Este estudo tem como objetivo central avaliar a influência da secagem por aspersão de nanocápsulas de núcleo lipídico contendo tretinoína nos perfis in vitro de liberação e de penetração cutânea deste fármaco a partir de hidrogéis. Esses experimentos foram conduzidos empregando-se células de difusão de Franz, pele de abdome de porcos (fêmeas), regime de aplicação de doses infinitas e meio receptor composto por tampão fosfato pH 7,4 e etanol (70:30). A secagem por aspersão das suspensões de nanocápsulas, utilizando PVP e lactose (1:1, m/m) a 10% como adjuvantes, forneceu produtos com bons perfis de dispersão em água, bons rendimentos (próximos a 70%), baixos teores de substâncias voláteis, e teores do fármaco acima de 92%. O tipo de produto intermediário, suspensão aquosa ou respectivo pó, utilizado na produção de hidrogéis (G-LNC-TTN e G-LNC-TTN-SD, respectivamente) não influenciou no perfil de liberação in vitro da tretinoína, que se ajustou ao modelo de Higuchi. No estrato córneo houve diferenças nas quantidades de tretinoína penetradas a partir das duas formulações. O G-LNC-TTN levou a uma retenção exponencial do fármaco nessa camada, enquanto para o G-LNC-TTN-SD isso não ocorreu. Essa diferença foi associada à forma de organização das nanocápsulas na matriz do gel. Na epiderme e na derme, ambas as formulações permitiram a chegada de pequenas e constantes quantidades de tretinoína. No compartimento receptor da célula de Franz o fármaco não foi detectado. A pequena permeação da tretinoína para as camadas mais profundas da pele e para o meio receptor são indicativos de baixa absorção sistêmica, e também podem contribuir para a diminuição dos efeitos adversos associados à terapia tópica com essa substância. A secagem das suspensões de nanocápsulas de núcleo lipídico, nas condições utilizadas, forneceu um intermediário em potencial para a produção de formas farmacêuticas semissólidas contendo tretinoína. / This study’s central goal is to assess the influence of spray-drying lipid core nanocapsules on tretinoin in vitro release profiles as well as skin penetration/permeation from hydrogels. These experiments were conducted employing Franz diffusion cells, pig abdominal skin (female), infinite doses regimen and receptor medium composed of phosphate buffer pH 7.4 and ethanol (70:30). Spray-drying of the nanocapsules suspensions, using PVP and lactose (1:1, m/m) at 10% (m/v) as drying adjuvant provided powders with good water dispersion profiles, good yields (around 70%), low volatile substances contents, in addition to drug contents above 92%. Interchanging intermediate products, aqueous suspension or respective powder, used in hydrogel formulation (G-LNC-TTN and G-LNC-TTN-SD, respectively) caused no influence on tretinoin in vitro release profile which was adjusted by Higuchi model. In corneum stratum there were differences in tretinoin quantities which penetrated from those formulations. The G-LNC-TTN provided an exponential retention of the drug on this skin’s layer, although G-LNC-TTN-SD did not. This difference was associated with the nanocapsules organization form in hydrogel matrix. In epidermis and dermis both formulations allowed permeation of constant and low tretinoin quantities. Moreover, at receptor fluid the drug was not detected. The low tretinoin permeation for deeper skin layers and for receptor fluid is low systemic absorption indicative, furthermore, may contribute in reducing adverse effects associated with tretinoin topical therapy. In given conditions, spray-drying of lipid core nanocapsules provided a potential intermediate for production of semi solids pharmaceutical forms containing tretinoin.

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.

