A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima do processo oxidativo da via das pentoses fosfato e apresenta diversas aplicações industriais. Foram avaliadas as influências de algumas variáveis sobre a produção de G6PDH. No Processo Descontínuo variaram-se a concentração da fonte de carbono, relação carbono-nitrogênio, concentração de aminoácidos e nucleotídeos , pH e a vazão de ar fornecida. A variação na atividade enzimática indicou que as condições do meio são importantes na obtenção desta enzima, tendo sido obtida atividade específica máxima de 86 U/g cél e produtividade de 10,5 U/L.h. No Processo Descontínuo-Alimentado variaram-se o sistema de adição e os nutrientes alimentados. A atividade específica máxima obtida foi 72 U/g cél e a produtividade foi 47 U/L.h. Os resultados indicaram o controle da concentração de glicose em 5g/L para uma melhor produtividade e a necessidade de maiores estudos a fim de otimizar o processo. / The glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is the first enzyme of the pentose phosphate pathway, converting glucose-6-phosphate into 6-phosphogluconate. Besides its importance in biochemistry and medical studies, this enzyme is used in several analytical methods, industrial and commercial application. In this work the influence of several variables in the production of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase in batch and fed-batch processes were studied. In batch cultures the variables were the glucose concentration (10 and 20 g/L), the C:N ratio (3.5 and 6.7 g/g), the aminoacids and nucleotides concentrations (10 and 20 mg/L), pH (4.6 and 5.7) and the aeration (0, 0.8, 1.7 and 2.2 vvm). It was observed that the G6PDH activity varied according to the conditions of the culture. Specific Activity value of 86 U/g cell and productivity of 10,5 U/L.h were attained when the test was carried out as follows: 30oC, pH 5.7, 400 rpm, 2.2 vvm, C:N ratio of 6.7, glucose concentration of 10 g/L, aminoacids (Tryptophan and Hystidine) and nucleotides (Adenine and Uracil) concentrations of 20 mg/L. Nevertheless, the fed-batch process was more efficient and productive than the batch process. The productivity obtained in the best fed-batch condition (glucose addition by an increasing exponential mode) was 47 U/L.h, more than four folds the productivity of the batch culture. So that, by maintaining the glucose concentration in the medium below 5 g/L, the productivity should be improved. However, more studies are needed for optimizing the G6PDH production in a Fed-Batch process. In the fed-batch cultures the feeding conditions and kind of feeding were studied. It was observed that the best fed-batch G6PDH specific activity (72 U/g of cell when the glucose was added in a decreasing linear mode) was lower than that attained in the batch cultures.

A glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) é a primeira enzima do processo oxidativo da via das pentoses fosfato e apresenta diversas aplicações industriais. Foram avaliadas as influências de algumas variáveis sobre a produção de G6PDH. No Processo Descontínuo variaram-se a concentração da fonte de carbono, relação carbono-nitrogênio, concentração de aminoácidos e nucleotídeos , pH e a vazão de ar fornecida. A variação na atividade enzimática indicou que as condições do meio são importantes na obtenção desta enzima, tendo sido obtida atividade específica máxima de 86 U/g cél e produtividade de 10,5 U/L.h. No Processo Descontínuo-Alimentado variaram-se o sistema de adição e os nutrientes alimentados. A atividade específica máxima obtida foi 72 U/g cél e a produtividade foi 47 U/L.h. Os resultados indicaram o controle da concentração de glicose em 5g/L para uma melhor produtividade e a necessidade de maiores estudos a fim de otimizar o processo. / The glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) is the first enzyme of the pentose phosphate pathway, converting glucose-6-phosphate into 6-phosphogluconate. Besides its importance in biochemistry and medical studies, this enzyme is used in several analytical methods, industrial and commercial application. In this work the influence of several variables in the production of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase in batch and fed-batch processes were studied. In batch cultures the variables were the glucose concentration (10 and 20 g/L), the C:N ratio (3.5 and 6.7 g/g), the aminoacids and nucleotides concentrations (10 and 20 mg/L), pH (4.6 and 5.7) and the aeration (0, 0.8, 1.7 and 2.2 vvm). It was observed that the G6PDH activity varied according to the conditions of the culture. Specific Activity value of 86 U/g cell and productivity of 10,5 U/L.h were attained when the test was carried out as follows: 30oC, pH 5.7, 400 rpm, 2.2 vvm, C:N ratio of 6.7, glucose concentration of 10 g/L, aminoacids (Tryptophan and Hystidine) and nucleotides (Adenine and Uracil) concentrations of 20 mg/L. Nevertheless, the fed-batch process was more efficient and productive than the batch process. The productivity obtained in the best fed-batch condition (glucose addition by an increasing exponential mode) was 47 U/L.h, more than four folds the productivity of the batch culture. So that, by maintaining the glucose concentration in the medium below 5 g/L, the productivity should be improved. However, more studies are needed for optimizing the G6PDH production in a Fed-Batch process. In the fed-batch cultures the feeding conditions and kind of feeding were studied. It was observed that the best fed-batch G6PDH specific activity (72 U/g of cell when the glucose was added in a decreasing linear mode) was lower than that attained in the batch cultures.

