Dentre os diversos fatores que afetam a produção e qualidade de frutos em plantas cítricas, os fatores fitossanitários destacam-se pela grande importância. Entre as diversas doenças que afetam a cultura dos citros, a Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma das mais severas e destrutivas, provocando tanto perdas em produção quanto em qualidade. Pelo fato desta doença ser causada por uma bactéria que se aloja no xilema, toda a dinâmica da água e nutrientes é afetada, resultando em uma série de sintomas visuais em diferentes graus. Buscou-se avaliar o estado nutricional de plantas cítricas sem sintomas vis uais de CVC e, com sintomas em diferentes níveis, através do Critério de Faixas de Suficiência, tradicionalmente utilizado na Citricultura Paulista e, através do Sistema Integrado de Diagnose e Recomendação, denominado pela sigla DRIS. O estudo foi realizado em pomares comerciais de laranjeira 'Pera' enxertada em limão 'Cravo', com sete anos de idade, no município de Araraquara – SP. Foram selecionadas em dois talhões, plantas com três níveis de CVC e plantas sem sintomas visuais, determinando-se os teores dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S) e dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn) em folhas de ramos frutíferos, bem como produção de frutos de cada planta. A interpretação através do método DRIS, envolveu a utilização de um "software" aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC, onde foi utilizado o método de cálculo proposto por Jones (1981). O DRIS foi eficiente, possibilitando a ordenação dos nutrientes, e, indicando deficiência nutricional para alguns nutrientes considerados adequados ou excessivos pelo Critério de Faixas de Suficiência. Independentemente da presença de sintomas de CVC, todas as plantas apresentaram baixos teores de Ca, resultando em diagnose de deficiência pelos dois critérios de interpretação; de modo geral, houve uma redução nos teores foliares de N e P, em plantas com sintomas mais severos. Com relação aos teores dos demais nutrientes não houve um padrão de decréscimo ou aumento em função da CVC. O "software" DRIS aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo IAC, com a população de referência por ele utilizada, deve ainda sofrer ajustes, de acordo com as condições e objetivos do trabalho para melhor correlação com produtividade. / Among all factors which affect the yield and fruit quality from citric plants, pests and diseases are of outstanding importance. There are several pests and diseases wich affect the citrus crop. The citrus variegated chlorosis (CVC) is one of the most severe and destructive diseases affecting both yield and quality. Because this disease is caused by a xylem bacteria, the water and nutrients dinamics is affected resulting in a series of visual simptons of different intensities. There objective of this work was to evaluate the nutritional status os citrus plants without visual simptons of CVC and, with different levels of simptons of this disease. The Sufficiency Range Criteria, traditionally used in the state of São Paulo and the Diagnosis and Recommendation Integrated System (DRIS) were the methods used for leaf analysis interpretation. The study was carried out in commercial orchards of 'Pêra' sweet orange budded on 'Cravo' lemom, seven years old, in the region of Araraquara – SP. Plants with three levels of CVC and plants without visual simptons were selected from two plots. Concentrations of macronutrients (N, P, K, Ca, Mg, S) and micronutrients (B, Cu, Fe, Mn, Zn) were determined on leaves of fruit branches. Fruit production from each plant was measured. The analysis through the DRIS method involved the utilization of a software developed specially for the citrus crop by the Instituto Agronômico de Campinas – IAC, where the method proposed by Jones (1981) was used. The results showed that the DRIS was efficient in ranking the nutrients and indicating the nutritional defficiency for some nutrients considered adequate or excessive by the Sufficiency Range Criteria. Regardless the presence of CVC simptons, all plants show low foliar concentrations of Ca, wich resulted in a diagnose of defficiency by the two criteria of interpretation. There was a foliar concentration reduction of N and P, in plants with more severe simptoms. With respect to the foliar concentration of the other nutrients there was not observed a standard decrease or increase due to CVC. The local DRIS-Citros IAC software norms utilized should be adjusted according to the work conditions and objectives to a improve yield correlation with plant nutrition.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

