Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Fitotecnia / La presente investigación se desarrolló con el objetivo de evaluar la selectividad de tres herbicidas, Linuron, Pendimethalin y Metribuzina, sobre dos cultivares de zanahoria (Daucus carota L. var. sativus). Se analizaron en forma independiente el cultivar de polinización abierta Chantenay RedCo y el cultivar híbrido Sugar Snax 54 (Nantes x Imperator), los cuales se consideraron como zanahoria estándar y miniatura, respectivamente. Durante la temporada 2010/2011, en el Campus Antumapu de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile, se evaluaron 5 tratamientos en cada cultivar. Se asperjaron Linuron y Pendimethalin en pre emergencia (en dosis de 1,5 y 3,5 L·ha-1 i.a. respectivamente), Linuron y Metribuzina en post emergencia del cultivo, en dosis de 1,5 L·ha-1 y 0,5 kg·ha-1 i.a. respectivamente, y un tratamiento testigo, el cual se mantuvo siempre limpio de malezas. Durante el desarrollo y previo a cosecha, se realizaron mediciones a la altura del follaje y porcentaje de mortalidad del cultivo y dominancia y densidad de las malezas. A cosecha se midieron los parámetros de peso fresco, longitud de raíz, diámetro de raíz, color, contenido de carotenoides y rendimiento comercial, para poder determinar la selectividad de los herbicidas. Por condiciones particulares del clima en la temporada en que se realizó el estudio, los ciclos de vida de ambos cultivares se vieron afectados, llegando a cosecharse en un tiempo más prolongado al esperado, viéndose alterados desde el momento de emergencia hasta la cosecha, incluyendo los momentos claves para la aplicación de los herbicidas post emergentes (1 y 5 hojas verdaderas). Finalmente se concluyó que todos los herbicidas utilizados fueron selectivos para ambos cultivares ya que no afectaron estadísticamente parámetros de calidad ni crecimiento, sin embargo, se recomienda la utilización de Linuron o Pendimethalin en las dosis señaladas, debido a que se obtuvo el mejor rendimiento comercial. / This research was conducted in order to evaluate the selectivity of three herbicides, Linuron, Pendimethalin and Metribuzin, on two cultivars of carrot (Daucus carota L. var. sativus). The OP cultivar Chantenay RedCo and the hybrid Sugar Snax 54 (Nantes x Imperator), which are considered as standard and miniature carrots respectively, were analyzed independently. During the 2010/2011 season, at the Antumapu Experimental Station of the University of Chile Agricultural Sciences Faculty, five treatments were evaluated in each cultivar. Linuron and Pendimethalin were sprayed at pre emergence (at a dose of 1.5 and 3.5 L·ha-1 respectively), Linuron and Metribuzin werte sprayed at post crop emergence, at doses of 1.5 L·ha-1 and 0.5 kg·ha-1 respectively, and a control treatment, which was kept clean of weeds. During the growing season and prior to the harvest, foliage hight and mortality rate were evlauated in each cultivar and dominance and density were evaluated to the weeds. At harvest parameters fresh weight, root length, root diameter, color, carotenoid content and comertial yield were measured in order to determine the selectivity of the herbicides. Due to weather conditions in the season of the study, the life cycles of both cultivars were affected, being harvested in a longer time than expected, getting altered from emergence to harvest, including the key moments for the application of the post emergence herbicides (1 and 5 true leaf). Finally it was concluded that the used herbicides were selective for both cultivars and didn’t affect statistically the parameters of quality and growth, however, Linuron and Pendimethalin are recommended at the mentioned dose, because it had the best comertial yield.

