O uso da LDE como veículo para quimioterápicos tem mostrado ser uma boa estratégia para aumentar a eficácia terapêutica dos mesmos. Nesse estudo, a LDE foi empregada como veículo para um derivado lipofílico do metotrexato (MTX), o di-dodecil metotrexato, que foi obtido com rendimento elevado através de reação de esterificação do MTX. O aumento na lipofilicidade do derivado possibilitou incorporação na LDE com rendimento e estabilidade elevados. O IC50 de LDE-di-dodecil MTX foi cerca de 100 vezes menor em relação ao MTX comercial, sua captação celular mais elevada nas linhagens leucêmicas estudadas e sua toxicidade animal reduzida, mostrando que a LDE é um veículo promissor para este fármaco. / The use of LDE as vehicle to drugs is a great strategy to improve the therapeutic index and reduce the side effects. In this study LDE was used as vehicle to di-dodecyl methotrexate, a lipophilic derivative of MTX, obtained through an esterification reaction with a high yield. The increased lipophilicity of the derivative allowed a high association to LDE and good stability. The IC50 of LDE-di-dodecyl MTX was lower than that of the MTX and the uptake was higher in leukemic cells. The MTX toxicity in mice was reduced after association to LDE, showing that LDE is a promising vehicle to this drug.

The goal of this thesis is the development of a tracking algorithm for populations of unmarked cancer cells that migrate in 3D in vitro gels. The tracking algorithm is intended to be a tool for analysing the motility of large population (i.e. hundreds) of cells in the context of the anti-migratory drug development and more specifically drug screening. In oncology, cancer cell migration plays pivotal roles in the spread of cancer cells from a primary tumor site to neighboring and secondary sites, i.e. the processes of tissue invasion and metastasis. Preventing such processes represents an important therapeutic approach to cancer treatment. Providing tools able to test potential anti-migratory drugs thus constitutes currently a real need in oncology therapy. The goal of drug screening in this context aims to rapidly and efficiently test the anti-migratory effects of many experimental conditions on cancer cell populations.<p>The focus in this thesis lies in two specific aspects that are important in anti-migratory drug screening: tracking cells inside an in vitro 3D environment and doing so using unmarked cells. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les agonistes du récepteur opioïde Mu (MOR) sont la première ligne de traitement pour le soulagement des douleurs aiguës modérées à sévères. Cependant, ces derniers induisent de nombreux effets indésirables, tels que la dépression respiratoire et la constipation, qui limitent leur utilisation pour une gestion appropriée de la douleur. Chacun des effets indésirables des agonistes du MOR est médié par des mécanismes cellulaires et moléculaires complexes. C’est pourquoi un nombre considérable de recherches précliniques ont été menées afin de découvrir des opioïdes qui induiraient moins d’effets indésirables. Plus particulièrement, de nombreuses études se sont concentrées sur le développement d’agonistes biaisés du MOR qui ont peu ou pas de recrutement de β-arrestine 2 et qui activent préférentiellement les protéines G. Néanmoins, ces recherches n’ont pas réussi à identifier des agonistes biaisés avec un profil amélioré d’effets indésirables en clinique. Nous proposons dans cette thèse que la caractérisation des similarités signalétiques des agonistes du MOR serait une bonne alternative à l’agonisme biaisé pour l’identification d’opioïdes avec des profils d’effets indésirables distincts. Pour ce faire, nous avons développé une méthode basée sur l’utilisation de l’apprentissage non supervisé par clustering pour classifier les ligands du MOR en des catégories pharmacodynamiques. Cette classification s’est faite à l'aide des paramètres qui caractérisaient une panoplie de voies de signalisation médiées par les protéines G et par les β-arrestines. Nous avons pu associer ces différentes catégories pharmacodynamiques avec différentes fréquences de rapport d’effets indésirables d’opioïdes cliniques au programme de pharmacovigilance de la FDA (Food and drug administration) tels que des effets respiratoires et gastro-intestinaux. Nous avons également montré que cette méthode peut être plus généralement appliquée à d’autres sous-types et types de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). L’efficacité et l’innocuité des agonistes du MOR pour le soulagement des douleurs chroniques non cancéreuses, telles que les douleurs neuropathiques, est un sujet controversé et plusieurs essais cliniques ne sont pas en faveur de leur utilisation. Or, la douleur neuropathique est