Nesse trabalho avaliamos a sensibilidade a drogas in vitro de alguns isolados obtidos de pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea. O microteste de MTT modificado mostrou-se eficaz para avaliação da sensibilidade in vitro de promastigotas de Leishmania e macrófagos de medula como modelo de infecção por L. (V.) braziliensis. A atividade de tamoxifeno e anfotericina B foi similar entre os isolados de Leishmania avaliados. Foi observada uma variação maior da sensibilidade ao Glucantime®, sendo que os isolados de L. (V.) braziliensis apresentaram maior sensibilidade a essa droga. Não foi observada correlação da resposta clínica dos pacientes ao tratamento com a atividade in vitro. Avaliamos também a eficácia de tamoxifeno no tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. (V.) braziliensis. Observamos que 20 ou 30 mg/kg/dia de tamoxifeno por 15 dias resultou em redução no tamanho das lesões e carga parasitária em comparação com animais controle.Um isolado apresentou morfologia flagelar distinta daquela observada em promastigotas típicos de Leishmania. / In this work we evaluated the in vitro sensitivity to drugs of some isolates from Brazilian patients with cutaneous leishmaniasis. The modified MTT microtest was effective for evaluation of in vitro sensitivity of Leishmania promastigotes and macrophages from bone marrow as a model of infection by L. (V.) braziliensis. The activity of tamoxifen and amphotericin B was similar among isolates of Leishmania evaluated. Sensitivity to Glucantime®, was more variable with isolates of L. (V.) braziliensis presenting higher sensitivity to the drug. There was no correlation between clinical response to treatment with in vitro activity. We have also evaluated the effectiveness of tamoxifen in the treatment of BALB/c mice infected with L. (V.) braziliensis and observed that 20 or 30 mg/kg/day of tamoxifen for 15 days resulted in reduction in the size of lesions and parasite load when compared with control animals. One of the isolates presented atypical flagellar morphology.

Este trabalho propôe o desenvolvimento de micropartículas para veiculação deste fármaco na pele, aumentando a estabilidade da molécula e proporcionando uma liberação sustentada, o que resulta na otimização da terapia, visto que ocorre a redução dos efeitos colaterais. As micropartículas foram produzidas por três métodos diferentes, os dois primeiros utilizando a quitosana como polímero e o último utilizando uma associação de alginato com quitosana. As micropartículas de quitosana resultaram em interação do fármaco veiculado com o polímero e desta forma a sua utilização como sistema de liberação para veiculação do fármaco estudado foi descartada. As micropartículas de alginato/quitosana encapsularam efetivamente o fármaco, resultando em partículas irregulares com diâmetro médio de 148m. Elas apresentaram liberação sustentada do ácido retinóico por um período compatível com sua utilização tópica e por isso, parecem ser adequados para garantir estabilidade ao fármaco. Além disso, elas diminuíram a retenção do fármaco no estrato córneo quando comparado ao fármaco livre, mantendo seus níveis nas outras camadas mais profundas da pele. Esse direcionamento sítio-específico poderia diminuir a sua irritação dérmica, possibilitando, dessa forma, juntamente com o aumento de sua estabilidade, a obtenção de efeitos terapêuticos com a utilização de doses menores. Também não foram observadas interações entre o fármaco e o polímero demonstrando que a matriz de alginato foi capaz de proteger o fármaco do contato e da interação com a quitosana. Além disso, o método utilizado mostrou ser simples e rápido, realizado em condições amenas, sem o inconveniente da utilização de agentes cross-linking químicos tóxicos, como o glutaraldeído. / This study proposes the development of microparticles for drug delivery into the skin, thus increasing molecule stability and providing sustained release that results in therapy optimization as a result of reduction in side-effects. The microparticles were produced by three different methods. The two first methods used chitosan as a polymer, and the third utilized a chitosanalginate association. The chitosan microparticles resulted in the interaction of the delivered drug with the polymer; hence, its use as a release system for delivery of the studied drug was disregarded. The alginate/chitosan microparticles effectively encapsulated the drug, resulting in irregular particles with a mean diameter of 148m. They exhibited sustained release of retinoic acid for a period of time that was compatible with topical application and, therefore, seem to be suitable to ensure drug stability. Additionally, the microparticles decreased drug retention in the stratum corneum as compared to the free drug, thus keeping its levels in other deeper layers of the skin. Such site-specific direction could reduce dermal irritation, consequently enabling, conjointly with stability increase, the achievement of therapeutic effects with the use of smaller doses. Drug-polymer interactions were also not observed, showing that the alginate matrix was capable of protecting the drug from the contact and interaction with chitosan. Besides, the applied method proved to be simple and fast. It can be performed in mild conditions without the inconvenience of using toxic cross-linking chemical agents, such as glutaraldehyde.

