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Identificação bioquímica e molecular de nucleotidases em fração solúvel e microssomal de tecido cardíaco de ratosPochmann, Daniela January 2009 (has links)
Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.
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Estudo da expressão e características bioquímicas das ectonucleotidases em cultura de células acinares de glândulas salivaresHenz, Sandra Liana January 2007 (has links)
Os nucleotídeos da adenina são moléculas sinalizadoras no meio extracelular e estão envolvidas em importantes condições fisiológicas e patológicas. O papel do ATP como um mediador extracelular e neurotransmissor têm sido descrito em vários sistemas, inclusive na glândula salivar. Nas glândulas salivares, o ATP é liberado juntamente com acetilcolina e noradrenalina a partir do sistema de inervação da glândula. Esse ATP atua sobre os receptores P2X4, P2X7, P2Y1 e P2Y2, regulando importantes processos secretórios. Os eventos induzidos pelos nucleotídeos extracelulares são controlados pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos a presença dessas ectonucleotidases nas células acinares da glândula submandibular. A presença de uma E-NTPDase e uma ecto-5'-nucleotidase foi identificada com as seguintes propriedades bioquímicas para a hidrólise de ATP, ADP e AMP: pH ótimo entre 6,5-8,0, requerimento de cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e valores de Kmapp na faixa de micromolar. As células acinares das glândulas salivares também foram capazes de hidrolisar o p-Nph-5´-TMP, sugerindo a presença de uma E-NPP. A enzima descrita nesse estudo é dependente de cátions metálicos divalentes (Ca+2 e Mg+2), sendo que a hidrólise do p-Nph-5´-TMP foi máxima na presença de níveis basais de cátions e em pH entre 8,5 e 9,0. Também se analisou o efeito de vários compostos sobre a hidrólise do ATP, ADP e p-Nph-5´-TMP e verificou-se que aazida sódica, inibidor de várias NTPDases, inibiu a hidrólise do ATP e do ADP, e não teve efeito sobre o p-Nph-5´-TMP.A ouabaína e o NEM, inibidores clássicos de ATPases, não afetaram significativamente a hidrólise de ATP, ADP e p-Nph-5´- TMP, já o AMP, inibiu a hidrólise do p-Nph-5´-TMP. Esses resultados sugerem a co-existência de diferentes ectonucleotidases nas células acinares, que estão relacionadas com a hidrólise dos nucleotídeos e que podem atuar em diferentes situações. Também avaliamos o efeito de fármacos antidepressivos na atividade e expressão das enzimas envolvidas na hidrólise dos nucleotídeos. Em relação à atividade enzimática, observamos que a fluoxetina induziu um aumento na hidrólise de ATP e ADP e o moclobemide e a imipramina induziram um aumento significativo na hidrólise de todos os nucleotídeos (ATP, ADP e AMP). A expressão relativa da NTPDase1-3 aumentou e da ecto-5´-nucleotidase diminuiu com a imipramina. A fluoxetina aumentou a expressão relativa da NTPDase3 e ecto-5´-nucleotidase e inibiu a expressão relativa da NTPDase2. O moclobemide aumentou a expressão relativa de todas as enzimas. Em relação à atividade enzimática da NPP, os tratamentos com imipramina, fluoxetina e moclobemide levaram a um aumento significativo dessa atividade, enquanto as expressões relativas das NPP-1, NPP-2 e NPP-3 não apresentaram alteração. A presença de ectonucleotidases modulando os níveis dos nucleotídeos nas células acinares é importante tendo em vista o papel do ATP nos mecanismos de secreção salivar. / Adenine nucleotides are extracellular signaling molecules and are involved in important physiological and pathological conditions. The role of adenosine triphosphate (ATP) as an extracellular mediator and neurotransmitter has been described in various systems, including salivary glands. In salivary glands, extracellular ATP is co-released with acetylcholine and noradrenaline from glands nerve system. ATP acts on P2X4, P2X7, P2Y1 e P2Y2 receptors and may regulate important secretory processes in salivary gland cells. The events induced by extracellular nucleotides are controlled by ectonucleotidases, that include family members of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), ectopyrophosphatases/ phosphodiesterases (E-NPP) and ecto-5’-nucleotidase. The presence of an E-NTPDase and ecto-5'-nucleotidase was identified with the following biochemical characteristics for ATP, ADP, and AMP hydrolysis: optimum pH between 6.5-8.0, dependence of divalent cations (Ca2+ e Mg2+) and Kmapp values in micromolar range. Acinar cells from salivary glands were capable to hydrolyze p-Nph-5´-TMP, suggesting the presence of an E-NPP. The enzyme described in this study is divalent cations-dependent (Ca+2 e Mg+2), and the p-Nph- 5´-TMP hydrolysis was maximal with basal levels of cations in pH between 8,5 and 9,0. The effect of different compounds in ATP, ADP e p-Nph-5´-TMP hydrolysis was evaluated and sodium azide, an inhibitor of several NTPDases, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but have no effect in p-Nph-5´-TMP hydrolysis. Ouabain, NEM, classical ATPases inhibitors did not affect ATP, ADP e p-Nph-5´-TMPhydrolysis; however, AMP inhibited the p-Nph-5´-TMP hydrolysis. These results suggest the co-existence of different ectonucleotidases in acinar cells that are related with nucleotide hydrolysis and can act under different situations. The effect of antidepressants in activity and expression of enzymes involved in nucleotide hydrolysis was also evaluated. In relation to enzymatic activity, fluoxetine induced an increase only in ATP and ADP hydrolysis, whereas moclobemide and imipramine induced a significant increase in hydrolysis of all nucleotides (ATP, ADP and AMP). The relative expression of NTPDase1-3 was enhanced and for ecto-5´-nucleotidase was diminished with imipramine. Fluoxetine enhanced relative expression of NTPDase3 and ecto-5´-nucleotidase and inhibited the relative expression of NTPDase2. Moclobemide enhanced the relative expression of all enzymes. In relation to E-NPPs activities, imipramine, fluoxetine e moclobemide treatmens lead to a significant increase in this activity whereas the relative expression of NPP-1, NPP-2, and NPP-3 did not show modifications. The presence of ectonucleotidases modulating the levels of nucleotides in acinar cells is important considering the ATP role in the mechanisms of salivary secretion.