une maladie fréquente qui est associée à une très pauvre qualité de vie du patient et pour laquelle seulement 30 à 40% des patients rapportent un soulagement adéquat de la douleur avec les traitements actuels. Dans les modèles précliniques, les cannabinoïdes sont capables de moduler des processus impliqués dans le développement des douleurs neuropathiques. Ceci les rend des candidats prometteurs pour le soulagement de ces douleurs en clinique. Néanmoins, peu de médicaments à base de cannabis sont présentement approuvés sur le marché pour un usage thérapeutique. Ces derniers sont régulés selon leur contenu en Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) et cannabidiol (CBD) et il existe une présomption selon laquelle les quantités de THC et les ratio THC:CBD permettraient de décrire l’activité biologique du cannabis médical. Or, les extraits commerciaux peuvent contenir jusqu’à 23 phytocannabinoïdes et de nombreux autres composés chimiques. La description de ces derniers uniquement en termes de contenus en THC et en CBD ne prend pas en considération les interactions potentielles qui peuvent arriver entre les multiples autres composants et qui peuvent aboutir à des effets cliniques différents. Nous avons donc testé dans cette thèse s’il y avait réellement une équivalence entre l’activité biologique d’un extrait de cannabis et des traitements cannabinoïdes avec des contenus en THC et/ou en CBD équivalents Nous avons démontré que les réponses analgésiques du THC et du CBD seuls, d’une combinaison THC:CBD (1 :1) et d’un extrait de cannabis de chémotype II (avec un ratio THC:CBD ≈ 1 :1) ne sont pas équivalentes dans un modèle de neuropathie diabétique chez les rats. Aux hautes doses testées, l’extrait était plus efficace à soulager la douleur que la combinaison THC:CBD (1 :1) qui, elle-même, était plus efficace que le THC et le CBD seuls. De plus, ces différents traitements engageaient les cibles moléculaires du système endocannabinoïde CB1 (récepteur cannabinoïde 1), CB2 (récepteur cannabinoïde 2) et TRPV1 de façon distincte. Ensemble ces résultats suggèrent qu’une équivalence au niveau des contenus en THC et des ratios THC:CBD ne se traduit pas par une équivalence d’activité biologique telle que l’analgésie. Dans son ensemble, cette thèse propose dans un premier temps une méthode basée sur la classification pharmacodynamique de ligands de RCPG qui pourrait être utile pour l’identification de nouveaux candidats opioïdes avec un profil d’effets indésirables amélioré. Dans un second temps, nous avons démontré que les cannabinoïdes induisent des effets analgésiques à travers différentes cibles pharmacodynamiques et que ces dernières étaient engagées de façon distincte par les différents traitements. Notre intention future est de décrire in vitro les profils signalétiques des cannabinoïdes sur ces différentes cibles et d'utiliser notre outil de classification pharmacodynamique afin de corréler ces réponses signalétiques avec leurs effets analgésiques et indésirables in vivo. Ces travaux fournissent des éléments pertinents pour le développement rationnel d’analgésiques plus efficaces et mieux tolérés en clinique. / According to the World Health Organization (WHO), Mu opioid receptor agonists (MOR) are the first line of treatment for the relief of moderate to severe acute pain. However, they induce numerous adverse effects, such as respiratory depression and constipation, which limit their use for appropriate pain management. Each of the adverse effects of MOR agonists is mediated by complex cellular and molecular mechanisms. As a result, a considerable amount of preclinical research has been conducted to discover opioids that would induce fewer adverse effects. Specifically, many studies have focused on developing biased MOR agonists that have little or no β-arrestin 2 recruitment and preferentially activate G proteins. Despite these investigations, efforts to identify biased agonists with an improved adverse event profile in the clinic have been unsuccessful. In this thesis, we propose that characterizing the signaling similarities of MOR agonists would be a good alternative to biased agonism for identifying opioids with distinct adverse effect profiles. To this end, we developed a method based on the use of unsupervised clustering learning to classify MOR ligands into pharmacodynamic categories. This classification was done using parameters that characterized a panoply of G protein- and β-arrestin-mediated signaling pathways. We were able to associate these different pharmacodynamic categories with different frequencies of clinical opioid adverse event reported to the FDA pharmacovigilance program such as respiratory and gastrointestinal effects. We have also shown that this method can be more generally