La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant le messager acide phosphatidique. La capacité de la PLD à influer sur la voie de signalisation de mTOR, acteur central dans le contrôle du tissu musculaire, nous a incités à étudier son rôle dans ce tissu. Mes travaux de thèse ont pour but d'étudier les mécanismes par lesquels la PLD intervient dans la différenciation myogénique et dans la régulation de la masse musculaire. Dans un premier temps, nous avons montré que le contrôle de la différenciation des myoblastes L6 par la PLD met en jeu l'activation des deux complexes de mTOR (mTORC1 et mTORC2). mTORC2 active la différenciation, probablement via son effecteur PKCalpha, alors que mTORC1 la réprime via son effecteur S6K1, en induisant la phosphorylation de rictor, un composant de mTORC2, et l'inhibition de ce complexe. Nous avons par ailleurs montré que l'extinction de PLD par interférence de I'ARN induit l'atrophie de myotubes L6 en culture, ainsi qu'une baisse de la phosphorylation de S6K1 et 4E-BP1, effecteurs de mTORC1. Inversement, la surexpression de PLD à l'aide de vecteurs adénoviraux induit une hypertrophie des myotubes, associée à une activation de la voie mTORC1, et de Akt, effecteur de mTORC2. De plus, la surexpression de PLD atténue l'atrophie induite par la dexaméthasone. Ces résultats mettent en évidence un rôle hypertrophique et anti-atrophique de la PLD, qui pourrait s'exercer par stimulation de la voie mTOR. Nos résultats suggèrent que la PLD est susceptible de jouer un rôle clé dans le muscle squelettique, en agissant tant au niveau de la régénération du tissu qu'au niveau de la régulation de sa masse. / Phospholipase D (PLD) hydrolyzes phosphatidylcholine of cell membranes, releasing the lipid messenger phosphatidic acid. The ability of PLD to affect mTOR signaling pathway, a central actor in the control of muscle tissue, prompted us to study its role in this tissue. My thesis aims at investigating how PLD is involved in myogenic differentiation, and how it regulates muscle mass. We first showed that the mechanism by which PLD controls differentiation of L6 myoblasts involves the activation of the two mTOR complexes (mTORC1 and mTORC2). mTORC2 activates differentiation, probably via its effector PKCalpha, whereas mTORC1 represses differentiation via its effector S6K1, by inducing the phosphorylation of Rictor, a component of mTORC2, and the inhibition of this complex. Besides, we showed that extinction of PLD by RNA interference induces the atrophy of L6 myotubes, and decreases the phosphorylation of the mTORC1 effectors S6K1 and 4E-BP1. Conversely, overexpression of PLD using adenoviral vectors induces the hypertrophy of myotubes and the activation of both mTORC1 pathway and the mTORC2 effector Akt. Furthermore, PLD overexpression attenuates atrophy induced by dexamethasone. These results highlight a hypertrophic and anti-atrophic role of PLD, which could be achieved through stimulation of the mTOR pathway. Our results suggest that PLD is likely to play a key role in skeletal muscle homeostasis, by acting at both the tissue regeneration and mass regulation levels.

Determinants of Regional Differentiation of Mortality in the Czech Republic Abstract There are considerable differences in socioeconomic and sociodemographic factors influencing mortality on the individual and also on the aggregate levels. These differences were observed and explained in many countries of the world. The objective of this thesis is to find and evaluate the most significant external factors which influence actual regional differentiation of mortality in districts of the Czech Republic. The objective was achieved by means of the demographic and statistical analysis methods. First, there was a comparison of mortality rates calculated for each of the socioeconomic clusters. It was found out that higher mortality rates appeared among men and women living in the districts with unfavourable external conditions. Using the Poisson log-linear model, the most important factors influencing differences in mortality rates in districts of the Czech Republic were identified. These factors are: share of the unemployed, share of the divorced, share of university-educated people and the number of physicans in hospitals per 1000 inhabitants. Share of the unemployed seems to be the most significant factor. There is a correlation between this factor and the total mortality rate as well as the leading causes of...