Leishmaniose é uma zoonose desenvolvida por protozoários do gênero Leishmania. A doença se manifesta sob a forma visceral e cutânea cujo tratamento apresenta diversas limitações como alto custo, elevada toxicidade dos fármacos e altos índices de recidiva. A leishmaniose cutânea abrange lesões destrutivas e ulceradas que podem evoluir para condições mais graves culminando em óbito dos hospedeiros acometidos. Tratamentos alternativos tem sido implementados com a finalidade de proporcionar acessibilidade financeira e menores efeitos colaterais aos pacientes. A terapia fotodinâmica se insere nesse contexto devido à praticidade, custo reduzido, mínima toxicidade e sem relatos de resistência descritos na literatura. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica em leishmaniose cutânea induzida em camundongos BALB/c infectados com leishmaniose cutânea. A otimização da PDT também foi avaliada pela administração de doadores de óxido nítrico (S-nitroso-MSA) encapsulados em nanopartículas de quitosana (CSNPs), já que esse composto é altamente reativo e potencialmente tóxico para o parasito. Camundongos BALB/c foram infectados no membro posterior esquerdo com 1.106 promastigotas de Leishmania (L) amazonensis que expressam o gene da luciferase e acompanhados por 4 semanas até o surgimento da lesão. Após esse período, os animais foram distribuídos em 6 grupos (n=4): Controle (não tratado), PDT1 (submetidos à uma sessão de PDT), PDT2 (duas sessões ), PDT1NPNO e PDT2NPNO (uma sessão e duas sessões de PDT em associação com S-nitroso-MSACPNPS, respectivamente), e NPNO (somente S-nitroso-MSA-CP NPS). A segunda sessão foi realizada 24 h após a primeira. A PDT foi efetuada usando um diodo emissor de luz (LED, λ=660 ± 22 nm) e azul de metileno (100 μM), com densidade de energia de 150 J/cm2. O progresso da doença foi avaliado por meio do tamanho da lesão e escala de dor utilizando um paquímetro e filamentos von Frey, respectivamente. A carga parasitária foi quantificada por intermédio do bioimageamento nas primeiras 96 h após o tratamento e nas 4 semanas seguintes. Os resultados obtidos demonstraram redução na carga parasitária durante o período experimental, com exceção do grupo PDT1NPNO. Houve redução parasitária significante em 72 h e 96 h para os grupos PDT2, PDT2NPNO e NPNO. A maior redução da lesão foi observada para o grupo PDT2 bem como menor sensibilidade ao estímulo doloroso. Nossos resultados indicam efeitos benéficos da PDT em duas sessões, sugerindo que pode ter ocorrido modulação do processo inflamatório. Entretanto, o uso das nanopartículas nas condições utilizadas nesse experimento não foi capaz de otimizar a eficiência da PDT nos animais infectados com Leishmania (L) amazonensis. / Leishmaniasis is a zoonotic disease developed by protozoa of genus leishmania. There are two dominant forms including visceral and cutaneous manifestations in which treatments are limited because of price, toxicity and resistance. Cutaneous leishmaniasis (CL) promotes destructive and ulcerated lesions that might intensify to a more severe symptom that could lead to patient death. Alternative treatments have been studied to promote reduction of side effects, cost and higher efficacy for the hosts. Photodynamic therapy has been introduced once the technic is practical, less expensive and with no resistance described in literature. Additionally, several studies indicate that the administration of exogenous NO donors represents an interesting strategy against cutaneous leishmaniasis. The aim of this work was to evaluate the effects of photodynamic therapy on cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice. Besides, the