As deficiências da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase de cadeia longa (LCHAD) e da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) são defeitos hereditários na oxidação de ácidos graxos. Os pacientes apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa (LCHFA), especialmente os ácidos 3- hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA), no sangue e outros tecidos. A sintomatologia é bastante variada, incluindo cardiomiopatia severa e sintomas musculares como fraqueza, dor e episódios recorrentes de rabdomiólise, assim como hepatopatia, retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, podendo levar a morte ainda na infância. Considerando que os mecanismos patogênicos do dano aos tecidos musculares cardíaco e esquelético apresentados por esses pacientes ainda não estão esclarecidos, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 3HTA e 3HPA sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmetros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado, bem como o potencial de membrana (ΔΨm), o inchamento, a liberação de citocromo c, a capacidade de retenção de Ca2+ e o conteúdo do NAD(P)H em mitocôndrias isoladas de músculo cardíaco e esquelético de ratos jovens. Inicialmente, observamos que o 3HTA e 3HPA em baixas concentrações (10-30 UM) aumentaram o estado 4 e diminuíram o RCR em mitocôndrias de músculo esquelético, indicando um efeito desacoplador. Quando em concentrações mais elevadas (50-100 UM), esses ácidos graxos diminuíram o estado 4, o estado 3 e o estado desacoplado da respiração mitocondrial, característicos de inibidores metabólicos. Ainda observamos que o 3HPA foi capaz de produzir efeitos semelhantes sobre a respiração mitocondrial em fibras musculares permeabilizadas, validando os resultados obtidos em mitocôndrias isoladas. Além disso, demonstramos que o 3HPA e o 3HTA (30 UM) diminuíram marcadamente o ΔΨm, o conteúdo de NAD(P)H, a capacidade de retenção de Ca2+ e a produção de ATP, além de induzirem inchamento, em mitocôndrias obtidas de ambos os tecidos e suplementadas com Ca2+. Esses efeitos foram prevenidos por ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, indicando o envolvimento do PTP e do Ca2+, respectivamente. O fato de termos verificado que o 3HPA aumentou marcadamente a fluidez das membranas mitocondriais em músculo esquelético indica que esse mecanismo pode estar envolvido no prejuízo da homeostase mitocondrial causado por esses compostos. Finalmente, verificamos que o análogo dicarboxílico do 3HTA, o ácido 3-hidroxitetradecanodioico, que também se acumula nos pacientes, não alterou os parâmetros avaliados, indicando uma ação seletiva para os ácidos monocarboxílicos. Analisando nossos resultados em conjunto, demonstramos que os principais LCHFA acumulados nas deficiências da LCHAD e MTP prejudicam a homeostase mitocondrial em músculo cardíaco e esquelético. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a cardiomiopatia severa, os sintomas e alterações musculares que acometem os pacientes afetados. / Long-chain 3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) and mitochondrial trifunctional protein (MTP) deficiencies are inborn errors of fatty acid oxidation. Affected patients present accumulation of long-chain hydroxylated fatty acids (LCHFA), particularly 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids, in blood and other tissues. The symptomatology is varied, including severe cardiomyopathy and muscular symptoms such as weakness, muscle pain and recurrent episodes of rhabdomyolysis, as well as hepatopathy, retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and development delay, leading to premature death. Considering that the pathogenesis of cardiac and skeletal muscle damage presented by the patients are still not established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HTA and 3HPA on important parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and uncoupled respiration, as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P)H redox state in cardiac and skeletal muscle mitochondria isolated from young rats. Initially, we observed that 3HTA and 3HPA at lower concentrations (10-30 UM) increased state 4 and decreased RCR in skeletal muscle mitochondria, indicating an uncoupling effect. At higher concentrations (50-100 UM), these fatty acids decreased state 4, state 3 and uncoupled respiration, suggesting metabolic inhibition. Furthermore, we observed that 3HPA was capable to provoke similar effects on mitochondrial respiration in permeabilized skeletal muscle fibers, validating the results obtained in isolated mitochondria. We also demonstrated that 3HPA and 3HTA (30 UM) strongly decreased the ΔΨm, NAD(P)H content, Ca2+ retention capacity and ATP production, besides