applied to other subtypes and types of G protein-coupled receptors (GPCRs). The efficacy and safety of MOR agonists for the relief of chronic non-cancer pain, such as neuropathic pain, is a controversial topic and several clinical trials do not support their use. Neuropathic pain is a common condition that is associated with very poor patient quality of life and for which only 30-40% of patients report adequate pain relief with current treatments. In preclinical models, cannabinoids are able to modulate processes involved in the development of neuropathic pain. This makes them promising candidates for the relief of such pain in the clinic. However, few cannabis-based medications are currently approved for therapeutic use. For safety reasons, these are regulated according to their Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) content under the presumption that THC amounts and THC:CBD ratios would adequately describe the biological activity of medical cannabis. Commercial extracts of medical cannabis may contain up to 23 phytocannabinoids and many other chemical compounds. Describing these products only in terms of THC and CBD content does not take into consideration the potential interactions that may occur between these multiple components and that may result in different clinical effects. We therefore tested in this thesis whether there was really an equivalence between the biological activity of a cannabis extract and cannabinoid treatments with equivalent THC and/or CBD contents. We demonstrated that the analgesic responses of pure THC and CBD, a THC:CBD (1:1) combination, and a chemotype II cannabis extract (with a THC:CBD ratio ≈ 1:1) were not equivalent in a rat model of diabetic neuropathy. At the high doses tested, the extract was more efficacious than the THC:CBD (1:1) combination which, in turn, was more efficacious than pure THC and CBD. Furthermore, these different treatments engaged the molecular targets of the endocannabinoid system CB1 (cannabinoid receptor 1), CB2 (cannabinoid receptor 2), and TRPV1 in distinct ways. Together, these results suggest that equivalence in THC content and THC:CBD ratios does not translate into equivalence in biological activity such as analgesia. Overall, this thesis firstly proposes a pharmacodynamic-based method of GPCR ligand classification that could be useful for the identification of new opioid candidates with an improved adverse effect profile. Secondly, we demonstrated that cannabinoids produced their analgesic effects via different pharmacodynamic targets and that these targets were distinctively engaged by the different treatments. Our future intention is to describe the in vitro signaling profiles of cannabinoids at these different targets, and to use our pharmacodynamic clustering tool to correlate these signaling responses with their in vivo their analgesic and adverse effects. This work provides relevant insights for the rational development of more effective and better tolerated analgesics in the clinic.

Spinal muscular atrophy (SMA) and Charcot-Marie-Tooth disease type 2D (CMT2D)/distal SMA type V (dSMAV) are two incurable neuromuscular disorders that predominantly manifest during childhood and adolescence. Both conditions are caused by mutations in widely and constitutively expressed genes that encode proteins with essential housekeeping functions, yet display specific lower motor neuron pathology. SMA results from recessive inactivating mutations in the survival motor neuron 1 (SMN1) gene, while CMT2D/dSMAV manifests due to dominant point mutations in the glycyl-tRNA synthetase (GlyRS) gene, GARS. Using a number of different model systems, ranging from Caenorhabditis elegans to the mouse, this thesis aimed to identify potential novel therapeutic compounds for SMA, and to increase our understanding of the mechanisms underlying both diseases. I characterised a novel C. elegans allele, which possesses a point mutation in the worm SMN1 orthologue, smn-1, and showed its potential for large-scale screening by highlighting 4-aminopyridine in a screen for compounds able to improve the mutant motility defect. Previously, the gene encoding three isoforms of chondrolectin (Chodl) was shown to be alternatively spliced in the spinal cord of SMA mice before disease onset. I performed functional analyses of the three isoforms in neuronal cells with experimentally reduced Smn levels, and determined that the dysregulation of Chodl likely reflects a combination of compensatory mechanism and contributor to pathology, rather than mis-splicing. Finally, working with two Gars mutant mice and a new Drosophila model, I have implicated semaphorin-plexin pathways and axonal guidance in the GlyRS toxic gain-of-function disease mechanism of CMT2D/dSMAV.

