Because of its complexity and intricacy, studying the nervous system is often challenging. Fortunately, the small nematode roundworm Caenorhabditis elegans is well established as a model system for basic neurobiological research. The C. elegans model is also the only organism with a supposedly complete connectome, an organism-wide map of synaptic connectivity resolved by electron microscopy, which provides some understanding of how the nervous system works as a whole. However, the number of available data-sets is small and the connectome contains errors and gaps. One example of this concerns electrical synapses. Electrical synapses are formed by gap junctions and difficult to map due to their often ambiguous morphology in electron micrographs, leading to misclassification or omission. On the other hand, chemical synapses are more easily mapped, but many aspects of their mode of operation remain elusive and their role in the C. elegans connectome is oversimplified. A comprehensive understanding of signal transduction of neurons between each other and other cells will be indispensable for a comprehensive understanding of the nervous system. In this thesis, I approach these challenges with a combination of advanced light and electron microscopy techniques. First, this thesis describes a strategy to increase synaptic specificity in connectomics. Specifically, I classify gap junctions with a high degree of confidence. To achieve this, I utilized array tomography (AT). In this thesis, AT is adapted for high-pressure freezing to optimize for structure preservation and for super-resolution light microscopy; in this manner, I aim to bridge the gap between light and electron microscopy resolutions. I call this adaptation super-resolution array tomography (srAT). The srAT approach made it possible to clearly identify and map gap junctions with high precision and accuracy. The results from this study showcased the feasibility of incorporating electrical synapses into connectomes in a systematic manner, and subsequent studies have used srAT for other models and questions. As mentioned above, the C. elegans connectomic model suffers from a shortage of datasets. For most larval stages, including the special dauer larval stage, connectome data is completely missing up to now. To obtain the first partial connectome data-set of the C. elegans dauer larva, we used focused ion-beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). This technique offers an excellent axial resolution and is useful for acquiring large volumes for connectomics. Together with our collaborators, I acquired several data-sets which enable the analysis of dauer stage-specific “re-wiring” of the nervous system and thus offer valuable insights into connectome plasticity/variability. While chemical synapses are easy to map relative to electrical synapses, signal transduction via chemical transmitters requires a large number of different proteins and molecular processes acting in conjunction in a highly constricted space. Because of the small spatial scale of the synapse, investigating protein function requires very high resolution, which electron tomography provides. I analyzed electron tomograms of a worm-line with a mutant synaptic protein, the serine/threonine kinase SAD-1, and found remarkable alterations in several architectural features. My results confirm and re-contextualize previous findings and provide new insight into the functions of this protein at the chemical synapse. Finally, I investigated the effectiveness of our methods on “malfunctioning,” synapses, using an amyotrophic lateral sclerosis (ALS) model. In the putative synaptopathy ALS, the mechanisms of motor neuron death are mostly unknown. However, mutations in the gene FUS (Fused in Sarcoma) are one known cause of the disease. The expression of the mutated human FUS in C. elegans was recently shown to produce an ALS-like phenotype in the worms, rendering C. elegans an attractive disease model for ALS. Together with our collaboration partners, I applied both srAT and electron tomography methods to “ALS worms” and found effects on vesicle docking. These findings help to explain electrophysiological recordings that revealed a decrease in frequency of mini excitatory synaptic currents, but not amplitudes, in ALS worms compared to controls. In addition, synaptic endosomes appeared larger and contained electron-dense filaments in our tomograms. These results substantiate the idea that mutated FUS impairs vesicle docking and also offer new insights into further molecular mechanisms of disease development in FUS-dependent ALS. Furthermore, we demonstrated the broader applicability of our methods by successfully using them on cultured mouse motor neurons. Overall, using the C. elegans model and a combination of light and electron microscopy methods, this thesis helps to elucidate the structure and function of neuronal synapses, towards the aim of obtaining a comprehensive model of the nervous system. / Das Nervensystem ist ein definierendes Merkmal aller Tiere, unter anderem verantwortlich für Sinneswahrnehmung, Bewegung und „höhere“ Hirnfunktionen. Wegen dessen Komplexität und Feingliedrigkeit stellt das Erforschen des Nervensystems oft eine Herausforderung dar. Jedoch ist der kleine Fadenwurm Caenorhabditis elegans als Modellsystem für neurobiologische Grundlagenforschung gut etabliert. Erbesitzt eines der kleinsten und unveränderlichsten bekannten Nervensysteme. C.elegans ist auch das einzige Modell, für das ein annähernd vollständiges Konnektom vorliegt, eine durch Elektronenmikroskopie erstellte Karte der synaptischen Verbindungen eines gesamten Organismus, die Einblicke in die Funktionsweise des Nervensystems als Ganzes erlaubt. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Datensätze gering und das Konnektom enthält Fehler und Lücken. Davon sind beispielsweise elektrische Synapsen betroffen. Elektrische Synapsen werden von Gap Junctions gebildet und sind auf Grund ihrer oft uneindeutigen Morphologie in elektronenmikroskopischen Aufnahmen schwierig zu kartieren, was dazu führt, dass einige falsch klassifiziert oder übersehen werden. Chemische Synapsen sind dagegen einfacher zu kartieren, aber viele Aspekte ihrer Funktionsweise sind schwer zu erfassen und ihre Rolle im Konnektom von C.elegans ist daher zu vereinfacht dargestellt. Ein umfassendes Verständnis der Signaltransduktion von Neuronen untereinander und zu anderen Zellen wird Voraussetzung für ein vollständiges Erfassen des Nervensystems sein. In der vorliegenden Arbeit gehe ich diese Herausforderungen mithilfe einer Kombination aus modernsten licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren an. Zunächst beschreibt diese Arbeit eine Strategie, um die synaptische Spezifität in der Konnektomik zu erhöhen, indem ich Gap Junctions mit einem hohen Maß an Genauigkeit klassifiziere. Um dies zu erreichen, nutzte ich array tomography (AT), eine Technik, die Licht- und Elektronenmikrokopie miteinander korreliert. In dieser Arbeit wird AT adaptiert für Hochdruckgefrierung, um die Strukturerhaltung zu optimieren, sowie für ultrahochauflösende Lichtmikroskopie; so wird die Kluft zwischen den Auflösungsbereichen von Licht- und Elektronenmikroskopie überbrückt. Diese Adaption nenne ich super-resolution array tomography (srAT). Der srATAnsatz machte es möglich, Gap Junctions mit hoher Präzision und Genauigkeit klar zu identifizieren. Für diese Arbeit konzentrierte ich mich dabei auf Gap Junctions des retrovesikulären Ganglions von C.elegans. Die Ergebnisse dieser Studie veranschaulichen, wie es möglich wäre, elektrische Synapsen systematisch in Konnektome aufzunehmen. Nachfolgende Studien haben srAT auch auf andere Modelle und Fragestellungen angewandt ...