optimization of PDT was evaluated through its association with encapsulated NO donors (S-nitroso-MSA) in chitosan nanoparticles (CSNPs) on CL in BALB/c mice using real time bioluminescence. In addition, we monitored lesion size progression and hyperalgesia. Promastigotes of L. (L) amazonensis transgenic line expressing luciferase were used. BALB/c mice were infected in the left footpad with 1.106 promastigotes. After 4 weeks, mice were randomly assigned to 6 experimental groups (n=4): Control (non-treated), PDT1 (submitted to one PDT session) PDT2 (submitted to two PDT sessions), (PDT1NPNO and PDT2NPNO (submitted to one and two PDT sessions following S-nitroso-MSA-CSNPs, respectively) and NPNO (treated only with S-nitroso-MSA-CSNPs). The second PDT session was performed 24 h after the first. PDT was performed using a red LED (λ= 660±22 nm), MB (100 μM) and fluence of 150 J/cm2. Disease progression was evaluated once a week for 4 weeks by measuring lesion size with a caliper and hyperalgesia with von Frey filaments. Parasite burden was analyzed through luciferase detection by bioimaging, every day, in the first 96 h and then for the next 4 weeks. Test groups presented significant reduction in parasite load compared to control during all experimental period except for PDT2NPNO. Our results indicate that two PDT sessions were more efficient suggesting a modulation of the inflammatory process. However, under these conditions, our results demonstrate that CSNPs were not able to enhance MB-mediated PDT efficiency on parasite burden on L. (L) amazonensis-induced CL in mice.

As lesões na pele, quando extensas, representam um grande problema de saúde pública e elevados custos associados aos tratamentos. A laserterapia tem sido aplicada por décadas a fim de acelerar o processo de cicatrização cutânea. Já a matriz de pericárdio porcino apresenta potencial para ser utilizado como curativo biológico, porém o patch tem rápida biodegradação, por isso adicionou-se quitosana. Muitos autores observaram esses tratamentos individualmente, no entanto não há dados concisos sobre a associação dessas terapias. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta clínica, histológica e histomorfométrica da ação fotobiomoduladora do laser no processo de reparação de úlceras cutâneas com o auxílio do curativo de pericárdio porcino revestido com quitosana. A úlcera cutânea foi induzida cirurgicamente em 48 ratos distribuídos em 6 grupos distintos com 8 animais cada, sendo eles: Matriz (curativo de pericárdio porcino); ML (curativo de pericárdio porcino com a aplicação da laserterapia); MQ (curativo de pericárdio porcino revestido com quitosana); MQL (curativo de pericárdio porcino revestido com quitosana com a aplicação da laserterapia); Ctrl (o grupo controle que não recebeu curativo algum) e Laser (o grupo controle que recebeu somente a laserterapia). Nos grupos que receberam imediatamente após o procedimento cirúrgico a radiação laser, com as seguintes características: comprimentos de onda da luz = 660nm, irradiância = 30mW/\'CM POT.2\', e densidade de energia de 30j/\'CM POT.2\'. O registro fotográfico das úlceras foi realizado no 10º dia pós-operatório e para fornecer a área ulcerada foi utilizado o software Image J. Foi realizada uma análise histológica e histomorfométrica (contagem de fibroblastos, células inflamatórias, vasos sanguíneos e colágenos) a partir de biópsias coletadas no 10º dia pós-operatório. Os resultados obtidos foram dados através das médias dos grupos com relação a cada análise, sendo eles: área da lesão (Laser = 0,48 \'CM POT.2\', Matriz = 0,46 \'CM POT.2\', Ctrl = 0,28 \'CM POT.2\', ML = 0,23 \'CM