Le thème principal de notre travail consistait en la mise en exergue de l'efficience de la mise en œuvre de techniques hybrides associant l’électrochimie à l’élément biologique (biocapteur) ou l’électrochimie aux performances de la spectrométrie de masse (couplage EC-MS). Les informations fournies, jointes aux résultats des mesures en voltampérométrie sur électrodes solides, permettent une bonne compréhension mécanistique quant au devenir oxydatif de substances médicamenteuses. <p>Notre champ d'investigation s'est plus spécifiquement focalisé sur deux familles de molécules psychotropes (les phénothiazines, et une dibenzoazépine). Celles-ci connaissent un usage thérapeutique intensif et un regain d’intérêt pour des applications nouvelles, mais leur utilisation optimale souffre de l’existence d'effets secondaires physiopathologiques importants et dont l’étiologie est encore mal connue. <p>En premier lieu, les résultats de la voltampérométrie cyclique et les différentes modulations en ligne d'une cellule électrochimique couplée à la détection par spectrométrie de masse, nous ont permis de mettre en évidence des différences essentielles dans le devenir des phénothiazines quant aux produits d'oxydations générés. Plus précisément, un comportement clairement distinct entre les phénothiazines garnies de deux (2C) ou trois carbones (3C) entre les deux azotes au niveau de leur chaîne latérale a pu être mis en évidence. Les phénothiazines 3C s'oxydent de manière classique en leur sulfoxyde correspondant. Par contre, les phenothiazines 2C, conjointement à la formation de leur sulfoxyde, souffrent dans des conditions énergiques d’oxydation (persulfate, potentiel élevé) d'une rupture de la chaîne latérale et libèrent la phénothiazine base aisément oxydable et donc subissant elle-même une oxydation. Au vu des structures moléculaires en trois dimensions, nous émettons l’hypothèse que volume trop important de la chaîne latérale des phénothiazines 2C empêcherait le déploiement aisé des structures aromatiques en un radical cation coplanaire lors du phénomène d'oxydation. Les tensions intrastructurelles apparues conduiraient au bris de la chaîne latérale. Différents modes d'oxydation (chimique, électrochimique, enzymatique) ont été utilisés et laissent chacun apparaître la dépendance directe entre la puissance de l'agent oxydant appliqué et les produits d'oxydation obtenus. Chaque technique de détection, de manière individuelle, a bien confirmé la dualité entre les deux groupes de molécules. La mise en commun des divers résultats nous a permis l'identification irrévocable des espèces intermédiaires instables et des composés finaux. Par corollaire, nous avons pu postuler un schéma général d'oxydation pour les dérivés phénothiaziniques. Il nous paraît intéressant de transposer nos résultats aux biotransformations des phénothiazines car les produits identifiés ne possèdent pas l'activité pharmacologique du composé parent mais présentent un profil toxicologique bien répertorié dans la littérature. Nos résultats suggèrent d’approfondir les études de biotransformation afin de déterminer si ‘l’éclatement’ oxydatif des phénothiazines 2C est également observé in vivo. Une relation cause/effet de ces métabolites pourrait ainsi être établie. <p>En deuxième point, au travers de l'association CE/SM ou CE/CL/SM, nous avons étudié l’électroxydation de la clozapine. La génération et l'identification des principaux métabolites de phases I et II, illustre un mimétisme certain avec le CYP450, et nous a permis de confirmer de nombreuses données de la littérature quant à l'oxydation in vivo et in vitro de la clozapine. L'oxydation électrochimique ne génère cependant pas l'ensemble des réactions de métabolisation prises en charge par le système CYP450. Lors de la combinaison CE/SM, par l'absence de séparation chromatographique dans cette configuration, le spectre de masse présente un pic correspondant à un intermédiaire à demi-vie courte, difficilement et rarement mis en évidence: l'ion nitrénium. Cette espèce hautement réactive envers les fonctions thiols des petites molécules et des protéines, se trouve très régulièrement