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Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies acquises touchant la cellule souche hématopoïétique et qui aboutissent à une hyperproduction de cellules sanguines dont le phénotype dépend du type du NMP. La mutation la plus proéminente des NMP est JAK2V617F. Elle peut être associée à différents NMP sporadiques et familiaux.Une des problématiques, non résolue, des NMP est de comprendre comment une même mutation JAK2V617F peut donner plusieurs maladies. Notre hypothèse est que le phénotype observé pourrait dépendre du nombre de copies de JAK2V617F. Une autre inconnue concerne la cause génétique des formes familiales.Pour ces raisons, nous avons modélisé des NMP sporadiques et un cas familial par les iPS. Cette approche devrait nous permettre d’une part, de comparer les effets de JAK2V617F à l’état hétérozygote et homozygote sur l’hématopoïèse et d’autre part, d’avancer dans la compréhension des effets d’une duplication de 5 gènes que nous avons identifiée, par une approche de génétique, comme un facteur de susceptibilité chez 2 familles.Dans la première partie du travail, concernant la modélisation des NMP sporadiques, nous avons montré que JAK2V617F augmente la prolifération des cellules myéloïdes obtenues à partir des iPS. D’autre part, nous avons pu mettre en évidence une différence marquée dans l’hypersensibilité à la TPO et à l’EPO entre les lignées hétérozygotes et homozygotes pour JAK2V617F permettant d’expliquer le phénotype des PV et des TE. Dans la deuxième partie concernant les NMP familiaux, nous avons pu mettre en évidence un phénotype spécifique attribuable à la seule duplication. Grace à ce modèle, nous allons pouvoir identifier le(s) gène(s) responsable(s) du phénotype. Ce travail apporte la preuve de concept que les iPS sont un bon outil pour modéliser les NMP sporadiques et familiaux et qu’elles peuvent servir comme outils de criblage de petites molécules développées à des fins thérapeutiques. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal hematologic diseases which lead to an overproduction of blood cells. The affected myeloid lineage depends on the type of MPN. JAK2V617F is the most predominant mutation in MPN and can be associated with various sporadic and familial cases.One main issue to address in MPN is to understand how a single mutation JAK2V617F can give rise to several diseases. Our hypothesis is that this phenotypic heterogeneity might be due to the JAK2V617F gene dosage. Another goal is to identify the genetic cause of familial MPN.For these reasons, we modeled sporadic and familial MPN cases with iPS technology. This approach allowed us i) to compare the impact of heterozygous and homozygous JAK2V617F mutation on hematopoiesis and ii) to get insight into the effects of a 5 genes duplication that we identified as a susceptibility locus uncovered by a genetic approach in 2 families.In the first part of the work concerning sporadic MPN modeling, we showed that JAK2V617F increases iPS myeloid potential. Furthermore, we showed a marked difference in the TPO and EPO hypersensitivity between heterozygous and homozygous JAK2V617F iPS cell lines that could be linked to the difference between PV and ET. In the second part of the work, we demonstrated a specific phenotype due to the sole duplication. This model will allow us to identify the gene(s) responsible of the phenotype. This study brings the proof of concept that iPS can be used for sporadic and familial MPN modeling and drug screening.

