Le transport routier est responsable de la production de la majeure partie des oxydes d’azote (NOx) émis dans l’atmosphère. La majorité de cette pollution est donc concentrée dans des zones très urbanisées. L’exposition permanente aux gaz d’échappement a des conséquences graves pour la santé humaine et pour cela, des normes d’émission de plus en plus strictes sont mises en place. Les technologies post-Traitement embarquées dans les pots d’échappement sont de plus en plus complexes et nécessitent un control continu de la composition gazeuse. Les conditions sérères de ce milieu requièrent le développement de capteurs de gaz robustes et de longue durée de vie. Dans ce travail, nous présentons la procédure de fabrication et la caractérisation d’un capteur électrochimique à trois électrodes pouvant satisfaire les exigences d’une application industrielle dans le domaine automobile. La technologie de sérigraphie utilisée a l’avantage d’être facilement transférable dans l’industrie pour une production de masse bas cout.Le principe de fonctionnement du capteur est basé sur la polarisation galvanostatique de l’électrode sensible permettant une détection sélective de NO2 sans interférence avec d’autres gaz comme CO et NO. De plus, afin d’augmenter la stabilité du capteur, de diminuer les temps de réponse et de recouvrement, un nouveau matériau d’électrode composite à base d’or a été développé.Enfin, la réduction électrochimique de l’oxygène sur l’or et sur des électrodes composite a été étudiée, afin de proposer un mécanisme de détection de NO2 / Road transport is one of the main sources of NOx emitted into the atmosphere. The majority of this pollution is concentrated in urbanized areas. The permanent exposure to the exhaust gases has serious consequences for human health and for that, emission standards become more stringent. The modern technologies present in automotive need the continuous control of the exhaust composition. The variations of temperature, composition of exhaust gas, vibrations and other factors require long life robust control systems. In this work, we present the procedure of fabrication and characterization of an electrochemical sensor with three electrodes that can fulfill the demands of industrial applications in automotive industry. Manufacturing by screen-Printing technology allows producing low-Cost sensor with high reproducibility in industrial process.The principle of our sensor is based on galvanostatic polarization of a gold sensing electrode allowing the selective detection of NO2 without interference to other gases such as CO and NO. In order to increase stability, and to decrease the response and recovery time of the sensor, a new Au composite sensitive electrode was developed. The electrochemical reduction of oxygen on gold and gold-Based electrodes was then studied, to propose a detailed mechanism of NO2 detection.

Des souches de Vibrio appartenant au clade Splendidus sont retrouvées de manière récurrente lors des mortalités estivales d'huîtres juvéniles. La souche V. tasmaniensis LGP32 est un pathogène intracellulaire facultatif des hémocytes d'huître, dont elle altère les fonctions de défense. Nous montrons ici que LGP32 se comporte comme un pathogène intravacuolaire qui survit au sein de larges vacuoles intrahémocytaires. Il induit des effets cytopathiques tels qu'une perméabilisation membranaire et un lessivage du contenu cytosolique des hémocytes. Cette cytotoxicité est dépendante de l'invasion hémocytaire. Par ailleurs, à l'intérieur du phagosome, LGP32 sécrète des vésicules de membrane externe (OMVs). Chez LGP32, ces OMVs jouent un rôle protecteur contre les défenses de l'hôte et servent de véhicules pour la délivrance de facteurs de virulence aux cellules de l'hôte. En effet, elles sont capables de titrer les peptides antimicrobiens et présentent un fort contenu en hydrolases (25% du protéome des OMVs). Une sérine protéase, nommée Vsp car elle est uniquement sécrétée par voie vésiculaire participe à la virulence de LGP32 en infections expérimentales mais ne dégraderait pas les peptides antimicrobiens. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une série de gènes impliqués dans la réponse anti-oxydante et l'efflux de cuivre, qui sont surexprimés dans les stades intracellulaires précoces de LGP32. La génomique fonctionnelle a montré que ces deux fonctions importantes sont requises pour la survie intracellulaire, la cytotoxicité et la virulence de LGP32. Leur grande conservation parmi les vibrios laisse supposer qu'elles puissent contribuer à la survie intracellulaire d'autres espèces de Vibrio. / Vibrio strains belonging to the Splendidus Clade have been repeatedly found in juvenile diseased oysters affected by summer mortalities. V. tasmaniensis LGP32 is an intracellular pathogen of oyster hemocytes which has been reported to alter the oxidative burst and