In den letzten Jahren wurden die westlichen Industrienationen vermehrt mit Wohlstandserkrankungen konfrontiert, welche durch Überernährung und gleichzeitigem Bewegungsmangel hervorgerufen werden. Dabei gilt es besonders die Fettsucht und das meist damit vergesellschaftete Metabolische Syndrom (MetS) zu nennen. Bei dem MetS handelt es sich um eine multifaktorielle Erkrankung, die laut „International Diabetes Foundation" (IDF) unter anderem durch erhöhte Triglyceride, ein niedrigeres HDL-Cholesterin, einen erhöhten Blutdruck und einen pathologischen Nüchternblutzucker gekennzeichnet ist. Eine wichtige Subpopulation von Betroffenen des MetS sind Frauen in den Wechseljahren, von denen ca. 40 % Symptome des MetS zeigen. In Studien zeigte sich, dass die Hormonersatztherapie (HRT) Parameter des Stoffwechsels in postmenopausalen Frauen unterschiedlich beeinflusst, je nachdem, ob sie gleichzeitig Symptome des MetS zeigen oder nicht. So werden z. B. Probleme der Insulinresistenz durch HRT von postmenopausalen Frauen zwar prinzipiell verbessert, aber nur, wenn diese Frauen nicht gleichzeitig weitere Symptome des MetS aufweisen wie z. B. Adipositas. Um sowohl die Folgen für die Gesundheit des betroffenen Individuums zu minimieren als auch die sozioökonomischen Folgen in Schranken halten zu können, sollten präventive Behandlungsmaßnahmen den kurativen deutlich zu bevorzugen sein. Voraussetzung für eine effektive chemische Prävention des MetS und seiner Folgen für die Gesundheit ist die genaue Kenntnis der molekularen Grundlagen der pathophysiologischen Veränderungen, die als Folge der Östrogendefizienz zur verstärkten Ausprägung der Symptome des MetS bzw. der Adipositas führen. Ein erster plausibler mechanistischer Ansatzpunkt schien dabei durch das Wechselspiel von Östrogenen und Leptin gegeben zu sein. So ist z. B. der Leptin-Spiegel in Frauen gegenüber Männern dreifach höher. Ein „cross-talk“ zwischen den beiden Hormonen im Hypothalamus gilt als nachgewiesen. Die Aromatase-knockout (ArKO)-Maus ist ein Mausmodell, das als Phänotyp die Östrogendefizienz mit den Symptomen des MetS vergesellschaftet. Durch die Deletion des Cyp19-Gens (Aromatase-Gen) sind diese Tiere nicht in der Lage, Östrogene zu synthetisieren. Dies äußert sich phänotypisch durch eine Infertilität beider Geschlechter und im zunehmenden Lebensalter durch die Ausprägung einer exzessiven Adipositas. Durch diese Eigenschaft scheint die ArKO-Maus ein adäquates Modell zur Erforschung von Folgen der Östrogendefizienz einschließlich des MetS zu sein. Aus diesem Grund war es interessant zu prüfen, ob und in welchem Umfang die ArKO-Maus a) ein adäquates Modell für hormonelle Prüfungen bei Zuständen der Östrogendefizienz im Allgemeinen und b) im Zusammenhang mit der Östrogendefizienz vergesellschaftete Fettsucht darstellt. Symptome der Wechseljahre sind ein Problem des alternden Organismus. Diese Tatsache wird in vielen tierexperimentellen Studien zu Erscheinungen der Östrogendefizienz nicht berücksichtigt. Deshalb war es weiterhin interessant, den Einfluss des Alters zu Beginn der Behandlung der ArKO-Maus zu untersuchen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Prüfung östrogenähnlicher Substanzen im ArKO-Mausmodell. Hier war es zusätzlich von Interesse neben dem Einfluss der östrogenen Substanzen auf ausgewählte Gewebe in der ArKO-Maus auch die Bedeutung der Behandlungsdauer zu untersuchen. Zur Beantwortung der ersten Frage die östrogene Empfindlichkeit betreffend wurden ArKO-Mäuse mit der ihren Wildtyp (WT)-Wurfgeschwister verglichen. Dabei wurden jeweils die östrogendefizienten Tiere, ArKO-Maus und ovariektomierte (ovx) WT-Maus, sowie die unter Östrogeneinfluss stehenden Tiere, E2-supplementierten ArKO-Mäuse und intakte WT-Mäuse miteinander verglichen. Basierend auf den physiologisch, biochemisch und molekularbiologisch erhobenen Daten ist das Fazit der ersten tierexperimentellen Studie: Die ArKO-Maus scheint anders als die ovx WT-Maus kein adäquates experimentelles Modell