La phénologie du débourrement est un caractère adaptatif majeur, sensible aux variations de température. Prédire l'évolution des forêts naturelles tempérées sous l'influence de changements environnementaux nécessite de pouvoir expliquer l'origine des patrons de différentiation clinaux observés pour ce caractère à l'échelle de paysages. Il a été démontré expérimentalement que le débourrement végétatif se produisait en même temps que la floraison. Cela suggère que les croisements se font préférentiellement entre arbres présentant des phénologies du débourrement similaires ; c'est ce que l'on appelle l'homogamie. Alors que la plupart des interprétations de clines de différenciation génétique soulignent l'influence de la sélection divergente, les spécificités de la phénologie du débourrement et ses conséquences sur le système de reproduction sont rarement considérées. A travers une approche par modélisation nous montrons ici dans un premier temps que la seule interaction entre homogamie et flux de pollen peut générer une différentiation génétique clinale à l'échelle d'un paysage sans aucune pression de sélection. Dans un tel contexte théorique, le filtragedes flux de pollen réalisé par l'homogamie en présence d'un gradient environnemental différencie progressivement et durablement les populations. Dans un second temps, nous montrons que l'homogamie amplifie la réponse adaptative des populations à la sélection co-gradient alors qu'il la contraint dans le cas de sélection contre-gradient. Nous montrons par ailleurs que l'homogamie peut induire une différentiation clinale en cas de sélection uniforme. / Timing of bud burst (TBB) is a key adaptive trait affected by temperature variations. Predicting the evolution of natural forests undergoing environmental variations requires to understand the evolutionary dynamics that have resulted in the strong patterns of differentiation characterized for this trait. It has been shown experimentally that the TBB was strongly correlated with the timing off lowering. This suggests that trees having similar TBB tend to mate preferentially, making assortative mating at TBB the default reproduction regime within tree species. Clinal patterns of genetic differentiation have been mostly interpreted as resulting from divergent selection, however, few studies have considered the peculiar features of timing of bud burst. Through a modelling approach based on quantitative genetics models, we first demonstrate here that the sole interaction between assortative mating at TBB and pollen flow can induce a clinal differentiation among populations without any selection pressure. In a such theoretical context, assortative mating filters pollen flow in presence of environmental gradients and progressively shifts the genetic values of populations. Then, we demonstrate that assortative mating amplifies the adaptive response of populations to co-gradient selection, and constrains it in the case of countergradient selection. Finally, we show that assortative mating differentiates populations even in the case of uniform selection.

A la suite d’un criblage pangénomique, nous avons montré que l’inhibition d’un miARN de la famille let-7, miR-98, entraîne une forte accélération de la différenciation musculaire avec hypertrophie des myotubes. Lors de ma thèse, j’ai cherché à comprendre comment miR-98 retarde la différenciation du muscle strié squelettique. Des analyses transcriptomiques dans des myoblastes où ce miARN a été inhibé ont montré la perturbation de l’expression d’environ 240 gènes. Parmi eux, j’ai montré que le répresseur transcriptionnel E2F5 est important pour la régulation de la différenciation musculaire via miR-98, et est directement ciblé par ce miARN. L’inhibition de E2F5 permet de rétablir un niveau de différenciation normal malgré l’inhibition de miR-98. E2F5 est un régulateur important du cycle cellulaire. Sa fonction dans le muscle n’avait pas encore été explorée. Mes résultats montrent que E2F5 accélère le processus de différenciation musculaire. J’ai ensuite montré que E2F5 peut réguler directement des gènes répresseurs de la différenciation musculaire, comme ID1 et HMOX1, et indirectement des répresseurs de la voie TGF-β, expliquant son action sur la différenciation. Au final, miR-98 régule la différenciation du muscle strié squelettique en agissant directement sur l’expression de E2F5, et indirectement sur ses multiples cibles. Mes résultats ont ainsi mis en évidence une nouvelle voie de régulation de la différenciation musculaire : la voie let-7 – E2F5. / A genome-wide screen had previously shown that knocking-down miR-98, a miRNA of let-7 family, leads to a dramatic increase of terminal myogenic differentiation, with myotube hypertrophy. My PhD project aimed to understand how miR-98 delays skeletal muscle differentiation. Transcriptomic analysis of human myoblasts with knocked-down miR-98 revealed that approximately 240 genes were sensitive to miR-98 depletion. Among these potential targets, I have identified the transcriptional repressor E2F5, which turned out to be important for miR-98 regulation of muscle differentiation. Knocking down E2F5 and miR-98 simultaneously had almost fully restored normal differentiation. I have subsequently shown that E2F5, an important cell cycle regulator, is a direct target of miR-98 in muscle, where its function had never been investigated before. My results show that E2F5 is a positive regulator of the muscle differentiation process. E2F5 can directly repress inhibitors of muscle differentiation, such as ID1 and HMOX1, and indirectly regulate TGF-β pathway family members. In conclusion, miR-98 regulates skeletal muscle differentiation by directly regulating E2F5 expression, and thus controlling the expression of multiple E2F5 targets. My results have highlighted a new regulatory pathway of muscle differentiation: the let-7 – E2F5 pathway.