A Morte Súbita dos Cítros (MSC) é uma doença que afeta plantas de laranjeira-doce enxertadas em limão Cravo ou Volkameriano e ainda não tem o agente causal determinado. Para entender quais são as principais mudanças fisiológicas causadas pela MSC, analisou-se as alterações nos metabolitos primários, tanto da casca da copa quanto do cavalo. Fez-se análises dos extratos hexânico e alcoólico com RMN em alta resolução e do extrato hexânico com cromatografia gasosa. Também analisou-se os metabolitos diretamente nas cascas com técnicas de RMN em alta e baixa resolução. Com essas análises foi possível observar que a MSC altera a deposição de triacilglicerídeos e sacarose nas cascas. A MSC também modifica o perfil de ácidos graxos, com o decréscimo dos teores de ácido oléico e linolênico e aumento dos ácidos cáprico, láurico, mirístico, plamítico, esteárico e linoléico, com a evolução da doença. Com esses resultados foi possível entender as principais alterações bioquímicas causadas pela MSC, como também demonstrar que elas podem ser usadas de forma complementar no diagnóstico da doença. Dentre todos os métodos avaliados, as análises das cascas com RMN em baixa resolução, com as técnicas CPMG e de precessão livre em onda contínua (CWFP), foram as mais rápidas (em alguns segundos) e eficientes para discriminar as plantas assintomáticas das sintomáticas. A discriminação das plantas pelos dados de RMN foi realizada com métodos quimiométricos como análise de componentes principais (PCA), análises de agrupamentos hierárquicos (HCA) e regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). / Citrus Sudden Death (CSD) is a new graft-transmissible disease of sweet orange grafted on Rangpur lime and Citrus volkameriana rootstocks. The causal agent is unknown. To understand the main physiological changes caused by the CSD, we analyzed the variations in the primary metabolites content in the bark of scion and rootstock. The hexanic and hydroalcoholic extracts were analyzed by high resolution NMR. The hexanic extracts were also analyzed by gas chromatography. The metabolites were also analyzed directly in the barks with high and low resolution NMR techniques. With these analyses it was possible to observe that CSD modifies the content of triglycerides and sucrose in the barks. The disease also changes the fatty acids profile, with a decrease in the oleic and linolenic and an increase in the capric, lauric, miristic, palmitic, stearic and linoleic content. With these results it was possible to understand the main biochemical disorders caused for the CSD, as well as to demonstrate that they can be used as complementary information in the disease diagnosis. The analysis of the barks with low resolution NMR techniques CPMG and continuous wave free precession (CWFP), had been the fastest (few seconds) and the most efficient one to discriminate between the symptomless and symptomatic plants. The discrimination of the plants by NMR data had been carried with chemometric methods such as principal component analysis (PCA), hierarchic cluster analysis (HCA) and partial least square regression (PLS).

A leprose dos citros é considerada uma das doenças mais destrutivas da indústria citrícola. O patossistema dessa doença envolve o agente causal o Citrus leprosis virus C, o vetor Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae) e as plantas hospedeiras. Este vírus com genoma conhecido é membro tipo do gênero Cilevirus. Causa sintomas localizados nas folhas, frutos e caules e está restrito ao continente Americano. Apesar de muitos esforços para se conhecer o patossistema, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações. O presente trabalho teve como objetivo obter informações detalhadas sobre as relações vetorvírus- hospedeiro da leprose citoplasmática, estando dividido em três objetivos: 1. Procurou-se uma planta indicadora padrão que fosse de facil obtenção, manejo e baixo custo, e que expressase em curto tempo os sintomas de CiLV-C e outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTBr); 2. Determinar parâmetros como o período de acesso para aquisição e inoculação do CiLV-C pelo ácaro vetor, o período de retenção do vírus pelo ácaro, avaliação da capacidade das diferentes fases do ácaro de transmitir o vírus e a % de indivíduos de uma população de ácaros colonizando plantas afetadas pela leprose capazes de transmitir o vírus; 3. Avaliar um grande número de espécies de plantas, de diferentes famílias botânicas, quanto à suscetibilidade experimental à infecção pelo CiLV-C, pelo ácaro vetor. A presença de CiLV-C nestes ensaios foi confirmada por testes de ELISA, RT-PCR, microscopia eletrônica de transmissão e imunofluorescência. O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) reage com lesões necróticas locais em apenas cinco dias à inoculação com ácaros virulíferos, podendo-se reduzir para dois dias se as plantas forem incubadas