für reine Östrogenprüfungen zu sein. Sie scheint aber geeignet für molekulare Untersuchungen im Zusammenhang von Östrogendefizienz und MetS zu sein. Zwischen den beiden Mausmodellen ArKO und WT fand sich auf physiologischer und molekularer Ebene eine Vielzahl von Unterschieden. Die ArKO-Mäuse waren signifikant schwerer und auch der Verfettungsgrad war bei den ArKO-Mäusen stärker ausgeprägt als bei den ovx WT-Mäusen. Bei der Regulation Genexpression durch Östrogene zeigte ein Teil der untersuchten Gene sogar ein entgegengesetztes Expressionsmuster. Zur Untersuchung, inwiefern das Lebensalter Einfluss auf physiologische und molekulare Eigenschaften der Östrogenwirkung nimmt, wurden weibliche ArKO-Mäuse aus zwei unterschiedlichen Altersgruppen untersucht. Mit der zweiten tierexperimentellen Studie konnte eine Reihe von Parametern identifiziert werden, die in ihrer östrogenen Regulation eine Abhängigkeit vom Alter aufweisen. So unterscheidet sich die Regulation des Körpergewichts signifikant zwischen beiden Altersgruppen, ebenso wie die des Uterusfeuchtgewichts. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass diese sich altersabhängig verändert und zum Teil im Vergleich der beiden untersuchten Lebensalter sogar entgegengesetzte Muster der östrogenabhängigen Regulation der Genexpression ausbildeten. Als Resümee der zweiten Studie kann daher festgehalten werden, dass bei den ArKO-Mäusen das Lebensalter der Tiere eine entscheidende Determinante für die Östrogensensitivität ist. Dies scheint insofern wichtig, wenn die Endpunkte auf Ebene von Geweben und Genen betrachtet werden, die besonders dem Alterungsprozess unterliegen bzw. die für gealterte Populationen relevant sind. Bei der HRT wird oft die Verwendung von Phytoöstrogenen als sichere „Alternativtherapie“ propagiert. Um zu überprüfen welche Effekte E2, Raloxifen und pflanzliche Sekundärmetaboliten auf physiologische Parameter und die Regulation der Expression ausgewählter Gene in relevanten Zielgeweben der ArKO-Mäuse haben, wurde eine Tiergruppe für drei Tage und eine andere Tiergruppe für 21 Tage mit Raloxifen, Genistein und 8-Prenylnaringenin behandelt. Raloxifen ist eine in der HRT verwendete synthetisch hergestellte östrogene Substanz, die ein bekannter Selektiver-Östrogenrezeptor-Modulator (SERM) ist. Das Soja-Isoflavonoid Genistein und das im Hopfen vorkommende Flavanon 8-Prenylnaringenin (8-PN) sind dagegen natürlich vorkommende sekundäre Pflanzenmetabolite. In den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass es zu einer Verringerung des Fettgewebes durch alle östrogene Substanzen kam. Für die Regulation der Expression östrogener Zielgene kann zusammenfassend festgestellt werden, dass sich nach einer 21-tägigen Behandlungszeit ein anderes Muster der Regulation der Genexpressionsmuster im Uterus ergab als nach einer dreitägigen Behandlung. Dies bestätigt die Annahme, dass auch die Dauer der Behandlung einen großen Einfluss auf die Genexpression und die dadurch vermittelten Veränderungen der Physiologie und des Stoffwechsels hat. Weiter konnte belegt werden, dass Raloxifen, Genistein und 8-PN auf den Uterus und die beiden Fettgewebe ähnliche Effekte zeigten wie E2. In der Expression der untersuchten Gene konnte dies allerdings nicht so deutlich nachgewiesen werden. Schlussfolgernd kann anhand dieser Studien festgehalten werden, dass die ArKO-Maus kein adäquater Ersatz der ovx WT-Maus zur hormonellen Prüfung östrogener Substanzen ist. Sie scheint aber ein geeignetes, ergänzendes experimentelles Modell für Fragestellungen zu sein, die sich mit Untersuchungen der Zusammenhänge von Östrogendefizienz und MetS beschäftigen. Ebenso zeigten die Daten, dass das Lebensalter zu Beginn des Experiments eine entscheidende Determinante für die Qualität der östrogenen Wirkung ist. Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die verwendeten östrogenen Substanzen keine eindeutigen SERM-Eigenschaften, sondern eher östrogene Wirkeigenschaften in den ArKO-Mäusen aufweisen.

