L'évaluation de la contamination des cours d'eau par les agents parasites protozoaires est fondamentale puisqu'on estime qu'une personne sur deux dans le monde est ou a été infectée par une zoonose d'origine parasitaire. Les trois principaux parasites responsables d'épidémies hydriques sont Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis et Toxoplasma gondii. Actuellement, seule la matrice eau est utilisée pour analyser la présence de ces parasites dans l'environnement aquatique. Peu reproductible et chronophage, cette méthode ne permet pas de mettre en place une surveillance de routine. Le projet de thèse propose l'utilisation de la moule zébrée, Dreissena polymorpha, comme un nouvel outil complémentaire pour évaluer la qualité biologique des milieux d'eau douce. Au travers d'expérimentations combinant différentes approches in vivo, ex vivo et in situ, le potentiel de la dreissène à accumuler les parasites protozoaires ainsi que leurs cinétiques d'accumulation dans les tissus ont été déterminés. Utilisée comme espèce sentinelle des contaminations chimiques, l'effet d'un stress biologique dû aux protozoaires a été évalué au laboratoire sur les cellules clefs de l'immunité des bivalves, les hémocytes. Ainsi, le projet permet de placer l'organisme Dreissena polymorpha dans une double stratégie de biosurveillance : une biosurveillance sanitaire liée à l'utilisation de la dreissène en tant que vecteur de parasites considérés comme enjeux de santé publique et une biosurveillance environnementale liée à la compréhension des facteurs de confusion avec les réponses biologiques utilisées comme biomarqueurs. / Assessment of the water biological contamination by protozoa is crucial since one in two person of the world population is or has been infected by a parasitic zoonosis. The main protozoa responsible of waterborne outbreaks are Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis and Toxoplasma gondii. Currently, protozoa detection is only based on water analysis. Irrelevant and time consuming, water analysis do not permit accurate biomonitoring. These project aims to use the freshwater mussel, Dreissena polymorpha, as a new complementary tool for biological quality analysis of freshwater. Through in vivo, ex vivo and in situ experiments, we determine the utility of zebra mussel for protozoa accumulation and their accumulation pattern within mussel tissues. Already use as a sentinel specie for chemical contamination, biological stress caused by protozoa has been determined in laboratory experiments on key cells of bivalve immunity, the hemocytes. Hence, Dreissena polymorpha could be involved in a twofold biomonitoring tactics: sanitary biomonitoring related to the use of zebra mussel as vector to protozoa with public health issue and environmental biomonitoring on understanding of the confounding factors in biological responses used as biomarkers.

Este trabalho teve como objetivos a identificação de sequências 18S rDNA amplificadas de Cryptosporidium spp. de diversas espécies de hospedeiros e avaliar variabilidade em sequências gênicas deste lócus, com vistas ao desenho de sondas moleculares com melhor eficiência diagnóstica para detecção e identificação deste parasito. Foram coletadas 392 amostras de animais domésticos (bovinos, eqüinos, suínos, ovinos, cães e felinos) de 98 propriedades rurais do município de Teodoro Sampaio, Estado de São Paulo, 474 de aves silvestres de cativeiro de diversas famílias, provenientes de criadouros comerciais do Estado de São Paulo e criadas como estimação, 141 de sagüis de cativeiro do Estado de São Paulo, e 24 de humanos imunodeprimidos provenientes de hospital do município de São Paulo. As amostras foram submetidas a prova coproparasitológica e molecular para detecção e identificação de Cryptosporidium. Alinhamentos múltiplos obtidos de seqüências 18S rDNA de Cryptosporidium spp. determinadas neste estudo e de sequências recuperadas do Genbank foram analisados visualmente para a definição das regiões polimórficas. Após a definição das regiões polimórficas, foram realizadas análises filogenéticas empregando-se separadamente cada uma delas. Pelo exame coproparasitológico foi encontrado positividade em amostras de nove (4,57%) bovinos, três (11,11%) cães, 41 (8,64%) aves silvestres, 13 (9,20%) sagüis e todas as de humanos. As outras espécies de animais domésticos não apresentaram positividade para o parasita no exame coproparasitológico. Nos bovinos foi encontrado o Cryptosporidium Andersoni, em cães o Cryptosporidium canis, em sagüis o Cryptosporidium parvum e em humanos, C. parvum, Cryptosporidium hominis, Cryptosporidium felis e C. canis. Dentre as amostras de aves nenhuma foi identificada como Cryptosporidium meleagridis. As amostras de curiós (Oryzoborus angolensis) foram classificadas como Cryptosporidium