tenue pour responsable majeur de la toxicité avérée de la clozapine. <p>L'apparition plus abondante de dérivés déméthylés démontre l'influence du potentiel appliqué à l'électrode de travail lors de l'oxydation électrochimique. En effet, les processus de déméthylation nécessitent des potentiels élevés pour être observés. En présence de glutathion, aux différents pics antérieurement identifiés, des pics supplémentaires relatifs à la formation d'adduits de GSH sur la CLZ apparaissent. Les courbes voltampérométriques réalisées sur la clozapine suggèrent la distinctement la formation de l'ion nitrénium et d'une nouvelle espèce aisément électroréduite, probablement une structure quinone imine. L'addition de GSH provoque la disparition des pics de réduction de la CLZ. Ces comportements en VC corroborent les interprétations issues des mesures par couplage EC/CL/SM. <p>La dernière partie de notre travail a consisté en la construction d'un biocapteur à pâte de carbone solide avec inclusion au sein de cette matrice de peroxydase de raifort. Basé sur la capacité reconnue de l'HRP à reproduire in vitro des produits d'oxydation similaires à la métabolisation in vivo, nous avons exploité un tel biocapteur pour l'analyse de la clozapine et de composés thiols. Une compréhension fine du mécanisme opérationnel intrinsèque du biocapteur a pu être suggérée. La génération à la surface de l'électrode de l'ion nitrénium par oxydation enzymatique de la clozapine par l'HRP, suivie de sa réduction immédiate fournit un courant ampérométrique substantiel. Sous des conditions de pH optimales, ce courant de réduction autorise la détermination quantitative de la clozapine dans un domaine de linéarité compris entre 1 x 10-5 M et 1 x 10-6 M. L'addition de composés thiols dans le milieu occasionne une chute de courant par action de ceux-ci sur la structure radical cation ou nitrénium par addition nucléophile. La disparition de l'ion nitrénium et la formation d'un adduit GSH-CLZ inhibent tout processus de réduction à l'électrode du biocapteur. Cette diminution de courant proportionnelle aux concentrations en thiols introduits, permet la détermination quantitative de dérivés thiols. Les courbes de calibration exprimées en pourcentage d'inhibition conduisent facilement à l'évaluation de la constante d'inhibition (Ki) et de CI50. L'étude de la réponse ampérométrique de la clozapine à l'EPC/HRP en l'absence ou présence d'un dérivé thiol envisagé permet la détermination de Km et de caractériser le type d'inhibition qui entre en jeu. De tels paramètres cinétiques nous ont habilités à classer les thiols considérés en fonction de leur puissance réactionnelle envers les substances oxydées de la clozapine.<p><p>Au terme de ce travail, nous espérons avoir illustré, par l’étude de quelques molécules modèles, l’intérêt de la mise en œuvre des techniques électrochimiques couplées à l’élément biologique ou à la spectrométrie de masse. Des améliorations au niveau de la cellule électrochimique sont envisageables par l’emploi d’électrodes modifiées, elles laissent entrevoir la possibilité de mimer totalement le système CYP450.<p>Les résultats fournis par ces techniques hybrides et par voltampérométrie cyclique sont complémentaires, ils procurent un éventail d'informations d'une utilité estimable pour une application dans des études prédictives précoces de candidats médicament. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure retrouvée au niveau des capillaires cérébraux. Elle représente un véritable obstacle pour les actifs qui doivent se rendre au cerveau pour y exercer un effet pharmacologique. Durant les étapes du développement du médicament, des modèles cellulaires in vitro sont utilisés pour l’évaluation de la perméabilité au cerveau des nouveaux médicaments. Le modèle assemblé avec des cellules endothéliales (CEs) isolées des capillaires des cerveaux de souris présente un intérêt particulier pour la recherche en raison de sa facilité d’obtention et sa pertinence pour le criblage des médicaments. Le but de ce projet a été de construire et de caractériser un modèle monocouche de CEs primaires de souris. En parallèle, un modèle