Progressive loss of voluntary movement control is the central symptom of Parkinson's disease (PD). Even today, we are not yet able to cure PD. This is mainly due to a lack of understanding the mechanisms of movement control, network activity and plasticity in motor circuits, in particular between the cerebral cortex and the striatum. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as one of the most important factors for the development and survival of neurons, as well as for synaptic plasticity. It is thus an important target for the development of new therapeutic strategies against neurodegenerative diseases. Together with its receptor, the Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), it is critically involved in development and function of the striatum. Nevertheless, little is known about the localization of BDNF within presynaptic terminals in the striatum, as well as the types of neurons that produce BDNF in the cerebral cortex. Furthermore, the influence of midbrain derived dopamine on the control of BDNF / TrkB interaction in striatal medium spiny neurons (MSNs) remains elusive so far. Dopamine, however, appears to play an important role, as its absence leads to drastic changes in striatal synaptic plasticity. This suggests that dopamine could regulate synaptic activity in the striatum via modulation of BDNF / TrkB function. To answer these questions, we have developed a sensitive and reliable protocol for the immunohistochemical detection of endogenous BDNF. We find that the majority of striatal BDNF is provided by glutamatergic, cortex derived afferents and not dopaminergic inputs from the midbrain. In fact, we found BDNF in cell bodies of neurons in layers II-III and V of the primary and secondary motor cortex as well as layer V of the somatosensory cortex. These are the brain areas that send dense projections to the dorsolateral striatum for control of voluntary movement. Furthermore, we could show that these projection neurons significantly downregulate the expression of BDNF during the juvenile development of mice between 3 and 12 weeks. In parallel, we found a modulatory effect of dopamine on the translocation of TrkB to the cell surface in postsynaptic striatal Medium Spiny Neurons (MSNs). In MSNs of the direct pathway (dMSNs), which express dopamine receptor 1 (DRD1), we observed the formation of TrkB aggregates in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of PD. This suggests that DRD1 activity controls TrkB surface expression in these neurons. In contrast, we found that DRD2 activation has opposite effects in MSNs of the indirect pathway (iMSNs). Activation of DRD2 promotes a rapid decrease in TrkB surface expression which was reversible and depended on cAMP. In parallel, stimulation of DRD2 led to induction of phospho-TrkB (pTrkB). This effect was significantly slower than the effect on TrkB surface expression and indicates that TrkB is transactivated by DRD2. Together, our data provide evidence that dopamine triggers dual modes of plasticity on striatal MSNs by acting on TrkB surface expression in DRD1 and DRD2 expressing MSNs. This surface expression of the receptor is crucial for the binding of BDNF, which is released from corticostriatal afferents. This leads to the induction of TrkB-mediated downstream signal transduction cascades and long-term potentiation (LTP). Therefore, the dopamine-mediated translocation of TrkB could be a mediator that modulates the balance between dopaminergic and glutamatergic signaling to allow synaptic plasticity in a spatiotemporal manner. This information and the fact that TrkB is segregated to persistent aggregates in PD could help to improve our understanding of voluntary movement control and to develop new therapeutic strategies beyond those focusing on dopaminergic supply. / Der fortschreitende Verlust der willkürlichen Bewegungskontrolle ist ein zentrales Symptom der Parkinson-Krankheit (PD). Auch heute sind wir noch nicht in der Lage, PD zu heilen. Dafür verantwortlich ist hauptsächlich ein mangelndes Verständnis von Mechanismen der Bewegungskontrolle, Netzwerkaktivität und Plastizität in motorischen Schaltkreisen, insbesondere zwischen Hirnrinde und Striatum. Der neurotrophe Faktor BDNF ist einer der wichtigsten Faktoren für die Entwicklung und das Überleben von Neuronen sowie für synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem. BDNF ist daher ein Target für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen neurodegenerative Erkrankungen. Zusammen mit seinem Rezeptor, der Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB), ist BDNF maßgeblich an der Entwicklung und Funktion des Striatums beteiligt. Dennoch ist nur wenig bekannt, wo BDNF an Synapsen im Striatum lokalisiert ist, und wo BDNF in Neuronen der Hirnrinde synthetisiert wird. Außerdem ist der Einfluss von Dopamin aus dem Mittelhirn auf die Kontrolle der BDNF / TrkB-Interaktion in striatalen Medium-Spiny-Neuronen (MSNs) bisher unklar. Dopamin scheint jedoch eine wichtige Rolle zu spielen, da dessen Abwesenheit zu drastischen Veränderungen der striatalen Plastizität führt. Dopamin könnte synaptische Plastizität im Striatum über eine Modulation der BDNF / TrkB-Interaktion regulieren. Um diese Fragen beantworten zu können, haben wir ein sensitives und zuverlässiges Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von endogenem BDNF entwickelt. Wir fanden heraus, dass BDNF im Striatum vor allem in glutamatergen Synapsen von Projektion aus dem Kortex lokalisiert ist und nicht in Terminalen dopaminerger Neurone aus dem Mittelhirn. Tatsächlich fanden wir BDNF in den Zellkörpern von Neuronen in den Schichten II-III und V des primären und sekundären motorischen Kortex sowie Schicht V des somatosensorischen Kortex. Es sind jene Hirnareale, welche dichte Projektionen zum dorsolateralen Striatum senden und entscheidend an der Steuerung von willkürlichen Bewegungen beteiligt sind. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eben jene Projektionsneurone die Bildung von BDNF während der juvenilen Entwicklung von Mäusen zwischen 3 und 12 Wochen signifikant herunter regulieren. In striatalen MSN fanden wir zudem einen modulatorischen Effekt von Dopamin auf die Translokation von TrkB zur Zelloberfläche. In MSNs des direkten Signalweges (dMSNs), welche Dopaminrezeptor 1 (DRD1) exprimieren, konnten wir die Bildung von TrkB-Aggregaten im 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) - Rattenmodell der Parkinson Erkankung beobachten. Dies deutet darauf hin, dass die DRD1-Aktivität die TrkB-Oberflächenexpression in diesen Neuronen steuert. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass die DRD2-Aktivierung in MSNs des indirekten Signalweges (iMSNs) eine gegensätzliche Wirkung hat. Die Aktivierung von DRD2 führt zu einer schnellen Reduktion der TrkB-Oberflächenexpression, die reversibel und von cAMP abhängig ist. Außerdem führte die Stimulation von DRD2 zu einer Induktion von Phospho-TrkB (pTrkB). Dieser Effekt war deutlich langsamer als die Wirkung auf die TrkB-Oberflächenexpression und deutet auf eine Transaktivierung von TrkB über DRD2 hin. Insgesamt scheint Dopamin entgegengesetzte Plastizitätsmodi in striatalen MSNs auszulösen, indem es auf die TrkB-Oberflächenexpression in DRD1- und DRD2-exprimierenden MSNs einwirkt. Diese Oberflächenexpression des Rezeptors ist entscheidend für die Bindung von BDNF, welches aus kortiko-striatalen Afferenzen freigesetzt wird. Dies führt zur Induktion von TrkB-vermittelten-Signaltransduktionskaskaden und Langzeitpotenzierung (LTP). Daher könnte die dopamin-vermittelte Translokalisation von TrkB das Gleichgewicht zwischen dopaminergen und glutamatergen Signalen modulieren, um die synaptische Plastizität in einer räumlich-zeitlich abgestimmten Weise zu ermöglichen. Diese Information und die Tatsache, dass TrkB bei PD stabile Aggregate bildet, könnte dazu beitragen, unser Verständnis der willkürlichen Bewegungskontrolle zu verbessern und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die über jene hinausgehen, welche sich auf die dopaminerge Versorgung konzentrieren.

Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine tödliche Infektionserkrankung, die durch den parasitären Plattwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird. Genomanalysen von E. multilocularis ergaben ein Gen, das laut Vorhersage für eine DyP-Typ Peroxidase codiere. Ziel dieser Arbeit ist die biologische Funktion des codierten Enzyms besser zu verstehen und Hinweise auf eine mögliche Rolle in der Abwehr von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu erlangen. Das Gen wurde heterolog in E. Coli exprimiert und molekulare Charakteristika des Gens mit bioinformatischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Quantitative RT-PCR Untersuchungen gaben Aufschluss über das Transkriptprofil von emipox in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von E. mulitlocularis. Mittels Whole-Mount In Situ-Hybridisierung (WMISH) wurden die Transkripte zudem lokalisiert und ihre Beziehung zum Stammzellsystem von E. multilocularis näher untersucht. Die Zugehörigkeit von EmIPOX zur Gruppe der DyP-Typ Peroxidasen wurde bestätigt. Homologe beim Menschen kommen nicht vor. Es konnte nachgewiesen werden, dass Transkripte von emipox auch, aber keinesfalls ausschließlich, in Stammzellen vorliegen. Überdurchschnittlich viele Transkripte liegen im aktivierten Protoscolex und im Metacestoden ex vivo aus einer infizierten Wirtsleber vor. Untersuchungen zur Enzymaktivität von EmIPOX zeigten neben einer Peroxidase- auch eine Katalaseaktivität. Die vorliegende Arbeit ist die erste Charakterisierung einer DyP-Typ Peroxidase bei Tieren. Sie legt nahe, dass EmIPOX eine Rolle in der Entgiftung von ROS in E. multilocularis spielt und stellt den Charakter von EmIPOX als potenzieller pharmakologischer Zielstruktur heraus. / Alveolar echinococcosis (AE) is a fatal infectious disease caused by the parasitic flatworm Echinococcus multilocularis. Genome analyses of E. multilocularis revealed a gene predicted to encode a DyP-type peroxidase. The aim of this work is to better understand the biological function of the encoded enzyme and to obtain information on a possible role in the defence against reactive oxygen species (ROS). The gene was heterologously expressed in E. Coli and molecular characteristics of the gene were investigated using bioinformatic and molecular biological methods. Quantitative RT-PCR analyses provided information on the transcript profile of emipox in different developmental stages of E. mulitlocularis. Whole-mount in situ hybridisation (WMISH) was also used to localise the transcripts and investigate their relationship to the stem cell system of E. multilocularis. The affiliation of EmIPOX to the group of DyP-type peroxidases was confirmed. There are no homologues in humans. It has been shown that transcripts of emipox are also, but by no means exclusively, present in stem cells. An above-average number of transcripts are present in the activated protoscolex and in the metacestode ex vivo from an infected host liver. Investigations into the enzyme activity of EmIPOX revealed both peroxidase and catalase activity. The present work is the first characterisation of a DyP-type peroxidase in animals. It suggests that EmIPOX plays a role in the detoxification of ROS in E. multilocularis and highlights the character of EmIPOX as a potential pharmacological target.