inducing swelling, in mitochondria obtained from both tissues and supplemented with Ca2+. These effects were prevented by cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, indicating the involvement of mitochondrial permeability transition and Ca2+, respectively. The fact that 3HPA strongly increased the mitochondrial membrane fluidity in skeletal muscle indicates that this mechanism may be involved in the mitochondrial bioenergetics impairment caused by these compounds. Finally we verified that the 3HTA dicarboxylic analogue, 3-hydroxytetradecanodioic acid, which also accumulates in the affected patients, did not alter the tested parameters, indicating a selective action of the monocarboxylic acids. Taken together, we demonstrated that the major LCHFA accumulated in LCHAD and MTP deficiencies impair mitochondrial homeostasis in cardiac and skeletal muscle. We presume that these mechanisms may explain, at least in part, the severe cardiomyopathy, symptomatology and muscle alterations characteristics of the patients affected by these disorders.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.

As biocélulas a combustível proporcionam meios de se obter energia de maneira mais sustentável, limpa e renovável e apresentam grande potencial para serem usadas como fontes de energia alternativas para dispositivos eletrônicos de baixa demanda energética. Esta dissertação investiga a bioeletro-oxidação de etanol pela enzima Álcool Desidrogenase (ADH) empregando-se bioânodos com polimerização simultânea do mediador (poli - verde de metileno) e polímero condutor (polipirrol). Uma vez preparado o bioânodo foram realizados estudos para verificar a oxidação do cofator (NADH), formação do produto da bio-oxidação de etanol, estabilidade e também estudos visando aumentar a eficiência energética gerada empregando nanotubos de carbono para aumento de área eletroquímicamente ativa e melhor comunicação com os sítios ativos das enzimas. Foi também preparada uma biocélula completa sem membrana polimérica visando diminuir resistência de transferência de prótons do sistema, com a configuração final constituída de ADH/NAD+, etanol, Lacase/O2 com e sem MWCNT. O bioânodo se mostrou relativamente estável, apresentando um decaimento médio de 36% do valor inicial da densidade de potência após 20 semanas de estocagem. Quando operado em condição contínua (tempo = 4h, E (V)= ½ PCA), o decaimento foi de 39% e de 66% em 12 horas de operação. Os valores de densidade de potência foram melhorados com a adição de MWCNTs sobre o suporte de C antes da eletropolimerização do filme simultâneo, em pH 8,9, obteve-se 275 + 12 ?W cm-2. A eletrólise para este sistema mostrou a formação de acetaldeído com conversão de 18% de etanol. Para a biocélula completa, os melhores resultados foram com a presença de MWCNTs no bioânodo, obtendo-se uma potência de 12,5 +0,9 ?W cm-2. Os resultados obtidos são bastante promissores comparado com a literatura atual e mostram que esse sistema pode ser empregado para construção de BFC. / Biofuel cells provide the means to obtain energy in a more sustainable, clean, and renewable way and have great potential as alternative energy sources for low-energy electronic devices. This dissertation investigates ethanol bioelectrooxidation by the enzyme Alcohol Dehydrogenase (ADH) at bioanodes with simultaneous polymerization of the mediator (polymethylene green) and conductive polymer (polypyrrole). After preparing the bioanode, we investigated cofactor (NADH) oxidation, the ethanol biooxidation product,and bioanode stability. We also conducted studies to increase the generated energy efficiency by using carbon nanotubes to augment the electrochemically active area and to improve communication with the enzyme active sites. We also prepared a complete biofuel cell without polymer membrane to decrease the system proton transfer resistance: the final configuration consisted of ADH / NAD +, ethanol, Laccase , and O2 with or without MWCNTs. The bioanode was relatively stable. The mean decay was 36% of the initial power density after 20 weeks of storage. When the bioanode was operated in continuous condition (time = 4h, E (V) = ½ PCA), the decay was 39% and 66% in 12 hours of operation. The power density values increased upon addition of MWCNTs to the C-support before simultaneous film electropolymerization at pH 8.9, to give 275 + 12 ?W cm-2. Under electrolysis conditions, this system produced acetaldehyde and converted 18% of ethanol. For the complete biofuel cell, the best results were with the presence of MWCNTs in the bioanode, which provided a power of 12.5 +0.9 ?W cm-2. The results obtained here are quite promising if compared to the current literature and show that this system can be used to construct a BFC.