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Administração repetida de morfina em ratos infantes : efeitos em curto, médio e longo prazos nas atividades nociceptiva, comportamental e ectonucleotidásicasRozisky, Joanna Ripoll January 2008 (has links)
O estudo do sistema opióide no neonato tem sido freqüentemente pesquisado. Os neonatos rotineiramente experimentam dor aguda e crônica causada por procedimentos invasivos em UTI pediátrica e freqüentemente não recebem analgesia adequada. Entretanto, o uso da analgesia opióide vem aumentando nas últimas décadas em consequência das mudanças e avanços na compreensão, na identificação e no tratamento da dor em crianças. Entretanto, ainda existe uma carência em estudos de seus efeitos específicos sobre uma administração em longo prazo nestes pacientes. Adicionalmente, alguns estudos têm demonstrado que a exposição às drogas logo após o nascimento pode ter implicações duradouras no sistema nervoso, e que a exposição à morfina pode influenciar no desenvolvimento e na função de alguns sistemas do neurotransmissores. Existem múltiplos sistemas espinhais que modulam a neurotransmissão nociceptiva no corno dorsal. Propõe-se que a adenosina extracelular esteja envolvida no controle fisiológico da dor a nível espinal e na ação antinociceptiva opióide. Por outro lado, o ATP é um neurotransmissor liberado dos terminais nervosos sensoriais aferentes para atuar na circuitaria central da dor. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados por E-NTPDase e por 5’nucleotidase. Esta cascata enzimática apresenta dupla função: remover o sinal do ATP e gerar um segundo, adenosina. Esta dissertação teve como objetivos: investigar o efeito da administração repetida da morfina de P8 até P14 nas respostas nociceptiva, inflamatória, comportamental e na atividade das ectonucleotidases em medula espinhal e córtex de ratos em P16, P30 e P60. Além disso, avaliar o efeito de uma segunda exposição repetida de morfina por 7 dias em P80 na resposta nociceptiva, inflamatória e comportamental. Os animais que receberam a morfina por sete dias em P14 não desenvolveram tolerância, porém, quando avaliados em P80, demonstraram maior analgesia da morfina (administração aguda), e após 7 dias de administração diária de morfina (P86), desenvolveram o clássico fenômeno da tolerância. No teste da formalina, observou-se aumento na resposta nociceptiva em P30 e em P60, mas não em P16. No desempenho no campo aberto os animais apresentaram alteração de alguns comportamentos, tais como aumento de grooming em P16, e aumento de rearing e locomoção em P30. Em P88, o grupo que recebeu a morfina diariamente (de P80 até P86) apresentou aumento de rearing. Nas atividades das E-NTPDases, observou-se em P16 um aumento na atividade de hidrólise do ATP em sinaptossomas de córtex cerebral, e uma diminuição na atividade de hidrólise do ADP em sinaptossomas de medula espinhal. Nas demais idades avaliadas (P30 e P60) não formas observadas diferenças nas atividades de hidrólises dos núcleotídeos de ambas as estruturas analisadas. O limiar nociceptivo mais elevado observado no teste da formalina pode ser devido a neuroplasticidade na circuitaria nociceptiva, tais como em neurotransmissores excitatórios em nível espinhal. As alterações comportamentais observadas sugerem que a exposição à morfina, logo após o nascimento, pode desencadear, a curto e longo prazo, fenômenos tais como sensibilização comportamental. Em conclusão, estes resultados indicam que a exposição à morfina durante a segunda semana de vida pode promover aumento na resposta nociceptiva e alterações comportamentais que perderam ao longo da vida. Os efeitos observados após exposição repetida à morfina em animais podem colaborar com o entendimento de conseqüências clínicas decorrentes da administração em longo prazo de opióides. Adicionalmente, estes resultados sugerem a necessidade do desenvolvimento de pesquisas que abordem diferentes sistemas de neurotransmissores objetivando neutralizar tais adaptações comportamentais induzidas pela morfina. Os resultados nas atividades de E-NTPDases destacam a importância do sistema purinérgico de ratos infantes submetidos à exposição repetida da morfina. Essas alterações enzimáticas podem constituir um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos secundários da retirada opióide. / The study of the opioid system in the newborn has been frequently researched. The newborns routinely experiencing acute and chronic pain caused by invasive procedures in pediatric ICU and often do not receive adequate analgesia. However, the use of opioid analgesia has been increasing in recent decades as a consequence of changes and advances in the understanding, in the identification, and treatment of pain in children. However, there is still a lack of knowledge on their specific effects in a long-term administration for this population of patients. Additionally, some studies have shown that exposure to drugs soon after birth may have lasting implications in the nervous system, and that exposure to morphine can influence the development and function of some systems of neurotransmitters. There are multiple systems that modulate the spinal nociceptive neurotransmission in the dorsal horn. It has been proposed that the extracellular adenosine is involved in the physiological control of pain in spinal and action antinociceptiva opioid. Moreover, the ATP is a neurotransmitter released from sensory afferent nerve terminals to act in the central circuitaria of pain. The extracellular nucleotides can be hydrolysates by E-NTPDase and by 5’nucleotidase. This enzyme cascade presents dual function: remove the signal from the ATP and generating a second, adenosine. This dissertation had the following objectives: to investigate the effect of repeated administration of morphine from P8 to P14 in nociceptive responses, inflammatory, and behavioral activity ectonucleotidases in the cortex and spinal cord of rats in P16, P30, P60. Moreover, to evaluate the effect of one second repeated morphine exposition per 7 days in P80 in the nociceptive, inflammatory and behaviour response. Animals that received the morphine for seven days in P14 did not develop tolerance, but when evaluated in P80, showed greater the morphine analgesia (acute administration), and after 7 days of daily administration of morphine (P86), developed the classic phenomenon of tolerance. In the formalin test, it was observed increase in response to nociceptive P30 and P60 but not on P16. In performing in the open field the animals showed some change in behavior, such as increased grooming in P16, and increase of rearing and locomotion in P30. At P88, the group that received the morphine daily (from P80 to P86) showed increase of rearing. On the ENTPDases activities were observed at P16 increase in the activity of hydrolysis of ATP in sinaptossomas of cerebral cortex, and a decrease in the activity of ADP in the hydrolysis of sinaptossomas spinal cord. In other ages evaluated (P30 and P60) it was not observed differences on nucleotides hydrolysis activity from both structures.analyzed. The higher threshold nociception observed in the test of formalin can be due to neuroplasticidade in circuitaria nociceptive, such as neurotransmitters in excitatórios in spinal level. The behavioural changes suggest that exposure to morphine, soon after birth, can trigger in the short and long term, phenomena such as behavioral sensitization. In conclusion, these results indicate that exposure to morphine during the second week of life may promote increase in response nociceptive and behavioural changes that have lost their lifetime. These behavioural changes indicate the need for the evaluation of the clinical consequences of long-term opioid administration. Additionally, these results suggest the need for development of research that address different systems of neurotransmitters aiming neutralize the behavioral changes induced by opioid. AThe findings on the E-NTPDases activities highlight the importance of purinergic system of young rats submitted to the repeated morphine exposure. These alterations activities may constitute one of the mechanisms that mediate the development of some of the side effects, such as opioid withdrawal, associated with repeated morphine exposure in early life.
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Estudo da atividade das enzimas NTPDase e 5'-nucleotidase e do perfil oxidativo em pacientes com insuficiência renal crônicaSilva, Adriane Cismoski da January 2008 (has links)
As anormalidades hemostáticas são comumente encontradas em pacientes com doença renal. Ambos, sangramento e estados pró-trombóticos, podem ser observados em pacientes com doença renal crônica (DRC). O principal papel das plaquetas é assegurar a hemostasia primária, a manutenção da integridade do vaso e cessar o sangramento após uma injúria. As plaquetas também estão envolvidas na trombose arterial aguda, na inflamação, na aterosclerose, e na angiogênese. Quando as plaquetas são ativadas elas se aderem à matrix endotelial onde ocorre a ativação e a liberação de agonistas secundários tais como o ATP, ADP, tromboxano A2, serotonina e outras substâncias biologicamente ativas. O ADP possui um papel crucial na ativação plaquetária, atuando em receptores P2. Está liberação pode ser responsável pela ativação, recrutamento e indução da agregação adicional de plaquetas no microambiente de lesão no vaso. Assim, o metabolismo do ADP no sangue é um importante mecanismo de regulação da função plaquetária. A NTPDase (ecto-CD39) hidrolisa o ATP e ADP extracelulares formando monofosfato de adenosina (AMP), que é subseqüentemente convertido para adenosina pela ação da enzima 5’- nucleotidase (CD73). O objetivo deste estudo foi explorar a relação entre a disfunção plaquetária na uremia com as anormalidades hemostáticas e a severidade na doença renal em pacientes com insuficiência renal crônica sob tratamento conservador ND (pacientes que não realizam hemodiálise) e HD (pacientes que realizam hemodiálise) comparando com indivíduos normais de mesma faixa etária. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da NTPDase em plaquetas de pacientes HD (52,88%) com o substrato ATP. A hidrólise do ADP apresentou-se diminuída (33,68% e 39,75%) em HD e ND pacientes, respectivamente. Além disso, a atividade da 5’-nucleotidase mostrou-se elevada em HD (160%) e ND (81,49%) quando comparado com o grupo controle. Correlações significativas foram encontradas entre a hidrólise do ATP, ADP e AMP e os níveis plasmáticos de creatinina e uréia. Foram realizadas comparações entre o tempo de hemodiálise a que os pacientes estavam submetido e a alterações na hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Encontrou-se aumento na atividade da NTPDase com substrato ATP, diminuição com o substrato ADP e aumento da atividade da 5´-nucleotídase entre 49 e 72 meses em paciente HD. Os resultados sugeriram que as alterações na hidrólise dos nucleotídeos em plaquetas podem contribuir para anormalidades hemostáticas em pacientes com DRC, podendo realçar o risco de complicações tromboembólicas e aterosclerose acelerada em pacientes com DRC. Podemos inferir que tanto a uremia como a hemodiálise têm influência nas desordens hemostáticas apresentadas nesses pacientes, e descritas nesse trabalho. Os conhecimentos sobre estresse oxidativo e seu papel como importante cofator contribuindo para disfunção endotelial, inflamação, aterosclerose e glomeruloesclerose têm substancialmente aumentado nos últimos anos. A doença cardiovascular (DCV) é a maior causa de morte em pacientes com insuficiência renal, sendo que cerca de 50% de todas as mortes em pacientes com terapia substitutiva e que receberam transplante renal estão relacionadas a DCV. A mortalidade por DCV em pacientes com insuficiência renal é aproximadamente 9% por ano, o que chega a ser 30 vezes maior do que da população em geral. O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos de defesa antioxidante. Nos últimos anos, foi estudado o efeito biológico das ROS, e, em estudos clínicos e experimentais recentes, foram notados sinais de estresse oxidativo em pacientes renais. No entanto, a influência da uremia e do procedimento de hemodiálise não foi elucidada. Nesse estudo, avaliou-se a influência da uremia e da hemodiálise sobre o estresse oxidativo e a atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase (δ- ALA-D) em pacientes com DRC em HD e ND comparando com o grupo controle. Observou-se um aumento na peroxidação lipídica em soro de pacientes HD e ND. O nível de TBARS em hemácias foi elevado somente em pacientes HD. A atividade da catalase mostrou-se aumentada (83,56% e 