In den letzten Jahren wurden die westlichen Industrienationen vermehrt mit Wohlstandserkrankungen konfrontiert, welche durch Überernährung und gleichzeitigem Bewegungsmangel hervorgerufen werden. Dabei gilt es besonders die Fettsucht und das meist damit vergesellschaftete Metabolische Syndrom (MetS) zu nennen. Bei dem MetS handelt es sich um eine multifaktorielle Erkrankung, die laut „International Diabetes Foundation" (IDF) unter anderem durch erhöhte Triglyceride, ein niedrigeres HDL-Cholesterin, einen erhöhten Blutdruck und einen pathologischen Nüchternblutzucker gekennzeichnet ist. Eine wichtige Subpopulation von Betroffenen des MetS sind Frauen in den Wechseljahren, von denen ca. 40 % Symptome des MetS zeigen. In Studien zeigte sich, dass die Hormonersatztherapie (HRT) Parameter des Stoffwechsels in postmenopausalen Frauen unterschiedlich beeinflusst, je nachdem, ob sie gleichzeitig Symptome des MetS zeigen oder nicht. So werden z. B. Probleme der Insulinresistenz durch HRT von postmenopausalen Frauen zwar prinzipiell verbessert, aber nur, wenn diese Frauen nicht gleichzeitig weitere Symptome des MetS aufweisen wie z. B. Adipositas. Um sowohl die Folgen für die Gesundheit des betroffenen Individuums zu minimieren als auch die sozioökonomischen Folgen in Schranken halten zu können, sollten präventive Behandlungsmaßnahmen den kurativen deutlich zu bevorzugen sein. Voraussetzung für eine effektive chemische Prävention des MetS und seiner Folgen für die Gesundheit ist die genaue Kenntnis der molekularen Grundlagen der pathophysiologischen Veränderungen, die als Folge der Östrogendefizienz zur verstärkten Ausprägung der Symptome des MetS bzw. der Adipositas führen. Ein erster plausibler mechanistischer Ansatzpunkt schien dabei durch das Wechselspiel von Östrogenen und Leptin gegeben zu sein. So ist z. B. der Leptin-Spiegel in Frauen gegenüber Männern dreifach höher. Ein „cross-talk“ zwischen den beiden Hormonen im Hypothalamus gilt als nachgewiesen. Die Aromatase-knockout (ArKO)-Maus ist ein Mausmodell, das als Phänotyp die Östrogendefizienz mit den Symptomen des MetS vergesellschaftet. Durch die Deletion des Cyp19-Gens (Aromatase-Gen) sind diese Tiere nicht in der Lage, Östrogene zu synthetisieren. Dies äußert sich phänotypisch durch eine Infertilität beider Geschlechter und im zunehmenden Lebensalter durch die Ausprägung einer exzessiven Adipositas. Durch diese Eigenschaft scheint die ArKO-Maus ein adäquates Modell zur Erforschung von Folgen der Östrogendefizienz einschließlich des MetS zu sein. Aus diesem Grund war es interessant zu prüfen, ob und in welchem Umfang die ArKO-Maus a) ein adäquates Modell für hormonelle Prüfungen bei Zuständen der Östrogendefizienz im Allgemeinen und b) im Zusammenhang mit der Östrogendefizienz vergesellschaftete Fettsucht darstellt. Symptome der Wechseljahre sind ein Problem des alternden Organismus. Diese Tatsache wird in vielen tierexperimentellen Studien zu Erscheinungen der Östrogendefizienz nicht berücksichtigt. Deshalb war es weiterhin interessant, den Einfluss des Alters zu Beginn der Behandlung der ArKO-Maus zu untersuchen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Prüfung östrogenähnlicher Substanzen im ArKO-Mausmodell. Hier war es zusätzlich von Interesse neben dem Einfluss der östrogenen Substanzen auf ausgewählte Gewebe in der ArKO-Maus auch die Bedeutung der Behandlungsdauer zu untersuchen. Zur Beantwortung der ersten Frage die östrogene Empfindlichkeit betreffend wurden ArKO-Mäuse mit der ihren Wildtyp (WT)-Wurfgeschwister verglichen. Dabei wurden jeweils die östrogendefizienten Tiere, ArKO-Maus und ovariektomierte (ovx) WT-Maus, sowie die unter Östrogeneinfluss stehenden Tiere, E2-supplementierten ArKO-Mäuse und intakte WT-Mäuse miteinander verglichen. Basierend auf den physiologisch, biochemisch und molekularbiologisch erhobenen Daten ist das Fazit der ersten tierexperimentellen Studie: Die ArKO-Maus scheint anders als die ovx WT-Maus kein adäquates experimentelles Modell für reine Östrogenprüfungen zu sein. Sie scheint aber geeignet für molekulare Untersuchungen im Zusammenhang von Östrogendefizienz und MetS zu sein. Zwischen den beiden Mausmodellen ArKO und WT fand sich auf physiologischer und molekularer Ebene eine Vielzahl von Unterschieden. Die ArKO-Mäuse waren signifikant schwerer und auch der Verfettungsgrad war bei den ArKO-Mäusen stärker ausgeprägt als bei den ovx WT-Mäusen. Bei der Regulation Genexpression durch Östrogene zeigte ein Teil der untersuchten Gene sogar ein entgegengesetztes Expressionsmuster. Zur Untersuchung, inwiefern das Lebensalter Einfluss auf physiologische und molekulare Eigenschaften der Östrogenwirkung nimmt, wurden weibliche ArKO-Mäuse aus zwei unterschiedlichen Altersgruppen untersucht. Mit der zweiten tierexperimentellen Studie konnte eine Reihe von Parametern identifiziert werden, die in ihrer östrogenen Regulation eine Abhängigkeit vom Alter aufweisen. So unterscheidet sich die Regulation des Körpergewichts signifikant zwischen beiden Altersgruppen, ebenso wie die des Uterusfeuchtgewichts. Auf molekularer Ebene konnte gezeigt werden, dass diese sich altersabhängig verändert und zum Teil im Vergleich der beiden untersuchten Lebensalter sogar entgegengesetzte Muster der östrogenabhängigen Regulation der Genexpression ausbildeten. Als Resümee der zweiten Studie kann daher festgehalten werden, dass bei den ArKO-Mäusen das Lebensalter der Tiere eine entscheidende Determinante für die Östrogensensitivität ist. Dies scheint insofern wichtig, wenn die Endpunkte auf Ebene von Geweben und Genen betrachtet werden, die besonders dem Alterungsprozess unterliegen bzw. die für gealterte Populationen relevant sind. Bei der HRT wird oft die Verwendung von Phytoöstrogenen als sichere „Alternativtherapie“ propagiert. Um zu überprüfen welche Effekte E2, Raloxifen und pflanzliche Sekundärmetaboliten auf physiologische Parameter und die Regulation der Expression