a 28ºC. O cv. ,,Una\" foi selecionado como planta-teste padrão dentre 113 cvs. avaliados. Outros vírus transmitidos por Brevipalpus do tipo citoplasmático (VTBr) como vírus da pinta verde do maracujá (Passion fruit green spot virus PFGSV), vírus da mancha anular de Ligustrum (Ligustrum ringspot virus LigRSV) e mancha verde do hibisco (Hibiscus green spot vírus HGSV) também causaram lesões locais necróticas em feijoeiro. Usando feijão como planta teste e ácaros virulíferos, se determinou o período de acesso à aquisição do vírus-4 h; período de acesso à inoculação do vírus-4h; período de retenção do vírus no ácaro de 12 dias, porcentagem de ácaros virulíferos, colonizando tecidos infectados, transmitirem CiLV-C em até 45%. Os experimentos também confirmaram que todas as etapas de desenvolvimento do ácaro (larvas, proto-deutoninfa e adultos) são capazes de transmitir CiLV-C, inclusive confirmou-se que o macho tem a capacidade de transmissão e que o vírus pode ser adquirido a partir de lesões de folhas, frutos e caules. Não se constatou transmissão transovariana do CiLV-C. Foram testadas 140 espécies, de 45 famílias, dentro das quais 62 espécies de 26 famílias apresentaram lesões localizadas nas folhas. Destas, 46 espécies sintomáticas, o CiLV-C foi detectado em pelo menos um dos testes para sua detecção, confirmando a transmissão. O conhecimento de parâmetros de alimentação, retenção do vírus e porcentagem de ácaros viruliferos na população, além do genoma de hospedeiras suscetíveis ao vírus tem importantes implicações no entendimento da epidemiologia, na quarentena e podem oferecer indícios da origem do CiLV-C. / Citrus leprosis (CL), caused by the Citrus leprosis virus C (CiLV-C), is reported only in the American continent. The pathosystem of the CL involves the causal agent, the main vector Brevipalpus phoenicis Geijeskes (Acari: Tenuipalpidae) and the susceptible hosts. For long time only Citrus spp. were considered the sole susceptible host. The entire genome of the CiLV-C was sequenced and a new genus, Cilevirus, was assigned for this virus. CL is characterized by the induction of localized symptoms on the leaves, fruits and stems. Important advances were made recently for the understanding of CL pathosystem, but despite these efforts little is known about details of the virus/vector/host relationship. The present work aimed to cover such deficiencies. In the first place a search of suitable indicator plant was made and the common bean (Phaseolus vulgaris L.) was found to respond with localized necrotic lesions after infestation with viruliferous B. phoenicis in five days and when infested leaves are incubated at 28°C. Furthermore, bean plants are easy and cheap to produce and handle. The black bean cv. ,,IAC Una\" was adopted as a standard test variety, among 113 assayed cultivars of various genetic backgrounds. Common bean plants mite-inoculated with other cytoplasmic-type Brevipalpus-transmitted viruses (BrTVs) [Passion fruit green spot virus (PFGSV), Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), Ligustrum ringspot virus (LigRSV) and Hibiscus green spot virus (HGSV)] also responded with necrotic local lesions and could serve as test plants for these viruses. Detecion of these viruses were made by RTPCR and/or transmission electron microscopy. Using common bean as test plant, some parameters of the vector/virus relationship were determined: virus acquisition feeding period- 4 h; virus inoculation feeding period- 4h; period of retention of the virus by a single viruliferous mite- at least 12 days; percentage of viruliferous mites from a mites colonizing infected tissues- 45%. The experiments also confirmed that all the developmental stages of the mite (larvae, proto- and deutonymph, adult) as well as males are able to transmit CiLV-C. No transovarial passage of the CiLV-C was registered. The virus can be acquired from lesions of leaves, fruits and stems. To assess the experimental host range of CiLV-C, a large number of plant species were inoculated with B. phoenicis, viruliferous to CiLV-C, under experimental conditions. Of the140 species tested, belonging to 45 families, 62 (of 26 families) produced localized lesions on inoculated leaves. Of these 62 plants producing local lesions, 45 had the presence of CiLV-C confirmed by at least one of the assays to detect the virus (RT-PCR, ELISA, transmission electron microscopy and immunofluorescence). These assays were also used to confirm the presence of CiLV-C in transmission experiments. Although only few non Citrus species were found naturally infected by CiLV-C, present results show that a large number of plant species are susceptible to the virus with implications on the epidemiology, quarantine and the evolution of the citrus leprosis pathosystem.