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Within the lymphocyte lineage, GATA-3 is a major transcription factor implicated in the regulation of Th1/Th2 differentiation by promoting the expression of the Th2 cytokines, such as IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13. Although the role of GATA-3 in the development of the Th2 lineage has been extensively described in the literature, the molecular mechanisms underlying its activity remain to be clarified. Here, we investigated whether GATA-3 might be regulated by reversible acetylation. In vivo, GATA-3 associates with class I and III HDACs. Biochemical studies unraveled the specific association of GATA-3 with the class III member SIRT1. Association with SIRT1 leads to the inhibition of GATA-3-induced IL-5 transcription. Using siRNA, we further show that SIRT1 promotes destabilization of GATA-3. Interestingly, nicotinamide, a specific inhibitor of SIRTs had no effect on the ability of SIRT1 to destabilize GATA-3 and to repress its transcriptional activity. In addition, a catalytic-defective mutant of SIRT1 (H363Y) shows similar effects to wild-type SIRT1, demonstrating that the deacetylase activity of SIRT1 is not required for its regulation of GATA-3. For the first time, our study indicates that SIRT1 is functionally linked to GATA-3. Moreover, our results also suggest that some important SIRT1 functions may not require its deacetylase activity.

Les hormones sécrétées par les cellules endocrines pancréatiques et intestinales participent à la régulation de l’homéostasie énergétique. Leur différenciation repose sur des programmes génétiques similaires contrôlés par le facteur de transcription Ngn3. Peu de choses sont connues sur les gènes activés par Ngn3 et leurs implications dans les mécanismes contrôlant la spécification et la maturation des cellules endocrines. Par conséquent, le transcriptome des progéniteurs endocrines a été déterminé dans l’équipe. Parmi les gènes fortement enrichis dans le lignage endocrine, j’ai caractérisé l’expression et la fonction de la kinase Pak3 et j’ai continué l’étude de la fonction pancréatique et intestinale du facteur de transcription Rfx6. J’ai montré que Pak3 est exprimé dans le lignage endocrine pendant le développement et chez l’adulte. Avec des expériences de perte de fonction, j’ai montré que ce gène inhibe la prolifération des progéniteurs endocrines et des cellules bêta durant l’embryogénèse. De plus, une étude métabolique a montré que les souris mutantes pour Pak3 sont intolérantes au glucose. En parallèle, en utilisant une souris conditionnelle pour Rfx6, j’ai montré que Rfx6 est nécessaire en aval de Ngn3 pour la différenciation des cellules endocrines pancréatiques et intestinales. Finalement, des expériences dans les souris adultes suggèrent que Rfx6 est nécessaire pour maintenir les cellules bêta, renouveler les cellules entéroendocrines et absorber les lipides dans l’intestin. En conclusion, ces études révèlent deux nouveaux gènes clés dans la régulation de la différenciation des cellules endocrines et de l’homéostasie énergétique dans le pancréas et l’intestin. / Pancreatic and intestinal endocrine cells, and their secreted hormones, contribute to the regulation of energy homeostasis. Their differentiation relies on similar genetic programs controlled by the proendocrine transcription factor Ngn3. However, our knowledge of the endocrinogenic programs implemented by Ngn3 is still fragmentary. Therefore, the transcriptome of endocrine progenitors has been determined in the lab. Among the genes which showed a strong enrichment in the endocrine lineage, I studied the expression and function of Pak3, a serine/threonine kinase and further pursued the dissection of the function of the transcription factor Rfx6 in the pancreas and the intestine. I showed that Pak3 is expressed throughout pancreas development and maintained in adult islets. Using ex vivo loss of function experiments and in vivo characterisation of the Pak3-deficient mice, I identified Pak3 as an inhibitor of islet progenitors and beta-cell proliferation in the embryonic mouse pancreas. Furthermore, we performed metabolic studies which revealed that Pak3-deficient micehave an impaired glucose homeostasis, especially under challenging high fat diet. In parallel, using a conditional knockout mouse for Rfx6, we showed that Rfx6 is necessary downstream of Ngn3 for endocrine cell differentiation in the pancreas as well as in the intestine. Finally, additional experiments in adult mice suggest that Rfx6 is necessary to maintain pancreatic beta-cells, enteroendocrine cell turnover and intestinal lipid absorption. In conclusion, these studies revealed two novel key players in the regulation of endocrine cell differentiation and energy homeostasis in the pancreas and the intestine.