Tesis presentada para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo y al Grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias, Mención en Producción Frutícola / Con el fin de conocer la acumulación y variación estacional de la biomasa de órganos y estructuras en plantas jóvenes y en producción de granado var. Wonderful, se utilizaron relaciones alómetricas que permitieron estimar los coeficientes de reparto (CR), el índice del área foliar (IAF) y la eficiencia del uso de la radiación (EUR) en ambos huertos. Para construir las relaciones alométricas se utilizó un método directo, en donde se extrajeron 4 árboles de tres años y 2 árboles de cinco años, en los periodos de brotación, cuaja, crecimiento intermedio del fruto, cosecha y receso. Los árboles fueron separados en raíz, estructura caulinar, hojas, frutos y caídas, obteniéndose el peso fresco y seco de cada compartimiento. Antes de la extracción de cada grupo de plantas, se midió su radiación interceptada (PARf) y su área de sección transversal del tronco (ASTT), variables independientes que se relacionaron con el peso seco de los órganos extraídos. Las alometrías (método indirecto) obtenidas, fueron aplicadas en otros 6 árboles de ambos huertos en base a la medición de dichas variables alométricas desde brotación a receso. Además, se marcaron 16 frutos recién cuajados por árbol para realizar el seguimiento de diámetro ecuatorial hasta cosecha. Los resultados indican que las alometrías obtenidas determinaron con un R2 =0,92 la biomasa de granados. El crecimiento anual de biomasa de árboles en producción fue de 14 kg en peso seco. Los frutos representaron el 55% de la biomasa total, alcanzando un CR máximo de 0,8, previo a la cosecha y su crecimiento siguió un patrón de doble sigmoidea. El IAF máximo fue de 2,2 con un PARf de 45% y la EUR se estimó en 1,22 g·MJ-1. Los árboles jóvenes acumularon 2,5 kg en peso seco y los coeficientes de reparto al desarrollo de raíces, caulinar y hojas fueron similares. Su IAF máximo fue 0,6 con un PARf de 22% y una EUR de 0,8 g·MJ-1 / The accumulation and seasonal variation of the biomass of organs and structures, in young and fully-producing pomegranate plants var. Wonderful, were estimated using allometric relationships which allowed to estimate the partition coefficients (CR), the leaf area index (LAI) and the radiation use efficiency (RUE) in both orchards. In order to build the allometric relationships a direct method was used, which included four three year old and two five year old trees which were uprooted during the periods of bud break, fruit set, intermediate fruit growth, harvest and winter dormancy. The fresh and dry weight of the organs of the tree, which were pooled into five compartments (roots, caulinar structures, leaves, fruits and litter) was then measured. Before uprooting the plants, their radiation interception (PARf) and trunk cross-sectional area (TCSA) were measured, which were related to the dry weight of the aboveground organs. The allometric (indirect method) hereby obtained were applied in 6 trees in both orchards using the same biometric measurements from sprouting to winter dormancy. In addition, the equatorial diameter of 16 fruits was tracked from fruit set to harvest. The results gave a determination coefficient of 0.92 for the estimation of the whole plant biomass of pomegranates from the allometric functions. The annual growth of the fruit-bearing trees was estimated at 14 kg dry weight. The fruits accounted for 55% of the total biomass, reaching a maximum CR of 0.8 before harvest and their growth curve followed a double sigmoid pattern. The maximum LAI was 2.2 with a PARf of 45% and the RUE was estimated at 1.22 g·MJ-1. Young trees accumulated 2.5 kg dry weight over the growing season and equally devoted the partition coefficients of root development, caulinar structures and leaves. The maximum LAI of these trees was of 0.6 with a PARf of 22% and a RUE 0.8 g·MJ-1.

Determina si existen diferencias en el espesor alveolar del incisivo inferior en pacientes con diferente patrón de crecimiento vertical. Una muestra de 200 radiografías cefalométricas de pacientes sin tratamiento ortodóntico previo entre 6 y 12,8 años, es clasificada en tres grupos según su patrón de crecimiento vertical determinado por su ángulo FMA en: grupo hipodivergente (n=19), grupo normodivergente (n=101) y grupo hiperdivergente (n=80). Se miden los siguientes parámetros de espesor alveolar del incisivo inferior: espesor alveolar total (cervical, medio y apical), espesor alveolar vestibular (medio y apical) y espesor alveolar lingual (medio y apical) mediante trazados manuales. Para el análisis estadístico se emplean pruebas paramétricas (ANOVA y post hoc de Scheffé) y no paramétricas (Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney). No se encuentran diferencias estadísticamente significativas (p>0.05) entre los tres grupos para el espesor alveolar total cervical y espesor alveolar vestibular medio. El grupo hiperdivergente presenta los menores valores de espesor al ser comparado con los grupos normodivergente e hipodivergente (p <0.05) en los otros parámetros medidos. No se hallaron diferencias significativas entre los grupos normodivergente e hipodivergente. Concluye que se debe considerar el patrón de crecimiento vertical en el plan de tratamiento ortodóntico. Se sugiere tener cuidado en el tratamiento de pacientes con patrón de crecimiento vertical hiperdivergente, pues presentan un menor espesor alveolar del incisivo inferior comparado con los otros dos grupos. / Tesis