monocouche de la lignée murine b.End3 a été investigué. L’évaluation de ces modèles a été basée sur les valeurs de TEER et de perméabilité aux marqueurs fluorescents, ainsi que sur la présence des protéines spécifiques de la BHE. La validation du modèle a été établie par la corrélation des résultats de perméabilité obtenus avec le modèle développé (in vitro) avec ceux obtenus chez la souris (in vivo). L’intégrité et l’expression des protéines spécifiques de la BHE du modèle primaire se sont montrées supérieures au modèle bEnd.3. La corrélation in vitro/in vivo du modèle primaire a abouti à un r2 = 0,765 comparé au r2 = 0,019 pour le modèle bEnd.3. Ce travail de recherche montre que le modèle primaire monocouche issu de cellules endothéliales cérébrales de souris est un modèle simple et fiable pour la prédiction de la perméabilité des actifs à travers la BHE. / The blood-brain barrier (BBB), a central nervous system structure, is found in the cerebral capillaries. It represents a major obstacle for the drugs that have to reach the brain in order to exercise their pharmacological effect. In the early stages of the drug development, in vitro cell models are used to evaluate the brain permeability of new drugs. Models assembled using primary endothelial cells (ECs) isolated from mouse brain capillaries are of particular interest for research, as for their ease of obtaining and relevance for the drug screening. Thus, the goal of this project was to build and characterize a primary mouse monolayer model. At the same time, a murine b.End3 cell line monolayer model was investigated. The evaluation of these models was based on the TEER and fluorescent marker permeability values, as well as on the presence of the BBB hallmark proteins. The model validation was established by the correlation of the permeability data obtained with the in vitro model and the data obtained in mice (in vivo). As a result, the primary mouse model showed superior monolayer integrity and higher expression of the tight junction and membrane transporter proteins when compared with the bEnd.3 cell line model. The in vitro/in vivo correlation of the primary model resulted in r2 = 0.765 compared to the bEnd.3 model with r2 = 0.019. This research work shows that the primary monolayer mouse model is a simple and reliable model for predicting the drug permeability across the BBB.

The orally active microtubule-disrupting agent (S)-1-ethyl-3-(2-methoxy-4-(5-methyl-4-((1-(pyridin-3-yl)butyl)amino)pyrimidin-2- yl)phenyl)urea (CYT997), reported previously by us (Bioorg Med Chem Lett 19:4639-4642, 2009; Mol Cancer Ther 8:3036-3045, 2009), is potently cytotoxic to a variety of cancer cell lines in vitro and shows antitumor activity in vivo. In addition to its cytotoxic activity, CYT997 possesses antivascular effects on tumor vasculature. To further characterize the vascular disrupting activity of CYT997 in terms of dose and temporal effects, we studied the activity of the compound on endothelial cells in vitro and on tumor blood flow in vivo by using a variety of techniques. In vitro, CYT997 is shown to potently inhibit the proliferation of vascular endothelial growth factor-stimulated human umbilical vein endothelial cells (IC(50) 3.7 +/- 1.8 nM) and cause significant morphological changes at 100 nM, including membrane blebbing. Using the method of corrosion casting visualized with scanning electron microscopy, a single dose of CYT997 (7.5 mg/kg i.p.) in a metastatic cancer model was shown to cause destruction of tumor microvasculature in metastatic lesions. Furthermore, repeat dosing of CYT997 at 10 mg/kg and above (intraperitoneally, b.i.d.) was shown to effectively inhibit development of liver metastases. The time and dose dependence of the antivascular effects were studied in a DLD-1 colon adenocarcinoma xenograft model using the fluorescent dye Hoechst 33342. CYT997 demonstrated rapid and dose-dependent vascular shutdown, which persists for more than 24 h after a single oral dose. Together, the data demonstrate that CYT997 possesses potent antivascular activity and support continuing development of this promising compound.