A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis transformadas com os genes atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. \'Hamlin\', \'Natal\', \'Pêra\' e \'Valência\', contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão \'Cravo\' para avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja \'Hamlin\' (H), sete de laranja \'Natal\' (N), cinco de laranja \'Pêra\' (P) e nove de laranja \'Valência\' (V). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10 repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30 dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha. / The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker. Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Natal\' and \'Pera\' containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different experiments including, eight \'Hamlin\' sweet orange plants (H), seven \'Natal\' sweet orange plants (N), five \'Pera\' sweet orange plants (P) and nine \'Valencia\' sweet orange plants (V). The experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration, and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants. Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom severity of citrus canker related to control plants.

Dentre os diversos fatores que afetam a produção e qualidade de frutos em plantas cítricas, os fatores fitossanitários destacam-se pela grande importância. Entre as diversas doenças que afetam a cultura dos citros, a Clorose Variegada dos Citros (CVC) é uma das mais severas e destrutivas, provocando tanto perdas em produção quanto em qualidade. Pelo fato desta doença ser causada por uma bactéria que se aloja no xilema, toda a dinâmica da água e nutrientes é afetada, resultando em uma série de sintomas visuais em diferentes graus. Buscou-se avaliar o estado nutricional de plantas cítricas sem sintomas vis uais de CVC e, com sintomas em diferentes níveis, através do Critério de Faixas de Suficiência, tradicionalmente utilizado na Citricultura Paulista e, através do Sistema Integrado de Diagnose e Recomendação, denominado pela sigla DRIS. O estudo foi realizado em pomares comerciais de laranjeira 'Pera' enxertada em limão 'Cravo', com sete anos de idade, no município de Araraquara - SP. Foram selecionadas em dois talhões, plantas com três níveis de CVC e plantas sem sintomas visuais, determinando-se os teores dos macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S) e dos micronutrientes (B, Cu, Fe, Mn e Zn) em folhas de ramos frutíferos, bem como produção de frutos de cada planta. A interpretação através do método DRIS, envolveu a utilização de um "software" aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC, onde foi utilizado o método de cálculo proposto por Jones (1981). O DRIS foi eficiente, possibilitando a ordenação dos nutrientes, e, indicando deficiência nutricional para alguns nutrientes considerados adequados ou excessivos pelo Critério de Faixas de Suficiência. Independentemente da presença de sintomas de CVC, todas as plantas apresentaram baixos teores de Ca, resultando em diagnose de deficiência pelos dois critérios de interpretação; de modo geral, houve uma redução nos teores foliares de N e P, em plantas com sintomas mais severos. Com relação aos teores dos demais nutrientes não houve um padrão de decréscimo ou aumento em função da CVC. O "software" DRIS aplicado especialmente para a cultura dos citros pelo IAC, com a população de referência por ele utilizada, deve ainda sofrer ajustes, de acordo com as condições e objetivos do trabalho para melhor correlação com produtividade. / Among all factors which affect the yield and fruit quality from citric plants, pests and diseases are of outstanding importance. There are several pests and diseases wich affect the citrus crop. The citrus variegated chlorosis (CVC) is one of the most severe and destructive diseases affecting both yield and quality. Because this disease is caused by a xylem bacteria, the water and nutrients dinamics is affected resulting in a series of visual simptons of different intensities. There objective of this work was to evaluate the nutritional status os citrus plants without visual simptons of CVC and, with different levels of simptons of this disease. The Sufficiency Range Criteria, traditionally used in the state of São Paulo and the Diagnosis and Recommendation