Memoria para optar al título de Bioquímico / Debido a la demanda social, la mujer ha tenido que postergar la maternidad. Esto presenta el inconveniente de que con el aumento de la edad decrece el número y la calidad de los folículos, disminuyendo progresivamente la fertilidad. Además, se ha descrito que los ovarios de mujeres pre y posmenopáusicas presentan características del desarrollo folicular similares al del ovario poliquístico (PCO) descrito en mujeres en edad fértil. También se ha descrito que mujeres con PCO y posmenopáusicas (entre 51 y 94 años de edad) presentan una mayor densidad de fibras nerviosas ováricas comparadas con ovarios de mujeres normales. En el modelo múrido, la rata presenta un aumento en la concentración de noradrenalina (NA) intraovárica y un incremento en el número de folículos tipo III (FTIII) y quistes ováricos a medida que envejece. Como consecuencia, disminuye el número de cuerpos lúteos (CL), el porcentaje de ovulación y el número de partos y crías. Por otro lado, en PCO en rata inducido con estímulos hormonales y/o ambientales, se generan características similares a las descritas en el envejecimiento ovárico. Además, PCO en ratas es acompañado de un aumento en la activación noradrenérgica ovárica, la cual es gatillada por un aumento previo en la producción de NGF intraovárico y su receptor de baja afinidad p75NTR. Mas aún, incremento de NGF intraovárico mediante al inyección de células sobreproductoras en el ovario de ratas jóvenes, induce un incremento del número de FTIII y prequistes. Por lo tanto, proponemos que NGF como factor neurotrófico y/o factor de crecimiento, durante el periodo de subfertilidad, acelera el envejecimiento ovárico siendo un importante componente para el control del final del periodo reproductivo en la rata. Ratas Sprague-Dawley de 6, 8 y 10 meses de edad fueron tratadas con NGF localmente en el ovario durante 28 días mediante una minibomba osmótica. Durante el procedimiento la ciclicidad estral fue estudiada por frotis vaginal. Posteriormente las ratas fueron eutanasiadas y se determinó la concentración de NGF intraovárico, la concentración de NA por HPLC, hormonas esteroidales en suero por EIA, y la morfología ovárica fue analizada mediante cortes de 6 um teñidos con hematoxilina-eosina. Los resultados demostraron los mayores efectos de la administración de NGF se observaron a los 10 meses de edad, donde observamos un incrementó en la concentración de NA y el número de FTIII en ovario, como esperábamos, disminuyó el número de CL y el porcentaje de ovulación. En los tratamientos de 6 y 8 meses no se observaron cambios tan importantes. Sin embargo, se observaron algunas características típicas del envejecimiento ovárico, como incremento de la concentración de noradrenalina, disminución de la población folicular y aumento de folículos tipo III. En la función esteroidogénica, se observó un perfil hormonal sérico similar al del envejecimiento. Estos resultados sugieren que el aumento intraovárico de NGF participa en el envejecimiento del ovario, favoreciendo la aparición de las características observadas al final del periodo reproductivo. / Woman has delayed their motherhood still after 30 years old because of social demand, but ovarian follicle numbers and quality decreases with age, progressively decreasing the fertility with age. Furthermore, it has been described that ovaries from women during the pre- and/or post-menopausal period show a follicular development similar to polycystic ovary (PCO) in fertile women. It has been also found that the ovary of women with PCO (between 18 and 44 years old) or during postmenopausal period (between 51 and 94 years old) shows increased nerves fibers in contrast with the ovary of normal women. In the murine model, the ovary of ageing rat is characterized by increased concentration of noradrenaline (NA) and elevated number of type III follicles (FTIII) and cysts in the ovary. As a consequence, it decreased the number of corpus luteum (CL), the ovulation rate, pregnancy and the number of live pups. PCO in rat, either induced by hormonal and/or environmental stimulus, presents similar characteristics as most of ovarian ageing. In addition PCO in rats is accompanied by an increase in the activity of sympathetic nerves induced by a previous increase in the intraovarian levels of NGF (nerve growth factor) and its receptor p75NTR. Moreover, local increase of NGF by injection of overproducing cells in the ovaries of young rats induces an elevated number of FTIII and pre-cysts. Therefore, now we propose that NGF, during the subfertile period, could act either as a neurotrophic factor or as a growth factor to accelerate the ovarian ageing being a principal component to control the end of reproductive period in rats. Sprague-Dawley rats 6, 8 and 10 months old (before at the end of the