61,23%) em pacientes HD e ND, respectivamente. Neste estudo, demonstrou-se a inibição da atividade da δ- ALA-D em pacientes HD e ND quando comparado ao grupo controle. Observouse, uma correlação positiva entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT com a quantidade de hemoglobina (r= 0.55, r= 0.42), respectivamente, e também observou-se uma correlação entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT e o nível de TBARS em eritrócitos (r= - 0.54, r= -0.51), respectivamente. Além disso, uma correlação negativa foi encontrada entre δ-ALA-D ou δ-ALA-D/DTT e a atividade da enzima CAT (r= - 0.63, r= -0.5), respectivamente. Nesse trabalho, demonstrou-se que a uréia pode ser o principal fator na geração de estresse oxidativo em pacientes com DRC. Além disso, a inibição da atividade d-ALA-D foi positivamente correlacionada com níveis de hemoglobina, demonstrando o papel fundamental da enzima d-ALA-D na biossíntese do heme e no desenvolvimento de anemia em pacientes com CRF. Estudos descreveram que o acúmulo de d-ALA pode levar ao aumento do estresse oxidativo, e a diminuição da eficiência nos mecanismos de defesa celular contra as espécies reativas de oxigênio pode levar a peroxidação lipídica e também a inibição da atividade da d- ALA-D, com concomitante alteração na síntese do heme, formando assim um ciclo de destruição. Esse estudo demonstrou várias alterações em pacientes com insuficiência renal crônica, sendo que muitas delas ajudam a explicar a tendência a desenvolver doença cardiovascular precoce nesses pacientes. / Hemostatic abnormalities are commonly found in patients with renal failure. Both a bleeding diathesis and the uremic prothrombotic state may be caused by renal disease. The main role of blood platelets is to ensure primary hemostasis, which is the maintenance of vessel integrity and cessation of bleeding upon injury. While playing a major part in acute arterial thrombosis, platelets are also involved in inflammation, atherosclerosis, and angiogenesis. When platelets are undergo activation first adhere to the subendothelial matrix where they become activated and release secondary agonists such as ATP, ADP, thromboxane A2, serotonin and several other biologically active substances. ADP and ATP play a crucial role in platelet activation, acting through P2 receptors. This release may be responsible for the activation, recruitment, and induction of aggregation of additional platelets in the microenvironment. Thus, the metabolism of ADP in the blood is important for the regulation of platelet functions. NTPDase (ecto-CD39) is that hydrolyzes extracellular adenosine tri- and diphosphate (ATP, ADP) to adenosine monophosphate (AMP), which is subsequently converted into adenosine by 5’- nucleotidase (CD73). The objectives of this study were to explore the relations between platelet dysfunction in uremia with hemostatic abnormalities and the severity of kidney disease in patients with CRF under conservative treatment (nondialysed - ND) and hemodialysis (HD) treatment companing to heathy subjects with the same age. The activities of the enzymes NTPDase and 5´-nucleotidase were analyzed in platelets from patients with chronic renal failure (CRF), both undergoing hemodialysis treatment (HD) and not undergoing hemodialysis (ND), as well as from a control group. The results showed an increase in platelet NTPDase activity in CRF patients on HD treatment (52.88%) with ATP as substrate. ADP hydrolysis was decreased (33.68% and 39.75%) in HD and ND patients, respectively. In addition, 5’-nucleotidase activity was elevated in the HD (160%) and ND (81.49%) groups when compared to the control group. Significant correlation was found among ATP, ADP and AMP hydrolysis and plasma creatinine and urea levels. Patients were compared statistically according the time of hemodialysis treatment. We found enhanced NTPDase with ATP substrate and decrease with ADP substrate, and increase in 5’-nucleotidase activity between 49 and 72 months on HD patients. Our results suggest the existence of alterations in nucleotide hydrolysis in platelets, which might contribute to abnormal homeostasis in renal failure patients, thus and the enhanced risk of thromboembolic complication and accelerated atherosclerosis in patients with renal failure. Our knowledge about stimuli and sources of oxidative stress, and about its role as an important cofactor contributing to endothelial dysfunction, inflammation, atherosclerosis and glomerulosclerosis has substantially increase over the last years. Cardiovascular disease (CVD) is the major cause of death in patients with renal insufficiency, accounting for 50% of all deaths in renal replacement therapy patients and in recipients of renal transplants. Mortality from CVD in patients with renal insufficiency is approximately 9% per year, which is about 30 times the risk in the general population. Oxidative stress defines an imbalance between formation of reactive oxygen species (ROS) and antioxidative defense mechanisms. In view of the profound biological effects of ROS, in recent years numerous clinical and experimental studies focused on detection of signs of oxidative stress in renal patients. However, the influence of uremia and the hemodialysis procedure, respectively, has not been elucidated. Oxidative stress has been implicated in long-term complications including anemia, amyloidosis, accelerated atherosclerosis, and malnutrition. In this study, we studied the influence of uremia and hemodialysis on oxidative stress and δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity in patients with CRF on HD treatment, in patients ND and in a control group. An increased lipid peroxidation was observed in the serum of HD and ND patients, as measured by TBARS serum levels. However, erythrocytic TBARS was only elevated in HD patients. The activity of catalase was increased (83.56%, 61.23%) in HD and ND groups, respectively. This study also showed an inhibition Blood δ--ALA-D activity of HD and ND patients was significantly lower when compared with the control group. A positive correlation was also observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with hemoglobin (r=0.55, r=0.42), respectively, and a negative correlated were observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with TBARS level in erythrocytes (r= - 