A produção de biocombustíveis e a obtenção de alguns compostos químicos a partir de materiais renováveis, como a biomassa lignocelulósica, ainda não são processos triviais, principalmente devido a recalcitrância destes materiais. Estudos recentes reconheceram as enzimas acessórias, como xilanases e enzimas com Atividade Auxiliar, como potencializadores da atividade de celulases no processo de despolimerização da lignocelulose. A prospecção de enzimas com características termoestáveis é vantajosa para este tipo de aplicação e além disso, estudos sobre o secretoma de diversos fungos cultivados em biomassa como fonte de carbono, tem encontrado enzimas com mecanismo oxidativo, dentre eles, o fungo termofílico Myceliophthora thermophila M77. Porém, estas enzimas tem sido pouco estudadas quanto a sua aplicação na sacarificação da biomassa. Sendo assim, este trabalho visou a expressão heteróloga, a caracterização bioquímica e a ação da enzima oxidativa celobiose desidrogenase do fungo M. thermophila (M77CDH) em conjunto com outras celulases no processo de sacarificação da biomassa. Pela análise filogenética a M77CDH prospectada foi classificada como pertencente a Classe IIB das CDHs. O gene que codifica esta enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterólogamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante M77CDH foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas análises bioquímicas, apresentou atividade ótima a 65 °C e reteve mais de 80% da sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular apresentou um desenovelamento da sua estrutura na temperatura de transição de 62,8 °C. Apresentou mais de 80% de atividade em uma faixa ampla de pH (4,5 - 9), em que o domínio citocromo mostrou maior afinidade em pHs alcalinos, característica incomum entre as CDHs descritas na literatura. A atividade da M77CDH foi ligeiramente aumentada pela adição de MgCl2 e Na2MoO4 e altamente afetada por CuSO4 e FeCl3. A eficiência catalítica (kcat/km=266 mM-1s-1) utilizando celobiose foi bastante similar aos valores indicados por CDHs da Classe IIA. O envelope da M77CDH gerado por SAXS foi satisfatório e conveniente com a literatura. Na sacarificação de bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, utilizando coquetel de A. niveus suplementado com M77CDH, foi possível observar que a adição de M77CDH modificou o perfil de produtos liberados na desconstrução da biomassa. Por fim, na sacarificação do PASC observou-se a sacarificação e produção de ácido celobiônico. / The production of biofuels and chemicals from renewable materials such as lignocellulosic biomass are non-trivial processes mainly due to the recalcitrance of the material. Recent studies have recognized accessory enzymes such as xylanases and Auxiliary Activity enzymes as potentiators in cellulase activity during the depolymerization of lignocellulose. The prospection of thermostable enzymes can be an advantage the improve the depolymerization of these materials. In addition, several enzymes showing oxidative mode of action were found in the secretoma of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila strain M77. However, these enzymes are poor studied regarding their application in biomass saccharification. Therefore, this project aimed the heterologous expression and biochemical characterization of the oxidative enzyme cellobiose dehydrogenase of the fungus M. thermophila (M77CDH). By phylogenetic analysis the M77CDH was classified as belonging to Class IIB of CDHs. The gene encoding this enzyme was cloned and heterologously expressed in A. nidulans, the M77CDH was purified and had its identity confirmed by mass spectrometry. In the biochemical analyzes the M77CDH showed an optimum activity at 65 °C and retained more than 80% of its activity at 50 °C for 2 hours. The circular dichroism analysis showed a denaturation