POT.2\', MQ = 0,22 \'CM POT.2\' e MQL = 0,19 \'CM POT.2\'); formação colagênica (Laser = 54,51%, Matriz = 51,75%, Ctrl = 58,84%, ML = 68,77%, MQ = 69,50% e MQL = 71,72%); células inflamatórias (Laser = 126,31, Matriz = 132,40, Ctrl = 101,85, ML = 97,67, MQ = 95,27 e MQL = 94,15); vasos sanguíneos (Laser = 6,83, Matriz = 4,48, Ctrl = 5,37, ML = 7,46, MQ = 5,42 e MQL = 3,98) e fibroblastos (Laser = 55,83, Matriz = 71,31, Ctrl = 78,63, ML = 85,40, MQ = 105,06 e MQL = 108,58). Os dados foram analisados pela análise de variância, com post hoc de Tukey, a fim de comparar os grupos com um nível de significância de 95% (p<0,05). Com base nesses achados, observou-se que houve melhora estatisticamente significante no grupo com curativos de pericárdio porcino revestido com quitosana associado à aplicação da laserterapia (MQL) quando comparado ao controle, mostrando-se mais eficaz no processo cicatricial de úlceras. / Large skin injuries represent a major public health issue, with high costs associated with the treatments. Laser therapy has been used for decades to accelerate the process of skin healing. The porcine pericardium matrix has the potential to be used as a biological dressing, but the patch has rapid biodegradation, so chitosan was added to delay this effect. Many authors have used these treatments individually; however there is no accurate data on the combination of these therapies. The aim of this study was to assess the clinical, histological and histomorphometric photobiomodulation laser action in the repair of skin ulcers associated with porcine pericardium dressing coated with chitosan. The skin ulcer was surgically induced in 48 rats, which were distributed into 6 groups with 8 animals each: Matrix (porcine pericardium dressing), ML (porcine pericardium dressing with laser therapy), MQ (porcine pericardium dressing coated with chitosan), MQL (porcine pericardium with a bandage coated with chitosan and laser therapy), Ctrl (the control group did not receive treatment) and Laser (the control group that received only laser therapy). The laser radiation groups received the treatment immediately after the surgery, with the following characteristics: light wavelength = 660nm, irradiance = 30mW/\'CM POT.2\' and of energy density 30j/\'CM POT.2\'. The photographic record of the ulcers was performed on the 10th postoperative day and to provide the ulcerated area was used the software ImageJ. We performed a histological and histomorphometric (count of fibroblasts, inflammatory cells, blood vessels and collagen) from biopsies also on the 10th postoperatively day. The results were given as means of groups from each analysis, as follows: lesion area (Laser = 0,48 \'CM POT.2\', Matriz = 0,46 \'CM POT.2\', Ctrl = 0,28 \'CM POT.2\', ML = 0,23 \'CM POT.2\', MQ = 0,22 \'CM POT.2\' e MQL = 0,19 \'CM POT.2\'), collagen formation (Laser = 54,51%, Matriz = 51,75%, Ctrl = 58,84%, ML = 68,77%, MQ = 69,50% e MQL = 71,72%), inflammatory cells (Laser = 126,31, Matriz = 132,40, Ctrl = 101,85, ML = 97,67, MQ = 95,27 e MQL = 94,15); blood vessels (Laser = 6,83, Matriz = 4,48, Ctrl = 5,37, ML = 7,46, MQ = 5,42 e MQL = 3,98) and fibroblasts (Laser = 55,83, Matriz = 71,31, Ctrl = 78,63, ML = 85,40, MQ = 105,06 e MQL = 108,58). Data were analyzed by analysis of variance with Tukey\'s post hoc to compare the groups with a significance level of 95% (p<0.05). Based on these findings, we observed that there was a statistically significant improvement in the group with porcine pericardium dressings coated with chitosan associated with the application of laser therapy (MQL) compared to control, displaying more effective in healing ulcers.

