Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle. / The supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei of the hypothalamus display reversible neurono-glial structural plasticity in various physiological conditions, such as parturition, lactation, or following salt loading. In such conditions, astrocytic leaflets that normally envelop the somas and dendrites of ocytocin (OT) or arginin-vasopressin (AVP) neurons retract from OT processes where they are replaced by new synapses, mainly GABAergic. Our hypothesis proposes that these cellular movements are regulated by molecules known for their roles in cell adhesion and motility, notably Eph receptors and ephrins (Efn). We have examined the role of one of these receptors, EphA4, a tyrosine-kinase receptor recognizing all ephrins, A or B, and then tried to identify the Efn interacting with EphA4 in these functions, following salt-loading. To demonstrate the presence of EphA4 in the SON and determine the effect of salt loading on its expression, we used in situ hybridization and immunohistochemistry in light and electron microscopy, on brain sections from rats or mice treated with salted water during 1-7 d, using riboprobes and antibodies specific for EphA4. These experiments demonstrated that EphA4 is expressed in the SON, with a distribution of its mRNA similar to that of OT neurons, and that it was absent from the glia limitans. Its expression increased following salt loading, particularly in dendrites. We then tested the effect of an absence of EphA4 on astrocytic process retraction and on synaptogenesis, using EphA4 kockout mice and wild-type littermates. We measured the ratio of astrocytic contact, and counted the number of synapses on the circumference of OT and AVP dendrites, identified in electron microscopy by immunocytochemistry, after 7 d of salt loading. The results confirmed the retraction of astrocytic processes from OT dendrites in wild-type animals after salt loading, and no change around AVP dendrites. However, there was no retraction from OT dendrites in EphA4 knockout mice, following salt loading. Altogether, these results constitute strong evidence for a role of EphA4 in the astrocyte leaflet retraction and accompanying synaptogenesis, specifically around OT dendrites. In order to identify the Efn interacting with EphA4 in this function, we used in situ hybridization and immunohistochemistry for EfnB3 and –A3. The in situ hybridization did not show the presence of EfnB3 in the SON, while the results for EfnA3 are currently being quantified. Nevertheless, anti-EfnA3 immunohistochemistry showed labelling in astrocytes and in the glia limitans of the SON, a labelling that seemed to increase following salt loading, although the specificity of the anti-EfnA3 antibody remains to be demonstrated on EfnA3 knockout mice, and its expression requires to be measured on a larger number of mice. The latter observations indicate EfnA3 as the potential partner (receptor/ligand) for EphA4 in the neurono-glial structural plasticity occurring in the SON following salt loading.

Un papier bioactif est obtenu par la modification d’un papier en y immobilisant une ou plusieurs biomolécules. La recherche et le développement de papiers bioactifs est en plein essor car le papier est un substrat peu dispendieux qui est déjà d’usage très répandu à travers le monde. Bien que les papiers bioactifs n’aient pas connus de succès commercial depuis la mise en marche de bandelettes mesurant le taux de glucose dans les années cinquante, de nombreux groupes de recherche travaillent à immobiliser des biomolécules sur le papier pour obtenir un papier bioactif qui est abordable et possède une bonne durée de vie. Contrairement à la glucose oxidase, l’enzyme utilisée sur ces bandelettes, la majorité des biomolécules sont très fragiles et perdent leur activité très rapidement lorsqu’immobilisées sur des papiers. Le développement de nouveaux papiers bioactifs pouvant détecter des substances d’intérêt ou même désactiver des pathogènes dépend donc de découverte de nouvelles techniques d’immobilisation des biomolécules permettant de maintenir leur activité tout en étant applicable dans la chaîne de production actuelle des papiers fins. Le but de cette thèse est de développer une technique d’immobilisation efficace et versatile, permettant de protéger l’activité de biomolécules incorporées sur des papiers. La microencapsulation a été choisie comme technique d’immobilisation car elle permet d’enfermer de grandes quantités de biomolécules à l’intérieur d’une sphère poreuse permettant leur protection. Pour cette étude, le polymère poly(éthylènediimine) a été choisi afin de générer la paroi des microcapsules. Les enzymes laccase et glucose oxidase, dont les propriétés sont bien établies, seront utilisées comme biomolécules test. Dans un premier temps, deux procédures d’encapsulation ont été développées puis étudiées. La méthode par émulsion produit des microcapsules de plus petits diamètres que la méthode par encapsulation utilisant un encapsulateur, bien que cette dernière offre une meilleure efficacité d’encapsulation. Par la suite, l’effet de la procédure d’encapsulation sur l’activité enzymatique et la stabilité thermique des enzymes a été étudié à cause