Integrated System (DRIS) were the methods used for leaf analysis interpretation. The study was carried out in commercial orchards of 'Pêra' sweet orange budded on 'Cravo' lemom, seven years old, in the region of Araraquara - SP. Plants with three levels of CVC and plants without visual simptons were selected from two plots. Concentrations of macronutrients (N, P, K, Ca, Mg, S) and micronutrients (B, Cu, Fe, Mn, Zn) were determined on leaves of fruit branches. Fruit production from each plant was measured. The analysis through the DRIS method involved the utilization of a software developed specially for the citrus crop by the Instituto Agronômico de Campinas - IAC, where the method proposed by Jones (1981) was used. The results showed that the DRIS was efficient in ranking the nutrients and indicating the nutritional defficiency for some nutrients considered adequate or excessive by the Sufficiency Range Criteria. Regardless the presence of CVC simptons, all plants show low foliar concentrations of Ca, wich resulted in a diagnose of defficiency by the two criteria of interpretation. There was a foliar concentration reduction of N and P, in plants with more severe simptoms. With respect to the foliar concentration of the other nutrients there was not observed a standard decrease or increase due to CVC. The local DRIS-Citros IAC software norms utilized should be adjusted according to the work conditions and objectives to a improve yield correlation with plant nutrition.

A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600), número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular, durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC. Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores. X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à 28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs) reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no meio. / The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been associated with high temperatures, it’s possible that the expression of pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units (CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.

Submitted by Ingrid Amaral null (ingridamaral88@hotmail.com) on 2016-04-12T11:56:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado_Ingrid_Amaral.pdf: 455312 bytes, checksum: 62dbe25fd5fc9414cda40cf6b569d002 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-13T14:55:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mariano_jlm_dr_prud.pdf: 21534624 bytes, checksum: 2f32b2e3ce64ced881d3b801c0ff70c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-13T14:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mariano_jlm_dr_prud.pdf: 21534624 bytes, checksum: 2f32b2e3ce64ced881d3b801c0ff70c5 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O ácaro Brevipalpus yothersi Baker é vetor da leprose dos citros, principal doença viral da citricultura mundial. Informações sobre a biologia de B. yothersi são essenciais para compreender a dinâmica populacional do ácaro no campo e inferir se mudanças no manejo do pomar em função da região pode alterar a biologia do ácaro. O objetivo do trabalho foi determinar a biologia e elaborar a tabela de vida de fertilidade de B. yothersi coletados em diferentes regiões citrícolas do estado de São Paulo. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Acarologia, pertencente à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP. Os ácaros foram coletados em pomares cítricos das regiões de Barretos, Jales e Santa Cruz do Rio Pardo, posteriormente, em laboratório, foram multiplicados em frutos de laranja. Os parâmetros biológicos avaliados foram duração das fases de desenvolvimento, oviposição, período de incubação, viabilidade dos ovos, longevidade, taxa líquida de reprodução (Ro), tempo médio de geração (T), taxa intrínseca de crescimento populacional (rm) e taxa finita de crescimento populacional (λ). Estes parâmetros foram avaliados em dois experimentos, o primeiro consistiu na biologia de B. yothersi em frutos isentos de resíduos de produtos fitossanitários à 23±1ºC e o segundo sob frutos com resíduo de espirodiclofeno à 25±1ºC. As observações foram realizadas diariamente, pela manhã e ao fim da tarde. A duração do desenvolvimento, longevidade, período de pré-oviposição, taxa de oviposição e número de ovos