galli, com exceção de uma, identificada como Cryptosporidium baileyi. C. galli foi encontrado também em um Sabiá Laranjeira (Turdus rufiventris), um Picharro (Saltator similis), dois canários e um Pintassilgo (C. carduelis). C. baileyi foi encontrado em um pintassilgo (Carduelis carduelis) um Pichochó (Sporophila frontalis), um Galo da Campina (Paroaria dominicana) e dois Canários (Sicalis flaveola). Pelos resultados, duas regiões polimórficas em sequência 18S rDNA de Cryptosporidium spp. (denominadas regiões 1 e 3) permitiram discriminar as diferentes espécies neste gênero de parasita, podendo ser utilizadas isoladamente como marcadores moleculares para identificação molecular dentro deste gênero. Saguis (Chalitrix spp.) de cativeiro são espécies susceptíveis a infecção por Cryptosporidium parvum apresentando-se como um hospedeiro de importância epidemiológica para esta zoonose. Curiós (O. angolensis) de cativeiro são espécies susceptíveis a infecção por Cryptosporidium galli apresentando-se como hospedeiro de importância epidemiológica para esta espécie de parasito. A não detecção de Cryptosporidium parvum em animais domésticos na região de Teodoro Sampaio, Estado de São Paulo, mostra uma condição sanitária favorável, já que este agente é causador de importante zoonose. A presença de espécies de Cryptosporidium spp. adaptadas a animais domésticos (como o C. felis e o C. canis) em humanos na cidade de São Paulo mostra que estes animais podem desempenhar importante papel na cadeia epidemiológica da criptosporidiose humana. / The objectives of this study were to identify 18S rDNA sequences of Cryptosporidium spp. From various species of hosts and to avaluate the variability in gene sequences of this locus, aiming the design of molecular probes with better diagnostic efficiency for the detection and identification of this parasite. It was collected 392 samples of domestic animals (cattle, horses, pigs, sheeps, dogs and cats) of 98 rural properties of Teodoro Sampaio city, São Paulo State, 474 captive wild birds of various families, from pet and comercial breeding in São Paulo State, 141 captive marmosets, of São Paulo State, and 24 immunossupressed humans from a São Paulo city hospital. The samples were submitted to coproparasitological and molecular tests for the detection and identification of Cryptosporidium. Multiple alignment of Cryptosporidium 18S rDNA sequences, that was determinated in this study and other download from GenBank were visually inspected in order to define polymorphic regions. After the definition of polymorphic regions, phylogenetic trees were reconstructed using each polymorphic region. Cryptosporidium spp. Were found by using coproparasitological tests in nine (4,57%) samples of cattle, tree (11,11%) dogs, 41 (8,64%) wild birds, 13 (9,20%) marmosets and all human samples. The other animal species were negative by coproparasitological tests. In cattle it was found Cryptosporidium andersoni, in dogs Cryptosporidium canis, in marmosets Cryptosporidium parvum and in humans, C. parvum, Cryptosporidium hominis, Cryptosporidium felis e C. canis. Among the samples of birds Cryptosporidium meleagridis was not found. All the samples of lesser seed-finch (Oryzoborus angolensis) were classified as Cryptosporidium galli, except for that from one individual with was identified as Cryptosporidium baileyi. Cryptosporidium galli was also found in one rufous-bellied thrush (Turdus rufiventris), one green-winged saltator (Saltator similis), two saffron finch (Sicalis flaveola) and one eurasian goldfinch (Carduelis carduelis). C. baileyi was found in one eurasian goldfinch (C. carduelis), one buffy-fronted seedeater (Sporophila Frontalis), one red-cowled cardinal (Paroaria dominicana) and two saffron finch (S. flaveola). From the results two polymorphic regions within 18S rDNA sequences of Cryptosporidium spp. (named as regions 1 and 3) enabled the discrimination of the different species in this genera, and then could be used alone as molecular markers for identification within this genera. Captive marmosets (Chalitrix spp.) are susceptible species for Cryptosporidium infection, presenting itself as an important source of infection for this zoonosis. Captive lesser seed-finch (Oryzoborus angolensis) are susceptible species for Cryptosporidium galli infection presenting itself as an epidemologic important host for this parasite. The absence of Cryptosporidium parvum in domestic animals of Teodoro Sampaio, São Paulo State, is indicative of a favorable health condition, as C. parvum is an agent causative of an important zoonosis. The presence of Cryptosporidium spp. species adapted to domestic animals (as C. felis and C. canis) in humans at São Paulo State indicate that these animals could play an important role in the epidemiology of human cryptosporidiosis.