of its structure at the transition temperature of 62.8 ° C. M77CDH also kept more than 80% of its activity in a wide pH range (4.5 - 9), in which the cytochrome domain showed higher affinity at alkaline pH, an unusual behavior compared with other CDHs described in the literature. The activity of M77CDH was increased slightly in the presence of MgCl2 and Na2MoO4 and was highly affected by CuSO4 and FeCl3. The catalytic efficiency (kcat/km = 266 mM-1s-1) in cellobiose was quite similar to the values indicated by CDHs from Class IIA. The envelope of M77CDH generated by SAXS was satisfactory and convenient with the literature. In saccharification of sugarcane bagasse hydrothermally pretreated using A. niveus cocktail supplemented with M77CDH was possible to observe the addition of M77CDH modified the profile of released products in the deconstruction of the biomass. Finally, in the action on PASC was observed the saccharification and production of cellobionic acid.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-18Bitstream added on 2014-06-13T18:50:48Z : No. of bitstreams: 1 silva_vc_me_arafcf.pdf: 335369 bytes, checksum: 08eedc270c2e51ba9d6a9688bf400044 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gene GPD2 de Saccharomyces cerevisiae, que codifica a enzima glicerol-3- fosfato desidrogenase (G3PDH; EC 1.1.1.8; NAD+: oxidoredutase) foi clonado na levedura Pichia pastoris para expressar extracelularmente a enzima em meio de cultura. Essa enzima apresenta aplicação prática em diversos sistemas acoplados para determinação quantitativa de triacilglicerol, glicerol, ácido fosfatídico e outros fosfolipidios também podendo ser usada para medir atividades enzimáticas em diversos tipos de amostras. Para que a atividade extracelular fosse suficiente em ensaios industriais e biológicos, um estudo de indução da expressão da enzima foi realizado no presente trabalho, que consistiu em escolher o clone que melhor secreta a enzima e estudar o meio de crescimento (BMGY), a densidade inicial celular (0,05 mg/mL), o meio de indução enzimática (BMMY), a natureza do tampão (tampão fosfato), o pH (6,0), o tempo de produção da proteína (4 dias), a concentração da enzima através de membrana filtrante (120 vezes), a melhor fonte de peptona (Acumédia), o estudo de pré-indução celular por estresse osmótico (atividade de 0,477 ± 0,0 U/mL em 24 horas com NaCl 0,35M). O processo de produção da G3PDH mostrou que a máxima produtividade enzimática (795 U/mL e atividade específica de 44,49 U/mg) e biomassa final de 17,75 mg/mL foi obtida com as seguintes condições experimentais: 48 horas de indução com meio BMMY, utilizando 1% de metanol, 1% de glicerol, densidade inicial celular de 0,05 mg/mL, pH 5,0 e sobrenadante concentrado 120 vezes em membrana filtrante. / The GPD2 gene from Saccharomyces cerevisiae, which encodes the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH, EC 1.1.1.8, NAD +: oxidoredutase) was cloned in the yeast Pichia pastoris to express the enzyme extracellularly in the culture medium. The enzyme G3PDH has practical application in various systems coupled to quantitative determination of triacylglycerol, glycerol, phosphatidic acid and other phospholipids. It can also be used to measure the enzymatic activities in diverse types of samples. For the application of the enzyme extracellular in industrial and biological tests, a study of induction of expression of the enzyme was accomplished in the present work, that consisted of to choose of clone that more expressing the enzyme, the growth medium (BMGY), the cellular initial density (0.05 mg/mL), the medium of enzymatic induction (BMMY), the buffer nature (phosphate potassium), pH (6.0), the time of production of the protein (4 days), the concentration of the protein (120-fold), the peptone source (Acumédia), the study of pre-induction cellular for osmotic stress (activity of 0.477 ± 0.0 U/mL in 24 hours with NaCl 0.35M). The study of the variable determinative in the process of production of the G3PDH it showed that the maximum enzymatic productivity (0.795 U/mL and 44.49 U/mg of specific activity) and final biomass of 17.75 mg/mL was obtained with the following experimental conditions: 48 hours of induction with medium BMMY, using 1% methanol, 1% glycerol, cellular initial density of 0.05mg/mL, pH 5.0 and the supernatant concentrated 120-fold in filter menbrane.