ausgewählter Gene in relevanten Zielgeweben der ArKO-Mäuse haben, wurde eine Tiergruppe für drei Tage und eine andere Tiergruppe für 21 Tage mit Raloxifen, Genistein und 8-Prenylnaringenin behandelt. Raloxifen ist eine in der HRT verwendete synthetisch hergestellte östrogene Substanz, die ein bekannter Selektiver-Östrogenrezeptor-Modulator (SERM) ist. Das Soja-Isoflavonoid Genistein und das im Hopfen vorkommende Flavanon 8-Prenylnaringenin (8-PN) sind dagegen natürlich vorkommende sekundäre Pflanzenmetabolite. In den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass es zu einer Verringerung des Fettgewebes durch alle östrogene Substanzen kam. Für die Regulation der Expression östrogener Zielgene kann zusammenfassend festgestellt werden, dass sich nach einer 21-tägigen Behandlungszeit ein anderes Muster der Regulation der Genexpressionsmuster im Uterus ergab als nach einer dreitägigen Behandlung. Dies bestätigt die Annahme, dass auch die Dauer der Behandlung einen großen Einfluss auf die Genexpression und die dadurch vermittelten Veränderungen der Physiologie und des Stoffwechsels hat. Weiter konnte belegt werden, dass Raloxifen, Genistein und 8-PN auf den Uterus und die beiden Fettgewebe ähnliche Effekte zeigten wie E2. In der Expression der untersuchten Gene konnte dies allerdings nicht so deutlich nachgewiesen werden. Schlussfolgernd kann anhand dieser Studien festgehalten werden, dass die ArKO-Maus kein adäquater Ersatz der ovx WT-Maus zur hormonellen Prüfung östrogener Substanzen ist. Sie scheint aber ein geeignetes, ergänzendes experimentelles Modell für Fragestellungen zu sein, die sich mit Untersuchungen der Zusammenhänge von Östrogendefizienz und MetS beschäftigen. Ebenso zeigten die Daten, dass das Lebensalter zu Beginn des Experiments eine entscheidende Determinante für die Qualität der östrogenen Wirkung ist. Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die verwendeten östrogenen Substanzen keine eindeutigen SERM-Eigenschaften, sondern eher östrogene Wirkeigenschaften in den ArKO-Mäusen aufweisen.

Ziel dieser Doktorarbeit ist eine umfassende Untersuchung der Heterogenität von Mikroglia aus morphologischer, elektrophysiologischer und transkriptioneller Perspektive mit dem Schwerpunkt auf Unterschiede zwischen weißer und grauer Substanz. Im ersten Kapitel diskutiere ich die morphologische Heterogenität von Mikroglia mit dem Fokus auf Satelliten- und Parenchymale-Mikroglia. Wir führten eine eingehende Analyse mehrerer Hirnareale durch und quantifizierten die Anzahl der Satellitenmikroglia, die mit verschiedenen neuronalen Subtypen in Kontakt stehen. Wir fanden heraus, dass die Anzahl der Satellitenmikroglia stark mit der neuronalen Dichte eines bestimmten Bereichs korreliert. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit untersuche ich die transkriptionelle Heterogenität von Mikroglia aus weißer und grauer Substanz, wobei ich die in Gliazellen neu etablierte Patch-seq-Methode anwende. Diese Methode ermöglicht es eine Kombination aus morphologischen, lektrophysiologischen und transkriptionellen Profilen einzelner Zellen zu erhalten, die es erlauben, zelluläre Unterschiede zu charakterisieren. Wir identifizieren einen zellulären Subtyp, wenn wir den Patch-seq-Datensatz mit FACS-basierter Einzelzell-RNA-seq-Datensätzen vergleichen. Dieser Subtyp gehört eindeutig zu dissoziierten Gewebeproben und ist durch die Expression von Stress-assoziierten Genen charakterisiert. Im dritten Kapitel wende ich mich der Frage zu, wie Transkripte mittels SLAM-seq nachverfolgt werden können, die während der Dissoziation des Gewebes entstehen. Das Verfahren ermöglicht es mRNA, die während der Dissoziation der Probe entsteht, metabolisch zu markieren, rechnerisch zu identifizieren und zu entfernen. Indem wir die markierten Transkripte aus dem Mikroglia “entfernen”, beobachten wir, dass ein „aktivierter Mikroglia“-Subtyp zur allgemeinen Mikroglia-Population gehört. / The aim of this doctoral work is to provide a comprehensive study and overview on the topic of the heterogeneity of microglia in the normal adult mouse brain from the morphological, electrophysiological and transcriptional perspective with the focus on differences between white and grey matters. In the first Chapter, I discuss the morphological heterogeneity of microglia in the brain with the focus on two morphologically distinct classes: satellite and parenchymal microglia. We performed an in-depth analysis of multiple brain areas and quantified the number of satellite microglia which is in contact with different neuronal subtypes. We found that satellite microglia numbers are highly correlated with neuronal densities of a certain area, while showing no preferences for any of the neuronal types. In Chapter two of this work, I study transcriptional heterogeneity of microglia from white and grey matters. For this I am employing Patch-seq, which we newly established in glial cells. This method allows a combination of morphological, electrophysiological and transcriptional profiles of single cells to assess their differences. When comparing Patch-seq dataset to the previously published FACS isolated single cell RNA-seq microglia datasets, we find a subtype of cells which uniquely belongs to FACS sample and is characterized by expression of stress-associated genes. This finding points out to the fact of dissociation-related artifacts in the single cell RNA-seq data which are not present in situ. In the third chapter, I identified transcripts which are induced during the dissociation of the tissue by employing the SLAM-seq method. This procedure allows to metabolically label newly transcribed mRNA and computationally remove transcripts from the sample. By removing the labeled transcripts from the dataset of cells isolated from the hippocampus via enzymatic dissociation, we observe that an “activated microglia” subtype merges with the general microglia population.