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The NLC were produced with a 1: 3 mixture of solid and liquid lipids (stearic acid and oleic acid, respectively), 0.25% sodium taurodeoxycholate and 1% soy lecithin by the microemulsion technique. For formulations with higher amounts of lipid, concentrations of 2 to 4% of the lipid mixture were evaluated. After the development of high lipid particles, different concentrations of CA dry extract (0.926, 1.274 and 1.853%) and glycolic extract (1.282, 2.418 and 3.336%) were added to the formulations. All NLC were characterized for mean diameter, polydispersity index (PdI), zeta potential, encapsulation efficiency (EE%) and drug loading (DL%). In vitro release and permeation studies of the unencapsulated extract (aqueous dispersions and commercial cream) and encapsulated were evaluated using Franz cells. The NLC obtained had a mean size of 130 nm and a uniform size distribution, with a PdI of 0.2, and an encapsulation efficiency of more than 90% for NLC containing dry extract and 40% for NLC developed with glycolic extract. The AS release profile from the developed formulations showed a controlled release, no more than 45% in 48 hours of study. Encapsulation of the dry extract in NLC resulted in an increase in AS retention in the stratum corneum 2-fold compared to the unencapsulated extract in aqueous dispersion, but was similar to the retained amount of AS when the commercial formulation was applied topically. NLC developed with glycolic extract were able to increase the permeation of AS to the deeper layers of the skin, when compared to the carriers containing the CA dry extract and the commercial cream. The results suggest that these systems significantly increase the permeation of AS and, therefore, may present potential benefits for the treatment of cutaneous diseases such as ES. / O extrato da planta Centella asiatica L. Urban (CA) tem sido utilizado tanto para fins cosméticos quanto para tratamento de doenças cutâneas, devido as suas atividades cicatrizantes e antiproliferativas. O principal componente ativo desta planta, o asiaticosídeo (AS), tem um importante efeito na esclerodermia (ES), doença que acomete a pele causando o seu espessamento e endurecimento. Estas manifestações dificultam o tratamento tópico localizado da ES. Assim, carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) contendo o extrato da planta CA foram desenvolvidos e caracterizados visando a aplicação tópica do AS. Os CLN foram produzidos com uma mistura de 1:3 de lipídeos sólido e líquido (ácido esteárico e ácido oleico, respectivamente), 0,25% de taurodeoxicolato de sódio e 1% de lecitina de soja pela técnica da microemulsão. Para produção de formulações com maior quantidade de lipídeo, concentrações de 2 a 4% da mistura de lipídeos foram avaliadas. Após o desenvolvimento das partículas com alto teor lipídico, diferentes concentrações do extrato seco de CA (0,926, 1,274 e 1,853%) e do extrato glicólico (1,282, 2,418 e 3,336%) foram adicionadas às formulações. Todos os CLN foram caracterizados quanto ao diâmetro médio, índice de polidispersão (PdI), potencial zeta, eficiência de encapsulação (EE%) e carga de fármaco (CF%). Estudos de liberação e permeação in vitro do extrato não encapsulado (dispersões aquosas e creme comercial) e encapsulado foram avaliados utilizando células de “Franz”. Os CLN obtidos apresentaram tamanho médio de 130 nm e distribuição de tamanho uniforme, com PdI de 0,2, além valores de eficiência de encapsulação superiores a 90% para os CLN contendo extrato seco e 40% para os CLN desenvolvidos com extrato glicólico. O perfil de liberação do AS a partir das formulações desenvolvidas mostrou uma liberação controlada, não mais que 45% em 48 horas de estudo. A encapsulação do extrato seco nos CLN resultou em aumento na retenção de AS no estrato córneo de 2 vezes, comparado ao extrato não encapsulado em dispersão aquosa, mas foi semelhante a quantidade retida de AS quando a formulação comercial foi aplicada topicamente. Os CLN desenvolvidos com extrato glicólico foram capazes de aumentar a permeação do AS para as camadas mais profundas da pele, em relação aos carreadores contendo o extrato seco da CA e o creme comercial. Os resultados sugerem que estes sistemas aumentam significativamente a permeação do AS e, por isso, podem apresentar potenciais benefícios para o tratamento de patologias cutâneas como a ES.