de l’importance du maintien de l’activité sur le développement d’une plateforme d’immobilisation. L’effet de la nature du polymère utilisé pour la fabrication des capsules sur la conformation de l’enzyme a été étudié pour la première fois. Finalement, l’applicabilité des microcapsules de poly(éthylèneimine) dans la confection de papiers bioactifs a été démontré par le biais de trois prototypes. Un papier réagissant au glucose a été obtenu en immobilisant des microcapsules contenant l’enzyme glucose oxidase. Un papier sensible à l’enzyme neuraminidase pour la détection de la vaginose bactérienne avec une plus grande stabilité durant l’entreposage a été fait en encapsulant les réactifs colorimétriques dans des capsules de poly(éthylèneimine). L’utilisation de microcapsules pour l’immobilisation d’anticorps a également été étudiée. Les avancées au niveau de la plateforme d’immobilisation de biomolécules par microencapsulation qui ont été réalisées lors de cette thèse permettront de mieux comprendre l’effet des réactifs impliqués dans la procédure de microencapsulation sur la stabilité, l’activité et la conformation des biomolécules. Les résultats obtenus démontrent que la plateforme d’immobilisation développée peut être appliquée pour la confection de nouveaux papiers bioactifs. / Biosensing paper attracts increasing attention due to its benefits of being simple, visible, portable and useful for detecting various contaminants, pathogens and toxins. While there has been no bioactive paper commercialized since glucose paper strips developed in the fifties, many research groups are working to immobilize biomolecules on paper to achieve a bioactive paper that is affordable and has good shelf life. The goal of this research is to develop some highly useful bioactive paper that could, for example, measure blood glucose, or immediately detect and simultaneously deactivate pathogens such as neuraminidase and E.coli. Previously, bioactive paper was produced either through physically absorbing biorecognition elements or printing bio-ink onto paper substrate. Our methodology for fabrication of bioactive paper strips is compatible with existing paper making process and includes three procedures: the fabrication of microcapsules, enzyme or antibody microencapsulation, immobilization of enzymes or antibody-entrapped microcapsules into paper pulp. The first step, in fabricating of bioactive paper strips is to produce biocompatible and inexpensive microcapsules with suitable parameters. To do so, two types of microencapsulation methods were compared; the emulsion method and the vibration nozzle method accomplished with an encapsulator. The parameters for producing optimal microcapsules with both methods were studied. Factors that affect their diameter, wall thickness, shell pore size, encapsulation efficiency and membrane compositions were also discussed. By comparison, microcapsules prepared with poly(ethyleneimine) (PEI) by the emulsion method exhibit properties that were more suitable for enzyme encapsulation and paper making process, whereas the microcapsules prepared by the vibration nozzle method were too big to be immobilized within paper pulp, and had lower encapsulation efficiency, enzymatic activity and productivity. Thus the emulsion method was chosen for subsequent experiments such as enzyme and antibody microencapsulation and bacterial vaginosis (BV) paper preparation. Microcapsules made by the emulsion method were semi-permeable in that the diffusion of substrate and product molecules were allowed freely across the membranes but the encapsulated enzymes would be retained inside. Glucose oxidase from Aspergillus niger (GOx) and laccase from Trametes versicolor (TvL) microcapsules showed high encapsulation efficiency, but the encapsulation process caused a severe decrease in the specific activities of both enzymes. Results from circular dichroism (CD) studies, fluorescence properties, enzymatic activities of free enzymes and Michaelis-Menten behavior demonstrated that the Vmax decrease for GOx was due to the restriction of diffusion across microcapsule membranes with pore size less than 5 nm. The microencapsulation process improved the thermal stability of GOx but decreased that of laccase. Bioactive papers were fabricated either by incorporating microcapsules containing different enzymes or empty microcapsules soaked in substrate and enhancer solution into the paper pulp during the sheet making process. Both the GOx and the BV paper strips underwent a color change in the presence of glucose and potassium iodide, and sialidase from Clostridium perfringens respectively. Some preliminary studies on antibody sensitized microcapsules, in which antibody was either encapsulated within the PEI microcapsules or conjugated to its membranes, were also performed. Our objective was to establish an enzyme immobilization platform based on microencapsulation techniques for paper based biosensors. Even though our current studies only focused on the microencapsulation of two enzymes, TvL and GOx, as well as the bioactive paper preparation, a similar approach can be applied to other enzymes. We believe that this immobilization method can potentially be employed for bioactive paper preparation on an industrial scale.