inhibit phagosome maturation. We show here that LGP32 behaves as an intravacuolar pathogen that survives within large cytoplasmic vacuoles. LGP32 induces cytotoxic effects such as membrane disruptions and cytoplasmic disorders. Cytotoxicity was shown to be entirely dependent on LGP32 entry into hemocytes. Moreover, LGP32 releases outer membrane vesicles (OMVs) inside the phagosome. LGP32 OMVs were found to be protective against host defenses and to serve as vehicles for the delivery of LGP32 virulence factors to oyster immune cells. Indeed, OMVs conferred a high resistance to antimicrobial peptides. They also displayed a high content in hydrolases (25 % of total proteome) among which a serine protease, named Vsp for vesicular serine protease, was found to be specifically secreted through OMVs. Vsp was shown to participate in the virulence phenotype of LGP32 in oyster experimental infections but did not degrade AMPs entrapped in OMVs. By developing a transcriptomic approach, we identified a series of Vibrio antioxidant and copper efflux genes whose expression is strongly induced within oyster hemocytes. Construction of isogenic deletion mutants showed that resistance to reactive oxygen species and copper efflux are two important functions required for LGP32 intracellular survival, cytotoxic effects and virulence. Their high conservation among vibrios suggests they could contribute to intracellular survival of other Vibrio species.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Les membres du genre Morbillivirus, famille Paramyxoviridae sont responsables de graves maladies chez l'homme et les animaux, comme la rougeole, la peste bovine (RP) et la peste des petits ruminants (PPR). Malgré l'existence de vaccins efficaces contre ces maladies, des traitements spécifiques sont souhaitables. L'inhibition de la réplication de ces virus peut-être acquise par interférence ARN (ARNi), un mécanisme d'inhibition post-transcriptionnel déclenché par des séquences courtes d'ARN double-brin (siARN). Le CIRAD a précédemment identifié 3 siARNs ciblant des régions conservées du gène de la nucléoprotéine virale capables d'inhiber au moins 80% de la réplication in vitro des virus de la rougeole, de la RP et de la PPR. Cependant, un problème majeur dans la stratégie d'ARNi est le risque d'apparition de virus résistants. Dans cette étude, nous avons évalué le risque d'apparition de mutants d'échappement du virus de la PPR sous pression de sélection de 3 siARNs appliqués seul ou en association après plusieurs transfections successives in vitro. Excepté pour la combinaison des 3 siARNs, le virus a échappé à l'ARNi après 3 à 20 passages consécutifs, avec des mutations simples ou multiples (synonymes ou pas) ou une délétion de 6 nucléotides dans la zone cible des siARN. Ces résultats mettent en évidence une plasticité génomique inattendue des morbillivirus surtout illustrée par cette délétion non-délétère d'une partie significative d'un gène viral essentiel, qui devrait être considérée comme un obstacle à l'utilisation de l'ARNi comme thérapie antivirale. Cependant, l'utilisation combinée de 3 siARNs peut être proposée pour diminuer le risque d'échappement aux siARNs. / Viruses in the genus Morbillivirus, within the family Paramyxoviridae are responsible for severe humans and animal diseases, including measles, rinderpest (RP) and peste des petits ruminants (PPR). In spite of the existence of efficient vaccines against these diseases, specific treatments to be applied when the infection is already present are desirable. Inhibition of morbillivirus replication can be achieved by RNA interference (RNAi), a mechanism of post-transcriptional gene silencing triggered by small double-stranded RNA (siRNA). The CIRAD previously identified three siRNAs that target conserved regions of the essential gene encoding the viral nucleoprotein and are able to prevent in vitro at least 80% of the replication of measles, RP and PPR viruses . However, a major problem in RNAi is the important risk of emergence of escape mutants. In this study, we investigated the ability of PPR virus to escape the inhibition conferred by single or multiple siRNAs after several consecutive transfections in vitro. Except with the combination of the three different siRNAs, the virus systematically escaped RNAi after 3 to 20 consecutive passages. The mutations were characterized by either single or multiple punctual nucleotide mutations (synonymous or not) or a deletion of a stretch of 6 nucleotides into the siRNA target. These results demonstrate that the genomic plasticity of morbilliviruses, illustrated maily by this significant and no-deleterious deletion in an essential viral gene, should be considered as an obstacle to the use of RNAi in antiviral therapy. However, the combined use of three siRNAs can be proposed to prevent treatment failure with siRNAs.