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ebselen is a seleno compound whose antioxidant properties have been attributed to its thiol-peroxidase and thioredoxin-like activity: it decomposes peroxides at the expense of reduced thiols. However, the excessive oxidation of thiols can be potentially toxic when it is not associated with peroxides degradation. Thus, this work investigated if LDH can be a possible in vitro target to toxicity of ebselen in comparison with diphenyl diselenide and diphenyl ditelluride, two antioxidant organochalcogens that can easily interact with thiol in exchange reaction. LDH inhibition was tested in homogenates from rat liver and heart, and in purified LDH from rabbit muscle. Ebselen was the most potent inhibitor of LDH. A maximal inhibitory effect was obtained at 2 μM to LDH purified and at 20 μM to LDH from heart and liver homogenates. Moreover, diphenyl diselenide followed by diphenyl ditelluride also presented a significant inhibitory effect on LDH activity. In addition, we observe that DTT was able to revert the inhibition of LDH induced by all compounds tested, confirming the involvement of essential thiol groups on LDH inhibition by organocalchogens. In conclusion, our results show that liver and heart LDH may be a possible target for toxicity of organochalcogens at relative low concentrations. However, the protection afforded by substrates may hide this potential molecular target of organochalcogenides. Our results also indicate that the use of LDH as a marker of cell viability may be biased by a direct inhibitory effect of ebselen or other chalcogenides on LDH, resulting in false protection in in vitro system. / O Ebselen é um composto de selênio o qual tem suas propriedades antioxidantes atribuídas à sua atividade mimética da tiorredoxina e tiolperoxidase: ele decompõe peróxidos à custa de tióis reduzidos. Contudo, a oxidação excessiva de tióis pode ser potencialmente tóxica quando não esta associada com a degradação de peróxidos. Assim, este trabalho investiga se a LDH pode ser um possível alvo à toxicidade do ebselen, em comparação com o disseleneto de difenila e o ditelureto de difenila, dois organocalcogênios antioxidantes que podem facilmente interagir com grupos tiol. A inibição da LDH foi testada em homogeneizados de fígado e coração de ratos, e em LDH purificada de músculo de coelhos. O Ebselen foi o mais potente inibidor da LDH. O seu efeito inibitório máximo foi obtido com 2 μM para a LDH purificada e 20 μM para a LDH de homogeneizados de fígado e coração de ratos. Além disso, o disseleneto de difenila, seguido do ditelureto de difenila, também apresentaram efeito inibitório significativo sobre a atividade da LDH. Em adição, observou-se que o DTT foi capaz de reverter a inibição da LDH induzida pelos compostos testados, confirmando o envolvimento de grupos tiol essenciais da LDH no processo de inibição pelos organocalcogênios. Em conclusão, estes resultados mostram que a LDH de fígado e coração pode ser um possível alvo para a toxicologia de organocalcogênios a doses relativamente baixas. Nossos resultados também indicam que o uso da LDH como um marcador de viabilidade celular pode ser mascarada por um efeito inibitório direto do ebselen, ou outros calcogênios, sobre a LDH, resultando em uma falsa proteção em um sistema in vitro.