A criptosporidiose é considerada uma das principais infecções por protozoários em aves, e já foi descrita em mais de 30 espécies de aves de várias Ordens, como Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psitaciformes e Struthioniformes. Três espécies de Cryptosporidium infectam aves: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli e Cryptosporidium meleagridis. Além dessas espécies, há vários genótipos distintos geneticamente das espécies de Cryptosporidium já descritas em aves, como os genótipos I, II, III e IV de aves. Há vários relatos de infecção por Cryptosporidium nos tratos gastrintestinal, respiratório e na bursa de Fabricius, resultando em perdas econômicas e mortalidade. O objetivo desse estudo foi a detecção de Cryptosporidium e sua caracterização molecular, em amostras de fezes de aves domésticas e de aves exóticas mantidas em cativeiro no Brasil. Foram coletadas 966 amostras de fezes de 18 famílias de aves. As amostras foram conservadas em solução de dicromato de potássio 2,5% a 4º C, até o processamento. Para purificação e concentração dos oocistos, foi utilizada a técnica de centrífugo-flutuação em solução de Sheather seguida de análise microscópica, em 463 amostras, por meio da técnica de coloração negativa com verde malaquita e de extração do DNA genômico dos oocistos, em amostra positivas à microscopia, ou, alternativamente, a extração de DNA foi realizada, sem a realização prévia de microscopia, em outras 503 amostras. A análise molecular foi realizada por meio da reação de nested-PCR, para amplificação de fragmentos da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico e do gene da actina. Foi observada amplificação para Cryptosporidium em 47 (4,86 %) amostras. O sequenciamento dos fragmentos amplificados possibilitou a identificação das três espécies que infectam aves: C. galli> em canário (Serinus canaria), galinha doméstica (Gallus gallus domesticus) e calopsita (Nymphicus hollandicus), C. meleagridis e C. baileyi em galinha doméstica (G. g. domesticus), Cryptosporidium genótipo I de aves em pavão azul (Pavocristatus) e canário (Serinus canaria), Cryptosporidium genótipo III de aves em agapornis (Agapornis roseicolis) e calopsita (N. hollandicus) e Cryptosporidium genótipo II de aves em avestruzes (Struthio camelus). / Cryptosporidiosis is considered a major protozoan infection in birds, and has been described in more than 30 species of birds of various orders, as Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psitaciformes and Struthioniformes. Three species of Cryptosporidium are considered valid in birds: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli and Cryptosporidium meleagridis. Besides these species, there are several genotypes genetically distinct from the species of Cryptosporidium described in birds, as avian genotypes I, II, III and IV. There are several reports of gastrointestinal, respiratory and bursa of Fabricius infections in birds, resulting in major economic losses and mortality. The aim of this study was the detection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in fecal samples of domestic birds and in exotic birds kept in captivity in Brazil. A total of 966 samples from 18 families of birds were collected and stored in 2.5% potassium dichromate solution at 4º C until processing. Oocysts were purified in Sheather sugar solution following microscopic analyses, in 463 samples, by malachite green negative stain and extraction of genomic DNA of oocysts in samples positive by microscopy or, alternatively, DNA extraction was accomplished without previous microscopic analyses in another 503 samples. Molecular analyses were performed using n-PCR for amplification of fragments of the 18S subunit of rRNA gene and of the actin gene. It was observed amplification for Cryptosporidium DNA fragments in 47 (4.86%) samples. Sequencing of amplified fragments and phylogenetic analyses allowed the identification of the three species that infect birds: C. galli in canaries (Serinus canaria), domestic chicken (Gallus gallus domesticus) and calopsita (Nymphicus hollandicus), C. meleagridis and C. baileyi in domestic chicken (G. g. domesticus), Cryptosporidium avian genotype I in peacock (Pavo cristatus) and canary (Serinus canaria), Cryptosporidium avian genotype III in agapornis (Agapornis roseicolis) and cockatiel (N. hollandicus), and Cryptosporidium avian genotype II in ostriches (Struthio camelus).

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. / The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 μl of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.

As doenças de veiculação hídrica são uma preocupação no mundo todo, e tem aumentado cada vez mais o interesse nos estudos relacionados aos protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia spp.. A presença de protozoários em águas de abastecimento está vinculada ao lançamento de esgoto nos mananciais, de modo que o tratamento de esgotos sanitários é de extrema importância para reduzir o risco de surtos de protozooses. Este trabalho avaliou a ocorrência e a possibilidade de remoção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em dois reatores UASB, um piloto e um em escala plena, operados com esgoto sanitário e um TDH de aproximadamente 8h, e um reator UASB piloto, operado com água negra simulada e um TDH aproximado de três dias. Nos dois reatores operados com esgoto sanitário as remoções foram semelhantes. A média de DQO total afluente, no reator piloto e no de escala plena, foi de 271 e 410 mg/L, respectivamente, e as remoções médias de DQO foram de 50,62 e 45,80%, respectivamente. Com relação aos exames parasitológicos, quase não houve remoção em ambos os reatores e, na maior parte dos casos, o número de (oo)cistos detectados no efluente foi maior do que no afluente. Já no reator piloto operado com águas negras, foram observadas remoções mais elevadas. A