0.54, r=-0.51), respectively. Furthermore, a negative correlation was found between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT and CAT activity (r= -0.63, r= -0.5), respectively. In this study, it was shown that uremia itself could be the principal factor in generating oxidative stress in CRF patients. Furthermore, the inhibition of d-ALA-D activity was positively correlated with hemoglobin levels, showing the fundamental role of this enzyme in heme biosynthesis and the development of anemia in patients with CRF. Studies reported that the accumulation of d-ALA may lead to increased oxidative stress. In addition an existence of a decreased efficiency in the mechanisms of cellular defense against reactive oxygen species can lead to lipid peroxidation and inhibition of the activity of d-ALA-D with concomitant change in the synthesis of heme, thus forming a cycle of destruction. This study showed several changes in patients with chronic renal failure, which may to explain the tendency to develop cardiovascular disease in these patients early.
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Identificação bioquímica e molecular de nucleotidases em fração solúvel e microssomal de tecido cardíaco de ratosPochmann, Daniela January 2009 (has links)
Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração. / Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine.
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Eficácia terapêutica do Metotrexato na Artrite Reumatóide depende da expressão de células T reguladoras CD39+? / Eficácia terapêutica do Metotrexato na Artrite Reumatóide depende da expressão de células T reguladoras CD39+?Peres, Raphael Sanches 10 May 2012 (has links)
Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença. / Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença.
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Avaliação da atividade de nucleotidases na hemostasia e parâmetros de estresse oxidativo em mulheres grávidas normais, com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e portadoras do vírus HIVLeal, Claudio Alberto Martins January 2010 (has links)
O período gestacional é bastante complexo e do ponto de vista vascular, ocorrem inúmeras alterações e adaptações no sistema circulatório, na funcionalidade plaquetária e no sistema endotelial com o objetivo de prevenir futuras complicações na mãe ou no concepto no momento do parto e após o nascimento. Além das alterações na circulação, nos processos vasculares e no sistema imune que são inerentes a este período, existem trabalhos demonstrando a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) as quais poderão desencadear um desequilíbrio do balanço redox. Os nucleotídeos de purina ATP, ADP, AMP, além do nucleosídeo adenosina participam da regulação vascular endotelial, de processos inflamatórios e do controle imunológico entre outras funções. O controle da produção e dos níveis intracelulares e extracelulares destes nucleotídeos e nucleosídeos são regulados por uma cascata enzimática, na qual, participam as enzimas E-NTPDases (Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolase), ENPPs (Ecto-Nucleotídeo Pirofosfatase Fosfodiesterase), 5`-Nucleotidase e adenosina desaminase. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade de enzimas envolvidas no processo hemostático de gestantes normais e com complicações, como a diabetes melito gestacional, a pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV, além de alguns parâmetros de estresse oxidativo e a agregação plaquetária durante o terceiro trimestre gestacional. Os resultados obtidos demonstram um aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5`-nucleotidase em plaquetas de gestantes normais e com diabetes melito gestacional e pré-eclampsia comparadas com mulheres não grávidas. Ocorreu um aumento na atividade da enzima adenosina desaminase no soro de gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Foi verificado, também, um aumento na atividade plaquetária, através da medida da agregação plaquetária, nas gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Por outro lado, foi verificado um aumento na atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase, butirilcolinesterase e acetilcolinesterase juntamente com um aumento da peroxidação lipídica e uma redução dos níveis de ácido ascórbico e conteúdo sulfidrílico total. Além disso, não foi encontrada alteração significativa na análise de carbonilação protéica. Os resultados apresentados aqui sugerem que estas ectonucleotidases atuam na modulação de respostas vasculares, inflamatórias, imunes e circulatórias. Finalmente, foi detectado um aumento na atividade de enzimas antioxidantes e uma redução no conteúdo de moléculas antioxidantes, acompanhadas de um aumento no dano oxidativo aos lipídios de membrana o que remete à uma produção aumentada de espécies reativas e a uma tentativa do organismo em combater este desequilíbrio. / The pregnancy stage is very complex in the vascular point of view, occurring many changes and adjusts in the circulatory system, in the platelets functionality and in the endothelial system with the function of prevent future complications to the pregnant or to the newborn at the delivery and in the afterbirth. Besides the circulation changes, in the vascular processes and in the immune system that are inherent to this stage, there are studies that report the generation of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS), which could trigger an imbalance in the redox status. The purine nucleotides ATP, ADP, AMP and the nucleoside adenosine participate in the endothelial vascular regulation, inflammatory events, immune regulation, among other functions. The control of the production, the intracellular and extracellular levels of these nucleotides and nucleosides are regulated by an enzymatic cascade, in which, participate the enzymes E-NTPDases (ectonucleotise triphosphate diphosphohydrolases), E-NPPs (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases), 5’-nucleotidase and adenosine deaminase. The purpose of this study was to investigate the activity of enzymes involved in the hemostatic dynamics from normal pregnant and those with complications, such as the gestational diabetes mellitus, the pre-eclampsia and infected with the HIV. We also investigated some oxidative stress parameters and the platelets