A diabetes é um distúrbio endócrino do metabolismo dos carboidratos clinicamente caracterizado por hiperglicemia, resultante da incapacidade do organismo em secretar insulina, defeitos na sua ação ou ambos. Recentemente, as conseqüências neurológicas da diabetes no sistema nervoso central têm recebido maior atenção, entretanto os mecanismos pelos quais a hiperglicemia é capaz de danificar o tecido nervoso ainda permanecem pouco esclarecidos. Estudos recentes têm demonstrado que a hiperglicemia é capaz de induzir dano oxidativo em cérebro de ratos. Portanto, o presente trabalho objetivou produzir um modelo de hiperglicemia neonatal em ratos e investigar o papel do estresse oxidativo (EO) na neurotoxicidade da hiperglicemia neonatal. Para a indução do modelo de hiperglicemia neonatal foram utilizados ratos Wistar de 5 dias de vida que foram submetidos a administração intraperitoneal de 100 mg/Kg de peso corporal de estreptozotocina (STZ), sendo que 5 dias após a administração de STZ os animais foram sacrificados e a média glicêmica do grupo diabético (222 mg/dL) durante todo tratamento é 82% maior do que a média do grupo controle (121 mg/dL). Os efeitos da hiperglicemia neonatal induzida por STZ foram estudados sobre os seguintes parâmetros de EO em cérebro de ratos: as atividades das enzimas glicose-6-fosfatodesidrogenase (G6PD), 6-fosfogluconato-desidrogenase (6PGD) e NADPH oxidase (Nox); o conteúdo de ânion superóxido (O2 -); as atividades das principais enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSHPx) e as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ratos submetidos ao modelo de hiperglicemia neonatal apresentaram alto conteúdo de O2•- através da ativação da NADPH oxidase, possivelmente esta ativação dependa do NADPH derivado das enzimas G6PD e 6PGD. Além disso, o aumento dos níveis de O2 - pode ter promovido um efeito rebote de aumento das atividades das principais enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GSHPx) e ter induzido a lipoperoxidação em cérebro de ratos. Portanto, esses resultados sugerem que o EO pode representar um mecanismo envolvido nos efeitos da hiperglicemia no sistema nervoso central de ratos neonatos. No entanto, outros estudos parecem ser necessários a fim de melhor caracterizar o papel das espécies reativas na neurotoxicidade da hiperglicemia neonatal. / Diabetes is an endocrine disorder of carbohydrate metabolism characterized by hyperglycemia and is the result of body’s inability to secret insulin or a defect of insulin action or both. The neurological consequences of diabetes on the central nervous system have most recently been received greater attention, but the mechanisms by which hyperglycemia can cause brain damage remain poorly understood. Recent studies have shown that hyperglycemia induces oxidative damage in rat brain. Therefore, this study aimed to produce a model neonatal hyperglycemia and investigate the role of oxidative stress (OS) in the neurotoxicity of neonatal hyperglycemia. The neonatal hyperglycemia was induced by one intraperitoneal administration of 100 mg/ kg body weight of streptozotocin (STZ), 5 days after the STZ administration, the animals were killed and the glucose diabetic group mean (222 mg/dL) during all treatment was 82% higher than the control group mean (121 mg/dL). So, the effects of streptozotocin-induced neonatal hyperglycemia were studied on the following oxidative stress parameters from rat brain: the activities of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) and NADPH oxidase (Nox), the content of superoxide anion (O2•-), the activities of the main antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSHPx), and thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS). Rats subjected to a model of neonatal hyperglycemia presented high content of O2•- through activation of NADPH oxidase and it is possible that this activation was dependent of G6PD- and 6PGD-derived NADPH. Also, increased levels on O2•- may have promoted a rebout effect, through to enhanced antioxidant enzymes activities (SOD, CAT and GSHPx) and led to lipid peroxidation in the brain. So, these results suggest that OS could represent a mechanism to understand the harmful effect of hyperglycemia on the central nervous system. However, further studies appear to be worthwhile in order to better characterize the role of reactive species in the neurotoxicity of neonatal hiperglycemia.