reproductive period) were used. We administered NGF during 28 days trough an osmotic mini-pumps, connected to the ovary by a sylastic cannula. During the procedure the estrual cycling activity was followed by vaginal smear. Rats were euthanized and the ovarian concentration of NGF was determined by ELISA, NA was determined by HPLC, the concentration of steroid hormones in serum by EIA and the morphological analysis of the ovary was done in 6 um slices stained with hematoxylineosin measured. The major effects of NGF occurred in the 10 months old rats, at this age we observe an increase in the concentration of NA and in the number of FTIII. As we can expect, the number of CL and the ovulation rate were decreased. In the NGF treatment at 6 and 8 months old there were no important changes. However, we observed the appearance of some ovarian ageing characteristics such as an increase in the concentration of NA, decrease of follicular population and an elevate number of FTIII (it was observed at 8 month old, as we can expect if the ageing is accelerated). In the steroidogenic function, we observe in all treatments the normal ageing-hormonal profile. These results suggest that the intraovarian excess of NGF accelerate the ageing ovarian, maybe increasing the rises of the typical characteristic at the end of the reproductive period

Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En las últimas décadas el cáncer se ha establecido como una de las principales causas de muerte. Por eso es importante dilucidar los mecanismos por los cuales se genera esta enfermedad con el fin de combatirla. El estudio de esta enfermedad es complejo, y debido a los modelos que se han generado para estudiar este mal, se ha logrado llegar a comprender mejor esta enfermedad. Entre los modelos actuales de cáncer, se encuentra el modelo de carcinogénesis química de piel de ratón, el cual nos permite abarcar en su totalidad el estudio de la progresión tumoral. Una de las líneas de investigación del cáncer es el estudio de la citoquina TGF-ß1, citoquina multifuncional que modula muchos procesos íntimamente relacionados con cáncer. En la actualidad se acepta que TGF-ß1 posee un rol dual en la progresión tumoral, debido a que este factor puede tanto inhibir como estimular la tumorogénesis, dependiendo del estadío en la progresión tumoral en el cual se encuentren las células que están bajo su estímulo. TGF-ß1 actúa sobre la célula modulando funciones determinadas mediante vías de transducción de señales. Entre estas vías la vía Smad3 y la vía ERK1/2, ambas importantes por su conexión con el cáncer. La activación de las vías de transducción de señales tiene como efecto, entre otros, un aumento en las proteínas relacionadas con la metástasis, como uPA, PAI-1 y MMP9. Estas proteínas participan activamente en la degradación de la matriz extracelular, proceso imprescindible para la migración y por ende la malignidad. Además de una mayor capacidad degradativa, en la célula tumoral se producen cambios morfológicos que facilitan su motilidad y por tanto la malignidad. Las células epiteliales bajo el estímulo de TGF-ß1 sufren un proceso denominado transición epitelio-mesenquimática (TEM). La TEM se relaciona con una mayor independencia celular, y una mayor migración debido a una morfología más fibroblastoidea de las células. Este proceso está asociado a una disminución de cadherina-E y a un aumento de vimentina. La TEM es un proceso importante en la búsqueda de terapias contra el cáncer y es por eso que los esfuerzos se han centrado en entender los mecanismos y las proteínas que modulan las señalizaciones de TGF-ß1, y por ende este proceso. Entre estas proteínas se ha descrito Skip, proteína asociada a la maquinaria de maduración de los mRNA y a la transcripción. Además esta proteína interactúa con proteínas virales relacionadas con el cáncer. Skip también tiene la capacidad de activar la vía Smad3 bajo el estímulo de TGF-ß1, lo cual nos sugiere un posible papel de Skip en la progresión tumoral inducida por TGF-ß1. Nuestros resultados mostraron que Skip puede regular las vías de transducción de TGF-1, Smad3 y ERK1/2, además de la expresión de uPA, PAI-1 y MMP9 tanto en células PDV como en células humanas de cáncer de próstata, PC-3. A su vez TGF-ß1 regula la expresión de Skip en forma dependiente del tipo celular, lo cual podría tener relación con el efecto que produce Skip sobre las vías moduladas por TGF-ß1. También se investigó la relación entre Skip y TEM. En este ámbito nuestros resultados indicaron que la disminución en la expresión de Skip evita que se realice el proceso de TEM. Esto quedó evidenciado en las células con menor expresión de Skip (C14), ya que en estas no se formaron los filamentos de vimentina, así como tampoco las fibras gruesas y largas en la periferia celular que son inducidas normalmente por TGF-ß1 en células PDV. Además nuestros datos indicaron que la disminución en la expresión de Skip produce una meno migración bajo el estímulo de TGF-ß1 en las células PDV, lo que indica que dicha disminución implica una resistencia a la inducción de la malignidad de las células PDV debida a TGF-ß1. Estas evidencias indicarían que Skip podría ser un blanco posible para bloquear procesos de malignidad debido a TGF-ß1, sin embargo antes es necesario estudiar el efecto de Skip sobre la TEM en células humanas. En función de esto se podrían diseñar estrategias para evitar el proceso de TEM, lo que impediría una de las etapas cruciales en la malignidad