Ce projet de recherche mené en collaboration avec le CTP (Centre Technique du papier) a eu comme objectif de mettre en place une stratégie de greffage de polymères sur des fibres de cellulose via « Chimie Click » dans l’eau et dans des conditions douces et respectueuses de l’environnement afin de conférer de nouvelles propriétés mécaniques aux papiers résultants. La première étape a été d’élaborer une fonctionnalisation alcyne des fibres dans des conditions douces – dans l’eau ou dans un mélange eau/isopropanol – permettant à la fois une fonctionnalisation conséquente tout en préservant la cristallinité de la cellulose, la structure fibre et les propriétés mécaniques. Différentes méthodes de microscopie ont été utilisées pour mieux comprendre l’impact de la fonctionnalisation sur les propriétés mécaniques. Afin d’améliorer les propriétés mécaniques du papier, le greffage sur les fibres de polyéthers d’alkyle fonctionnalisés azoture a été réalisé dans l’eau par cycloaddition de Huisgen d’azoture-alcyne catalysée par le cuivre (II) (CuAAC). Plusieurs polymères de natures différentes (poly(éthylène glycol) et poly[(éthylène glycol)-stat-(propylène glycol)]), de différentes masses molaires et fonctionnalités (mono- ou difonctionnels) ont été liés aux fibres de cellulose. L’ajout de chaînes de poly(éthylène glycol) s’est avéré avoir un effet lubrifiant entraînant une légère diminution de l’indice de traction mais une augmentation importante de la flexibilité du papier. De plus, le greffage de polymères difonctionnels a démontré des propriétés originales de résistance à l’eau sans changer la nature hydrophile des fibres de cellulose. Enfin, le couplage Thiol-Yne a permis de fixer de petites molécules hydrosolubles fonctionnalisées thiol sur des fibres modifiées alcyne en s’affranchissant du cuivre nécessaire à la réalisation de la réaction de CuAAC. / This research project, in collaboration with CTP (Centre Technique du Papier), aimed at developing chemical pathway in water to graft polymers on cellulose fibers via “Click Chemistry” in eco-friendly and non-degrading conditions conferring new mechanical properties upon the resulting paper sheets. A first step was to develop a “green” alkyne derivatization method in mild conditions – through pure water or water/isopropanol mixture – allowing for a substantial alkyne functionalization without jeopardizing the cellulose crystallinity, the fiber structure, and maintaining good mechanical properties of the cellulose fibers and resulting paper sheets. To better understand how the functionalization impacts the mechanical properties, several microscopy methods were employed. Then, aiming at improving mechanical properties of the resulting paper, grafting of azidefunctionalized polyoxyalkylenes on alkyne-modified fibers was achieved via Copper(II)-Catalyzed Alkyne-Azide Cycloaddition (CuAAC) in pure water. Water soluble polymers of different nature (poly(ethylene glycol) or poly[(ethylene glycol)-stat-(propylene glycol)]), with different molar mass and functionality (one or two azide groups per macromolecular chain) were successfully attached on cellulose fibers. Grafting of PEG chains involved a slight decrease of the tensile index but a drastic increase of the flexibility of the paper sheet. Interestingly, fibers grafted with difunctional polymers demonstrated an original water resistance maintaining the hydrophilic nature of fibers. Finally, Thiol-Yne reaction was successfully carried out to attach small water soluble thiol-bearing reagents on alkyne-functionalized fibers in water as a metal-free alternative to CuAAC reaction.