L’ataxie spinocérébelleuse de type 3, aussi connue en tant que la maladie de Machado-Joseph (MMJ), est une maladie qui se développe lorsqu’il y a une expansion des trinucléotides CAG dans la région codante du gène ATXN3. Ce dernier code pour la protéine ATXN3, une enzyme désubiquitinante avec des fonctions essentielles dans le maintien et la stabilisation de l’homéostasie protéique, la résistance au stress, la régulation de la transcription, la réparation de l’ADN, l’organisation du cytosquelette et la régulation de la myogenèse. Les principaux symptômes associés à cette maladie sont l’ataxie (le symptôme clé), une détérioration motrice progressive, la dystonie, la spasticité et la rigidité. Du fait de l’absence de thérapie spécifique et efficace pour traiter les individus atteints de la MMJ, l’approfondissement des connaissances liées à cette maladie est nécessaire. Le but de cette thèse est de comprendre davantage les mécanismes et voies de signalisations impliqués dans la pathologie de la MMJ. Pour atteindre cet objectif, à partir de notre modèle transgénique C. elegans MMJ, deux différents criblages ont été effectués : un criblage non biaisé de 3942 composés, et un criblage de modificateurs génétiques à base d’ARN interférent (ARNi) de 387 clones de facteurs de transcription. Le premier criblage nous a permis d’identifier cinq molécules prometteuses : l’alfacalcidol, le chenodiol, le cyclophosphamide, le fenbufen et le sulfaphenazole. Elles ont permis la restauration du défaut de la motilité, la protection contre la neurodégénérescence, et une augmentation de la durée de vie réduite chez les vers mutants. Trois parmi ces molécules, le chenodiol, le fenbufen et le sulfaphenazole ont démontré une nécessité de la présence de HLH-30/TFEB, un régulateur clé de l’autophagie et de la biogenèse lysosomale, pour leurs propriétés neuroprotectrices. Concernant le deuxième criblage, il nous a permis d’identifier un nouveau gène candidat impliqué dans la MMJ, fkh-2/FOXG1. L’inactivation de ce gène a entraîné une aggravation du défaut de la motilité, de la neurodégénérescence, et de la longévité réduite. À l’inverse, sa surexpression a restauré tous ces phénotypes, suggérant ainsi un rôle neuroprotecteur pour FKH-2/FOXG1 dans la MMJ. Le modèle C. elegans de MMJ et les criblages sont des outils puissants permettant un approfondissement des connaissances quant à la pathologie de la MMJ. Pour cette thèse, par l’identification des molécules neuroprotectrices et les facteurs de transcription HLH-30/TFEB et FKH-2/FOXG1, ayant des activités neuroprotectrices dans notre modèle lorsqu’ils sont surexprimés, il a été possible à mieux comprendre la pathologie de la MMJ, ainsi que les mécanismes et les voies de signalisation qui y sont impliqués. Ces découvertes sont prometteuses à investiguer dans des organismes modèles plus avancés, des applications précliniques et également, pour le développement de nouvelles interventions thérapeutiques pour la MMJ. / Spinocerebellar ataxia type 3, also known as Machado-Joseph disease (MJD), is a polyglutamine expansion disease arising from a trinucleotide CAG repeat expansion in the coding region of ATXN3. This gene encodes ATXN3 protein, a deubiquitinating enzyme, which is involved in protein homeostasis maintenance and stabilization, stress resistance, transcription regulation, DNA repair, cytoskeleton organisation and myogenesis regulation. The main symptoms associated with this disease are ataxia (the key symptom), progressive motor deterioration, dystonia, spasticity and stiffness. Due to our incomplete understanding of mechanisms and molecular pathways related to this disease, there are no therapies that successfully treat core MJD patients. Therefore, the identification of new candidate targets related to this disease is needed. The aim of this thesis is to gain insights into the pathways and mechanisms leading to MJD. In order to achieve this goal, we performed two different screens, a blind drug screen of 