DQO total afluente desse reator variou de 837 a 3269 mg/L e a remoção média observada foi de 71,22%. Neste reator também foram observadas maiores remoções de (oo)cistos, sendo que a remoção de cistos Giardia spp. variou de 67,73 a 93,69% e, em um dos ensaios, foi observada uma remoção de 70% de oocistos de Cryptosporidium spp. Acredita-se que o melhor desempenho desse reator se deve ao seu elevado tempo de detenção hidráulico. Foi avaliada, ainda, a ocorrência de (oo)cistos no lodo dos três reatores, resultando em valores bastante elevados, da ordem de 105 cistos/g de massa seca, em todos eles. De qualquer modo, em todos os reatores avaliados, mesmo o que apresentou as maiores eficiências, o efluente ainda apresentava altas concentrações de poluentes, necessitando de um pós-tratamento para a remoção dos remanescentes de matéria orgânica, sólidos e patógenos. / The waterborne diseases are a concern worldwide, and has grown more and more interest in studies related to the protozoa Cryptosporidium spp. and Giardia spp. The presence of protozoa in drinking water is related to the release of sewage in water sources. So that, the sewage treatment is extremely important to reduce the risk of outbreaks protozoa. This study evaluated the occurrence and the possibility of removal of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. in two UASB reactors, a pilot and a full-scale, operated with sewage and a HRT of 8 hours, approximately, and a pilot UASB reactor, operated with simulated black water and an approximate HRT of three days. Removals were similar in both reactors operated with sewage. The average influent total COD, in pilot and full scale reactors, was 271 and 410 mg/L, respectively, and the average COD removal were 50.62 and 45.80%, respectively. With the parasitological test, there was almost no removal in both reactors and, in most cases, the number of (oo)cysts detected in the effluent was higher than in the influent. In the pilot reactor operated with black water, higher removals were observed. The total COD influent of this reactor ranged from 837 to 3269 mg/L and the average removal observed was 71.22%. In this reactor (oo)cysts removals were also higher, and the removal of Giardia cysts ranged from 67.73 to 93.69%, and in one of the trials, a 70% removal of Cryptosporidium spp was observed. It is believed that the best performance of this reactor is due to its high hydraulic retention time. The occurrence of (oo)cysts in the sludge of the three reactors was also evaluated, resulting in very high values of the order of 105 cysts/g of dry weight, in all of them. Anyway, in all this reactor, even the one with the highest efficiency, the effluent still had high concentrations of pollutants, necessitating a post treatment for the removal of remaining organic matter, solids and pathogens.

Este trabalho teve por objetivo avaliar a combinação de processos de tratamento de esgoto e a partir dos efluentes produzidos com diferentes padrões de qualidade elencar as possibilidades para reúso de acordo com legislação internacional. Foi feito o monitoramento da estação piloto de tratamento de esgoto constituído reator UASB seguido de lodo ativado cujos efluentes foram utilizados neste estudo, não somente para análises físico-químicas e microbiológicas, mas também para posterior tratamento físico-químico em laboratório com equipamento jarteste utilizando dois coagulantes - cloreto férrico e sulfato de alumínio. Após os tratamentos combinados seis amostras diferentes foram analisadas, sendo elas: efluente do UASB, efluente do lodo ativado, tratamentos UASB-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\', UASB-\'FE\'CL IND.3\', lodo ativado-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\' e lodo ativado-\'FE\'CL IND.3\'. Os ensaios realizados com cloreto férrico foram os que melhor promoveram remoção dos microrganismos indicadores e de (oo)cistos, de DQO e SST. Porém, mesmo após o tratamento físico-químico não será possível reutilização agrícola, urbana e/ou industrial dos efluentes, conforme legislação internacional e diretrizes da OMS, uma vez que a concentração de microrganismos indicadores ainda é muito elevada. Os valores médios de E. coli, coliformes totais e Giardia spp., mesmo após o tratamento que forneceu melhor remoção microbiológica (lodo ativado \'FE\'CL IND.3\') foram de 4,31 x \'10 POT.2\', 7,68 x \'10 POT.3\' e 2,17 x \'10 POT.2\', respectivamente. / The present dissertation reports to evaluate the combination of process wastewater treatment and from the effluent produced with different standards quality list the possibilities for reuse in accordance with international Law. Was monitored from the wastewater treatment plant pilot consists of a UASB reactor followed by activated sludge whose effluents were used in this study not only physical-chemical and microbiological analyzes, but also for subsequent physical-chemical treatment in the laboratory with equipment jartest using two coagulants ferric chloride and aluminum sulfate. After the treatments combined six different samples were analyzed: UASB effluent, activated sludge effluent, treatments UASB-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\', UASB-\'FE\'CL IND.3\', activated sludge-activated sludge and activated sludge-\'FE\'CL IND.3\'. The tests with ferric chloride were better promoted removal of the microbiological indicators and (oo)cysts, COD and TSS. However, even after physical-chemical treatment will not be possible wastewater reuse in agriculture, urban and/or industrial, according international law and the WHO guidelines, since the concentration of indicator microorganisms is still very high. The average values of E. coli and total coliform and Giardia spp., even after the treatment which promoted better microbiological removal, were 4,31 x \'10 POT.2\', 7,68 x \'10 POT.3\' e 2,17 x \'10 POT.2\', respectively.