La construction d’un NSOM, dans ce manuscrit de thèse, est décrite en détail. Lacombinaison du système NSOM construit avec un interféromètre est proposée afin d’accéderà des mesures de phase, à la fois de ultra-haute sensibilité mais également de très granderésolution spatiale. Le nom de l’instrument développé est un interferomètre optique àbalayage en champ proche (NSOI, pour l’acronyme en anglais). Le principe est basé surl’utilisation d’un diapason accordable en cristal de quartz, sur lequel se trouve une pointe,afin de sonder le matériau étudié. La mesure de la force de cisaillement de la pointe sondeau voisinage de la surface permet d’assurer la régulation et la stabilité de la distance depositionnement de la pointe par rapport à la surface considérée. Le dispositif est construit encombinant différents éléments électroniques pilotés par un logiciel développé en langageLab-VIEW. Le bruit de la mesure en NSOI est supprimé par un calcul simple basé sur lathéorie de l’optique ondulatoire et des interférences associées. Le système permet deréaliser des mesures optiques en champ proche ainsi que la détermination en hauterésolution de la phase du champ optique. L’échantillon SNG01 (l’un des réseaux utilisés pourcaractériser notre microscope à balayage en champ proche), ainsi que des disques optiques(CD, DVD and disques blu-ray) ont été utilisés pour tester la faisabilité et les performancesde notre système.Dans ce manuscrit de thèse, le graphène et les monocouches de MoS2 sont étudiés. Nous montrons qu’une épaisseur à l’échelle atomique peut être résolue par notresystème NSOI, avec l’utilisation de l’algorithme de suppression du bruit de mesure. Lesjoints de grain du graphène sont observés à grande échelle, via la technique d’imagerie parcollection en champ proche et par la réalisation de cartographies de phase. En particulier,les tensions internes à une couche de graphène sont observées, uniquement dans le casd’une imagerie de phase. / In this thesis, near-field scanning optical interferometry (NSOI), which combinesNSOM with interferometer, is proposed for the phase measurement. The shear-forcedetection scheme is applied for distance regulation. The hardware of the systemis constructed by combining various electronic devices, and the operating softwareis coded by LabVIEW. Unwanted background signal is removed by simple calculationbased on interference theory. By using this, the near-field optical measurementand the ultra-sensitive phase investigation of nano-materials are performed. 2D materialssuch as graphene and monolayer MoS2 are investigated. It is shown thatatomic-scale thickness can be resolved by the NSOI. Especially, the grain boundariesof graphene and the seed of MoS2 can be found by phase detection. In addition,direct laser writing (DLW) on silver-containing glass is observed by using NSOM,and NSOI. For the first time, the writing threshold is correlatively observed in thefluorescence imaging and the near-field phase image.

Ce travail combine l'électrochimie à l'interface liquide - liquide avec le procédé sol - gel pour la modification interfaciale avec de la silice mésoporeuse. Dans la première partie de ce travail, l’interface liquide – liquide macroscopique a été utilisée pour séparer la solution aqueuse de l'espèce de précurseur de silice hydrolysées (tétraéthoxysilane (TEOS)) de l'agent tensioactif cationique (cethyltrimethylammonium (CTA+) qui a agi comme un template et a été dissous dans le dichloroéthane. Le dépôt de matériau de silice a été déclenchée par le transfert du CTA+ à partir de la phase organique vers la phase aqueuse. CTA+ qui a transféré à la phase aqueuse a catalysé la réaction de condensation de la silice sur l’interface liquide – liquide. Le dépôt de silice à des interfaces liquide – liquide miniaturisées était la deuxième partie de ce travail. Les dépôts stables sur le côté de l'interface ont été synthétisés in situ par voie électrochimique. La stabilité mécanique des dépôts de silice permis un traitement thermique de la silice. Basé sur les techniques d’imagerie (par exemple SEM) il a été constaté que les dépôts forment des hémisphères pour des temps plus long. La réaction interfaciale a également été suivie in situ par spectroscopie Raman confocale. Caractéristiques moléculaires de l'interface ont été modifiées de manière spectaculaire une fois les espèces CTA+ ont été transférés à la phase aqueuse. Les interfaces liquide – liquide miniaturisés et modifiés ont également été évaluée avec le transfert voltampérométrique / This work combines the electrochemistry at the interface between two immiscible electrolyte solutions (ITIES) with the Sol – Gel process of silica leading to an interfacial modification with mesoporous silica using soft template. In the first part of this work the macroscopic liquid – liquid interface was employed to separate the aqueous solution of the hydrolyzed silica precursor species (tetraethoxysilane (TEOS)) from the cationic surfactant (cethyltrimethylammonium (CTA+)) dissolved in the dichloroethane. The silica material deposition was controlled by the electrochemical CTA+ transfer from the organic to the aqueous phase. Template transferred to the aqueous phase catalyzed the condensation reaction and self-assembly resulting in silica deposition at the interface. Silica deposition at the miniaturized ITIES (membranes supporting array of micrometer in diameter pores were used in this regard) was the second part of this work. Silica interfacial synthesis performed in situ resulted in stable deposits growing on the aqueous side of the interface. Mechanical stability of the supported silica deposits allowed further processing – silica material was cured. Based on imaginary techniques (e.g. SEM) it was found that deposits forms hemispheres for longer experimental time scales. Interfacial reaction was also followed with in situ confocal Raman spectroscopy. Molecular characteristics of the interface were changed dramatically once CTA+ species were transferred to the aqueous phase. Array of microITIES modified with silica was also assessed by ion transfer voltammetry