Los tumores de mama pertenecen a un grupo de lesiones neoplásicas denominadas tumores desmoplásicos que, bajo la influencia de ciertos factores epiteliales, originan una estructura estromal rígida responsable de la consistencia dura de la masa tumoral. Este proceso fibrótico ocurre en etapas tempranas de la enfermedad, es controlado por una forma de fibroblastos conocidos como miofibroblastos, o fibroblastos activados, y sus mecanismos son pobremente comprendidos. La activación del tejido estromal es una etapa fundamental en la progresión tumoral, permitiendo tanto la adquisición de propiedades malignas en células epiteliales, como la capacidad invasiva y metastásica. En esta memoria de título estudiamos la miodiferenciación de fibroblastos mamarios no tumorales RMF-EG, frente al estímulo de TGF-β1, secretado por células tumorales y que es abundante en el microambiente tumoral. Los resultados mostraron que 5ng/mL de TGF-β1 aumentó la expresión de actina α-SMA, marcador de miofibroblastos, y de CTGF, molécula asociada a diversos desórdenes fibróticos. A través del uso del inhibidor DPI y el knock-down de NOX4 demostramos que TGF-β1 promovió un ambiente oxidativo que favoreció la miodiferenciación fibroblástica de células RMF-EG. Determinamos también que TGF-β1 activó la ruta de señalización JNK1,2 y que esta activación era fundamental para el aumento de la expresión de CTGF, NOX4 y α-SMA. Estudiamos la influencia de la activación de esta ruta alternativa junto con el aumento del tenor oxidativo, sobre la activación de la ruta canónica Smad2,3. Los resultados mostraron que el aumento en la expresión de NOX4 y la fosforilación de JNK1,2 actuaban de manera sinérgica para activar la ruta Smad2,3. En conjunto, estos resultados demuestran que TGF-β1 provoca la miodiferenciación de fibroblastos no tumorales, a través de un mecanismo que requiere de la activación de JNK1,2, el aumento temprano de la expresión de CTGF y NOX4 con un consecuente aumento de los niveles intracelulares de ROS. / Memoria para optar al título de Bioquímico / Brest tumors belong to a group of neoplastic lesions known as desmoplastics or scirrhous tumors which, under the influence of tumor cell factors, originate a fibrous structure responsible for the hard consistency of the tumor mass. This fibrotic process occurs during early stages of the disease, it is orchestrated by activated fibroblast i.e. myofibroblast and its mechanisms are poorly understood. Activation of the stromal compartment is a critical step in tumor progression, enabling the epithelial acquisition of malignant properties, such as invasive and metastatic capacities. In the present study, we investigated the myofibroblastic differentiation of normal human mammary fibroblast RMF-EG, induced by TGF-β1, a growth factor secreted by tumor cells and abundant in tumor microenvironment. Our results reveal that a 5ng/mL TGF-β1 stimulus increased the expression of myofibroblast marker α-SMA and CTGF, a molecule associated to several fibrotic disorders. Using a NOX inhibitor (DPI) and a siRNA for NOX4, we demonstrated that TGF-β1 promoted an oxidative environment that favors myofibroblastic differentiation of RMF-EG cells. We also determined that TGF-β1-dependant activation of JNK1,2 was essential for CTGF, NOX4 and α-SMA increased expression. We assessed the influence of JNK1,2 activation and NOX4 activity on canonical Smad2,3 activation. Our results reveal that the TGF-β1-dependant increase of NOX4 expression and JNK1,2 phosphorylation induced a synergical activation of the canonical TGF-β1 pathway, Smad2,3.Taken together, these results demonstrate that TGF-β1 promotes myofibroblastic differentiation of normal fibroblasts RMF-EG through a mechanism that requires JNK1,2 activation, early increase of CTGF and NOX4 expression with a consequent increase of intracellular ROS levels

Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o desórdenes inflamatorios. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito. El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT, en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta. Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2. Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs. Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana, mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281 y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína. Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos. En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders. Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell. It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin, interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T. cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay, which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with several strains of the parasite. The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT), and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment. The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20- 191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281 and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line. The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate the antiangiogenic gene expression. In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions induced by trypanosomic infections