Esgotos urbanos constituem compartimentos ambientais que favorecem a emergência e re-emergência enfermidades de veiculação hídrica. Este estudo objetivou analisar cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., assim como cistos, ovos e larvas de outros protozoários e helmintos patogênicos; Coliformes Totais e Termotolerantes, Rotavírus e Adenovírus em amostras de esgoto bruto e tratado da Estação de Tratamento de Esgoto de Ribeirão Preto - SP. As coletas de esgoto foram realizadas no ponto de entrada e no ponto de saída da ETE-Ribeirão Preto/SP. As análises de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. foram realizados pelo Método 1623 da EPA. Ovos, cistos e larvas de outros protozoários e helmintos foram analisados pelo Método de Sedimentação proposto pela CETESB (1989). A análise de coliformes totais e termotolerantes foi realizada pela Técnica de Tubos Múltiplos (Colilert®). A análise de vírus foi realizada através do Teste de Elisa com o KIT da RIDASCREEN® Enzimaimunoensaio. Os resultados obtidos revelaram que a concentração de Giardia spp. no esgoto bruto variou de 120 a 2200 cistos/L, já no esgoto tratado essa concentração variou de 0,45 a 3,5 cistos/L. Com relação aos oocistos de Cryptosporidium spp. a concentração no esgoto bruto variou de não detectável a 28,9 oocistos/L e no esgoto tratado as concentrações variaram de não detectável a 1,05 oocistos/L. O processo de lodos ativados na ETE-RP promoveu uma remoção parcial de parasitas, tais como: Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hystolitica, Ancylostoma sp., Ascaris sp. Fasciola hepatica e Strongyloides stercoralis, cujo fator de redução variou entre 18,2 e 100%. Pode-se observar que houve diferença estatisticamente significante entre o número mais provável de coliformes totais e termotolerantes no esgoto bruto e esgoto tratado, mostrando uma redução na concentração desses organismos indicadores após o tratamento do esgoto na ETE-Ribeirão Preto/SP. Não houve correlação significativa entre as concentrações de coliformes totais e termotolerantes em relação à concentração de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp.. A análise de vírus mostrou resposta positiva para Rotavirus e Adenovirus em todas as amostras analisadas (esgoto bruto e tratado), mostrando menor absorvância no esgoto tratado. Os resultados obtidos contribuem para a identificação e caracterização de microorganismos de veiculação hídrica no esgoto tratado na ETE-RP, fornecendo dados úteis para a definição de políticas públicas de saneamento, referentes ao controle da qualidade microbiológica do esgoto no país. / Sewage treatment is still precarious in many Brazilian cities, which has contributed to the emergence and re-emergence of waterborne diseases. This study analyzed Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts, as well as cysts, eggs and larvae of other protozoa and helminthes. Also part of the study were total and thermotolerant coliforms, Rotavirus and Adenovirus in samples of raw and treated sewage of the Sewage Treatment Station (ETE) of Ribeirão Preto, SP, Brazil. Sewage samples were taken at the points of entry and exit of the ETE, Ribeirão Preto. Analyses of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts were performed through the EPA\'s method 1623. Eggs, cysts and larvae of other protozoa and helminthes were analyzed utilizing the method of sedimentation as proposed by CETESB (1989). Analyses of total and thermotolerant coliforms were performed using the Multiple Tube method (Colilert®). Viral analyses were performed through the RIDASCREEN® enzyme immunoassay ELISA test kit. The results revealed that the concentration of Giardia spp. in raw sewage varied from 120 to 2,200 cysts/L; this concentration varied from 0.45 to 3.5 cysts/L in treated sewage. The concentration of Cryptosporidium spp. oocysts in raw sewage varied from non-detectable to 28.9 oocysts/L and from non-detectable to 1.05 oocysts/L in treated sewage. The activated sludge process used in ETE promoted a partial removal of parasites such as: Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hystolitica, Ancylostoma sp., Ascaris sp. Fasciola hepatica and Strongyloides stercoralis. Reduction factors varied from 18.2 to 100%. A statistically significant difference was observed between the most probable number of total and thermotolerant coliforms in raw and treated sewage, showing a reduction in the concentration of these indicators after the treatment of sewage in ETE, Ribeirão Preto. No statistically significant correlation was found between the concentrations of total and thermotolerant coliforms in relation to the concentration of Giardia cysts spp. and Cryptosporidium spp. oocysts. Analyzing viruses showed positive responses for Rotavirus and Adenovirus in all the studied samples (raw and treated sewage), with a smaller absorbance in the treated sewage. The results contribute to the identification and evaluation of the prevalence of waterborne microorganisms in treated sewage in ETE, Ribeirão Preto, providing useful data for the definition of public policies for sanitation concerning microbiological quality control in Brazil\'s sewage.