aggregation during the third gestational trimester. The results demonstrated an increase in the enzymes NTPDase and 5’-nucleotidase in platelets from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus and pre-eclampsia compared with not-pregnant women. It was also observed an increase in the enzyme adenosine deaminase activity in the serum from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. It was also verified an increase in the platelets activity through the measure of platelets aggregation in the normal pregnant, those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. Otherwise, it was verified an increase in the activity of the enzymes superoxide dismutase, catalase, butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase together with an increase in the lipid peroxidation and a decrease in the ascorbic acid and total sulphydryl groups content. Moreover, it was not observed any significant alteration in the protein carbonilation. The results showed here suggest that these ectonucleotidases participate in the modulation of vascular, inflammatory, immune and circulatory responses. Finally, it was detected an increase in the activity of antioxidant enzymes and a decrease in the antioxidant molecules content, together with an increase in the membrane lipids oxidative damage, which brings about an increased production of reactive species and a struggle of the body to combat this unbalance.
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Sistema purinérgico : expressão ontogenética e localização sináptica das ectonucleotidases e seu envolvimento no déficit cognitivo causado por convulsão neonatalCognato, Giana de Paula January 2009 (has links)
O ATP extracelular modula a atividade sináptica do SNC através de receptores purinérgicos do tipo P1 e P2. Os purinoreceptores do tipo P1 (A1, A2A, A2B e A3) são mais eficientemente ativados por adenosina, enquanto que os purinoreceptores P2 são ativados por ATP. Os níveis da ATP e adenosina na fenda sináptica são controlados pela ação de uma cascata de enzimas chamadas ectonucleotidases. Dentre outros membros, essa família de enzimas é composta pelas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e pela Ecto-5'- nucleotidase. Todos esses membros possuem funções específicas em uma variedade de situações fisiológicas, como por exemplo, o desenvolvimento cerebral e a cognição, ou parecem exercer algum papel na patofisiologia de doenças do SNC, tais como a epilepsia. Portanto, no presente estudo foi investigado (1) o mapeamento ontogenético das E-NPPs em diferentes regiões cerebrais, (2)a localização das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase a nível sináptico e subsináptico em hipocampo e estriado de ratos, (3)a participação das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase nos mecanismos neuroquímicos envolvidos no déficit cognitivo causado por convulsão neonatal em ratos adultos e (4) se o tratamento crônico com antagonistas não seletivos (cafeína) ou seletivos (KW6002) dos receptores A2A pode previnir os déficits de memória causados por convulsão neonatal em ratos adultos. Nossos resultados mostram uma ampla expressão relativa das E-NPPs durante todo o período de desenvolvimento cerebral. Além disso, as E-NTPDases e a E-5'-nucleotidase estão predominantemente localizadas nas sinapses, possuindo diferentes localizações pré e pós- sinápticas e diferentes associações glutamatérgicas e GABAérgicas. Nossos resultados também evidenciam que a hidrólise de ATP se encontra aumentada em ratos adultos que apresentaram déficit cognitivo após convulsão neonatal e que o consumo crônico de antagonistas dos receptores A2A (cafeína e KW6002) pode previnir o déficit cognitivo causado por crises epilépticas no período neonatal. Em resumo, essa tese mostra pela primeira vez a localização subsináptica das ectonucleotidases e correlaciona o sistema purinérgico com a maturação cerebral e com os déficits cognitivos induzidos por convulsão neonatal. Além disso, nossos resultados evidenciam que o consumo crônico de cafeína pode ser um provável agente profilático na prevenção de disfunções de memória na vida adulta associadas às crises convulsivas neonatais. / Extracellular ATP modulates the synaptic activity through P1 and P2 purinoceptors. Adenosine activates preferentially P1 receptors (A1, A2A, A2B, and A3) and ATP activates preferentially P2. The levels of ATP and adenosine in the synaptic cleft are controlled by the action of an enzyme cascade named ectonucleotidases. Besides other members, this enzyme family is constituted by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) and Ecto-5'- nucleotidase. All these members have specific physiological functions in brain development and cognition or seem to have some role in the patophysiology of brain disorders, such as epilepsy. Therefore, in the present study, we have investigated (1) the expression mapping of E-NPPs in different brain regions during development, (2) the synaptic and subsynaptic localization of ENTPDases and E-5'-nucleotidase in hippocampus and striatum of rats, (3) the participation of E-NTPDases and E-5'-nucleotidase in the neurochemical mechanisms of memory dysfunction induced by neonatal seizure in adult rats, and (4) if the chronic intake of nonselective (caffeine) or selective (KW-6002) antagonists of A2A could prevent the cognitive impairment caused by convulsion in early life. Our results showed a wild relative expression of E-NPPs during brain development. In addition, E-NTPDases and E-5'-nucleotidase are predominantly localized in synapses, with different pre and post-localization and different glutamatergic and GABAergic associations. Our results also showed an enhanced ATP hydrolysis in adult rats with memory impairment induced by neonatal convulsion and a prevention of this kind of memory dysfunction by the chronic intake of A2A receptors antagonists (caffeine and KW-6002). In summary, this study showed the first evidence of subsynaptic localization of ectonucleotidases and correlates the purinergic system with brain maturation and with the memory impairment induced by one single seizure in early life. Besides, our results pointed to the chronic intake of caffeine as a possible prophylactic agent for the prevention of cognitive dysfunction in adulthood induced by a single seizure in the neonatal period.