Magister en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En el cáncer ovárico epitelial (COEI), el ovario pierde el control normal de la angiogénesis. El COE exhibe alta expresión del Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), un factor proangiogénico. Por otro lado, la calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional con propiedades anti-angiogénicas. Su exposición en la cara extracelular de la membrana plasmática de células tumorales en proceso de muerte celular es necesaria para que éstas sean reconocidas y fagocitadas por células dendríticas. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de CRT en muestras humanas: ovarios normales inactivos, tumores benignos, tumores borderline y muestras de cáncer ovárico epitelial. Además, evaluar si el NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales normales de la superficie ovárica humana (células HOSE) y en una línea celular de cáncer ovárico epitelial (A2780). Los niveles de mRNA y proteicos de CRT fueron evaluados mediante RT-PCR, western-blot e inmunohistoquímica en un total de 67 muestras ováricas humanas. La expresión de CRT inducida por estimulación con NGF en líneas celulares fue evaluada por RT-PCR, western-blot e inmunocitoquímica. Los niveles de mRNA de CRT aumentaron en muestras de cáncer ovárico epitelial comparado con ovarios normales inactivos, tumores benignos y tumores borderline. Los niveles proteicos resultaron mayores en cáncer con respecto a tumores benignos y tumores borderline. Al estimular las líneas celulares HOSE y A2780 con NGF (100 ng/ml) por 30 minutos, no se observaron cambios estadísticamente significativos en los niveles de mRNA. Sin embargo, a través de inmunocitoquímica y western-blot se observó un aumento significativo en los niveles proteicos de CRT al estimular con NGF comparado con la situación control. Este efecto fue revertido por GW441756, un inhibidor específico del receptor de NGF, TRKA. Estos resultados sugieren que NGF regula la expresión de CRT en células epiteliales ováricas mediante la activación de su receptor de alta afinidad TRKA / In epithelial ovarian cancer (EOC), the ovary loses the normal control of angiogenesis. EOC exhibits high expression of Nerve Growth Factor (NGF), a proangiogenic protein. On the other hand, calreticulin (CRT) is a multifunctional protein with anti-angiogenic properties. Its exposure on the cell membrane of dying tumor cells is necessary to promote their recognition and engulfment by dendritic cells. The aim of this work was to evaluate CRT expression in human samples: normal inactive ovaries, benign tumors, borderline tumors and epithelial ovarian cancer samples. Besides, to evaluate whether NGF regulates CRT expression in human ovarian surface epithelium cells (HOSE cells) and in an epithelial ovarian cancer cell line (A2780). Calreticulin mRNA and protein levels were analyzed by RT-PCR, western-blot and immunohistochemistry in 67 human ovarian samples. CRT expression induced by NGF stimulation in cell lines was evaluated by RT-PCR, western-blot and immunocytochemistry. CRT mRNA levels were elevated in epithelial ovarian cancer samples as compared to inactive normal ovaries, benign tumors and borderline tumors. CRT protein levels, evaluated by western-blot, were increased in epithelial ovarian cancer with respect to benign and to borderline tumors. When HOSE and A2780 cell lines where stimulated with NGF (100 ng/ml) for 30 minutes, no significant increase in CRT mRNA levels, evaluated by RT-PCR, was found. However, by immunocytochemistry and western-blot there was a significant increase in CRT protein levels after NGF stimulation, as compared to controls. This effect was reverted by GW441756, a TRKA specific inhibitor, receptor for NGF. These results suggest that Nerve Growth Factor regulates CRT expression in epithelial ovarian cells through TRKA activation, its high affinity receptor

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Farmacología / La fibrosis cardiaca se genera por un depósito exagerado de proteínas de matriz extracelular (MEC) producto de la activación de los fibroblastos (FC). Estas células, representan cerca de un 60 a 70% de las células del corazón, y en respuesta a un daño, son activadas por diversas citoquinas y factores de crecimiento (entre ellas, TGF-β1, Ang II, etc.), los que desencadenan en ellas un cambio estructural y funcional que las diferencia a miofibroblastos cardiacos (MFC). Los MFC tienen como principal función la de secretar proteínas de la MEC con el fin de contraer y reparar la zona dañada en el caso de un infarto al corazón. Así, el MFC juega un papel crucial en la respuesta frente a un daño en el tejido cardiaco. A pesar de ello, es muy poco lo que se sabe con respecto al comportamiento de este tipo