Le transfert adoptif de cellules T exprimant un récepteur chimérique reconnaissant un antigène (CAR), est un traitement qui génère des réponses impressionnantes dans les cancers hématologiques mais est beaucoup moins efficace pour le traitement de tumeurs solides. Les tumeurs solides modulent leur microenvironnement induisant des formes multiples d’immunosuppression qui inhibent l’efficacité des fonctions effectrices des cellules T ayant infiltrées la tumeur. Au cours de ma thèse, j’ai évalué le potentiel de deux stratégies pour améliorer les réponses anti-tumorales des cellules T CAR. La première se focalise sur l’étude du rôle potentiel des cellules immunes non T, exprimant un CAR sur la stimulation des fonctions et de la persistance de cellules T CAR+ dans le microenvironnement tumoral. Afin d’étudier la fonction des cellules CAR non T, nous avons généré un modèle de souris transgénique (vav-CAR) dans lequel les cellules immunes expriment un CAR reconnaissant l’antigène tumoral Her2 (ErbB2). Comme attendu, les cellules T CAR+ possèdent des fonctions anti-tumorales, mais nous avons aussi mis en évidence que les macrophages et les cellules NK exprimant le CAR montraient une réponse cytokinique, cytotoxique et phagocytiques spécifiques de l’antigène. De plus, en utilisant le modèle vav-CAR, nous avons démontré le potentiel des cellules immunes CAR+ dans le rejet des tumeurs et cela indépendamment des cellules T CD8+. Les cellules T CD4+ sont essentielles puisque leur élimination réduit considérablement les réponses anti-tumorales dans notre modèle vav-CAR. Il a été démontré que certaines sous-populations de cellules T auxiliaires participent aux réponses anti-tumorales avec les cellules Th1 et Th17 démontrant une efficacité plus robuste que les autres sous-populations. Notre deuxième stratégie s’est focalisée sur l’étude de l’impact du métabolisme au cours de la polarisation des cellules T CD4+ et plus particulièrement lors de la différenciation des cellules T CAR+ en cellules Th1. En effet, l’activation et différenciation des cellules T sont fortement associées à une augmentation des besoins métaboliques. Dans le microenvironnement tumoral, en raison de la forte demande en ressources de la tumeur, la déprivation en nutriments ainsi générée peut limiter l’accès aux nutriments d’autres types cellulaires et ainsi altérer le devenir et les fonctions des cellules immunes greffés infiltrant la tumeur. En conséquence, modifier les cellules immunes CAR+ afin qu’elles puissent résister à la compétition métabolique du microenvironnement tumoral pourrait leur permettre de conserver leurs fonctions effectrices. En étudiant l’impact de la déprivation en nutriments sur la différenciation des cellules T, nous avons trouvé que des concentrations limitantes en glutamine, l’acide aminé le plus abondant du plasma, inhibaient le potentiel des cellules T à se différencier vers la voie Th1 associée à la production d’IFNγ. Au contraire, cette condition favorisait la conversion de cellules T CD4 naïves en cellules régulatrices Foxp3+ ayant des fonctions suppressives (Tregs). De plus, nous avons montré que la présence d’un seul métabolite dérivé de la glutamine, l’α-ketoglutarate (αKG), suffisait à augmenter les fonctions effectrices anti-tumorales de plusieurs sous-types de cellules T auxiliaires CAR+, augmentant la production d’IFNγ et diminuant l’expression de FOXP3. Ainsi, durant ma thèse, j’ai développé un modèle murin vav-CAR, générant un outil permettant d’étudier et manipuler les fonctions de multiples populations de cellules immunitaires exprimant un CAR. Ce modèle permettra