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é doença endêmica no Brasil onde apresenta aumento contínuo do número de casos bem como expansão da área geográfica de detecção de casos. Na Amazônia, a situação epidemiológica da LTA é ainda mais complexa, pois há várias espécies de leishmânia como agente causal da doença, cada espécie com seus reservatórios e vetores próprios podendo determinar diferentes quadros clínicos com diversas respostas ao tratamento medicamentoso. O município de Santarém situa-se no oeste do estado do Pará, onde há alta endemicidade da LTA. A participação de cada espécie de leishmânia nos casos de leishmaniose cutânea (LC) na região não é ainda conhecida através de estudos definitivos. Este trabalho tem como objetivo principal identificar as espécies de leishmânia nos casos de pacientes portadores de LC atendidos no Centro de Controle de Zoonoses de Santarém (CCZS) no ano de 2003, e estudar a possibilidade de diferenças significativas na apresentação clínica das lesões causadas pelas diferentes espécies do parasito. Através de duas técnicas moleculares, uma através de identificação de sequência de nucleotídeos que codifica a subunidade menor do RNA ribossomal e outra que identifica sequência de gene que codifica a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, aplicadas em material de biópsia de 93 pacientes atendidos no CCZS, durante o ano de 2003, identificamos espécies de leishmânias. Com os métodos realizados consegue-se diferenciar Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.) amazonensis e o grupo de outras espécies do gênero Leishmania (V.) que não Leishmania (V.) braziliensis a que chamamos Leishmania (L.) outras espécies. As espécies encontradas e suas proporções foram: Leishmania (V.) braziliensis 57%, Leishmania (V.) outras espécies 37% e Leishmania (L.) amazonensis 5%. Encontrou-se maior proporção de lesões em membros inferiores nos casos ocasionados por Leishmania (V.) braziliensis. Não foram encontradas diferenças significativas em outras características clínicas analisadas, tais como sexo, idade e número de lesões. / Tegumentary leishmaniasis (TL) is an endemic disease in Brazil, where it shows a continual rise in the number of cases, as well as geographic expansion in the area of detected cases. In the Amazon, the epidemiological situation of TL is even more complex because there are several species of leishmania as causal agent of the disease, each species with its own reservoir hosts and sandfly vectors being able to determine different clinical expressions with diverse responses to medical treatment. The municipality of Santarem is located in the western part of the state of Pará, where there are high endemic levels of TL. The participation of each species of leishmania in the cases of cutaneous leishmaniasis (CL) in the region has not yet been determined through definitive studies. The principal object of this study is to identify the species of leishmania in the cases of carriers who were patients at the Santarem Zoonosis Control Center in the year 2003, and to study the possibility of significant differences in the clinical presentation of lesions caused by different species of the parasite. We identified species of Leishmania using two molecular techniques, the first through identifying the sequence of nucleotides that encodes the smaller subunit of ribossomal RNA and another that identifies the gene sequence that encodes the enzyme glicose-6-phosphate desidrogenasis applied to biopsy material from 93 patients of the Santarem Zoonosis Control Center, during the year 2003. Using these methods we were able to differentiate Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.) amazonensis and the other species of the genus Leishmania (V.) that were not Leishmania (V.) braziliensis which we call Leishmania (L.) of other species. The species found and their proportions were: Leishmania (V.) braziliensis 57%, Leishmania (V.) other species 37%, and Leishmania (L.) amazonensis 5%. A greater proportion of lesions was found in inferior members in the cases of Leishmania (V.) braziliensis. Significant differences were not found in other analyzed clinical characteristics, such as sex, age, and number of lesions.