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Sistema purinérgico : expressão ontogenética e localização sináptica das ectonucleotidases e seu envolvimento no déficit cognitivo causado por convulsão neonatalCognato, Giana de Paula January 2009 (has links)
O ATP extracelular modula a atividade sináptica do SNC através de receptores purinérgicos do tipo P1 e P2. Os purinoreceptores do tipo P1 (A1, A2A, A2B e A3) são mais eficientemente ativados por adenosina, enquanto que os purinoreceptores P2 são ativados por ATP. Os níveis da ATP e adenosina na fenda sináptica são controlados pela ação de uma cascata de enzimas chamadas ectonucleotidases. Dentre outros membros, essa família de enzimas é composta pelas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e pela Ecto-5'- nucleotidase. Todos esses membros possuem funções específicas em uma variedade de situações fisiológicas, como por exemplo, o desenvolvimento cerebral e a cognição, ou parecem exercer algum papel na patofisiologia de doenças do SNC, tais como a epilepsia. Portanto, no presente estudo foi investigado (1) o mapeamento ontogenético das E-NPPs em diferentes regiões cerebrais, (2)a localização das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase a nível sináptico e subsináptico em hipocampo e estriado de ratos, (3)a participação das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase nos mecanismos neuroquímicos envolvidos no déficit cognitivo causado por convulsão neonatal em ratos adultos e (4) se o tratamento crônico com antagonistas não seletivos (cafeína) ou seletivos (KW6002) dos receptores A2A pode previnir os déficits de memória causados por convulsão neonatal em ratos adultos. Nossos resultados mostram uma ampla expressão relativa das E-NPPs durante todo o período de desenvolvimento cerebral. Além disso, as E-NTPDases e a E-5'-nucleotidase estão predominantemente localizadas nas sinapses, possuindo diferentes localizações pré e pós- sinápticas e diferentes associações glutamatérgicas e GABAérgicas. Nossos resultados também evidenciam que a hidrólise de ATP se encontra aumentada em ratos adultos que apresentaram déficit cognitivo após convulsão neonatal e que o consumo crônico de antagonistas dos receptores A2A (cafeína e KW6002) pode previnir o déficit cognitivo causado por crises epilépticas no período neonatal. Em resumo, essa tese mostra pela primeira vez a localização subsináptica das ectonucleotidases e correlaciona o sistema purinérgico com a maturação cerebral e com os déficits cognitivos induzidos por convulsão neonatal. Além disso, nossos resultados evidenciam que o consumo crônico de cafeína pode ser um provável agente profilático na prevenção de disfunções de memória na vida adulta associadas às crises convulsivas neonatais. / Extracellular ATP modulates the synaptic activity through P1 and P2 purinoceptors. Adenosine activates preferentially P1 receptors (A1, A2A, A2B, and A3) and ATP activates preferentially P2. The levels of ATP and adenosine in the synaptic cleft are controlled by the action of an enzyme cascade named ectonucleotidases. Besides other members, this enzyme family is constituted by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) and Ecto-5'- nucleotidase. All these members have specific physiological functions in brain development and cognition or seem to have some role in the patophysiology of brain disorders, such as epilepsy. Therefore, in the present study, we have investigated (1) the expression mapping of E-NPPs in different brain regions during development, (2) the synaptic and subsynaptic localization of ENTPDases and E-5'-nucleotidase in hippocampus and striatum of rats, (3) the participation of E-NTPDases and E-5'-nucleotidase in the neurochemical mechanisms of memory dysfunction induced by neonatal seizure in adult rats, and (4) if the chronic intake of nonselective (caffeine) or selective (KW-6002) antagonists of A2A could prevent the cognitive impairment caused by convulsion in early life. Our results showed a wild relative expression of E-NPPs during brain development. In addition, E-NTPDases and E-5'-nucleotidase are predominantly localized in synapses, with different pre and post-localization and different glutamatergic and GABAergic associations. Our results also showed an enhanced ATP hydrolysis in adult rats with memory impairment induced by neonatal convulsion and a prevention of this kind of memory dysfunction by the chronic intake of A2A receptors antagonists (caffeine and KW-6002). In summary, this study showed the first evidence of subsynaptic localization of ectonucleotidases and correlates the purinergic system with brain maturation and with the memory impairment induced by one single seizure in early life. Besides, our results pointed to the chronic intake of caffeine as a possible prophylactic agent for the prevention of cognitive dysfunction in adulthood induced by a single seizure in the neonatal period.