celular frente al remodelado cardiaco. Además, se tiene un escaso conocimiento acerca de los receptores celulares que presenta este tipo celular, pudiendo ser piezas claves en la regulación de la secreción exacerbada de MEC y por tanto, de la generación de fibrosis del tejido. En la fibrosis cardiaca, adquiere gran importancia la participación del sistema calicreina-cinina. Se ha propuesto que la ausencia de los receptores de cininas es deletérea a nivel del tejido cardiaco, especialmente en la respuesta frente a una injuria. Dentro de este sistema, se encuentran bradicinina (BK) que actúa sobre el receptor B2 de cininas (B2R) y lis-des-Arg-BK (DAKD) que ejercen su acción sobre el receptor B1 (B1R). En FC se ha demostrado que, BK produce liberación de NO y de prostaglandinas, además de reducir la secreción de colágeno. Sin embargo, en MFC se desconocen que subtipos de receptores están presentes, así como las vías transduccionales que se activan tras la estimulación de ambos subtipos de receptores. En la presente tesis y de acuerdo con el contexto, se realizaron diversos experimentos para demostrar la existencia y funcionalidad de los receptores de cininas tanto en FC como en MFC. Por western blot (WB) se evidenció la presencia de ambos receptores tanto en FC como en MFC, no obstante, la expresión de B1R es mayor en MFC que FC; mientras que B2R permanece constante. La expresión de B1R aumentó tras el tratamiento de FC con TGF-β1, principal diferenciador a MFC. Además mediante las técnicas de inmunofluorescencia y ensayos de radioligando, se determinó que en FC el B1R se encuentra localizado principalmente a nivel intracelular, mientras que en MFC se localiza marcadamente en las membranas plasmáticas. Por otro lado, mediante el análisis de los movimientos de calcio intracelular, se demostró que B2R es funcional en ambos tipos celulares, mientras que B1R es funcional en MFC y no así en FC. Sin embargo, en FC la preincubación con el agonista de B1R (DAKD), y la posterior estimulación (30 min) con el mismo agonista, mostró que estos receptores son también funcionales. Mediante inmunofluorescencia se evidenció que tras la preincubación con el agonista existe una relocalización de B1R hacia las membranas plasmáticas, dónde son capaces de generar movimientos de calcio intracelular, demostrando que también son receptores activos. Además, en MFC se demostró que la activación de B1R y B2R por sus respectivos agonistas induce una reducción en la expresión de colágeno I (Col I). En FC, la activación de B2R induce la disminución en los niveles de Col I, mientras que la activación de B1R que provoca la reducción en la expresión de Col I, requiere de un estímulo previo que redistribuya este receptor hacia la membrana plasmática. Finalmente, el uso de distintos inhibidores permitió demostrar que en MFC, tanto la activación de B1R como B2R, conducen a la disminución en la expresión de Col I a través de la activación de una vía transduccional que es compartida por ambos receptores, y que corresponde a: PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. En resumen, los resultados de esta tesis sostienen que en MFC la activación de B1R y B2R conduce a la disminución de la expresión de Col I, lo cual se relaciona a los efectos antifibróticos de las cininas en el progreso de patologías como la fibrosis cardiaca / Cardiac fibrosis is generated by an excessive deposit of extracellular matrix proteins (ECM) product of fibroblast (CF) activation. These cells account for about 60 to 70% of the cells in the heart. In response to injury, fibroblasts are activated by various cytokines and growth factors (including TGF-β1, Ang II, etc.), which trigger in them structural and functional changes, differentiating to cardiac myofibroblasts (CMF). The main function of CMF is to secrete ECM proteins to repair the damaged area in the case of a heart attack. Thus CMF play a crucial role in the response to injury in the heart tissue. However, very little is known about the behavior of this cell type versus cardiac remodeling. Furthermore, the knowledge on the receptors present on this cell type is scarce, and they could be key elements in the regulation of the exacerbated secretion of MEC and therefore the generation of tissue fibrosis. In cardiac fibrosis, the participation of the kallikrein-kinin system is very important. It has been proposed that the absence of kinin receptors is deleterious for cardiac tissue, especially in response to an injury. Within this system are bradykinin (BK) which acts on the B2 kinin receptor (B2R) and lis-des-Arg-BK (DAKD) that exerts its action on the B1 receptor (B1R). In CF, it has been shown that BK induces NO release and prostaglandins production, which reduce collagen secretion. However, in CMF it is not known which kinin receptor subtype is present and what signal transduction pathways are activated by these receptors. In this thesis and in accordance with the context, various experiments were conducted to prove the existence and functionality of kinin receptors in both CF and CMF the presence of both receptors in both CF as MFC was observed by Western blot (WB), however, expression of B1R in CMF was greater than in FC, while