de B. yothersi apresentaram diferenças entre as populações. O ciclo biológico de B. yothersi criados sobre frutos de laranja varia de 18 a 24 dias, considerando os intervalos de 22º a 26 ºC, 50 a 70% de umidade relativa e fotofase de 14 horas. As diferenças biológicas entre populações de B. yothersi indicam que há diferenças na dinâmica populacional do ácaro no campo, necessitando de manejos adequados para cada região para melhor controle da leprose. / The mite Brevipalpus yothersi Baker is the vector of the citrus leprosis, major viral disease of citrus worldwide. Information about B. yothersi's biology are essential to understanding the population dynamics of the mite in the field and infer whether changes in orchard management by region can change the mite biology. The objective was to determine the biology and prepare the fertility life table of B. yothersi collected in different citrus regions of São Paulo state. The experiments were performed in Acarology Laboratory, belonging to the Faculty of Agricultural and Veterinary Sciences - FCAV/UNESP, Jaboticabal - SP. The mites were collected in citrus orchards in the regions of Barretos, Jales and Santa Cruz do Rio Pardo, later in the laboratory were multiplied in orange fruits. The biological parameters assessed were duration of the stages of development, oviposition, incubation period, egg viability, longevity, net reproductive rate (Ro), mean generation time (T), intrinsic rate of increase (rm) and finite rate increase (λ). These parameters were evaluated in two experiments, the first consisted the biology of B. yothersi in fruits free of residues of pesticides at 23 ± 1°C and the second consisting of the biology of B. yothersi under fruit with spirodiclofen residue at 25 ± 1°C . The observations were performed daily, in the morning and in the afternoon. The duration of the development, longevity, pre-oviposition period, oviposition rate and number of B. yothersi eggs showed differences between populations. The life cycle of B. yothersi created on orange fruit ranges from 18 to 24 days, considering the ranges of 22 to 26°C, 50-70% relative humidity and 14 hours. The biological differences between populations of B. yothersi indicate that there are differences in the population dynamics of the mite in the field, requiring adequate management practices for each region for better control of leprosis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3312.pdf: 4327625 bytes, checksum: af69914851f0a422fc453d6719c75b20 (MD5) Previous issue date: 2010-08-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / The classification of the Hortia genus, belonging to the Rutaceae, is ambiguous. Hortia, which has been placed in Cusparieae by De Candolle in 1824, in the most recent morphological classification of Engler in 1931 it belongs to Toddalieae. More recently, Silva and colleagues classified again Hortia in Cusparieae. However, the phytochemical study of the species from Hortia genus still not allow classify correctly it inside the family. Thus, the phytochemical study of Hortia described in this paper aims to contribute with the chemosystematics of the Rutaceae and with the best classification of the genus inside the family. The study of the species H. oreadica, H. brasiliana and H. superba led to the isolation and identification of 11 substances, the alkaloids N-methyl-4- methoxy-quinolin-2-one (01), integriquinolone (02), new in the genus Hortia, rutaecarpine (03), the coumarins scoparone (04) xanthotoxin (05), which were first described in the species H. superba, isopimpinellin (06), new in the genus Hortia, 5- chloro-8-methoxy-furanocoumarin (07), new in the literature, prangol (08) and heraclenol (09), and the flavonoids isosakuranetin (10) and neoponcirin (11), the latter being new in the genus Hortia. The presence of metabolites such as alkaloids, coumarins and flavonoids confirm that Hortia belongs to the Rutaceae family, even so are not clear its accurate positioning. Some of the isolated compounds were tested against the inhibition of Guignardia citricarpa following two methods of inhibition assays. One based on inhibition of G. citricarpa in vitro against growth mycelial, by the method of incorporation into the culture medium. The other based on the inhibition test to G. citricarpa in vitro on spore germination and