de promouvoir l’utilisation de cellules immunes optimisées exprimant un CAR dans le cadre d’immunothérapies dirigées contre des tumeurs solides. De plus, en utilisant ce modèle, nous avons identifié un métabolite de la glutamine, qui orchestre les réponses immunitaires au moyen d’une reprogrammation métabolique des cellules T CD4. / The adoptive transfer of T cells expressing a chimeric antigen receptor (CAR) as a treatment for cancer has achieved impressive responses in haematological malignancies, but has been less successful in the treatment of solid tumors. The tumor microenvironment of solid tumors presents multiple forms of immunosuppression, inhibiting the efficient effector function of infiltrating anti-tumor T cells. During my PhD, we assessed the potential of two strategies to enhance the anti-tumor function of CAR T cells. The first focuses on the potential of other CAR-expressing immune subsets to stimulate CAR T cell function and persistence in the tumor microenvironment. To elucidate the function of CAR-expressing non-T lymphocytes, we generated a transgenic mouse model (vav-CAR) in which immune cells express a CAR against the Her2 (ErbB2) tumor antigen. As expected, CAR T cells harboured anti-tumor function but we also found that CAR-modified macrophages and natural killer cells (NKs) exhibited significant antigen specific cytokine secretion, cytotoxicity and phagocytosis. Moreover, using the vav-CAR model, we demonstrated the potential of CAR immune cells to mediate tumor rejection independently of CD8+ T cells. CD4+ T cells were critical for this response as their deletion severely abrogated the anti-tumor responses in our vav-CAR model. Distinct T helper subsets have been shown to participate to anti-tumor responses, with Th1 and Th17 cells demonstrating a more robust efficacy as compared to other T helper subsets. Our second strategy was focused on the impact of metabolism in the polarisation of CD4+ T cells, in particular the differentiation of CAR T cells to Th1 lineage. T cell activation and polarisation is highly associated with increased metabolic needs. Given that nutrient deprivation in the tumor microenvironment, due to a high demand of the tumor for resources, can limit the nutrients available for other cell types, the fate and function of adoptively transferred immune cells may be altered upon entering the tumor. Therefore, modifying CAR immune cells to resist metabolic suppression in the tumor microenvironment may help retain their effector functions. Upon assessing the effects of nutrient deprivation on T cell differentiation, we found that limiting concentrations of glutamine, the most abundant amino acid in the plasma, inhibited the potential of T cells to undergo Th1 differentiation with associated IFNγ secretion. Rather, this condition resulted in the conversion of naïve CD4+ T cells into suppressive Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). Furthermore, we determined that a single glutamine-derived metabolite, α-ketoglutarate (αKG), enhanced the anti-tumor effector functions of multiple CAR T helper subsets, increasing the production of IFNγ and reducing FOXP3 expression.Thus, during my PhD, I generated a vav-CAR model, providing a platform in which the function of multiple CAR-bearing immune subsets can be studied and manipulated. This model will promote the utilisation of optimized CAR-bearing immune cells in adoptive immunotherapy for solid tumors. Furthermore, using the CAR model, we have identified a glutamine metabolite that orchestrates immune responses through the metabolic reprogramming of CD4 T cells.