B2R remained constant. B1R expression increased after treatment of CF with TGF-β1, the main differentiator to CMF. By immunofluorescence techniques and radioligand assays, it was determined that CF B1R was located primarily intracellularly, whereas CMF was markedly located in the plasma membranes. Moreover, by analyzing intracellular calcium movements, B2R was shown to be functional in both cell types, while B1R was functional in CMF, but not in CF. However, when CF were preincubated with the B1R agonist (DAKD) and subsequently stimulated (30 min) with the same agonist, these receptors were also functional. By Immunofluorescence it was shown that after preincubation with the agonist the B1R was relocated to plasma membranes, where they were able to generate intracellular calcium movements, showing they are active receptors. Furthermore, it was demonstrated that B1R and B2R activation in CMF by their respective agonists, induces a reduction in the expression of collagen I (Col I). In contrast in CF, B2R activation induced a decrease in Col I levels, whereas a previous stimulus that redistributes B1R receptor to the plasma membrane is required to induce a reduction in Col I expression after B1R stimulation. Finally, the use of various inhibitors shows that CMF allowed both B1R activation and B2R, leading to a decrease in Col I expression through activation of a signal transduction pathway which is shared by both receptors, and that is mediated by PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. In summary, the results of this study argue that B1R and B2R activation in CMF leads to decreased expression of Col I, which is related to antifibrotic effects of kinins in the progress of diseases such as cardiac fibrosis / Conicyt Fondecyt

Tesis para optar al grado de Magíster en Urbanismo / El presente proyecto está enmarcado en el Proyecto U Apoya Línea 2 del departamento de Sociología (SOCU–SOS-11/8), titulado “Impactos del desarrollo inmobiliario y turístico de pequeñas localidades balneario del Litoral Central Chileno: Localización de Departamentos y Resort, Gentrificación Urbano Costera y Nuevas Demografías Residenciales”, cuyo responsable es el profesor Camilo Arriagada Luco. En este contexto es que la presente alumna tesista de magíster en Urbanismo se adjudicó, mediante concurso, una media beca que, por una parte apoya la realización de esta tesis de posgrado y por otra le encomienda la labor de entregar un producto final consistente en la aplicación de cuestionarios teóricos a profesionales expertos del área urbana tanto del sector público como privado y de centros académicos relevantes, concluyendo con la construcción de un marco teórico sobre globalización inmobiliaria, gentrificación y cambio socio demográfico en localidades turísticas y balnearios en regiones metropolitanas. En lo que respecta al desarrollo de la tesis, por una parte se propuso realizar una recopilación bibliográfica en torno al tema de interés, ésta incluye revisión de prensa escrita y audiovisual, de autores y de instrumentos de planificación territorial. Esta revisión bibliográfica estuvo también triangulada por observaciones en terreno del fenómeno en estudio. Por otra parte, a modo de complementar la información bibliográfica se analizó el discurso -emanado de entrevistas dirigidas- de los distintos actores involucrados en el quehacer inmobiliario - urbano desde cuatro focos diferentes como es la academia, el sector profesional privado y público, y los desarrolladores inmobiliarios, estando imbricadas estas categorías en algunos casos (docente y profesional del mundo privado, por ejemplo). Es interesante conocer las opiniones que subyacen a la práctica del desarrollo inmobiliario costero, para comprender mejor la lógica de la dinámica y evidenciar las fallas y vacíos de las políticas públicas urbanas. Los tópicos por los que se preguntaron fueron tres, a saber: 1) opinión general sobre el desarrollo inmobiliario y de Grandes Proyectos Urbanos en el borde costero; 2) opinión sobre la capacidad de integración social entre habitantes antiguos y nuevos; y 3): ideas de propuestas para mejorar los IPT y contribuir a un desarrollo armónico del territorio donde cada entrevistado aportó sus ideas al respecto, como así también dejaron algunas interrogantes planteadas que aportaron al enriquecimiento del debate en cuestión y que son potenciales temas para ser investigados. Asimismo, se realiza una descripción del crecimiento físico de las conurbaciones seleccionadas, a fin de dimensionar los cambios provocados en el paisaje y su repercusión en la vida cotidiana de los residentes habituales y los visitantes estacionales. Esta tesis reviste aportes a la investigación urbana toda vez que los casos de estudio y el desarrollo del borde costero en este contexto han sido poco investigados a nivel nacional al tratarse de una realidad emergente. Además destacar el hecho que el Borde Costero tiene su propia normativa, lo que agrega una fuente más de discusión a la hora de la planificación. En nuestro país toda la costa es susceptible de desarrollarse en términos inmobiliarios, por lo que este estudio podría servir para nuevas intervenciones territoriales en la zona.