Le projet présenté dans ce mémoire a pour objectif de développer un système de récupération d’énergie des gaz d’échappement d’un véhicule à essence. Constitué de piles à combustible à oxyde solide (SOFC) en configuration monochambre, le dispositif doit convertir l’énergie chimique des gaz imbrûlés en électricité. Son fonctionnement en aval du catalyseur trois voies permettrait de compléter son action dépolluante tout en améliorant l’efficacité énergétique du véhicule. Par opposition aux piles SOFC dites conventionnelles, les piles SOFC monochambres ne nécessitent pas de scellement étanche entre les compartiments et fonctionnent sous un mélange gazeux composé d’hydrocarbures et d’oxygène. L’empilement en stack de plusieurs cellules est simplifié et plus compact, son intégration au cœur du pot d’échappement est donc plus simple. Ce concept a été précédemment étudié dans la littérature et le présent projet a pour but d’améliorer les performances délivrées en optimisant certains paramètres : la géométrie de pile et les matériaux d’électrodes et d’électrolyte. De plus, un mélange gazeux plus représentatif des conditions réelles a été défini et utilisé tout au long du projet. Une étude préliminaire sur les matériaux sous forme de poudre a permis de réaliser un premier choix parmi quatre matériaux de cathode et de définir les conditions de fonctionnement théoriques des cellules. Ensuite, les cellules complètes ont été mises en forme puis étudiées sous mélange gazeux. Une densité maximale de puissance de 25 mW.cm-2 à 550°C pour une cellule Ni-CGO/CGO/LSCF-CGO a ainsi pu être obtenue. / This study aims at developing a system able to recover energy from exhaust gases of a thermal engine. Composed of Solid Oxide Fuel Cells (SOFC) in a single chamber configuration, the device has to convert chemical energy of gases into electricity. Embedded in the exhaust line at the exit of the three-way catalyst, the stack of single chamber SOFC will complete the reduction of toxic gases emissions with an improvement of the vehicle energy efficiency.Unlike conventional SOFC, single chamber SOFC do not require any gastight sealing between compartments and work in a mixed atmosphere composed of hydrocarbon and oxygen. Stack assembly is thus simplified and more compact; insertion into the exhaust line is therefore easier. This concept has been previously studied in the literature and this work aims at enhancing performances through the optimisation of some parameters such as cell geometry and cell components materials.Moreover, a more representative gas mixture of actual compositions in the exhaust line has been defined and used all along this project. A preliminary study on the raw materials has allowed to make a first selection among four cathode materials and to define theoretical working conditions of our cells. Afterwards, cells have been elaborated and then studied in the selected gas mixture. A maximum power density of 25 mW.cm-2 has been obtained at 550°C for a Ni-CGO/CGO/LSCF-CGO cell.