3942 compounds to identify protective small molecules, and a large-scale RNA interference (RNAi) screen of 387 transcription factor genes leading to identification of modifiers involved in our transgenic C. elegans MJD model. The first screen allowed us to identify five lead compounds restoring motility, protecting against neurodegeneration, and increasing the lifespan in mutant worms. These compounds were alfacalcidol, chenodiol, cyclophosphamide, fenbufen and sulfaphenazole. We then found that three of these compounds, chenodiol, fenbufen and sulfaphenazole required HLH-30/TFEB, a key transcriptional regulator of the autophagy and the lysosomal biogenesis, to complete their neuroprotective activities. The second screen brought us to identify a news hit gene candidate involved in MJD, fkh-2/FOXG1. We showed that inactivation of this gene enhanced the motility defect, neurodegeneration and reduced longevity in our MJD model. However, in opposite, its overexpression rescued all these phenotypes, suggesting a neuroprotective role for FKH-2/FOXG1 in MJD when overexpressed. C. elegans models for MJD and the screenings are promising tools to understand the mechanisms and pathways causing neurodegeneration, leading to MJD. In this study, we identified positively acting compounds that may be promising candidates for investigation in mammalian models of MJD and preclinical applications in the treatment of this disease. Also, we gained insights into the pathways of MJD and found that HLH-30/TFEB and FKH-2/FOXG1 are both implicated in MJD and have neuroprotective activities when they are overexpressed. These promising findings may aid the development of novel therapeutic interventions for MJD.

<p>Small nematode model organisms such as <em>Caenorhabditis elegans</em> are widely used in the fields of neurobiology, toxicology, drug discovery, etc. They are advantageous due to their fully characterized genomic and cellular system. Traditional screening methods involve the exposure of animals to chemicals/drugs inside multiwell-plates while its effects on growth, movement and other cellular/sub-cellular processes are monitored by visual inspection. Yet, these methods are time-consuming, low-throughput, expensive, tedious, difficult to control, hard to modulate instantaneously, prone to subjectivity and not suitable for movement-based behavioural assays. Hence, a method to induce and to quantify movement on-demand in a rapid, sensitive, precise and reversible manner would greatly facilitate biological studies. In this thesis, microfluidic engineering approaches have been utilized in nematode-based assays due to their potential to obtain high precision measurements in a low-cost, rapid and automated manner. Movement response of worms to a diverse range of electric signals has been quantitatively characterized. DC and pulse-DC electric fields have been shown to stimulate worms’ swimming towards the negative electrode inside a microchannel (electrotaxis). AC electric fields were used to inhibit movement on-demand. Animals’ movement has been characterized in terms of speed and range of motion, body-bend frequency and turning time. Electrotaxis was shown to be mediated by neuronal activities and correlations between animal’s behaviour and neuronal signalling has also been demonstrated. Using this basic understanding, multiple microfluidic components such as position sensors and electric immobilizers have been developed. Electrotaxis has then been applied as a technique to sort worms in accordance to their size/age and phenotype as well as to perform drug screening at a single-animal level. Integration of the techniques and components developed during this research is expected to have a significant impact on the development of an integrated microfluidic platform for high throughput automated behavioural screening of nematodes with applications in drug discovery, toxicology, neurobiology and genetics.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)