissão. A qPCR revelou que não houve aumento da carga viral ao longo do tempo em nenhum dos tratamentos avaliados para nenhum dos vírus em questão. A MET não detectou partículas de CiLV-C e CoRSV. A taxa de transmissão do CiLV-C foi de 83; 75 e 58% para os tratamentos frutos de laranja sintomáticos, feijão-de-porco e frutos de laranja sadio, respectivamente. Os primeiros sintomas de leprose dos citros foram observados após 30±5 dias após a infestação dos ácaros. Nos testes de transmissão de CoRSV nenhum sintoma da mancha anular foi observado durante um período de seis meses. Estes resultados indicam a necessidade de longo período é necessário antes da transmissão do CoRSV pelo vetor. Para o CiLV-C os resultados indicam que o tipo de interação vírus-vetor é persistente circulativa.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

A cultura dos citros é extremamente dependente de uma nutrição mineral adequada para atingir maiores patamares de produção a menores custos, especialmente sob condições adversas, como no caso da ocorrência da clorose variegada dos citros (CVC). Neste contexto, o boro influencia diretamente a produção por proporcionar maior desenvolvimento radicular, aumentando o volume de solo explorado pelas raízes, maximizando o aproveitamento da água e dos fertilizantes, bem como por estar diretamente envolvido na formação da parede celular, contribuindo para aumento da resistência geral da planta. O presente trabalho foi desenvolvido a partir de um experimento de campo, conduzido no período de setembro de 2001 a agosto de 2002, em área de campo comercial localizada no município de Comendador Gomes (MG). Utilizou-se a variedade Pêra Rio enxertada sobre Limão Cravo no oitavo ano de produção, cultivada em LATOSSOLO VERMELHO-AMARELO Distrófico psamítico. O objetivo do estudo foi avaliar o uso de fontes de boro aplicadas ao solo em diferentes dosagens e sua influência na produção e qualidade do citros afetado pela CVC. Foram avaliados o estado nutricional das plantas, atributos químicos do solo, produtividade, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. As fontes utilizadas foram: ulexita-pó, ulexita-granulada, colemanita-pó, ácido bórico e termofosfato com boro, nas dosagens de 1, 2, 3 e 4 kg ha-1 . O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com fatorial 5X4, além de dois tratamentos adicionais (testemunha e termofosfato magnesiano), em quatro repetições. A avaliação do estado nutricional foi feita pela análise química dos teores de nutrientes nas folhas amostradas seis meses após a aplicação dos tratamentos. Os atributos químicos do solo foram avaliados por meio de análises das amostras coletadas onze meses após a aplicação dos tratamentos, na profundidade de 0-20 cm. A produção foi avaliada por ocasião da colheita, bem como os atributos tecnológicos e físicos dos frutos. Os resultados mostraram que todas as fontes de boro proporcionaram aumentos significativos nos teores foliares de boro, sendo o ácido bórico e a ulexita-pó as que promoveram os maiores aumentos, não havendo influência das fontes e doses nos teores foliares de P, Ca e Mg. Os teores de boro no solo permaneceram acima do nível considerado adequado, sendo observados maiores valores onde utilizou-se fontes menos solúveis como a colemanita e o termofosfato com boro. A produtividade e os atributos físicos dos frutos não tiveram influência da utilização de fontes e doses de boro no pomar com elevada CVC, sendo observado que o aumento da doses de boro aplicado no solo diminuiu a porcentagem de suco no fruto. / Citrus crop is extremely dependent on an adequate mineral nutrition to reach bigger levels of production to fewer costs, especially under adverse conditions, as in the case of occurrence of citrus variegated chlorosis (CVC). In this context, boron directly influences the production because it provides a bigger root growth, what increases the volume of the explored soil by the roots, maximizes the use of water and fertilizers, as well as because it is directly involved in the cell wall biosynthesis, what contributes to the increase of the general resistance of the plant. The current study was developed from a field experiment and conducted in the period of September/2001 to August/2002, in a commercial field area located in the city of Comendador Gomes (state of MG). Pêra Rio variety grafted on Limão Cravo was used in the eighth year of production, cultivated in Typic Haplustox. The aim of the study was to evaluate the use of boron sources applied to soil in different dosages and its influence in the production and quality of the citrus affected by CVC. Plant nutritional condition, soil chemical attribute evaluations, productivity, and technical and physical attributes of the fruits were evaluated. The sources used were: ulexite fine, ulexite granular, colemanite fine, boric acid and fused boron phosphate, in 1, 2, 3 and 4 kg ha-1 rates. The experimental design used was completely randomized, with 5X4 factorial, besides two additional treatments (control and fused magnesium phosphate), in four replications. The evaluation of the nutritional state was done by leaf chemical analysis sampled six months after the application of the treatments. The chemical attributes of the soil were evaluated through analysis of samples collected eleven months after the application of the treatments, at a depth of 0- 20cm. The production was evaluated on the occasion of the harvest, as well as the technological and physical attributes of the fruits. The results showed that all boron sources promoted significative increases on the leaf boron contents. The higher increase was promoted by boric acid and ulexite fine sources. However didn´t happen source and dose influences on leaf contents of P, Ca e Mg. The boron soil contents remained higher than the level considerate suitable. The higher soil boron content was observed when sources with low solubility like colemanite and fused boron phosphate were applied. Productivity and fruit physical attributes didn´t were influenced by boron sources and dosages in plants with higher incidence of CVC. With the boron doses increase diminish the fruit juice contents.