Le nouveau mode de combustion HCCI est adapté pour réduire les émissions d’oxydes d’azote et de particules fines issues de moteurs Diesel afin de respecter les futures normes d’émission Euro de plus en plus drastiques. Ce type de combustion se traduit par l’augmentation des émissions de monoxyde de carbone et des hydrocarbures et par une faible température des gaz d’échappement retardant ainsi leur conversion par le catalyseur d’oxydation Diesel (DOC). C’est dans ce contexte environnemental et économique que le couplage plasma-catalyseur apparait comme une solution intéressante afin d’améliorer l’efficacité du traitement des gaz d’échappement Diesel. Cette thèse est dédiée à l’étude du couplage d’un plasma non-thermique de type décharge à barrière diélectrique (DBD) et d’un catalyseur d’oxydation Diesel (Pt-Pd/Al2O3) pour le traitement de mélanges gazeux représentatifs d’un échappement de moteur Diesel HCCI (O2-NO-H2O-CO-CO2-CH4-C3H6- C7H8-C10H22-N2). Les expériences avec un réacteur plasma pilote ont été menées sur deux bancs expérimentaux : le premier à l’échelle laboratoire en vue de comprendre la physico-chimie impliquant le plasma et le catalyseur avec une attention particulière pour les sous-produits de réaction, et le second à l’échelle industriel afin de déterminer l’efficacité et la faisabilité d’un tel couplage dans les conditions de débit et de température les plus proches possibles de celles rencontrées en sortie moteur véhicule. L’étude menée en fonction de la puissance injectée dans le milieu, la VVH, la température des gaz, ainsi que la nature du cycle de roulage a permis de montrer l’efficacité du plasma pour abaisser de façon significative la température d’activation du DOC pour l’oxydation de CO et des hydrocarbures. Aussi, la présence du plasma en amont du DOC a permis, sur un cycle NEDC simulé, une réduction de 68% et 42% des masses de CO et des hydrocarbures émis en accord avec la norme Euro6 (2014). L’efficacité du plasma pour l’oxydation des hydrocarbures et de NO à basse température dans ces conditions de débits élevés (jusqu’à 900 Lmin−1 sur le cycle NEDC) a été confirmée et les principaux produits de réaction identifiés et quantifiés. / The new HCCI combustion mode is well adapted to improve nitrogen oxide and particulate matter reduction from Diesel engine in order to meet future emission regulations adopted in the Euro zone. However, HCCI engines emit relatively high amounts of unburned hydrocarbons and carbon monoxide due to lower engine exhaust temperature increasing the catalyst light-off time and decreasing the average efficiency of the Diesel oxidation catalyst (DOC). In this environmental and economic context, the combination of plasma with DOC has been considered especially for intermittent use during the cold start. The thesis presents the combination of nonthermal plasma upstream Diesel oxidation catalyst (Pt-Pd/Al2O3) applied to the treatment of simulating Diesel HCCI exhaust gas (O2-NO-H2O-CO-CO2-CH4-C3H6-C7H8-C10H22-N2). The studies were conducted at atmospheric pressure with a pilot-scale dielectric barrier discharge reactor (DBD) on two experimental devices. The first is a laboratory scale set-up (low flow rate : 20 Lmin−1) used to understand the physico-chemical involving the plasma and the catalyst by focusing on the by-products reactions. The second is an industrial scale (gas flow rate up to 260 Lmin−1) used to study the feasibility and the efficiency of the plasma-DOC system under conditions similar to those encountered in Diesel exhaust engine. The effects of the plasma, the DOC and the plasma-DOC systems on the exhaust gas have been investigated under various conditions. The main contribution of the plasma was to give a « thermal » and a chemical « push » to the DOC resulting in the decrease of light-off temperature for CO and HC oxidation. These improvements were shown to depend on the treatment conditions (injected energy i.e. energy density, space velocity, gas temperature and nature of the driving cycle). It is shown that for a simulated European Driving Cycle (NEDC), the combination of plasma upstream DOC reduces the cumulative mass of CO and hydrocarbons by about 68% and 42%, respectively, in accordance with the Euro 6 standard (2014). The efficiency of plasma for hydrocarbons and NO oxidation at low temperature in high flow conditions (up to 900 Lmin−1 on the NEDC) has been confirmed and the main reaction products identified and quantified.

Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient 109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète de certains polluants toxiques pour l’environnement comme les composés organiques tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l’instant, pas cultivables in vitro. Mon travail s’inscrit dans le cadre d’une collaboration entre l’Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G. M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l’Ecole Centrale de Lyon. Nos partenaires à l’Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte de nouveaux gènes d’intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de la quinoléine présente dans les bactéries d’un sol de référence largement étudié au laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer une souche d’E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes recherchés dans un échantillon d’ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones de recombinaison qui vont jouer le rôle d’hameçons. Nous avons testé la capacité de Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule après l’ évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées pour améliorer l’efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop faible peut-être due à l’incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish. / As the development of metagenomic technologies in the past ten years, it is unquestionned that microorganisms encompass the largest resource of metabolic and genetic diversity in the world. Actually, one gramme of soil contains more than 109 bacteria and 103-104 species. Some of their members are able to carry out enzymatic reactions leading to the complete degradation of pollutants (such as quinoline). So, the biodegradation of some highly toxic or organic compounds by microorganisms will be a general trend for pollutant treatment. However, the huge reservoir of molecules and enzymes from microorganisms still need to be explored because more than 99% of microorganisms cannot be cultivated in vitro.My work was based on collaboration between the University SJTU and Ecole Centrale de Lyon. Our partners at the University SJTU have built a laboratory scale denitrification reactor which was capable of degrading quinoline by removing the chemical oxygen demand. A new tool called "Genefish" has been developed in our laboratory as an alternative method for metagenomics which aims to discover novel industrial or environmental genes of interest. Following the early work in our laboratory, my thesis is presented here in two parts.In the first part, we set up a quinoline microcosm experiment both under aerobic and anaerobic condition using reference soil extensively studied in the laboratory at Ecole Centrale de LYON. This work aimed to reveal the potential bacterial diversity and even genes responsible for quinoline degradation. We used RISA(Ribosomal intergenic Spacer analysis) to analyze the bacteria community structure changes and GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) was also used to detect the quinoline degradation and reveal potential quinoline metabolic pathways under aerobic and anaerobic condition. Results showed great bacteria community structure changes and high quinoline degradation activity after the quinoline addition under aerobic condition. The future work is to investigate the bacteria community which may be responsible for quinoline degradation using the technique of NGS (Next Generation Sequencing).The second object of my thesis was to use the Genefish tool to capture targeted genes (the bcr gene responsible for the quinoline degradation in the wastewater treatment bioreactor) from the soil metagenome. The aim was to construct an E.coli strain containing a capture plasmid and Red system for capturing targeted genes from metagenomic DNA by homologous recombination. The capture plasmid includes a toxic cassette consisting of two suicide genes which can be activated by chemical induction, finally support the positive recombinants selection. It also contains two multiply cloning sites in which highly conserved sequences were inserted and works as the bait during recombination. We have tested the capacity of Genefish to capture the PCR products of bcr gene; the efficiency was low because of the persistence of several copies of the capture plasmid into the Genefish strain after recombination events. So, three strategies were tried to improve the recombination efficiency: co-electroporation, plasmid segregation and mono-copy capture plasmid construction. Finally, the strategy of plasmid segregation works but the recombination efficiency was still low maybe caused by the uncertain model of homologous recombination. The further research will focus on the transfer of the toxic cassette and homologous arms into the host strain chromosome, this new strategy will exclude the bad effect of low copy number capture plasmid, uncertain model of λ Red induced homologous recombination and the homologous arms site in the capture plasmid which are the most important factors influencing the homologous recombination efficiency in Genefish.