appressorium formation by the method of germination of spores on plates of polystyrene. The first methodology only evaluated the inhibition of the formation of mycelia and it is not directly involved in the infection process of plants, already the second one evaluated the inhibition of reproductive structures of microorganisms (spores), responsible for the infection process. The average growth mycelial for all substances tested revealed the alkaloid N-methyl-4-methoxy-2-quinolin-2-one (100 μg.mL-1) as the most effective among all the substances tested. As the inhibition front of spore germination and appressorium formation, the results were quite satisfactory, the coumarin scoparone (100 μg.mL-1) showed 96% of inhibition spore germination and 99% for the formation of appressorium, the alkaloid N-methyl-4-methoxy-2-quinolin-2-one (100 μg.mL-1) with 83% and 91%, and the flavonoid isosakuranetin (100 μg.mL-1) with 71,4% and 80%, respectively. Therefore, from this study it was found that some natural products with antifungal activity revealed important sources in the discovery of new products free of toxicity and effective as a fungicide. / A classificação do gênero Hortia dentro da família Rutaceae é duvidosa. Hortia, que já foi posicionada em Cusparieae por De Candolle em 1824, na mais recente classificação morfológica de Engler em 1931 pertence a Toddalieae. Mais recentemente da Silva e colaboradores voltam a propor Hortia em Cusparieae. Contudo, o estudo fitoquímico das espécies do gênero Hortia ainda não permitem classificá-la corretamente dentro da família. Desta forma, o estudo fitoquímico de Hortia descrito neste trabalho, visa contribuir com a quimiossistemática da família Rutaceae e também com a melhor classificação do gênero dentro da mesma. O estudo das espécies H. oreadica, H. brasiliana e H. superba levou ao isolamento e identificação de 11 substâncias, sendo os alcalóides N-metil-4-metoxi-2-quinolona (01), integriquinolona (02), inédita no gênero Hortia e a rutaecarpina (03), as cumarinas escoparona (04), xantotoxina (05), sendo estas descritas pela primeira vez na espécie H. superba, isopimpenilina (06), inédita no gênero Hortia, 5-cloro-8-metoxi-furanocumarina (07), inédita na literatura, prangol (08) e heraclenol (09), e os flavonóides isosakuranetina (10) e neoponcirina (11), sendo este último inédito no gênero Hortia. A presença de metabólitos como alcalóides, cumarinas e flavonóides vêm a confirmar que Hortia pertence à família Rutaceae, embora não esteja claro seu exato posicionamento dentro da mesma. Alguns dos compostos isolados foram avaliados frente à inibição do desenvolvimento de Guignardia citricarpa, seguindo duas metodologias de ensaios de inibição, uma baseada no ensaio de inibição de G. citricarpa in vitro frente ao crescimento micelial, pelo método de incorporação ao meio de cultura e a outra, baseada no ensaio de inibição de G. citricarpa in vitro frente à germinação de esporos e formação de apressórios, pelo método de germinação de esporos em placa de poliestireno. Foram submetidas à ambos os ensaios de inibição as substâncias: N-metil-4-metoxi-2-quinolona, escoparona, prangol e isosakuranetina, as quais foram avaliadas quanto sua atividade antifúngica, porém a primeira metodologia avaliou a inibição apenas da formação de micélios, e estes não estão envolvidos diretamente com o processo de infecção das plantas, já a segunda metodologia avaliou a inibição de estruturas reprodutivas do microrganismo (os esporos), responsável pelo processo de infecção. Foram calculadas as médias de crescimento micelial para todas as substâncias testadas, revelando o alcalóide Nmetil- 4-metoxi-2-quinolona (100 μg.mL-1) como o mais eficaz dentre todas as substâncias ensaiadas. Quanto a inibição frente à germinação de esporos e formação de apressórios, os resultados foram bastante satisfatórios, a cumarina escoparona (100 μg.mL-1) apresentou inibição de 96% para a germinação de esporos e 99% para a formação de apressórios, o alcalóide N-metil-4-metoxi-2- quinolona (100 μg.mL-1) com 83% e 91%, e o flavonóide isosakuranetina (100 μg.mL-1) com 71,4% e 80%, respectivamente. Portanto, a partir deste trabalho verificou-se que alguns produtos naturais com potencial antifúngico revelaram importantes fontes na descoberta de novos produtos livres de toxicidade e eficaz como fungicida