Introdução: O risco à saúde humana ocasionado pela contaminação biológica de águas captadas para abastecimento público é realçado pela ocorrência de surtos de doenças associadas aos protozoários Giardia e Cryptosporidium, que possuem baixas doses infecciosas e alta capacidade de sobrevivência no ambiente, além de serem capazes de resistir ao processo tradicional de desinfecção da água (cloração). Partindo-se da hipótese de que há um risco elevado de infecção por estes protozoários pela ingestão de água tratada por métodos convencionais e que fazem uso de mananciais superficiais impactados por contaminação biológica, resultando num possível incremento da incidência de diarréias, este estudo se propôs a verificar a ocorrência destes protozoários em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP, caracterizar sua patogenicidade e avaliar o risco associado ao seu consumo através da água tratada. Métodos: Foram coletadas 48 amostras do ribeirão dos Cristais no ponto de captação da estação de tratamento de água, semanalmente, durante 12 meses (de 16/05/2013 a 21/05/2014). A detecção e a análise da concentração dos protozoários foram realizadas de acordo com Método 1623.1 da United States Environmental Protection Agency e a extração e caracterização dos espécies/genótipos de Giardia e Cryptosporidium foi realizada através metodologias moleculares e seqüenciamento. O risco de infecção pela ingestão de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium presentes na água tratada foi calculado usando a ferramenta da Avaliação Quantitativa do Risco Microbiológico, a partir dos dados de concentração dos patógenos obtidos pelo Método 1623.1, eficiência de remoção dos (oo)cistos durante o processo convencional de tratamento da água, modelo dose-resposta e taxa de ingestão diária de água para indivíduos menores de 5 anos e maiores de 21 anos. Resultados: Cistos de Giardia foram detectados em 83,3% das amostras (40/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 8,6 cistos/L. Oocistos de Cryptosporidium foram etectados em 37,5% das amostras (18/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 2 oocistos/L. As espécies/genótipos encontrados (Giardia intestinalis A e B e Cryptosporidium parvum e hominis) são característicos de contaminação antrópica e são frequentemente identificados em estudos epidemiológicos como responsáveis por surtos. A estimativa do risco anual de infecção por Giardia foi de 3,3x10-3 (IC95% 4,6x10-3) para crianças e de 11,5x10-3 (IC95% 13,3x10-3) para adultos, enquanto o risco por Cryptosporidium foi de 1,1x10-3 (IC95% 1,7x10-3) para crianças e de 3,9x10-3 (IC95% 5,0x10-3) para adultos. O incremento da incidência de diarréias foi observado no cenário de estudo após um acidente que resultou em transbordamento de esgotos não tratados no manancial, coincidindo com o aumento na detecção de (oo)cistos. Conclusão: Os resultados evidenciaram que a vulnerabilidade do ribeirão dos Cristais a contaminações biológicas pode culminar em um risco elevado de infecção e adoecimento por Giardia e Cryptosporidium através da ingestão de água tratada. Portanto, o caso é preocupante, tanto do ponto de vista do tratamento e abastecimento de água potável, quanto da degradação e contaminação do manancial, evidenciando a necessidade de se estabelecer medidas de intervenção direcionadas a promover a qualidade da água e garantir sua segurança / Introduction: The risk to human health caused by biological contamination of source water from public water supply is highlighted by the occurrence of outbreaks associated with the protozoa Giardia and Cryptosporidium, which have low infectious doses and high capacity of survival in the environment, besides being capable of withstanding traditional process for water disinfection (chlorination). Considering that there is a high risk of infection by these protozoa through drinking water treated with conventional methods uptaked from surface waters impacted by biological contamination, resulting in a possible increase in the incidence of diarrhea, this study aimed to verify the occurrence of these protozoa in waters collected for public supply in Cajamar-SP, characterize their pathogenicity and evaluate the risk associated with its consumption. Methods: Forty eight samples were collected in ribeirão dos Cristais, at uptake point of the water treatment plant, weekly, for 12 months (from 05/16/2013 to 05/21/2014). The detection and quantification of protozoa were carried out according to the United States Environmental Protection Agency Method 1623.1, and the extraction and characterization of species/genotypes of iardia and Cryptosporidium were performed through molecular methods and sequencing. The risk of infection by ingestion of Giardia and Cryptosporidium (oo)cysts present in the treated water were calculated using the Quantitative Microbial Risk Assessment tool, based on the concentration data of pathogens obtained by the Method 1623.1, removal efficiency of (oo) cysts in the conventional process of water treatment, dose-response model and rate of daily water intake for individuals under the age of 5 years and over 21 years. Results: Giardia cysts were detected in 83.3% of the samples (40/48), with concentrations ranging rom the detection limit (<0.1) to 8.6 