Leishmaniose é uma zoonose desenvolvida por protozoários do gênero Leishmania. A doença se manifesta sob a forma visceral e cutânea cujo tratamento apresenta diversas limitações como alto custo, elevada toxicidade dos fármacos e altos índices de recidiva. A leishmaniose cutânea abrange lesões destrutivas e ulceradas que podem evoluir para condições mais graves culminando em óbito dos hospedeiros acometidos. Tratamentos alternativos tem sido implementados com a finalidade de proporcionar acessibilidade financeira e menores efeitos colaterais aos pacientes. A terapia fotodinâmica se insere nesse contexto devido à praticidade, custo reduzido, mínima toxicidade e sem relatos de resistência descritos na literatura. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica em leishmaniose cutânea induzida em camundongos BALB/c infectados com leishmaniose cutânea. A otimização da PDT também foi avaliada pela administração de doadores de óxido nítrico (S-nitroso-MSA) encapsulados em nanopartículas de quitosana (CSNPs), já que esse composto é altamente reativo e potencialmente tóxico para o parasito. Camundongos BALB/c foram infectados no membro posterior esquerdo com 1.106 promastigotas de Leishmania (L) amazonensis que expressam o gene da luciferase e acompanhados por 4 semanas até o surgimento da lesão. Após esse período, os animais foram distribuídos em 6 grupos (n=4): Controle (não tratado), PDT1 (submetidos à uma sessão de PDT), PDT2 (duas sessões ), PDT1NPNO e PDT2NPNO (uma sessão e duas sessões de PDT em associação com S-nitroso-MSACPNPS, respectivamente), e NPNO (somente S-nitroso-MSA-CP NPS). A segunda sessão foi realizada 24 h após a primeira. A PDT foi efetuada usando um diodo emissor de luz (LED, &lambda;=660 &plusmn; 22 nm) e azul de metileno (100 &mu;M), com densidade de energia de 150 J/cm2. O progresso da doença foi avaliado por meio do tamanho da lesão e escala de dor utilizando um paquímetro e filamentos von Frey, respectivamente. A carga parasitária foi quantificada por intermédio do bioimageamento nas primeiras 96 h após o tratamento e nas 4 semanas seguintes. Os resultados obtidos demonstraram redução na carga parasitária durante o período experimental, com exceção do grupo PDT1NPNO. Houve redução parasitária significante em 72 h e 96 h para os grupos PDT2, PDT2NPNO e NPNO. A maior redução da lesão foi observada para o grupo PDT2 bem como menor sensibilidade ao estímulo doloroso. Nossos resultados indicam efeitos benéficos da PDT em duas sessões, sugerindo que pode ter ocorrido modulação do processo inflamatório. Entretanto, o uso das nanopartículas nas condições utilizadas nesse experimento não foi capaz de otimizar a eficiência da PDT nos animais infectados com Leishmania (L) amazonensis. / Leishmaniasis is a zoonotic disease developed by protozoa of genus leishmania. There are two dominant forms including visceral and cutaneous manifestations in which treatments are limited because of price, toxicity and resistance. Cutaneous leishmaniasis (CL) promotes destructive and ulcerated lesions that might intensify to a more severe symptom that could lead to patient death. Alternative treatments have been studied to promote reduction of side effects, cost and higher efficacy for the hosts. Photodynamic therapy has been introduced once the technic is practical, less expensive and with no resistance described in literature. Additionally, several studies indicate that the administration of exogenous NO donors represents an interesting strategy against cutaneous leishmaniasis. The aim of this work was to evaluate the effects of photodynamic therapy on cutaneous leishmaniasis in BALB/c mice. Besides, the optimization of PDT was evaluated through its association with encapsulated NO donors (S-nitroso-MSA) in chitosan nanoparticles (CSNPs) on CL in BALB/c mice using real time bioluminescence. In addition, we monitored lesion size progression and hyperalgesia. Promastigotes of L. (L) amazonensis transgenic line expressing luciferase were used. BALB/c mice were infected in the left footpad with 1.106 promastigotes. After 4 weeks, mice were randomly assigned to 6 experimental groups (n=4): Control (non-treated), PDT1 (submitted to one PDT session) PDT2 (submitted to two PDT sessions), (PDT1NPNO and PDT2NPNO (submitted to one and two PDT sessions following S-nitroso-MSA-CSNPs, respectively) and NPNO (treated only with S-nitroso-MSA-CSNPs). The second PDT session was performed 24 h after the first. PDT was performed using a red LED (&lambda;= 660&plusmn;22 nm), MB (100 &mu;M) and fluence of 150 J/cm2. Disease progression was evaluated once a week for 4 weeks by measuring lesion size with a caliper and hyperalgesia with von Frey filaments. Parasite burden was analyzed through luciferase detection by bioimaging, every day, in the first 96 h and then for the next 4 weeks. Test groups presented significant reduction in parasite load compared to control during all experimental period except for PDT2NPNO. Our results indicate that two PDT sessions were more efficient suggesting a modulation of the inflammatory process. However, under these conditions, our results demonstrate that CSNPs were not able to enhance MB-mediated PDT efficiency on parasite burden on L. (L) amazonensis-induced CL in mice.