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T14:44:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Antiquitina é uma família de proteínas altamente conservada na evolução que pertence à superfamília de aldeído desidrogenase (ALDH), mas cuja função biológica é desconhecida. Baseado em homologia estrutural e analogia do padrão de expressão, foi isolado um gene da soja, homólogo a antiquitina de humanos, designado GmTP-55, que codifica uma proteína de 55,562 kDa, apresentando um domínio conservado de desidrogenases. A proteína TP-55 apresenta 82% de identidade de seqüência com a proteína 26g de ervilha, induzida por déficit hídrico, e 60% de homologia com a proteína antiquitina de humanos, pertencentes a família ADLH7A1 (conhecida como antiquitina) da superfamília de ALDH. O acúmulo da proteína TP-55 em plantas de soja foi observado na raiz e predominantemente no caule, sob condições de déficit hídrico e estresse salino. Com a finalidade de examinar a função do homólogo da antiquitina in vivo, plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum) e Arabidopsis thaliana expressando constitutivamente o cDNA GmTP-55 foram obtidas e submetidas a diversas condições de estresses abióticos. Enquanto que, em arabidopsis, a expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR, em Arabidopsis, a expressão da proteína quimérica TP-55-GFP foi avaliada por microscopia de fluorescência, demonstrando seu acúmulo predominantemente no núcleo e no citoplasma. A expressão ectópica do gene viiGmTP-55 tanto em arabidopsis quanto em tabaco conferiu as plantas transgênicas tolerância a estresse salino durante a germinação e a déficit hídrico durante o desenvolvimento. A eficiência de germinação das sementes transgênicas em concentrações crescentes de NaCl foi muito superior do que a dos controles não transformados. Assim também, em condições de seca progressiva, as plantas transgênicas de tabaco mantiveram a turgidez foliar em altos níveis, contrastando com o aparecimento de murcha foliar das plantas controle. As plantas transgênicas também exibiram uma maior tolerância a estresses oxidativos, que foram induzidos por meio de tratamento com H 2 O 2 e paraquat. Tanto as sementes de arabidopsis quanto as de tabaco expressando GmTP-55 germinaram eficientemente em meio contendo 15 μM de H 2 O 2 , enquanto a germinação das sementes controle foi drasticamente reduzida nas mesmas condições. Similarmente, os discos foliares de tabacos transgênicos tratados com paraquat apresentaram uma redução significativa de lesões necróticas quanto comparadas com as plantas controle. Considerando que o denominador comum resultante dos estresses salino, hídrico e oxidativo seria a produção de ROS e aldeídos tóxicos derivados, estes resultados sugerem que o gene TP-55, homólogo da antiquitina, esteja envolvido em respostas celulares adaptativas relacionadas com detoxificação de aldeídos. / Antiquitin is an evolutionarily conserved protein family of unknown function that belongs to the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. Based on structural homology and expression pattern analogy, we have isolated an antiquitin homolog gene from soybean, designated GmTP-55 that encodes a dehydrogenase motif- containing 55.562 kDa protein. The predicted encoded protein, TP-55, shares 82% sequence identity with the water-stress induced 26g protein from peas and 60% homology with human antiquitin that belongs to the ADLH7A1 (known as antiquitin) family of the ALDH superfamily. Accumulation of TP-55 in soybean was detected in roots and mostly in stems under water deficit and salt stress. To examine the role of antiquitin in vivo, we have obtained transgenics tobacco (Nicotiana tabacum) and Arabidopsis thaliana plants constitutively expressing GmTP-55 and analyzed their response to a variety of abiotic stress conditions. While in tobacco the transgene expression was confirmed by RT-PCR, in Arabidopsis, the expression of the TP-55-GFP chimerical protein was evaluated by fluorescence microscopy that demonstrated its major accumulation in the nucleus and cytoplasm. Ectopic expression of GmTP-55 in both Arabidopsis and tobacco conferred tolerance to salinity during germination and to water stress during plant growth. Under increasing salt concentration the germination efficiency of transgenic seeds were much greater than that of untransformed seeds. ixLikewise, under progressive drought, the transgenic tobacco kept the shoot turgidity to a normal level, which was in contrast to the leaf wilt phenotype of control plants. The transgenic plants also exhibited an enhanced tolerance to oxidative stresses that were induced by H 2 O 2 and paraquat treatments. Both Arabidopsis and tobacco seeds expressing GmTP-55 germinated efficiently in medium supplemented with H 2 O 2 15 μM, whereas the germination of control seeds was drastically reduced under the same condition. Likewise, transgenic tobacco leaf discs treated with paraquat presented a significant reduction in the necrotic lesions as compared to the control leaves. Since the common denominator resulting from salinity, dehydration and oxidative stress is the production of ROS and derived toxic aldehydes, our results suggested that the antiquitin homolog gene might be involved in adaptive responses related to aldehyde detoxification.