cysts/L. Cryptosporidium oocysts were detected in 7.5% of the samples (18/48), with concentrations ranging from the detection limit (<0.1) to 2 oocysts/L. The species/genotypes found (Giardia intestinalis A and B and Cryptosporidium parvum and hominis) are characteristic of anthropogenic contamination and are often identified in epidemiological studies as being responsible for outbreaks. The estimated annual risk of infection by Giardia was 3,3x10-3 (95% CI 4,6x10-3) for children and 11,5x10-3 (95% CI 13,3x10-3) for adults, while the risk for Cryptosporidium was 1,1x10-3 (95% CI 1,7x10-3) for children and 3,9x10-3 (95% CI 5,0x10-3) for adults. The increase in the incidence of diarrhea was observed in the study scenario after an accident that resulted in an overflow of untreated sewage that reached the reservoir, coinciding with an increase in the detection of the (oo)cysts. Conclusion: The results showed that the vulnerability of the ribeirão dos Cristais to biological contamination may result in a high risk of infection and illness by Giardia and Cryptosporidium through the drinking water consumption. Therefore, the case is of concern, both from the point of view of the treatment and supply of drinking water, as well as to the degradation and contamination of the water source, highlighting the need to establish intervention measures aimed at promoting water quality and ensure its safety

Giardia e Cryptosporidium são protozoários cosmopolitas cuja epidemiologia é especialmente importante devido ao seu expressivo potencial zoonótico. Animais silvestres são frequentemente relatados como reservatórios da giardiose e criptosporidiose humanas, todavia, são escassas as evidências sobre sua real importância na manutenção e disseminação destas protozooses. No intuito de avaliar a ocorrência e determinar os genótipos responsáveis pela infecção de mamíferos neotropicais, 452 amostras fecais procedentes de 52 diferentes espécies, in situ e ex situ, de sete localidades distintas foram avaliadas por métodos de diagnóstico microscópico, seguidos por técnicas moleculares de amplificação (Nested PCR), sequenciamento e caracterização genotípica. Os resultados revelaram prevalência aparente de 6,2% para Giardia spp. e de 4,8% para Cryptosporidium spp. (n=343). Dezessete diferentes espécies de mamíferos silvestres foram positivas, sendo 11 para Giardia spp., nove para Cryptosporidium spp. e três para ambos os protozoários. A caracterização molecular revelou a predominante presença de genótipos zoonóticos em mamíferos cativos (Giardia duodenalis genótipo AI) e de genótipos hospedeiro-específicos em animais de vida livre (Cryptosporidium sp. rat genotype III e Cryptosporidium wrairi). Foram também identificados Giardia duodenalis genótipo D em cachorro-do-mato Cerdocyon thous e Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV em bugio-preto Alouatta caraya, ambos mantidos em cativeiro. Aspectos ecológicos, como habitat, guilda trófica, estratégia do uso do ambiente e influência antrópica, foram considerados relevantes para a ocorrência dos parasitas. Tais achados demonstraram que animais silvestres podem ser infectados por genótipos zoonóticos e específicos dos agentes, o que revela a importância de estudos envolvendo esta abordagem para sugerir possíveis relações entre os protozoários, hospedeiros humanos, animais domésticos e silvestres perante diferentes características ambientais. / Giardia and Cryptosporidium are cosmopolitan protozoans whose epidemiology is especially important due to its significant zoonotic potencial. Wild animals are often reported as reservoirs of human giardiosis and cryptosporidiosis, however, there is little evidence about their real importance in the maintenance and dissemination of these protozoosis. In order to evaluate the occurrence and determine the genotypes responsible for neotropical mammals infection, 452 fecal samples of 52 different species, in situ and ex situ, of seven locations were evaluated by microscopic methods of diagnosis, followed by molecular amplification (Nested PCR), sequencing and genotypic chacacterization techniques. The results revealed an apparent prevalence of 6,2% for Giardia spp. and 4,8% for Cryptosporidium spp. (n=343). Seventeen different species of wild mammals were positive, 11 for Giardia spp., nine for Cryptosporidium spp. and three for both protozoans. Molecular characterization shows predominant presence of zoonotic genotypes in captive mammals (Giardia duodenalis genotype AI) and host-specific genotypes in free-living animals (Cryptosporidium sp. rat genotype III and Cryptosporidium wrairi). Giardia duodenalis genotype D in crab-eating fox Cerdocyon thous and Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV in black howler monkey Alouatta caraya, both in captivity, were also identified. Ecological aspects, like habitat, trophic guilds, strategy of using the environment and human influence, were considered relevant to occurrence of the parasites. These findings could demonstrate wild mammals can be infected by zoonotic and specific genotypes of agents, which shows the importance of studies using this approach to suggest possible relationships between protozoans, human hosts, domestic animals and wildlife facing different environmental characteristics.