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Avaliação da atividade de nucleotidases na hemostasia e parâmetros de estresse oxidativo em mulheres grávidas normais, com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e portadoras do vírus HIVLeal, Claudio Alberto Martins January 2010 (has links)
O período gestacional é bastante complexo e do ponto de vista vascular, ocorrem inúmeras alterações e adaptações no sistema circulatório, na funcionalidade plaquetária e no sistema endotelial com o objetivo de prevenir futuras complicações na mãe ou no concepto no momento do parto e após o nascimento. Além das alterações na circulação, nos processos vasculares e no sistema imune que são inerentes a este período, existem trabalhos demonstrando a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs) as quais poderão desencadear um desequilíbrio do balanço redox. Os nucleotídeos de purina ATP, ADP, AMP, além do nucleosídeo adenosina participam da regulação vascular endotelial, de processos inflamatórios e do controle imunológico entre outras funções. O controle da produção e dos níveis intracelulares e extracelulares destes nucleotídeos e nucleosídeos são regulados por uma cascata enzimática, na qual, participam as enzimas E-NTPDases (Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolase), ENPPs (Ecto-Nucleotídeo Pirofosfatase Fosfodiesterase), 5`-Nucleotidase e adenosina desaminase. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade de enzimas envolvidas no processo hemostático de gestantes normais e com complicações, como a diabetes melito gestacional, a pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV, além de alguns parâmetros de estresse oxidativo e a agregação plaquetária durante o terceiro trimestre gestacional. Os resultados obtidos demonstram um aumento na atividade das enzimas NTPDase e 5`-nucleotidase em plaquetas de gestantes normais e com diabetes melito gestacional e pré-eclampsia comparadas com mulheres não grávidas. Ocorreu um aumento na atividade da enzima adenosina desaminase no soro de gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Foi verificado, também, um aumento na atividade plaquetária, através da medida da agregação plaquetária, nas gestantes normais e com diabetes melito gestacional, pré-eclampsia e contaminadas com o vírus HIV. Por outro lado, foi verificado um aumento na atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase, butirilcolinesterase e acetilcolinesterase juntamente com um aumento da peroxidação lipídica e uma redução dos níveis de ácido ascórbico e conteúdo sulfidrílico total. Além disso, não foi encontrada alteração significativa na análise de carbonilação protéica. Os resultados apresentados aqui sugerem que estas ectonucleotidases atuam na modulação de respostas vasculares, inflamatórias, imunes e circulatórias. Finalmente, foi detectado um aumento na atividade de enzimas antioxidantes e uma redução no conteúdo de moléculas antioxidantes, acompanhadas de um aumento no dano oxidativo aos lipídios de membrana o que remete à uma produção aumentada de espécies reativas e a uma tentativa do organismo em combater este desequilíbrio. / The pregnancy stage is very complex in the vascular point of view, occurring many changes and adjusts in the circulatory system, in the platelets functionality and in the endothelial system with the function of prevent future complications to the pregnant or to the newborn at the delivery and in the afterbirth. Besides the circulation changes, in the vascular processes and in the immune system that are inherent to this stage, there are studies that report the generation of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS), which could trigger an imbalance in the redox status. The purine nucleotides ATP, ADP, AMP and the nucleoside adenosine participate in the endothelial vascular regulation, inflammatory events, immune regulation, among other functions. The control of the production, the intracellular and extracellular levels of these nucleotides and nucleosides are regulated by an enzymatic cascade, in which, participate the enzymes E-NTPDases (ectonucleotise triphosphate diphosphohydrolases), E-NPPs (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases), 5’-nucleotidase and adenosine deaminase. The purpose of this study was to investigate the activity of enzymes involved in the hemostatic dynamics from normal pregnant and those with complications, such as the gestational diabetes mellitus, the pre-eclampsia and infected with the HIV. We also investigated some oxidative stress parameters and the platelets aggregation during the third gestational trimester. The results demonstrated an increase in the enzymes NTPDase and 5’-nucleotidase in platelets from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus and pre-eclampsia compared with not-pregnant women. It was also observed an increase in the enzyme adenosine deaminase activity in the serum from normal pregnant and those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. It was also verified an increase in the platelets activity through the measure of platelets aggregation in the normal pregnant, those with gestational diabetes mellitus, pre-eclampsia and infected with the HIV. Otherwise, it was verified an increase in the activity of the enzymes superoxide dismutase, catalase, butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase together with an increase in the lipid peroxidation and a decrease in the ascorbic acid and total sulphydryl groups content. Moreover, it was not observed any significant alteration in the protein carbonilation. The results showed here suggest that these ectonucleotidases participate in the modulation of vascular, inflammatory, immune and circulatory responses. Finally, it was detected an increase in the activity of antioxidant enzymes and a decrease in the antioxidant molecules content, together with an increase in the membrane lipids oxidative damage, which brings about an increased production of reactive species and a struggle of the body to combat this unbalance.
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