Serotonin gilt als Hauptangriffsstelle gängiger Antidepressiva bei schweren Depressionen, wie bspw. selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), und -Enhancer (SSRE). Es bleibt offen, ob SSRI / E ausschließlich über die Manipulation des Serotoninspiegels wirken, oder ob alternative Signalwege daran beteiligt sind. Ansatzpunkte hierfür sind beispielsweise die neurotrophen Signalwege (spez. Brain derived neurotophic factor, BDNF) oder die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren- (HPA) – Signalwege des Stressachsensystems. Ebenfalls wurde in Nagetiermodellen beobachtet, dass mit der Dysregulation des zentralen Serotoninsystems bei schweren Depressionen, ein Rückgang der Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus einhergeht. Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel von Serotonin, BDNF, adulter Neurogenese und der Stressachse zu untersuchen. Zentrum der Studien ist ein Mausmodell, mit einer genetischen Depletion des zentralen Serotonin-synthetisierenden Enzyms Tryptophanhydroxylase 2 (sog. Tph2-/- Mäuse). Es wurden die physiologische Reaktionen auf die Behandlung mit gängigen Antidepressiva abhängig von der Abwesenheit von Serotonin untersucht, um mögliche alternative Signalwege aufzeigen zu können. Die bekannte Zunahme der Neurogenese nach SSRI/SSRE-Behandlung wurde in Wildtyptieren beobachtet, während die Therapie in Tph2-/- Mäusen keine direkte kausale Wirkung zeigte. Im Gegensatz dazu waren die BDNF-Spiegel in depressionsrelevanten Hirnregionen in Tph2-/- Mäusen nach SSRI, signifikant verringert. Auch zeigen die Studien eine neurobiologische Relevanz von Serotonin im ZNS, bei den antidepressiven Mechanismen einer Elektrokonvulsiven Krampftherapie. Ebenfalls deuten erhöhte Neurogeneseraten bei lebenslanger Abwesenheit von Serotonin im ZNS, Therapiemethoden-unabhängig, möglicherweise auf eine modulierte Stressreaktion hin. Untersuchungen der Parameter des HPA-Stressachsensystems, wiesen auf einen grundlegend veränderten Stresshormonspiegel in Tph2-/- Mäusen hin. / Serotonin, the "molecule of happiness" is an important target for antidepressants. The mainly prescribed drugs in major depression are selective serotonin re-uptake inhibitors (SSRI); but recently, SSR-enhancer (SSRE) have also attracted clinical attention. However, only a quarter of patients responds to treatment. It needs to be determined, whether SSRI/E act solely via manipulating serotonin levels or whether other pathways are involved, e.g. neurotrophic signaling (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) or the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA)-axis. Furthermore, in major depression, dysregulation of central serotonin signaling is accompanied with a decline in hippocampal neurogenesis, as has been observed in rodent models. At the center of this thesis is a mouse model deficient in the central serotonin-synthesizing enzyme, tryptophan hydroxylase 2 (Tph2-/- mice). I have investigated physiological responses to antidepressant treatment in the absence of brain serotonin, and the possible role of alternative pathways. I observed the typical increase in neurogenesis upon SSRI treatment in WT mice, while it had no effect in Tph2-/- mice. In contrast, BDNF levels were significantly decreased in Tph2-/- mice after treatment with no effect in WT control mice. Furthermore, my results show a critical role of brain serotonin in the neurobiological effects of electroconvulsive seizure. Surprisingly, in animals lacking central serotonin, increased neurogenesis was observed independently of the treatment. The gathered data indicated an altered stress response; therefore, parameters of the HPA-axis have been studied, indicating a downregulated HPA system in Tph2-/-animals in baseline state, but showed no difference in treatment or feedback control. This thesis gives insight into the mechanisms of antidepressant action and reveals ideas for novel pathways involved in the process that could be used as targets in therapeutic approaches and further research in major depression.