Introdução: O risco à saúde humana ocasionado pela contaminação biológica de águas captadas para abastecimento público é realçado pela ocorrência de surtos de doenças associadas aos protozoários Giardia e Cryptosporidium, que possuem baixas doses infecciosas e alta capacidade de sobrevivência no ambiente, além de serem capazes de resistir ao processo tradicional de desinfecção da água (cloração). Partindo-se da hipótese de que há um risco elevado de infecção por estes protozoários pela ingestão de água tratada por métodos convencionais e que fazem uso de mananciais superficiais impactados por contaminação biológica, resultando num possível incremento da incidência de diarréias, este estudo se propôs a verificar a ocorrência destes protozoários em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP, caracterizar sua patogenicidade e avaliar o risco associado ao seu consumo através da água tratada. Métodos: Foram coletadas 48 amostras do ribeirão dos Cristais no ponto de captação da estação de tratamento de água, semanalmente, durante 12 meses (de 16/05/2013 a 21/05/2014). A detecção e a análise da concentração dos protozoários foram realizadas de acordo com Método 1623.1 da United States Environmental Protection Agency e a extração e caracterização dos espécies/genótipos de Giardia e Cryptosporidium foi realizada através metodologias moleculares e seqüenciamento. O risco de infecção pela ingestão de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium presentes na água tratada foi calculado usando a ferramenta da Avaliação Quantitativa do Risco Microbiológico, a partir dos dados de concentração dos patógenos obtidos pelo Método 1623.1, eficiência de remoção dos (oo)cistos durante o processo convencional de tratamento da água, modelo dose-resposta e taxa de ingestão diária de água para indivíduos menores de 5 anos e maiores de 21 anos. Resultados: Cistos de Giardia foram detectados em 83,3% das amostras (40/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 8,6 cistos/L. Oocistos de Cryptosporidium foram etectados em 37,5% das amostras (18/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 2 oocistos/L. As espécies/genótipos encontrados (Giardia intestinalis A e B e Cryptosporidium parvum e hominis) são característicos de contaminação antrópica e são frequentemente identificados em estudos epidemiológicos como responsáveis por surtos. A estimativa do risco anual de infecção por Giardia foi de 3,3x10-3 (IC95% 4,6x10-3) para crianças e de 11,5x10-3 (IC95% 13,3x10-3) para adultos, enquanto o risco por Cryptosporidium foi de 1,1x10-3 (IC95% 1,7x10-3) para crianças e de 3,9x10-3 (IC95% 5,0x10-3) para adultos. O incremento da incidência de diarréias foi observado no cenário de estudo após um acidente que resultou em transbordamento de esgotos não tratados no manancial, coincidindo com o aumento na detecção de (oo)cistos. Conclusão: Os resultados evidenciaram que a vulnerabilidade do ribeirão dos Cristais a contaminações biológicas pode culminar em um risco elevado de infecção e adoecimento por Giardia e Cryptosporidium através da ingestão de água tratada. Portanto, o caso é preocupante, tanto do ponto de vista do tratamento e abastecimento de água potável, quanto da degradação e contaminação do manancial, evidenciando a necessidade de se estabelecer medidas de intervenção direcionadas a promover a qualidade da água e garantir sua segurança / Introduction: The risk to human health caused by biological contamination of source water from public water supply is highlighted by the occurrence of outbreaks associated with the protozoa Giardia and Cryptosporidium, which have low infectious doses and high capacity of survival in the environment, besides being capable of withstanding traditional process for water disinfection (chlorination). Considering that there is a high risk of infection by these protozoa through drinking water treated with conventional methods uptaked from surface waters impacted by biological contamination, resulting in a possible increase in the incidence of diarrhea, this study aimed to verify the occurrence of these protozoa in waters collected for public supply in Cajamar-SP, characterize their pathogenicity and evaluate the risk associated with its consumption. Methods: Forty eight samples were collected in ribeirão dos Cristais, at uptake point of the water treatment plant, weekly, for 12 months (from 05/16/2013 to 05/21/2014). The detection and quantification of protozoa were carried out according to the United States Environmental Protection Agency Method 1623.1, and the extraction and characterization of species/genotypes of iardia and Cryptosporidium were performed through molecular methods and sequencing. The risk of infection by ingestion of Giardia and Cryptosporidium (oo)cysts present in the treated water were calculated using the Quantitative Microbial Risk Assessment tool, based on the concentration data of pathogens obtained by the Method 1623.1, removal efficiency of (oo) cysts in the conventional process of water treatment, dose-response model and rate of daily water intake for individuals under the age of 5 years and over 21 years. Results: Giardia cysts were detected in 83.3% of the samples (40/48), with concentrations ranging rom the detection limit (<0.1) to 8.6 cysts/L. Cryptosporidium oocysts were detected in 7.5% of the samples (18/48), with concentrations ranging from the detection limit (<0.1) to 2 oocysts/L. The species/genotypes found (Giardia intestinalis A and B and Cryptosporidium parvum and hominis) are characteristic of anthropogenic contamination and are often identified in epidemiological studies as being responsible for outbreaks. The estimated annual risk of infection by Giardia was 3,3x10-3 (95% CI 4,6x10-3) for children and 11,5x10-3 (95% CI 13,3x10-3) for adults, while the risk for Cryptosporidium was 1,1x10-3 (95% CI 1,7x10-3) for children and 3,9x10-3 (95% CI 5,0x10-3) for adults. The increase in the incidence of diarrhea was observed in the study scenario after an accident that resulted in an overflow of untreated sewage that reached the reservoir, coinciding with an increase in the detection of the (oo)cysts. Conclusion: The results showed that the vulnerability of the ribeirão dos Cristais to biological contamination may result in a high risk of infection and illness by Giardia and Cryptosporidium through the drinking water consumption. Therefore, the case is of concern, both from the point of view of the treatment and supply of drinking water, as well as to the degradation and contamination of the water source, highlighting the need to establish intervention measures aimed at promoting water quality and ensure its safety